本申請是2013年1月23日提交的申請?zhí)枮?01380016110.0(pct申請?zhí)杙ct/us2013/022663)，發(fā)明名稱為“除草劑耐受性棉花事件pdab4468.19.10.3”的發(fā)明專利申請的分案申請。優(yōu)先權(quán)聲明本專利申請要求獲得于2012年1月23日提交的美國臨時(shí)專利申請系列no.61/589,594的權(quán)益。背景當(dāng)在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)時(shí)，編碼aad-12(芳氧基鏈烷酸(aryloxyalkanoate)雙加氧酶-12)的基因能夠賦予針對苯氧基乙酸類除草劑，2，4-d和mcpa，和吡啶基氧基乙酸類除草劑，綠草定和氟草煙，的產(chǎn)業(yè)水平的耐受性。當(dāng)在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)時(shí)，編碼pat(膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(phosphinothricinacetyltransferase))的基因能夠引入針對膦絲菌素除草劑(草胺膦)的耐受性。pat已經(jīng)成功地在棉花中表達(dá)，同時(shí)用作生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因作物的可篩選標(biāo)記并在轉(zhuǎn)基因植物中引入針對除草劑草胺膦的商業(yè)水平的耐受性。已知轉(zhuǎn)基因在植物中的表達(dá)受到其在植物基因中定位的影響，這可能是由于染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)(例如異染色質(zhì))或者轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件(例如增強(qiáng)子)靠近整合位點(diǎn)(weisingetal.，ann.rev.genet.22：421-477，1988)。與此同時(shí)，轉(zhuǎn)基因在基因組中的不同位點(diǎn)的存在會以不同的方式影響植物的整體表型。由于這個(gè)原因，經(jīng)常需要篩選大量的轉(zhuǎn)基因事件，以便鑒定以所導(dǎo)入的感興趣的基因的最佳表達(dá)為特征的特定轉(zhuǎn)基因事件。例如，已經(jīng)在植物和其它生物中觀察到，導(dǎo)入基因的表達(dá)水平在不同事件中可能有很大的變化。也可能存在空間或時(shí)間表達(dá)模式的差異，例如，轉(zhuǎn)基因在各種植物組織中的相對表達(dá)的差異，這可能不符合根據(jù)存在于所導(dǎo)入基因構(gòu)建體中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件所預(yù)期的模式。由于這個(gè)原因，通常產(chǎn)生數(shù)百至數(shù)千個(gè)不同的事件并對這些事件進(jìn)行篩選，以便獲得具有為產(chǎn)業(yè)目的所期望的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平和模式的單一事件。理想的是，能夠檢測特定事件的存在，以便確定有性雜交的后代中是否含有感興趣的轉(zhuǎn)基因或感興趣的轉(zhuǎn)基因群。此外，用于檢測特定事件的方法將有助于遵從，例如，要求上市前審批(pre-marketapproval)和對從重組作物衍生的食品或纖維進(jìn)行標(biāo)注的法規(guī)，或者有助于進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測，監(jiān)測田間作物的性狀，或者監(jiān)測從作物的收獲品衍生的產(chǎn)品，以及用于確保相關(guān)方遵從有關(guān)法規(guī)或合同條款。有可能通過任何本領(lǐng)域已知的核酸檢測方法來檢測轉(zhuǎn)基因事件的存在，包括但不僅限于，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)或使用核酸探針的dna雜交。這些檢測方法一般聚焦于頻繁使用的遺傳元件，例如啟動子、終止子、標(biāo)志物基因等，因?yàn)閷τ谠S多dna構(gòu)建體，編碼區(qū)是可以互換的。其結(jié)果是，這些方法并不能用于區(qū)分不同的事件，特別是那些使用相同的dna構(gòu)建體或非常相似的構(gòu)建體產(chǎn)生的事件，除非鄰近所插入異源dna的側(cè)翼dna的dna序列是已知的。例如，美國專利申請2006/0070139中描述了一種關(guān)于玉米事件das-59122-7的事件特異性pcr測定法。建立一種用于鑒定棉花事件pdab4468.19.10.3的簡單而有判別力的方法是令人期待的。公開本發(fā)明的實(shí)施方案涉及一種新的抗除草劑的轉(zhuǎn)基因棉花轉(zhuǎn)化事件，其被命名為棉花事件pdab4468.19.10.3，其包括如本文中描述的aad-12和pat，它們被插入到棉花細(xì)胞基因組內(nèi)的一個(gè)特定位點(diǎn)。代表性的棉花種子已保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc)，其登錄號在第[0032]段中示明。包含該事件的棉花植物的dna包括本文中所述的、表征插入dna在棉花基因組內(nèi)的位置的接點(diǎn)/側(cè)翼序列。seqidno：1和seqidno：2能鑒別棉花事件pdab4468.19.10.3。更具體地，seqidno：1的bp1354/1355處的接點(diǎn)和seqidno：2的bp168/169處的接點(diǎn)的周圍序列能鑒別棉花事件pdab4468.19.10.3。下面的段落[0013]描述了包含這些接點(diǎn)的序列的實(shí)例，這些接點(diǎn)是含有棉花事件pdab4468.19.10.3的棉花植物的dna的特征。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種抗苯氧基乙酸類除草劑如2，4-d和mcpa的棉花植物或其部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種抗吡啶基氧基乙酸類除草劑如綠草定和氟草煙的棉花植物或其部分。在一個(gè)額外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種具有包含一個(gè)或多個(gè)選自下組的序列的基因組的棉花植物：seqidno：1的bp1329-1380；seqidno：1的bp1304-1405；seqidno：1的bp1254-1455；seqidno：1的bp1154-1555；seqidno：1的bp1054-1655；seqidno：2的bp143-194；seqidno：2的bp118-219；seqidno：2的bp68-269；和seqidno：2的bp1-369，和其互補(bǔ)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這類植物的種子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了耐受如下化合物的棉花植物或其部分，該化合物被轉(zhuǎn)化成苯氧乙酸類生長素除草劑如2，4-d和mcpa(例如2，4-db、mcpb等)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了耐受如下化合物的棉花植物或其部分，該化合物可以被轉(zhuǎn)化成吡啶基氧基乙酸類除草劑如綠草定和氟草煙(例如綠草定b、氟草煙b等)。苯氧乙酸生長素和吡啶基氧基乙酸除草劑中存在的丁酸部分可以通過β-氧化被轉(zhuǎn)變成除草劑的植物毒素形式。丁酸形式的除草劑本身是無除草活性的(nonherbicidal)。