一種基于CRISPRCas9系統(tǒng)對哺乳動物細胞基因組進行活體定位的載體及其應用的制作方法

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一種基于CRISPRCas9系統(tǒng)對哺乳動物細胞基因組進行活體定位的載體及其應用的制造方法與工藝

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種基于crisprcas9系統(tǒng)對哺乳動物細胞基因組進行活體定位的載體及其應用。

背景技術：

成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復序列crispr/cas(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/crispr-associatedsystems)，是目前最高效的基因組編輯系統(tǒng)。crispr/cas系統(tǒng)總共有五大類，typeⅱcrispr-cas系統(tǒng)在細胞和生物水平上的基因編輯方面已被廣泛高效地運用，它由cas9核蛋白和一條具有crrna和tracrrna功能的向導rna構成。其中cas9蛋白含有兩個起切割目的序列作用的保守區(qū)域，分別為hnh和ruvc結構域；而在向導rna的3’端存在著crrna:tracrrna的支架，可鞏固向導rna和cas9蛋白的相互作用。crispr/cas9系統(tǒng)主要是通過識別特定基因序列后進行切割達到基因編輯的作用，故需要一條長度約為20個核苷酸的向導序列和一條含有pam(protospaceradjacentmotif)dna序列，不同菌種來源的cas9蛋白識別的pam不盡相同，對于streptococcuspyogenescas9(spcas9)蛋白則是5’-ngg-3’。當具備上述所需結構，crispr/cas9系統(tǒng)則可精確地進行基因編輯，首先cas9蛋白與向導rna形成復合物，然后通過識別特定基因的dna序列的pam，解旋dna序列，接著向導rna與單鏈dna形成rna-dna復合結構，緊接著cas9蛋白的hnh和ruvc結構域各自切割特定dna序列的一條鏈，形成帶有平末端的dna雙鏈斷裂，之后通過修復途徑達到基因編輯的效果。(jiang,w.,bikard,d.,cox,d.,zhang,f.andmarraffini,l.a.(2013)rna-guidededitingofbacterialgenomesusingcrispr-cassystems.nat.biotechnol.,31,233–239.)在此之后，科學家發(fā)現(xiàn)通過點突變可hnh和ruvc結構域的活性沉默后并不會影響cas9蛋白識別特定的dna序列的功能，此時cas9蛋白被稱為nuclease-deadcas9(dcas9)蛋白，起到了靶向特定dna序列的作用，研究人員利用這一特性實現(xiàn)了基因表達水平調(diào)控、染色質(zhì)成像等功能。(chen,b.etal.(2016)expandingthecrisprimagingtoolsetwithstaphylococcusaureuscas9forsimultaneousimagingofmultiplegenomicloci.nucleicacidsres,44,1-13.)

若在dcas9蛋白尾部串連一個熒光蛋白，同時表達任意一個具有重復序列或非重復序列的特定dna序列的向導rna，通過crispr/cas9系統(tǒng)的功能則可達到標記特定dna序列的效果，此功能被稱為crispr成像。crispr成像技術可以使得人們觀察到活細胞中特定基因的動態(tài)變化，例如端粒的長度隨著時間推移是如何改變的，特定基因的拷貝數(shù)在間期和分裂期是如何變化的。另外，了解一些基因組元件在活細胞中的精確定位對于認識染色體動力學至關重要，這是因為基因是根據(jù)它們在三維空間中的位置來控制我們的生物學和健康。一個基因要轉錄和表達，在染色體上它必須是可接近的。dna在擁擠細胞核中的定位對從胚胎發(fā)育到癌癥一切的事物均起重要的作用。然而，當前的一些技術最多只能在活細胞中一次追蹤三個基因組位點。標記更多的位點要求通過用甲醛來浸泡細胞固定它們，因此這會殺死細胞，使得無法觀察染色體結構響應刺激或隨時間推移發(fā)生的改變。但crispr成像技術則可以在不殺死細胞的情況下達到三個及三個以上基因組位點，目前，最新研究表明可以同時標記七個基因位點。(ma,h.etal.(2016)multiplexedlabelingofgenomiclociwithdcas9andengineeredsgrnasusingcrisprainbow.nat.biotechnol.,34,528-531.)

在crispr成像系統(tǒng)中的熒光蛋白多為sfgfp，它可以在重復序列較多的dna序列情況下達到很好的標記效果，但熒光強度相對較弱，若用普通的熒光顯微鏡捕捉其標記基因的熒光信號，特別是捕捉sfgfp熒光蛋白標記重復序列很少的情況下難度系數(shù)比較大，只能通過串聯(lián)數(shù)個熒光蛋白來增強起熒光信號，但這個方法卻會使得基因標記的效率下降且噪音升高，并不能徹底解決熒光信號弱的問題。目前，尚未有熒光信號特別強的熒光蛋白應用于crispr成像系統(tǒng)中，若找到一種熒光強度較強的熒光蛋白應用于此系統(tǒng)中，相信可以更清晰明確的觀測到特定基因各個時期的變化且可以探查細胞周期進程中、表觀遺傳調(diào)節(jié)過程中或響應細胞刺激過程中，染色體內(nèi)和染色體間結構域動態(tài)相互作用。理論上，研究人員若應用這種方法，可繪制出每個人類染色體特有重復序列在染色體內(nèi)的位置。原則上，這種方法也可用于分析核纖層相關的結構域和染色體捕獲為基礎的拓撲關聯(lián)結構域，并允許科學家對活細胞中諸如易位和癌癥相關染色體破碎、重排這種事件進行可視化研究。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的是提供一種基于crisprcas9系統(tǒng)對哺乳動物細胞基因組進行活體定位的載體。

本發(fā)明的基于crisprcas9系統(tǒng)對哺乳動物細胞基因組進行活體定位的載體，其特征在于，包括cas9蛋白的突變體dcas9蛋白和與其結合的特定基因的向導rna，在cas9蛋白的突變體dcas9蛋白上具有suntag系統(tǒng)，suntag系統(tǒng)中含有gcn4抗原表位決定簇，將高亮度綠色熒光蛋白mneongreen連接在gcn4抗體上，gcn4抗體與gcn4抗原表位決定簇相結合。

優(yōu)選，所述的基于crisprcas9系統(tǒng)對哺乳動物細胞基因組進行活體定位的載體，其為環(huán)形載體，其核苷酸序列如seqidno.1或seqidno.2所示。

本發(fā)明的第二個目的是提供基于crisprcas9系統(tǒng)對哺乳動物細胞基因組進行活體定位的載體在對哺乳動物細胞基因組進行活體定位中的應用。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種對哺乳動物細胞基因組進行活體定位的方法，其特征在于，將上述基于crisprcas9系統(tǒng)對哺乳動物細胞基因組進行活體定位的載體通過脂質(zhì)體介導轉染到哺乳動物細胞中共培養(yǎng)，然后通過熒光顯微鏡觀察。

本發(fā)明通過cas9蛋白的突變體dcas9蛋白和特定基因的向導rna結合后，在向導rna引導下定位到特定基因，由于suntag系統(tǒng)中含有24個gcn4抗原表位決定簇，高亮度綠色熒光蛋白m-neongreen連接在gcn4抗體上，即scfv-gcn4，故高亮度綠色熒光蛋白可以和suntag系統(tǒng)結合，且suntag系統(tǒng)是連接在dcas9蛋白后面的多肽，因此基于上述部分組成能夠達到在特定基因上發(fā)光進而達到定位的效果。