它們在易感植物(例如棉花植物)內(nèi)通過β-氧化被轉(zhuǎn)變成其各自的酸形式，正是乙酸形式的除草劑有植物毒性。不能夠進(jìn)行快速β-氧化的植物不會受到丁酸除草劑的傷害。然而，能夠進(jìn)行快速β-氧化并能夠?qū)⒍∷岢輨┺D(zhuǎn)變成乙酸形式的植物可以隨后被aad-12保護(hù)。因此，本發(fā)明提供了具有包含一個(gè)或多個(gè)選自下組的序列的基因組的棉花植物：seqidno：1的bp1329-1380；seqidno：1的bp1304-1405；seqidno：1的bp1254-1455；seqidno：1的bp1154-1555；seqidno：1的bp1054-1655；seqidno：2的bp143-194；seqidno：2的bp118-219；seqidno：2的bp68-269；和seqidno：2的bp1-369，和其互補(bǔ)物，它們能鑒別棉花事件pdab4468.19.10.3的存在。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這類植物的種子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于控制棉花作物中雜草的方法，包括向棉花作物施用苯氧乙酸除草劑例如2，4-d和mcpa，其中該棉花作物包括具有包含一個(gè)或多個(gè)選自下組的序列的基因組的棉花植物：seqidno：1的bp1329-1380；seqidno：1的bp1304-1405；seqidno：1的bp1254-1455；seqidno：1的bp1154-1555；seqidno：1的bp1054-1655；seqidno：2的bp143-194；seqidno：2的bp118-219；seqidno：2的bp68-269；和seqidno：2的bp1-369，和其互補(bǔ)物，它們能鑒別棉花事件pdab4468.19.10.3的存在。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于控制棉花作物中雜草的方法，包括向棉花作物施用吡啶基氧基乙酸除草劑如綠草定和氟草煙，其中該棉花作物包括具有包含一個(gè)或多個(gè)選自下組的序列的基因組的棉花植物：seqidno：1的bp1329-1380；seqidno：1的bp1304-1405；seqidno：1的bp1254-1455；seqidno：1的bp1154-1555；seqidno：1的bp1054-1655；seqidno：2的bp143-194；seqidno：2的bp118-219；seqidno：2的bp68-269；和seqidno：2的bp1-369，和其互補(bǔ)物，它們能鑒別棉花事件pdab4468.19.10.3的存在。棉花事件pdab4468.19.10.3中存在的aad-12基因賦予對苯氧乙酸除草劑和吡啶基氧基乙酸除草劑的耐受性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于控制棉花作物中雜草的方法，包括向棉花作物施用草胺膦除草劑，所述棉花作物包括具有包含一個(gè)或多個(gè)選自下組的序列的基因組的棉花植物：seqidno：1的bp1329-1380；seqidno：1的bp1304-1405；seqidno：1的bp1254-1455；seqidno：1的bp1154-1555；seqidno：1的bp1054-1655；seqidno：2的bp143-194；seqidno：2的bp118-219；seqidno：2的bp68-269；和seqidno：2的bp1-369，和其互補(bǔ)物，它們能鑒別棉花事件pdab4468.19.10.3的存在。棉花事件pdab4468.19.10.3中存在的pat基因引入對草胺膦除草劑的耐受性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在含有棉花dna的樣品中檢測棉花事件pdab4468.19.10.3的方法，所述方法包括：(a)使所述樣品與第一引物和第二引物接觸，第一引物的長度為至少10bp并且選擇性結(jié)合seqidno：1的bp1-1354內(nèi)的側(cè)翼序列或其互補(bǔ)物，第二引物的長度為至少10bp并且選擇性結(jié)合seqidno：1的bp1355-1672內(nèi)的插入序列或其互補(bǔ)物；和(b)對所述引物之間產(chǎn)生的擴(kuò)增子進(jìn)行測定；或(c)使所述樣品與第一引物和第二引物接觸，第一引物的長度為至少10bp并且選擇性結(jié)合seqidno：2的bp1-168內(nèi)的插入序列或其互補(bǔ)物，第二引物的長度為至少10bp并且選擇性結(jié)合seqidno：2的bp169-2898內(nèi)的側(cè)翼序列或其互補(bǔ)物；和(d)對所述引物之間產(chǎn)生的擴(kuò)增子進(jìn)行測定。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了檢測棉花事件pdab4468.19.10.3的方法，包括：(a)使所述樣品與第一引物和第二引物接觸，第一引物與選自下組的側(cè)翼序列選擇性結(jié)合：seqidno：1的bp1-1354和seqidno：2的bp169-2898，及其互補(bǔ)物，第二引物與seqidno：3或其互補(bǔ)物選擇性結(jié)合；(b)使所述樣品進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；和(c)對所述引物之間產(chǎn)生的擴(kuò)增子進(jìn)行測定。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種棉花植物育種的方法，包括：將第一植物與第二棉花植物雜交產(chǎn)生第三棉花植物，所述第一植物包含如下的dna，該dna含有一個(gè)或多個(gè)選自下組的序列：seqidno：1的bp1329-1380；seqidno：1的bp1304-1405；seqidno：1的bp1254-1455；seqidno：1的bp1154-1555；seqidno：1的bp1054-1655；seqidno：2的bp143-194；seqidno：2的bp118-219；seqidno：2的bp68-269；和seqidno：2的bp1-369，和其互補(bǔ)物；對所述第三棉花植物測定包含一個(gè)或多個(gè)選自下組的序列的dna的存在：seqidno：1的bp1329-1380；seqidno：1的bp1304-1405；seqidno：1的bp1254-1455；seqidno：1的bp1154-1555；seqidno：1的bp1054-1655；seqidno：2的bp143-194；seqidno：2的bp118-219；seqidno：2的bp68-269；和seqidno：2的bp1-369，和其互補(bǔ)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種分離的dna分子，其能鑒別棉花事件pdab4468.19.10.3。除了seqidnos：1和2之外，這些分子還包括長度至少為50bp，并包括跨越seqidno：1的bp1354/1355接點(diǎn)的多核苷酸序列的分子，和長度至少為50bp，并包括跨越seqidno：2的bp168/169接點(diǎn)的多核苷酸序列的分子。