本發(fā)明的基于crisprcas9系統(tǒng)對哺乳動物細胞基因組進行活體定位的載體，其熒光強度較強，能夠在活細胞條件下觀察特定基因的各個時期的表達情況，可以獲得特定基因在整個間期和分裂期的動態(tài)變化趨勢，并且不會將細胞殺死，而且除此之外，本發(fā)明能夠同時定位數(shù)個基因，觀察它們在特定時期是否有相互作用，進而能夠記錄它們的相互作用的動態(tài)過程以闡釋基因相互作用的機理。另外，所述特定基因可為重復序列較多的dna序列，也可為重復序列低于20的dna序列。理想狀態(tài)下，利用本發(fā)明能夠探查特定基因在細胞周期進程中、表觀遺傳調(diào)節(jié)過程中或響應細胞刺激過程中，染色體內(nèi)和染色體間結構域動態(tài)相互作用。上述優(yōu)點都是fish等需將細胞固定后進行定位的方法所不具備的。

附圖說明：

圖1是pcag-gfp-addgene質(zhì)粒圖譜圖。

圖2是phr-scfv-gcn4-sfgfp-gb1-nls-dwpre質(zhì)粒圖譜圖。

圖3是pcag-scfv-gcn4_v4-sfgfp質(zhì)粒圖譜圖。

圖4是pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen質(zhì)粒圖譜圖。

圖5是pcag-scfv-gcn4_v4-3xmneongreen質(zhì)粒圖譜圖。

圖6是phrdsv40-nls-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp-dwpre質(zhì)粒圖譜圖。

圖7是p1u6-sgefrna-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp質(zhì)粒圖譜圖。

圖8是p1u6-grna-bbsi質(zhì)粒圖譜圖。

圖9是p1u6-sgefrna質(zhì)粒圖譜圖。

圖10是p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp質(zhì)粒圖譜圖。

圖11是p1u6-sgeftelomere質(zhì)粒圖譜圖。

圖12是sfgfp熒光蛋白定位到端粒的圖像。

圖13是mneongreen熒光蛋白定位到端粒的圖像。

圖14是3xmneongreen熒光蛋白定位到端粒的圖像。

圖15是hek293t活細胞核內(nèi)各熒光蛋白定位到端粒的數(shù)目柱狀圖。

圖16是各組熒光蛋白信噪比的小提琴圖。三組實驗分別為取35mm共聚焦玻璃皿，每孔接種1.5-2mlhek293t細胞懸液，培養(yǎng)24小時待細胞貼壁后，更換新的dmem培養(yǎng)基，然后利用3000transfectionreagent(l3000001)進行轉染，其中第一組為p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp轉染量為1250ng，p1u6-sgeftelomere轉染量為750ng，pcag-scfv-gcn4_v4-sfgfp轉染量為500ng，第二組為p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp轉染量為1250ng，p1u6-sgeftelomere轉染量為750ng，pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen轉染量為500ng，第三組為p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp轉染量為1250ng，p1u6-sgeftelomere轉染量為750ng，pcag-scfv-gcn4_v4-3xmneongreen轉染量為500ng，3000transfectionreagent(l3000001)用量為說明書指示量，具體為5ulp3000稀釋在125ulopti-mem中，5ullipofectamine3000稀釋在125ulopti-mem中，將質(zhì)粒添加到p3000稀釋液中，接著將lipofectamine3000稀釋液逐滴加到p3000和質(zhì)?；旌弦褐?，室溫靜置5min后將混合液逐滴加到培養(yǎng)基中。培養(yǎng)24h換新的dmem培養(yǎng)基，48h后于激光掃描共焦顯微鏡(zeiss：lsm880)下觀察，在觀察前利用hoechst試劑對細胞核進行染色，確定熒光蛋白表達在細胞核內(nèi)。

由圖可知，mneongreen信噪比最好，即p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen這一組信噪比最好，表明mneongreen此熒光蛋白在除去熒光背景且定位到端粒的情況下熒光強度較強。

圖17是各組熒光蛋白絕對熒光強度的小提琴圖。三組實驗分別為取35mm共聚焦玻璃皿，每孔接種1.5-2mlhek293t細胞懸液，培養(yǎng)24h待細胞貼壁后，更換新的dmem培養(yǎng)基，然后利用3000transfectionreagent(l3000001)進行轉染，其中第一組為p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp轉染量為1250ng，p1u6-sgeftelomere轉染量為750ng，pcag-scfv-gcn4_v4-sfgfp轉染量為500ng，第二組為p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp轉染量為1250ng，p1u6-sgeftelomere轉染量為750ng，pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen轉染量為500ng，第三組為p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp轉染量為1250ng，p1u6-sgeftelomere轉染量為750ng，pcag-scfv-gcn4_v4-3xmneongreen轉染量為500ng，3000transfectionreagent(l3000001)用量為說明書指示量，具體為5ulp3000稀釋在125ulopti-mem中，5ullipofectamine3000稀釋在125ulopti-mem中，將質(zhì)粒添加到p3000稀釋液中，接著將lipofectamine3000稀釋液逐滴加到p3000和質(zhì)?；旌弦褐?，室溫靜置5min后將混合液逐滴加到培養(yǎng)基中。培養(yǎng)24h換新的dmem培養(yǎng)基，48h后于激光掃描共焦顯微鏡(zeiss：lsm880)下觀察，在觀察前利用hoechst試劑對細胞核進行染色，確定熒光蛋白表達在細胞核內(nèi)。

由圖可知，三個熒光蛋白串聯(lián)組成的3xmneongreen熒光強度最強。即p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-3xmneongreen這一組熒光強度最強。

圖18是各組熒光蛋白減去背景所得到熒光強度的小提琴圖。三組實驗分別為取35mm共聚焦玻璃皿，每孔接種1.5-2mlhek293t細胞懸液，培養(yǎng)24h待細胞貼壁后，更換新的dmem培養(yǎng)基，然后利用3000transfectionreagent(l3000001)進行轉染，其中第一組為p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp轉染量為1250ng，p1u6-sgeftelomere轉染量為750ng，pcag-scfv-gcn4_v4-sfgfp轉染量為500ng，第二組為p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp轉染量為1250ng，p1u6-sgeftelomere轉染量為750ng，pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen轉染量為500ng，第三組為p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp轉染量為1250ng，p1u6-sgeftelomere轉染量為750ng，pcag-scfv-gcn4_v4-3xmneongreen轉染量為500ng，3000transfectionreagent(l3000001)用量為說明書指示量，具體為5ulp3000稀釋在125ulopti-mem中，5ullipofectamine3000稀釋在125ulopti-mem中，將質(zhì)粒添加到p3000稀釋液中，接著將lipofectamine3000稀釋液逐滴加到p3000和質(zhì)?；旌弦褐校覝仂o置5min后將混合液逐滴加到培養(yǎng)基中。培養(yǎng)24h換新的dmem培養(yǎng)基，48h后于激光掃描共焦顯微鏡(zeiss：lsm880)下觀察，在觀察前利用hoechst試劑對細胞核進行染色，確定熒光蛋白表達在細胞核內(nèi)。

由圖可知，三個熒光蛋白串聯(lián)組成的3xmneongreen在減去熒光背景后所得的熒光強度最強。即p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-3xmneongreen這一組在減去熒光背景后所得的熒光強度最強。

圖19是各組熒光蛋白熒光強度和絕對熒光強度的線性擬合圖。實驗為將圖17-圖18所得數(shù)據(jù)進行線性擬合。

由圖可知，三者的絕對熒光強度隨著熒光強度的增強而增強。即第一組p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-sfgfp，第二組p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen，第三組p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-3xmneongreen這三組的絕對熒光強度隨著減去熒光背景后所得的熒光強度的增強而增強。

具體實施方式：

以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。

下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細的說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。除非特別說明，下面實施例中所用的技術均為本領域內(nèi)的技術人員已知的常規(guī)技術；所使用的儀器設備和試劑等，均為本領域內(nèi)的技術人員可以通過公共途徑如商購等獲得的。