實(shí)例包括：seqidno：1的bp1329-1380；seqidno：1的bp1304-1405；seqidno：1的bp1254-1455；seqidno：1的bp1154-1555；seqidno：1的bp1054-1655；seqidno：2的bp143-194；seqidno：2的bp118-219；seqidno：2的bp68-269；和seqidno：2的bp1-369，和其互補(bǔ)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了棉花纖維、顆粒(grain)、種子、種子油或種子粕，在所述棉花纖維、顆粒、種子、種子油或種子粕中含有棉花事件pdab4468.19.10.3，表現(xiàn)為該棉花纖維、顆粒、種子、種子油或種子粕的dna中含有一個(gè)或多個(gè)選自下組的序列：seqidno：1的bp1329-1380；seqidno：1的bp1304-1405；seqidno：1的bp1254-1455；seqidno：1的bp1154-1555；seqidno：1的bp1054-1655；seqidno：2的bp143-194；seqidno：2的bp118-219；seqidno：2的bp68-269；和seqidno：2的bp1-369，和其互補(bǔ)物。本發(fā)明的實(shí)施方案還包括含有棉花事件pdab4468.19.10.3的棉花植物細(xì)胞和植物部分，包括但不僅限于，花粉、胚珠、花、芽(shoot)、根和葉，以及營養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核、花粉細(xì)胞、種子、種子油和種子粕、及卵細(xì)胞(eggcell)。在一些實(shí)施方案中，棉花事件pdab4468.19.10.3可以和其它性狀組合，其他性狀包括例如其它除草劑耐受基因和/或昆蟲抑制蛋白和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(例如rna干擾、dsrna、轉(zhuǎn)錄因子等)。額外的性狀可以通過植物育種、對含有棉花事件pdab4468.19.10.3的轉(zhuǎn)基因植物的再次轉(zhuǎn)化、或同源重組介導(dǎo)的靶向整合添加新性狀，而疊加到植物基因組內(nèi)。其它實(shí)施方案包括切離包含棉花事件pdab4468.19.10.3的多核苷酸序列，包括例如pat基因表達(dá)盒。一旦切離多核苷酸序列，經(jīng)過修飾的事件可以被重新靶定到特定的染色體位點(diǎn)，在該位點(diǎn)中額外的多核苷酸序列與棉花事件pdab4468.19.10.3疊加。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋棉花染色體靶位點(diǎn)，其位于a亞基因組3號的染色體上seqidnos：1和2中表示的側(cè)翼序列之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋制作轉(zhuǎn)基因棉花植物的方法，包括將異源核酸插入到a亞基因組的3號染色體上seqidno：1和2中表示的基因組序列之間的位置，即seqidno：1的bp1-1354和seqidno：2的bp169-2898之間的位置。此外，本發(fā)明的實(shí)施方案還提供了用于檢測樣品(例如棉花纖維的樣品)中主題事件之存在的測定法。該測定法可以基于插入到棉花基因組中的重組構(gòu)建體的dna序列，并基于插入位點(diǎn)側(cè)翼的基因組序列。還提供了可用于實(shí)施該測定法的試劑盒和條件。本發(fā)明的實(shí)施方案還部分地涉及對轉(zhuǎn)基因棉花品系中由于插入來自pdab4468的t-dna而產(chǎn)生的邊界區(qū)域的dna序列的克隆和分析。這些序列是唯一的?；诓迦胄蛄泻徒狱c(diǎn)序列，可以生成且實(shí)際生成了事件特異性引物。pcr分析表明，這些事件可以通過分析用這些事件特異性引物組所產(chǎn)生的pcr擴(kuò)增子來加以辨識。因此，這些和其他相關(guān)的程序可以用于唯一地辨識包含本發(fā)明事件的棉花品系。一個(gè)實(shí)施方案提供了一種控制棉花作物中雜草的方法，包括向棉花作物施用苯氧乙酸除草劑，所述棉花作物包括含有如下所述的dna的棉花植物，所述dna包含選自下組的序列：seqidno：1的bp1329-1380；seqidno：1的bp1304-1405；seqidno：1的bp1254-1455；seqidno：1的bp1154-1555；seqidno：1的bp1054-1655；seqidno：2的bp143-194；seqidno：2的bp118-219；seqidno：2的bp68-269；和seqidno：2的bp1-369。在本方法的進(jìn)一步的方面中，苯氧乙酸除草劑是2，4-d。在本方法進(jìn)一步的方面中，苯氧乙酸除草劑是mcpa。一個(gè)實(shí)施方案提供了一種控制棉花作物中雜草的方法，包括向棉花作物施用吡啶氧基乙酸除草劑，所述棉花作物包括含有如下所述的dna的棉花植物，所述dna包含選自下組的序列：seqidno：1的bp1329-1380；seqidno：1的bp1304-1405；seqidno：1的bp1254-1455；seqidno：1的bp1154-1555；seqidno：1的bp1054-1655；seqidno：2的bp143-194；seqidno：2的bp118-219；seqidno：2的bp68-269；和seqidno：2的bp1-369。在本方法進(jìn)一步的方面中，吡啶氧基乙酸除草劑是綠草定。在本方法進(jìn)一步的方面中，苯氧乙酸除草劑是氟草煙。一個(gè)實(shí)施方案提供了一種控制棉花作物中雜草的方法，包括向棉花作物施用草胺膦除草劑，所述棉花作物包括含有如下所述的dna的棉花植物，所述dna包含選自下組的序列：seqidno：1的bp1329-1380；seqidno：1的bp1304-1405；seqidno：1的bp1254-1455；seqidno：1的bp1154-1555；seqidno：1的bp1054-1655；seqidno：2的bp143-194；seqidno：2的bp118-219；seqidno：2的bp68-269；和seqidno：2的bp1-369。一個(gè)實(shí)施方案提供了一種分離的dna序列，其包含一個(gè)或多個(gè)選自下組的序列：seqidno：1的bp1329-1380；seqidno：1的bp1304-1405；seqidno：1的bp1254-1455；seqidno：1的bp1154-1555；seqidno：1的bp1054-1655；seqidno：2的bp143-194；seqidno：2的bp118-219；seqidno：2的bp68-269；和seqidno：2的bp1-369。一個(gè)實(shí)施方案提供了一種棉花植物育種的方法，包括：將第一植物與第二棉花植物雜交產(chǎn)生第三棉花植物，所述第一植物包含含有一個(gè)或多個(gè)選自下組的序列的dna：seqidno：1的bp1329-1380；seqidno：1的bp1304-1405；seqidno：1的bp1254-1455；seqidno：1的bp1154-1555；seqidno：1的bp1054-1655；seqidno：2的bp143-194；seqidno：2的bp118-219；seqidno：2的bp68-269；和seqidno：2的bp1-369，和其互補(bǔ)物；以及對所述第三棉花植物測定包含一個(gè)或多個(gè)選自下組的序列的dna的存在：seqidno：1的bp1329-1380；seqidno：1的bp1304-1405；seqidno：1的bp1254-1455；seqidno：1的bp1154-1555；seqidno：1的bp1054-1655；seqidno：2的bp143-194；seqidno：2的bp118-219；seqidno：2的bp68-269；和seqidno：2的bp1-369，和其互補(bǔ)物。一個(gè)實(shí)施方案提供了一種分離的dna分子，其包含接點(diǎn)序列，所述接點(diǎn)序列包含至少一個(gè)選自下組的序列：seqidno：1的bp1329-1380；seqidno：1的bp1304-1405；seqidno：1的bp1254-1455；seqidno：1的bp1154-1555；seqidno：1的bp1054-1655；seqidno：2的bp143-194；seqidno：2的bp118-219；seqidno：2的bp68-269；seqidno：2的bp1-369，和其互補(bǔ)物。