實施例1：

圖1是pcag-gfp-addgene質(zhì)粒圖譜圖。

圖2是phr-scfv-gcn4-sfgfp-gb1-nls-dwpre質(zhì)粒圖譜圖。

圖3是pcag-scfv-gcn4_v4-sfgfp質(zhì)粒圖譜圖。

圖4是pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen質(zhì)粒圖譜圖。

圖5是pcag-scfv-gcn4_v4-3xmneongreen質(zhì)粒圖譜圖。

圖6是phrdsv40-nls-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp-dwpre質(zhì)粒圖譜圖。

圖7是p1u6-sgefrna-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp質(zhì)粒圖譜圖。

圖8是p1u6-grna-bbsi質(zhì)粒圖譜圖。

圖9是p1u6-sgefrna質(zhì)粒圖譜圖。

圖10是p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp質(zhì)粒圖譜圖。

圖11是p1u6-sgeftelomere質(zhì)粒圖譜圖。

具體構建步驟如下：

以購買所得pcag-gfp(addgene:11150)為載體，用ecori和hindiii酶切得到4238bp片段為載體。以購買所得的phr-scfv-gcn4-sfgfp-gb1-nls-dwpre(addgene：60906)為模板，進行pcr擴增，pcr引物序列如下：

ga-scfv-gcn4-sfgfp-f:

gtctcatcattttggcaaagaattcgccaccatgggccccgacat

ga-scfv-gcn4-sfgfp-r:

gaccatgattacgccaagcttttacaccttgcgcttcttcttggg。

由此獲得pcr產(chǎn)物scfv-gcn4_v4-sfgfp，利用gibsonassembly試劑盒將pcr產(chǎn)物scfv-gcn4_v4-sfgfp和上述用ecori和hindiii酶切得到的4238bp片段進行連接得到pcag-scfv-gcn4_v4-sfgfp。

以pcag-scfv-gcn4_v4-sfgfp為載體，用hindiii酶切后得到的載體與m-neongreen連接，其中m-neongreen為全基因合成所得，得到pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen(其核苷酸序列如seqidno.1所示)。

以pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen為載體，用agei酶切后得到線性化的pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen。

以線性化的pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen為模板，分別進行兩個pcr擴增。

第一個pcr擴增的pcr引物序列如下：

primer1_f:gtacaagggtggaggtcggagcggcgtgtccaagggcgaagagga；

primer1_r:ggacacgctaccatcgatgctacccttgtacagctcgtccatgccc；

由此得到pcr產(chǎn)物primer1。

第二個pcr擴增的pcr引物序列如下：

primeri2_f:agggtagcatcgatggtagcgtgtccaagggcgaagagga；

primer2_r:aagcttgtactcttcaccggatcccttgtacagctcgtccatgccc。

由此得到pcr產(chǎn)物primer2。

利用gibsonassembly試劑盒將pcr產(chǎn)物primer1和pcr產(chǎn)物primer2進行連接得到pcag-scfv-gcn4_v4-3xmneongreen(其核苷酸序列如seqidno.2所示)。

以購買得到的p1u6-sgefrna-bbsi(addgene：74707)為載體，用bbsi酶切得到3364bp片段為載體。用下述引物合成得到baei序列，

baei-f:caccggaccggtataacgtcagtacctaaca；

baei-r:aaacacttaggtactgacgttataccggtcc；

由此得到baei序列，利用t4ligase試劑盒將baei序列與上述3364bp片段相連后得到p1u6-sgefrna。以p1u6-sgefrna為載體，用mlui和spei酶切得到3329bp片段為載體。以購買所得的phrdsv40-nls-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp-dwpre(addgene：60910)為模板，進行pcr擴增，pcr引物序列如下：

ga-24gcn4-f:ccgagtcggtgctttttttacgcgttctccaagagagtgatcctggc；

ga-24gcn4-r:cggtggcggccgctctagaactagtttaattaagcttgtgcccca；

由此得到pcr產(chǎn)物ga-24gcn4，利用gibsonassembly試劑盒將上述用mlui和spei酶切得到的3329bp片段與pcr產(chǎn)物ga-24gcn4進行連接得到p1u6-sgefrna-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp。