一個(gè)實(shí)施方案提供了一種棉花種子，其在基因組中包含選自下組的dna序列：seqidno：1的bp1329-1380；seqidno：1的bp1304-1405；seqidno：1的bp1254-1455；seqidno：1的bp1154-1555；seqidno：1的bp1054-1655；seqidno：2的bp143-194；seqidno：2的bp118-219；seqidno：2的bp68-269；seqidno：2的bp1-369，和其互補(bǔ)物。進(jìn)一步的實(shí)施方案提供了一種棉花種子，其在基因組中包含aad-12/pat棉花事件pdab4468.19.10.3，并且其代表性棉花種子被保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，登錄號為no.pta-12457。進(jìn)一步的實(shí)施方案提供了一種通過種植這兩個(gè)實(shí)施方案中任一個(gè)的棉花種子產(chǎn)生的棉花植物。進(jìn)一步的實(shí)施方案提供了通過該棉花植物生產(chǎn)的棉花種子，其中所述種子在其基因組中含有aad-12/pat棉花事件pdab4468.19.10.3，其與以登錄號no.pta-12457保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的棉花種子中存在的aad-12/pat棉花事件pdab4468.19.10.3相同。進(jìn)一步的實(shí)施方案提供了該棉花植物的部分，其中所述部分選自下組：花粉、胚珠、花、棉鈴、芽、根和葉，并且所述部分包含所述事件。進(jìn)一步的實(shí)施方案提供了從棉花植物或其部分衍生的組合物，其中所述組合物是選自下組的商業(yè)產(chǎn)品：棉粕、棉纖維和棉籽油。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，棉花植物包含與seqidno：21的殘基1，355-7,741具有至少95％的序列同一性的dna序列。一個(gè)實(shí)施方案提供了上述實(shí)施方案植物的后代棉花植物，其中所述植物對苯氧基乙酸、吡啶基氧基乙酸和草胺膦除草劑顯示耐受性，并且所述耐受性是由于所述事件或所述基因組中編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)導(dǎo)致的。進(jìn)一步的實(shí)施方案提供了一種棉花種子，包含含有如下所述的dna序列的基因組，所述dna序列與seqidno：21具有至少95％的序列同一性。進(jìn)一步的實(shí)施方案提供了通過種植該棉花種子產(chǎn)生的植物。一個(gè)實(shí)施方案提供了一種含有棉花事件pdab4468.19.10.3的轉(zhuǎn)基因棉花植物或其部分，其中包含棉花事件pdab4468.19.10.3的代表性棉花種子已經(jīng)被保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，登錄號為no.pta-12457。更具體而言，本申請?zhí)峁?.一種棉花種子，該種子在其基因組中包含選自下組的dna序列：seqidno：1的殘基1329-1380；seqidno：1的殘基1304-1405；seqidno：1的殘基1254-1455；seqidno：1的殘基1154-1555；seqidno：1的殘基1054-1655；seqidno：2的殘基143-194；seqidno：2的殘基118-219；seqidno：2的殘基68-269；和seqidno：2的殘基1-369；及其互補(bǔ)物。2.一種棉花種子，該種子在其基因組中包含aad-12/pat棉花事件pdab4468.19.10.3，并且其代表性的棉花種子被保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，登錄號為no.pta-12457。3.一種棉花植物，其是通過種植項(xiàng)1或項(xiàng)2的種子產(chǎn)生的。4.一種由項(xiàng)3的植物產(chǎn)生的棉花種子，其中所述種子在其基因組中包含aad-12/pat棉花事件pdab4468.19.10.3，該事件也存在于以登錄號no.pta-12457保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的棉花種子中。5.項(xiàng)3的棉花植物的一部分，其中所述部分選自花粉、胚珠、花、棉鈴、芽、根和葉，并且所述部分包含所述事件。6.一種從項(xiàng)3的棉花植物或項(xiàng)5的部分衍生的組合物，其中所述組合物是選自下組的商業(yè)產(chǎn)品：棉粕、棉纖維和棉籽油。7.項(xiàng)3的植物的后代棉花植物，其中所述植物對苯氧基乙酸、吡啶氧基乙酸和草胺膦除草劑顯示耐受性，并且所述耐受性是由于在所述事件或所述基因組中編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)導(dǎo)致的。8.項(xiàng)3的棉花植物，其中所述棉花植物包含與seqidno：21的殘基1，355-7，741具有至少95％的序列同一性的dna序列。9.一種棉花種子，其包含含有與seqidno：21具有至少95％的序列同一性的dna序列的基因組。10.通過種植項(xiàng)9的種子產(chǎn)生的植物。11.一種包含棉花事件pdab4468.19.10.3的轉(zhuǎn)基因棉花植物或其部分，其中包含棉花事件pdab4468.19.10.3的代表性棉花種子已被保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，登錄號為no.pta-12457。12.一種分離的dna序列，其包含一個(gè)或多個(gè)選自下組的序列：seqidno：1的bp1329-1380；seqidno：1的bp1304-1405；seqidno：1的bp1254-1455；seqidno：1的bp1154-1555；seqidno：1的bp1054-1655；seqidno：2的bp143-194；seqidno：2的bp118-219；seqidno：2的bp68-269；和seqidno：2的bp1-369。13.一種棉花植物育種方法，包括：將第一植物與第二棉花植物雜交產(chǎn)生第三棉花植物，所述第一植物包含含有一個(gè)或多個(gè)選自下組的序列的dna：seqidno：1的bp1329-1380；seqidno：1的bp1304-1405；seqidno：1的bp1254-1455；seqidno：1的bp1154-1555；seqidno：1的bp1054-1655；seqidno：2的bp143-194；seqidno：2的bp118-219；seqidno：2的bp68-269；和seqidno：2的bp1-369，和其互補(bǔ)物；和對所述第三棉花植物測定包含一個(gè)或多個(gè)選自下組的序列的dna的存在：seqidno：1的bp1329-1380；seqidno：1的bp1304-1405；seqidno：1的bp1254-1455；seqidno：1的bp1154-1555；seqidno：1的bp1054-1655；seqidno：2的bp143-194；seqidno：2的bp118-219；seqidno：2的bp68-269；和seqidno：2的bp1-369，和其互補(bǔ)物。14.一種分離的dna分子，其包含接點(diǎn)序列，該接點(diǎn)序列含有至少一個(gè)選自下組的序列：seqidno：1的bp1329-1380；seqidno：1的bp1304-1405；seqidno：1的bp1254-1455；seqidno：1的bp1154-1555；seqidno：1的bp1054-1655；seqidno：2的bp143-194；seqidno：2的bp118-219；seqidno：2的bp68-269；和seqidno：2的bp1-369，和其互補(bǔ)物。15.一種控制棉花作物中的雜草的方法，包括向棉花作物施用苯氧乙酸除草劑，所述棉花作物包括含有如下所述的dna的棉花植物，該dna包含選自下組的序列：seqidno：1的bp1329-1380；seqidno：1的bp1304-1405；seqidno：1的bp1254-1455；seqidno：1的bp1154-1555；seqidno：1的bp1054-1655；seqidno：2的bp143-194；seqidno：2的bp118-219；seqidno：2的bp68-269；和seqidno：2的bp1-369。16.項(xiàng)15的方法，其中所述苯氧乙酸除草劑是2，4-d。17.項(xiàng)15的方法，其中所述苯氧乙酸除草劑是mcpa。18.一種控制棉花作物中的雜草的方法，包括向棉花作物施用吡啶氧基乙酸除草劑，所述棉花作物包括含有如下所述的dna的棉花植物，該dna包含選自下組的序列：seqidno：1的bp1329-1380；seqidno：1的bp1304-1405；seqidno：1的bp1254-1455；seqidno：1的bp1154-1555；seqidno：1的bp1054-1655；seqidno：2的bp143-194；seqidno：2的bp118-219；seqidno：2的bp68-269；和seqidno：2的bp1-369。19.項(xiàng)18的方法，其中所述吡啶氧基乙酸除草劑是綠草定。20.項(xiàng)18的方法，其中所述吡啶氧基乙酸除草劑是氟草煙。21.一種控制棉花作物中的雜草的方法，包括向棉花作物施用草胺膦除草劑，所述棉花作物包括含有如下所述的dna的棉花植物，該dna包含選自下組的序列：seqidno：1的bp1329-1380；seqidno：1的bp1304-1405；seqidno：1的bp1254-1455；seqidno：1的bp1154-1555；seqidno：1的bp1054-1655；seqidno：2的bp143-194；seqidno：2的bp118-219；seqidno：2的bp68-269；和seqidno：2的bp1-369。種子保藏作為本公開的一部分，至少2500粒含有棉花事件pdab4468.19.10.3的棉花品系的種子被保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc)(10801universityboulevard,manassas,va,20110)，公眾可以無限制地獲得(但是受專利權(quán)保護(hù))。該保藏被指定為atcc登錄號pta-12457，分類命名為陸地棉(gossypiumhirsutuml.)，是以陶氏益農(nóng)公司(dowagrosciencesllc)的名義于2012年1月23日保藏的。該保藏的實(shí)施和維持遵照布達(dá)佩斯條約關(guān)于專利程序目的的種子保藏條款。序列簡述seqidno：1是用于棉花事件pdab4468.19.10.3的5’dna側(cè)翼邊界序列。核苷酸1-1354是基因組序列。核苷酸1355-1672是插入序列。seqidno：2是用于棉花事件pdab4468.19.10.3的3’dna側(cè)翼邊界序列。核苷酸1-168是插入序列。核苷酸169-2898是基因組序列。seqidno：3是pdab4468的t-鏈dna序列，其在下面的表1中有注釋。seqidno：4是用于確認(rèn)3’邊界基因組dna的寡核苷酸引物3endg1。seqidno：5是用于確認(rèn)3’邊界基因組dna的寡核苷酸引物3endg2。seqidno：6是用于確認(rèn)3’邊界基因組dna的寡核苷酸引物3endg3。seqidno：7是用于確認(rèn)5’邊界基因組dna的寡核苷酸引物5endg1。seqidno：8是用于確認(rèn)5’邊界基因組dna的寡核苷酸引物5endg2。seqidno：9是用于確認(rèn)5’邊界基因組dna的寡核苷酸引物5endg3。seqidno：10是用于確認(rèn)5’邊界基因組dna的寡核苷酸引物5endt1。seqidno：11是用于確認(rèn)5’邊界基因組dna的寡核苷酸引物5endt2。seqidno：12是用于確認(rèn)5’邊界基因組dna的寡核苷酸引物5endt3。seqidno：13是用于確認(rèn)3’邊界基因組dna的寡核苷酸引物3endt1。seqidno：14是用于確認(rèn)3’邊界基因組dna的寡核苷酸引物3endt2。seqidno：15是用于確認(rèn)3’邊界基因組dna的寡核苷酸引物3endt3。seqidno：16是用于確認(rèn)5’邊界基因組dna的寡核苷酸引物bacg6。seqidno：17是用于確認(rèn)5’邊界基因組dna的寡核苷酸引物ubirev。seqidno：18是用于確認(rèn)5’邊界基因組dna的寡核苷酸引物ghbaca6。seqidno：19是用于確認(rèn)5’邊界基因組dna的寡核苷酸引物aad3b1。seqidno：20是用于確認(rèn)5’邊界基因組dna的寡核苷酸引物5endpls。seqidno：21是棉花事件pdab4468.19.10.3的序列，包括5’基因組側(cè)翼序列、pdab4468t-鏈插入、和3’基因組側(cè)翼序列。附圖簡述圖1是含有aad-12和pat基因表達(dá)盒的pdab4468的質(zhì)粒圖。圖2描繪了用于確認(rèn)棉花事件pdab4468.19.10.3的5’和3’邊界序列的引物位置。實(shí)施本發(fā)明的模式棉花事件pdab4468.19.10.3插入的兩端均已被測序和表征。事件特異性測定法已經(jīng)得以開發(fā)。該事件已被定位(mapped)到棉花基因組中(a亞基因組的3號染色體)?？梢粤钤撌录B入到更多的優(yōu)良品系中。如在上文“背景”部分提到的，將轉(zhuǎn)基因引入并整合到植物基因組中涉及到一些隨機(jī)事件(故而將得到表達(dá)的給定插入命名為“事件”)。也就是說，由于轉(zhuǎn)化技術(shù)眾多，諸如土壤桿菌轉(zhuǎn)化、基因槍轉(zhuǎn)化(即基因槍)和碳化硅介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(即whiskers)等，無法預(yù)測轉(zhuǎn)基因?qū)迦朐诨蚪M中的何處。因此，鑒定插入物兩側(cè)的側(cè)翼植物基因組dna對于辨識具有給定插入事件的植物而言是重要的。例如，可設(shè)計(jì)pcr引物使其產(chǎn)生跨越插入物和宿主基因組的接點(diǎn)區(qū)的pcr擴(kuò)增子。該pcr擴(kuò)增子可用于鑒定插入事件的獨(dú)特或不同的類型。本文提供了定義和實(shí)施例，用以幫助描述本發(fā)明的實(shí)施方案，并指導(dǎo)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員實(shí)踐這些實(shí)施方案。除非另有說明，否則術(shù)語可以被相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)常規(guī)的用法來理解。dna堿基的命名根據(jù)37cfr§1.822所述。如這里所使用的，術(shù)語“后代”是指包含棉花事件pdab4468.19.10.3的任何一代親本植物的后代。轉(zhuǎn)基因“事件”是通過用異源dna，即包含感興趣的轉(zhuǎn)基因的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，再生由于轉(zhuǎn)基因插入到植物的基因組中而產(chǎn)生的植物群體，且選擇特定基因組位置中的插入為特征的特定植物而產(chǎn)生的。術(shù)語“事件”是指包含異源dna的原始轉(zhuǎn)化體以及該轉(zhuǎn)化體的后代。術(shù)語“事件”也指通過轉(zhuǎn)化體與另一含有基因組/轉(zhuǎn)基因dna的品種之間的有性異交產(chǎn)生的后代。即使經(jīng)過與輪回親本進(jìn)行多次回交，插入的轉(zhuǎn)基因dna和來自被轉(zhuǎn)化親本的側(cè)翼基因組dna(基因組/轉(zhuǎn)基因dna)仍存在于雜交后代的同一染色體位置處。