用下述引物合成得到telomere序列，

oligo_f:ttagggttagggttagggttagttta

oligo_r:taaccctaaccctaaccctaacggtg，由此得到telomere序列。

用agei和baei酶切p1u6-sgefrna，回收2934bp片段，利用t4ligase試劑盒將telomere序列與上述2934bp片段相連后得到p1u6-sgeftelomere。

用agei和baei酶切p1u6-sgefrna-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，回收11549bp片段，利用t4ligase試劑盒將telomere序列與上述11549bp片段相連后得到p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp。

取35mm共聚焦玻璃皿，每孔接種1.5-2mlhek293t細胞懸液，培養(yǎng)24h待細胞貼壁后，更換新的dmem培養(yǎng)基，然后利用3000transfectionreagent(l3000001)進行轉染，其中p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp轉染量為1250ng，p1u6-sgeftelomere轉染量為750ng，pcag-scfv-gcn4_v4-sfgfp轉染量為500ng，或者p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp轉染量為1250ng，p1u6-sgeftelomere轉染量為750ng，pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen轉染量為500ng，或者p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp轉染量為1250ng，p1u6-sgeftelomere轉染量為750ng，pcag-scfv-gcn4_v4-3xmneongreen轉染量為500ng，3000transfectionreagent(l3000001)用量為說明書指示量，具體為5ulp3000稀釋在125ulopti-mem中，5ullipofectamine3000稀釋在125ulopti-mem中，將質(zhì)粒添加到p3000稀釋液中，接著將lipofectamine3000稀釋液逐滴加到p3000和質(zhì)?；旌弦褐校覝仂o置5min后將混合液逐滴加到培養(yǎng)基中。培養(yǎng)24h換新的dmem培養(yǎng)基，48h后于激光掃描共焦顯微鏡(zeiss：lsm880)下觀察，在觀察前利用hoechst試劑對細胞核進行染色，確定熒光蛋白表達在細胞核內(nèi)。

具體結果如圖12-19所示，

圖12是在hek293t活細胞轉染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-sfgfp，轉染量分別為1250ng，750ng，和500ng，48h后于激光掃描共焦顯微鏡(zeiss：lsm880)下觀察得到的結果，從圖12可得知綠色的亮點為cripsprcas9系統(tǒng)結合suntag24x系統(tǒng)以及sfgfp熒光蛋白成功定位到端粒telomere的位置。

圖13是在hek293t活細胞轉染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen，轉染量分別為1250ng，750ng，和500ng，48h后于激光掃描共焦顯微鏡(zeiss：lsm880)下觀察得到的結果，從圖13可得知綠色的亮點為cripsprcas9系統(tǒng)結合suntag24x系統(tǒng)以及mneongreen熒光蛋白成功定位到端粒telomere的位置。

圖14是在hek293t活細胞轉染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-3xmneongreen，轉染量分別為1250ng，750ng，和500ng，48h后于激光掃描共焦顯微鏡(zeiss：lsm880)下觀察得到的結果，從圖14可得知綠色的亮點為cripsprcas9系統(tǒng)結合suntag24x系統(tǒng)以及3xmneongreen熒光蛋白成功定位到端粒telomere的位置。

圖15是將圖12至圖14這三個實驗組所得的結果對綠色亮點進行統(tǒng)計得到的結果，從圖中可以看出在hek293t活細胞轉染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen，轉染量分別為1250ng，750ng，和500ng，48h后于激光掃描共焦顯微鏡(zeiss：lsm880)下觀察這一組實驗得到的結果顯示cripsprcas9系統(tǒng)定位效率較在hek293t活細胞轉染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-sfgfp，轉染量分別為1250ng，750ng，和500ng,48h后于激光掃描共焦顯微鏡(zeiss：lsm880)下觀察和在hek293t活細胞轉染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-3xmneongreen，轉染量分別為1250ng，750ng，和500ng,48h后于激光掃描共焦顯微鏡(zeiss：lsm880)下觀察這兩組實驗統(tǒng)計得到的cripspr/cas9系統(tǒng)定位效率高。

圖16則是將圖12至圖14這三個實驗組所得的結果對綠色亮點進行統(tǒng)計得到的結果，從圖中可以看出在hek293t活細胞轉染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen，轉染量分別為1250ng，750ng，和500ng，48h后于激光掃描共焦顯微鏡(zeiss：lsm880)下觀察這一組實驗顯示利用crisprcas9系統(tǒng)定位得到綠色亮點的信噪比較在hek293t活細胞轉染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-sfgfp，轉染量分別為1250ng，750ng，和500ng,48h后于激光掃描共焦顯微鏡(zeiss：lsm880)下觀察和在hek293t活細胞轉染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-3xmneongreen，轉染量分別為1250ng，750ng，和500ng,48h后于激光掃描共焦顯微鏡(zeiss：lsm880)下觀察這兩組實驗統(tǒng)計得到的信噪比高，表明用mneongreen熒光蛋白標記的端粒telomere更容易被觀察到。

圖17將圖12至圖14這三個實驗組所得的結果對綠色亮點進行統(tǒng)計得到的結果，從圖中可以看出在hek293t活細胞轉染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-3xmneongreen，轉染量分別為1250ng，750ng，和500ng，48h后于激光掃描共焦顯微鏡(zeiss：lsm880)下觀察這一組實驗顯示利用crisprcas9系統(tǒng)定位得到綠色亮點的絕對熒光強度較在hek293t活細胞轉染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-sfgfp，轉染量分別為1250ng，750ng，和500ng,48h后于激光掃描共焦顯微鏡(zeiss：lsm880)下觀察和在hek293t活細胞轉染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen，轉染量分別為1250ng，750ng，和500ng,48h后于激光掃描共焦顯微鏡(zeiss：lsm880)下觀察這兩組實驗統(tǒng)計得到的絕對熒光強度強，表明用3xmneongreen熒光蛋白標記的端粒telomere更加明亮。

圖18將圖12至圖14這三個實驗組所得的結果對綠色亮點進行統(tǒng)計得到的結果，從圖中可以看出在hek293t活細胞轉染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-3xmneongreen，轉染量分別為1250ng，750ng，和500ng，48h后于激光掃描共焦顯微鏡(zeiss：lsm880)下觀察這一組實驗顯示利用crisprcas9系統(tǒng)定位得到綠色亮點在減去背景后所得到的熒光強度較在hek293t活細胞轉染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-sfgfp，轉染量分別為1250ng，750ng，和500ng,48h后于激光掃描共焦顯微鏡(zeiss：lsm880)下觀察和在hek293t活細胞轉染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen，轉染量分別為1250ng，750ng，和500ng,48h后于激光掃描共焦顯微鏡(zeiss：lsm880)下觀察這兩組實驗統(tǒng)計得到的熒光強度強，表明用3xmneongreen熒光蛋白標記的端粒telomere更加明亮。

圖19是將圖17至圖18的數(shù)據(jù)進行線性擬合所得到結果。從圖中可以看出三組實驗即在hek293t活細胞轉染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-sfgfp，轉染量分別為1250ng，750ng，和500ng，48h后于激光掃描共焦顯微鏡(zeiss：lsm880)下觀察或在hek293t活細胞轉染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen，轉染量分別為1250ng，750ng，和500ng，48h后于激光掃描共焦顯微鏡(zeiss：lsm880)下觀察或在hek293t活細胞轉染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-3xmneongreen，轉染量分別為1250ng，750ng，和500ng，48h后于激光掃描共焦顯微鏡(zeiss：lsm880)下觀察所得到的絕對熒光強度和減去背景所得的熒光強度都呈一定的線性關系，即縱坐標各組的絕對熒光強度隨著橫坐標減去背景所得的熒光強度增強而增強。