術(shù)語“事件”還指來自原始轉(zhuǎn)化體和其后代的、包含插入的dna和與插入的dna緊鄰的側(cè)翼基因組序列的dna，該dna預(yù)期會被轉(zhuǎn)移給由于一個(gè)包含插入dna的親本品系(例如原始轉(zhuǎn)化體和通過自交產(chǎn)生的后代)與一個(gè)不包含插入dna的親本品系之間的有性雜交，而接受包括感興趣的轉(zhuǎn)基因在內(nèi)的插入dna的后代?！敖狱c(diǎn)序列”或“邊界序列”跨越下述二者的連接點(diǎn)：插入到基因組內(nèi)的dna；和來自位于該插入點(diǎn)側(cè)翼的棉花天然基因組的dna。鑒定或檢測植物遺傳材料中的任一接點(diǎn)序列(oneortheotherjunctionsequences)足以用來鑒別該事件。跨越本文中描述的棉花事件中的插入點(diǎn)、和相似長度的側(cè)翼dna的dna序列被包括在內(nèi)。本文中提供了這樣的鑒別性序列的具體實(shí)例；然而，其它與各插入物的接點(diǎn)、或各插入物與基因組序列的接點(diǎn)重疊的序列，也能鑒別，并且可以根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案加以使用。本發(fā)明的實(shí)施方案部分地涉及使用這些側(cè)翼、接點(diǎn)和插入序列進(jìn)行事件鑒定。相關(guān)的pcr引物和擴(kuò)增子也包含在本發(fā)明的實(shí)施方案中。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，可以利用使用跨越所插入的dna和其邊界的擴(kuò)增子的pcr分析方法檢測或鑒定從本專有權(quán)轉(zhuǎn)基因棉花品系衍生的商業(yè)化轉(zhuǎn)基因棉花品系或品種。側(cè)翼/接點(diǎn)序列能鑒別棉花事件pdab4468.19.10.3?；谶@些序列，生成了事件特異性的引物。pcr分析表明，通過分析用這些事件特異性引物組產(chǎn)生的pcr擴(kuò)增子，可以在不同棉花基因型中鑒定這些棉花品系。因此，這些和其他相關(guān)的程序可用于唯一地鑒定這些棉花品系。本文中鑒定的序列是唯一的。本發(fā)明實(shí)施方案的檢測技術(shù)可特別用于和植物育種相結(jié)合，用來在為了向后代中引入一個(gè)或多個(gè)額外的感興趣的性狀而將包含感興趣的事件的親本植物與另一種植物品系雜交之后，確定哪個(gè)后代植物包含給定的事件。這些pcr分析方法有利于棉花育種計(jì)劃，以及品質(zhì)控制，尤其是對商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因棉花種子。現(xiàn)在還可以制作和使用用于這些轉(zhuǎn)基因棉花品系的pcr檢測試劑盒。這也有利于產(chǎn)品注冊和產(chǎn)品管理。進(jìn)一步地，側(cè)翼棉花/基因組序列可用于具體鑒定每一個(gè)插入物的基因組位置。這個(gè)信息可用于制作特異針對每個(gè)事件的分子標(biāo)志系統(tǒng)。這些可用于快速育種策略和建立連鎖數(shù)據(jù)。更進(jìn)一步地，側(cè)翼序列信息可用于研究和表征轉(zhuǎn)基因整合過程、基因組整合位點(diǎn)特征、事件分選(sorting)、轉(zhuǎn)基因及其側(cè)翼序列的穩(wěn)定性、和基因表達(dá)(尤其是涉及基因沉默、轉(zhuǎn)基因的甲基化模式、位置效應(yīng)、以及潛在的表達(dá)相關(guān)元件如mars[基質(zhì)結(jié)合區(qū)]，等等)。根據(jù)本公開的所有內(nèi)容，應(yīng)該明確，本發(fā)明的實(shí)施方案包括基于在段落[0032]中示明的atcc登錄號可獲得的種子。本發(fā)明的實(shí)施方案還包括以在段落[0032]中示明的atcc登錄號保藏的種子所種植出的除草劑耐受性棉花植物。本發(fā)明的實(shí)施方案還包括所述植物的部分，例如葉、組織樣品、由所述植物產(chǎn)生的種子、花粉等(其中植物的這些部分包括aad-12和pat，和seqidno：1和2)。更進(jìn)一步，本發(fā)明的實(shí)施方案還包括從所保藏種子種植出的植物的子代和/或后代植物，優(yōu)選地是抗除草劑棉花植物，其中所述植物具有包含如本文中所述的可檢測接點(diǎn)/側(cè)翼序列的基因組。本文中所使用的術(shù)語“棉花”是指陸地棉(gossypiumhirsutum)，包括其能夠用棉花植物育種而得的所有品種。本發(fā)明實(shí)施方案的除草劑耐受性棉花植物可以通過如下所述育種：首先使第一親本棉花植物與第二親本棉花植物進(jìn)行第一次有性雜交，其中第一親本棉花植物由本文中提到的任何一種品系的種子長成的棉花植物構(gòu)成，從而產(chǎn)生多個(gè)第一子代植物；然后選擇抗草胺膦的第一子代植物；使該第一子代植物自交，從而產(chǎn)生多個(gè)第二子代植物；然后從這些第二子代植物中選出抗草胺膦的植物。這些步驟可以進(jìn)一步包括使所述第一子代植物或所述第二子代植物與所述第二親本棉花植物或第三親本棉花植物回交。然后可以種植包含本發(fā)明實(shí)施方案的棉花種子、或其后代的棉花作物。還應(yīng)當(dāng)理解，兩個(gè)不同的轉(zhuǎn)基因植物也可以交配而產(chǎn)生含有兩個(gè)獨(dú)立分離(segregating)、加合的外源基因的后代。合適子代的自交可以產(chǎn)生對兩個(gè)加合的外源基因均為純合的植物。還構(gòu)想了與親本植物的回交和與非轉(zhuǎn)基因植物的異交，以及無性繁殖。其他通常用于不同性狀和作物的育種方法是本領(lǐng)域已知的?；亟挥N已經(jīng)被用于基因轉(zhuǎn)移，以將簡單遺傳的、高度可遺傳的性狀引入到作為輪回親本的期望純合栽培品種中。待轉(zhuǎn)移性狀的來源被稱為供體親本。得到的植物可望具有輪回親本(例如栽培種)的屬性和從供體親本轉(zhuǎn)移而來的期望性狀。最初的雜交之后，選擇具有供體親本表型的個(gè)體，并與輪回親本反復(fù)雜交(回交)。得到的植物可望具有輪回親本(例如栽培種)的屬性和從供體親本轉(zhuǎn)移而來的期望性狀。類似地，本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的除草劑耐受性棉花植物可以使用本領(lǐng)域已知的方法用額外的轉(zhuǎn)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化技術(shù)如土壤桿菌轉(zhuǎn)化、基因槍轉(zhuǎn)化(即基因槍)、和碳化硅介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(即whiskers)，可用于將額外的轉(zhuǎn)基因?qū)氲矫藁ㄊ录dab4468.19.10.3的基因組中?？梢赃M(jìn)行對含有新插入的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物的選擇和表征，以鑒定含有除本發(fā)明實(shí)施方案aad-12和pat基因之外的其他新型轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定整合體的植物。本發(fā)明實(shí)施方案的dna分子可以用作分子標(biāo)志輔助育種(mab)方法中的分子標(biāo)志。本發(fā)明實(shí)施方案的dna分子可以在用于鑒定遺傳連鎖農(nóng)藝有用性狀的方法(例如aflp標(biāo)志、rflp標(biāo)志、rapd標(biāo)志、snp和ssr)中使用，如本領(lǐng)域已知的?？梢允褂胢ab方法在與本發(fā)明實(shí)施方案的棉花植物(或其后代和任何其他棉花栽培品種或變種)的雜交后代中跟蹤除草劑耐受性特性。這些dna分子是此性狀的標(biāo)志，可以使用本領(lǐng)域眾所周知的mab方法在棉花植物——本發(fā)明實(shí)施方案的至少一種棉花品系或其后代在這些植物中是親本或祖先——中跟蹤耐除草劑性狀。本發(fā)明實(shí)施方案的方法可以用于鑒定具有主題事件的任何棉花品種。本發(fā)明實(shí)施方案的方法包括產(chǎn)生抗除草劑的棉花植物的方法，其中所述方法包括用根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的植物育種。更具體地，所述方法可以包括使兩個(gè)本發(fā)明實(shí)施方案的植物雜交，或者使一個(gè)本發(fā)明實(shí)施方案的植物與任何其它植物雜交。優(yōu)選的方法進(jìn)一步包括通過分析所該雜交的子代中可以根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案檢測到的事件和有利的品種性能(例如產(chǎn)量)，來篩選所述雜交的后代。例如，本發(fā)明的實(shí)施方案可用于通過使用包含其它期望性狀(如農(nóng)藝性狀、疾病耐受性或抵抗性、線蟲耐受或抵抗性和成熟日期)的植物進(jìn)行育種循環(huán)對主題事件進(jìn)行跟蹤。包含主題事件和期望性狀的植物可以得到檢測、鑒定、篩選和快速利用，例如在更多輪的育種中利用。主題事件/性狀也可以通過育種與其他的抗昆蟲性狀和/或與其他的抗除草劑性狀結(jié)合，并根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的方法進(jìn)行跟蹤。后者的實(shí)施方案是包含與cry1f和cry1ac基因組合、或與具有編碼對除草劑麥草畏耐受性的基因組合的主題事件的植物，cry1f和crylac基因賦予對豆夜蛾(pseudoplusiaincludens)(大豆尺蠖)、anticarsiagemmatalis(絨毛豆毛蟲)、epinotiaaporema、omoidesindicatus、rachiplusianu，草地夜蛾(spodopterafrugiperda)、斜紋夜蛾(spodopteracosmoides)、亞熱帶粘蟲(spodopteraeridania)、煙芽夜蛾(heliothisvirescens)、美洲棉鈴蟲(heliocoverpazea)、黃色燈蛾蟲(spilosomavirginica)和南美玉米苗斑螟(elasmopalpuslignosellus)的耐受性。因此，本方面的實(shí)施方案可以與編碼下述抗性的性狀組合：草甘膦抗性(例如抗性植物或細(xì)菌的epsps，gox，gat)、草胺膦抗性(例如dsm-2，bar)，乙酰乳酸合酶(als)抑制性除草劑(例如咪唑啉酮[如咪草煙]、磺酰脲類、三唑嘧啶磺苯胺類、嘧啶硫代苯甲酸類(pyrmidinylthiobenzoates)，和其它化學(xué)品[csr1，sura等])抗性、溴苯腈抗性(例如bxn)、hppd(4-羥苯基-丙酮酸-雙加氧酶)酶抑制劑抗性、八氫番茄紅素去飽和酶(pds)抑制劑抗性、光系統(tǒng)ii型除草劑抗性(例如psba)、光系統(tǒng)i型除草劑抗性、原卟啉原氧化酶ix(ppo)抑制型除草劑抗性(例如ppo-1)、苯脲除草劑抗性(例如cyp76b1)、麥草畏降解酶(見例如us20030135879)，和其它可以被單獨(dú)疊加或多重組合的性狀，從而提供有效控制或阻止雜草遷移和/或?qū)θ魏吻笆鲱愋偷某輨┑目剐缘哪芰?。此外，棉花事件pdab4468.19.10.3可以和一種或多種額外的輸入(例如昆蟲抗性、病原體抗性或脅迫耐受性等)或輸出(例如增加的產(chǎn)量、改善的油譜、提高的纖維品質(zhì)等)性狀組合。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案可用于提供一套完整的改良作物品質(zhì)農(nóng)藝包，其能夠靈活而成本高效地控制任意數(shù)量的農(nóng)業(yè)害蟲。通過同源重組將多核苷酸序列整合在植物細(xì)胞中的特定染色體位點(diǎn)上的方法，在本領(lǐng)域中已有描述。例如，如在美國專利申請公開no.2009/0111188a1中描述的位點(diǎn)特異性整合描述了利用重組酶或整合酶介導(dǎo)將供體多核苷酸序列引入到染色體靶中。此外，國際專利申請no.wo2008/021207描述了鋅指介導(dǎo)的同源重組，用于將一個(gè)或多個(gè)供體多核苷酸序列整合到基因組的特定位置?？梢允褂弥亟M酶，例如在美國專利no.6720475中描述的flp/frt或在美國專利no.5,658,772中描述的cre/lox，將多核苷酸序列整合到特定的染色體位點(diǎn)上。最后，使用大范圍核酸酶將供體多核苷酸靶定到特定的染色體位置，在puchtaetal.，pnasusa93(1996)pp.5055-5060中有描述。其它用于在植物細(xì)胞中進(jìn)行位點(diǎn)特異性整合的方法通常是已知的并且是適用的(kumaretal.，trendsinplantsci.6(4)(2001)pp.155-159)。進(jìn)一步，已經(jīng)在多種原核和低等真核微生物中鑒定的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)可以應(yīng)用于植物中。這種系統(tǒng)的實(shí)例包括，但不限于，來自魯氏酵母psr1質(zhì)粒的r/rs重組酶系統(tǒng)(arakietal.(1985)j.mol.biol.182：191-203)和噬菌體mu的gin/gix系統(tǒng)(maeserandkahlmann(1991)mol.gen.genet.230：170-176)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，理想的是，在現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因事件的附近整合或疊加新的轉(zhuǎn)基因。基于獨(dú)特的特征(例如單插入位點(diǎn)、正常的孟德爾分離和穩(wěn)定的表達(dá))和卓越的功效組合(包括除草劑耐受性以及多種環(huán)境場所之內(nèi)或跨越多種環(huán)境場所的農(nóng)藝性能)而選擇的轉(zhuǎn)基因事件，可以認(rèn)為是優(yōu)選的基因組位點(diǎn)。新整合的轉(zhuǎn)基因應(yīng)當(dāng)保持現(xiàn)有的轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)基因表達(dá)特征。而且，由于基因組側(cè)翼序列和新整合事件的染色體位置已經(jīng)被確定，開發(fā)用于檢測和確認(rèn)新整合事件的測定法將不是問題。最后，新的轉(zhuǎn)基因整合到與現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因連鎖的特定染色體位置中，將加快通過使用常規(guī)育種方法的有性異交將轉(zhuǎn)基因向其它遺傳背景的基因滲入。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，理想的是從轉(zhuǎn)基因事件切出多核苷酸序列。例如，如在美國專利申請公開no.2011/0191877中所述的轉(zhuǎn)基因切出，采用鋅指核酸酶從染色體整合的轉(zhuǎn)基因事件中除去由基因表達(dá)盒構(gòu)成的多核苷酸序列。被去除的多核苷酸序列可以是可選擇標(biāo)志。一旦切出并去除多核苷酸序列，可以通過插入多核苷酸序列來重新靶定該經(jīng)過修飾的轉(zhuǎn)基因事件。多核苷酸序列的切出和后續(xù)經(jīng)修飾轉(zhuǎn)基因事件的重靶定可以提供許多好處，例如重復(fù)使用可選擇標(biāo)志物、或能夠克服由于特定基因的表達(dá)導(dǎo)致的對植物轉(zhuǎn)錄組的意外改變。本文公開了棉花基因組中a亞基因組的3號染色體上的特定位點(diǎn)，其對于異源核酸的插入是極為理想的。