序列表

<110>南方醫(yī)科大學

<120>一種基于crisprcas9系統(tǒng)對哺乳動物細胞基因組進行活體定位的載體及其應用

<160>1

<210>1

<211>6776

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ctaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctc60

attttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccga120

gatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactc180

caacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcacc240

ctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggag300

cccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaa360

agcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccac420

cacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcgccattcaggctgcg480

caactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagg540

gggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttg600

taaaacgacggccagtgagcgcgcgtaatacgactcactatagggcgaattgggtaccgg660

gccccccctcgaggcagatctcgacattgattattgactagttattaatagtaatcaatt720

acggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaat780

ggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgtt840

cccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaa900

actgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtc960

aatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcct1020

acttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatgggtcgaggtgagccccac1080

gttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttat1140

tttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggcgcgcgccaggcgggg1200

cggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcaga1260

gcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaa1320

agcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgttgccttcgccccgtgccccgctccgcg1380

ccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggc1440

gggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggctcgtttctt1500

ttctgtggctgcgtgaaagccttaaagggctccgggagggccctttgtgcgggggggagc1560

ggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggcccgcgctgc1620

ccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcgtgtgcgcga1680

ggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcgggggggctgcgaggggaacaaaggc1740

tgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcggcggtcgggctg1800

taacccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggg1860

gctccgtgcggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtggg1920

ggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcgg1980

ccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaa2040

tcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctggcggagccgaaatctggga2100

ggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcgggcgaagcggtgcggcgccggcaggaagga2160

aatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccatctccagcc2220

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ttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttcttt2340

ttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaagaa2400

tttgctagcacgccaccatgggccccgacatcgtgatgacccagagccccagcagcctga2460

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gcggcaccaacaaccgcgcccccggcgtgcccagccgcttcagcggcagcctgatcggcg2640

acaaggccaccctgaccatcagcagcctgcagcccgaggacttcgccacctacttctgcg2700

ccctgtggtacagcaaccactgggtgttcggccagggcaccaaggtggagctgaagcgcg2760

gcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcagcggcggcggcagcg2820

aggtgaagctgctggagagcggcggcggcctggtgcagcccggcggcagcctgaagctga2880

gctgcgccgtgagcggcttcagcctgaccgactacggcgtgaactgggtgcgccaggccc2940

ccggccgcggcctggagtggatcggcgtgatctggggcgacggcatcaccgactacaaca3000

gcgccctgaaggaccgcttcatcatcagcaaggacaacggcaagaacaccgtgtacctgc3060

agatgagcaaggtgcgcagcgacgacaccgccctgtactactgcgtgaccggcctgttcg3120

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agtccacaaagggcgacctgcagttcagcccctggattctggtgccccacatcggctacg3480

gcttccaccagtacctgccctaccccgacggcatgagccctttccaggccgctatggtgg3540

atggcagcggctaccaggtgcaccggaccatgcagtttgaggacggcgccagcctgaccg3600

tgaactacagatacacctacgagggcagccacatcaagggcgaggcccaagtgaagggca3660

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gaagcaagaaaacctaccccaatgacaagaccatcatcagcaccttcaagtggtcctaca3780

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ctatggccgccaactacctgaagaaccagcctatgtacgtgttccgcaagaccgagctga3900

agcactccaagacagaactgaacttcaaagagtggcagaaagccttcaccgacgtgatgg3960

gcatggacgagctgtacaagggtggaggtcggaccggtgaagagtacaagcttatcctga4020

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aagttttcaaacagtacgctaacgacaacggtgttgacggtgaatggacctacgacgacg4140

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cttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaag4320

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ggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaag4440

acaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaacca4500

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accgcggtggagctccagcttttgttccctttagtgagggttaattgcgcgcttggcgta4620

atcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacat4680

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atgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctc4860

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aggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggct5040

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agttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttg5580

caagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctac5640

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tcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatg6720

tatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccac6776

<210>2

<211>8213

<212>dna

<213>人工序列

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