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案提供了將感興趣的異源核酸導(dǎo)入到該預(yù)先建立的目標(biāo)位點(diǎn)或該目標(biāo)位點(diǎn)附近的方法。本發(fā)明的實(shí)施方案還包括一種棉花種子和/或棉花植物，其包含插入在所公開的目標(biāo)位點(diǎn)中或該位點(diǎn)附近的任何異源核苷酸序列。實(shí)現(xiàn)這種靶向整合的一個(gè)選項(xiàng)是，切出本文中示例的pat表達(dá)盒和/或用不同的插入物代替之。在此可以根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案使用例如靶向同源重組，但不局限于此。如本文中所使用的，基因、事件或特征“疊加”是指將期望的性狀組合到一個(gè)轉(zhuǎn)基因品系中。植物育種者通過將各自具有期望性狀的親本進(jìn)行雜交，然后鑒定同時(shí)具有這些期望性狀的后代，來疊加轉(zhuǎn)基因性狀。另一種疊加基因的方式是在轉(zhuǎn)化期間同時(shí)向植物的細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移兩個(gè)或多個(gè)基因。另一種疊加基因的方式是用另一個(gè)感興趣的基因再次轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因植物。例如，基因疊加可用于組合兩種或更多種不同的特征，包括例如，兩種或更多種不同的昆蟲性狀、昆蟲抗性性狀和疾病抗性性狀，兩種或更多種除草劑抗性性狀，和/或昆蟲抗性性狀和除草劑抗性性狀。在感興趣的基因的基礎(chǔ)上使用可選擇標(biāo)志物也可以視為基因疊加。“同源重組”是指任何在相應(yīng)位置處含有相似核苷酸序列的一對核苷酸序列之間的反應(yīng)，通過該反應(yīng)，這兩個(gè)核苷酸序列能夠相互作用(重組)形成一個(gè)新的重組dna序列。相似核苷酸序列的位點(diǎn)在本文中分別稱為“同源序列”。一般來說，同源重組的頻率隨著同源序列長度的增加而增大。因此，盡管同源重組可以在兩個(gè)不完全相同的核苷酸序列之間發(fā)生，但是重組的頻率(或效率)隨著兩個(gè)序列之間差異性的增加而降低。重組可以用每個(gè)供體上的一個(gè)同源序列和靶分子實(shí)現(xiàn)，從而產(chǎn)生“單交換”重組產(chǎn)物。或者，可將兩個(gè)同源序列放置在每個(gè)靶標(biāo)和供體核苷酸序列上。供體上的兩個(gè)同源序列與靶標(biāo)上的兩個(gè)同源序列之間的重組會產(chǎn)生“雙交換”重組產(chǎn)物。如果供體分子上的同源序列位于待操作序列(例如感興趣的序列)的兩側(cè)，則與靶分子的雙交換重組將產(chǎn)生這樣的重組產(chǎn)物，其中感興趣的序列代替了原本位于靶分子上的同源序列之間的dna序列。通過雙交換重組事件實(shí)現(xiàn)的靶標(biāo)與供體之間的dna序列交換被稱為“序列替代?！北景l(fā)明實(shí)施方案的優(yōu)選植物或種子，在其基因組中含有如本文所鑒定的起作用的aad-12和pat核苷酸序列，以及如本文所鑒定的位于該插入物兩側(cè)的至少20-500個(gè)或更多個(gè)毗鄰的側(cè)翼核苷酸。除非另有說明，否則提到“側(cè)翼序列”是指相對于seqidno：1和2鑒定的那些。這些側(cè)翼序列的全部或一部分可以預(yù)期被轉(zhuǎn)移給由于含有該事件的親本品系的有性雜交而接收被插入的dna的后代。本發(fā)明的實(shí)施方案包括本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的植物的可再生細(xì)胞的組織培養(yǎng)物。此外，還包含從這種組織培養(yǎng)物再生的植物，特別是當(dāng)所述植物能夠表達(dá)一個(gè)示范品種的所有形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特征時(shí)。本發(fā)明實(shí)施方案的優(yōu)選植物具有從所述保藏種子種植的植物的所有生理學(xué)和形態(tài)學(xué)特征。本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)一步包括這種種子的后代和具有感興趣的品質(zhì)性狀的種子的后代。如這里所使用的，“品系”是指個(gè)體之間就至少一個(gè)性狀而言顯示很小或沒有遺傳變異的一群植物。這些品系可以通過數(shù)代的自花授粉和選擇，或者通過使用組織或細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)從單個(gè)親本無性繁殖而獲得。如這里所使用的，術(shù)語“栽培種”和“品種”是同義的，是指用于商業(yè)生產(chǎn)的品系。“穩(wěn)定性”或“穩(wěn)定的”是指，相對于給定的組分，該組分在代與代之間得以保持，優(yōu)選為至少三代。“商業(yè)效用”被定義為具有良好的植物活力和高生育力，使得作物能夠被農(nóng)民用傳統(tǒng)的種植設(shè)備生產(chǎn)，并且能夠使用常規(guī)的破碎和提取設(shè)備從種子中提取具有所述組分的油?！稗r(nóng)藝學(xué)優(yōu)良”是指某個(gè)品系除了由主題事件導(dǎo)致的除草劑耐受性之外，還具有理想的農(nóng)藝性狀，如產(chǎn)量、成熟度、抗病性等。這些農(nóng)藝學(xué)特性和數(shù)據(jù)點(diǎn)中的任何一個(gè)或全部均可用于辨識這樣的植物，無論是作為一個(gè)點(diǎn)還是位于用于限定此類植物的特征范圍的任一端或兩端。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本公開內(nèi)容會想到，檢測試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方案例如可以包括針對和/或包含“接點(diǎn)序列”或“過渡序列”(棉花基因組側(cè)翼序列在此處與插入序列相接)的探針和/或引物。例如，這包括被設(shè)計(jì)用于鑒定一個(gè)或全部兩個(gè)接點(diǎn)序列(插入物在此處與側(cè)翼序列相接)的多核苷酸探針、引物、和/或擴(kuò)增子。一種常見的設(shè)計(jì)是，一個(gè)引物與側(cè)翼區(qū)雜交，一個(gè)引物與插入物雜交。這些引物的長度通常是每個(gè)約至少～15個(gè)殘基。利用這種設(shè)置，可以利用引物生成/擴(kuò)增可檢測的擴(kuò)增子，該擴(kuò)增子指示本發(fā)明實(shí)施方案的事件的存在。這些引物可用于產(chǎn)生跨越(并包括)如上文所指出的接點(diǎn)序列的擴(kuò)增子。在側(cè)翼序列中“觸地(touchingdown)”的引物通常不被設(shè)計(jì)為在超出接點(diǎn)多于大約1200個(gè)堿基之處雜交。因此，典型的側(cè)翼引物將被設(shè)計(jì)為包括任一鏈上從插入物起點(diǎn)開始向側(cè)翼序列中延伸1200個(gè)堿基以內(nèi)的至少15個(gè)殘基。也就是說，包含來自(或者雜交于)seqidno：1的堿基對154-1672和/或seqidno：2的堿基對1-1369的大小合適的序列的引物，在本發(fā)明實(shí)施方案的范圍之內(nèi)。插入物的引物可以類似地設(shè)計(jì)于插入物上的任何地方，但seqidno：3的堿基對1-6287可以非排他性地用于例如此類引物的設(shè)計(jì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員還將會認(rèn)識到，引物和探針可被設(shè)計(jì)成在一定范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)雜交和/或pcr條件下進(jìn)行雜交，其中引物或探針與示例序列不是完美互補(bǔ)。也就是說，某種程度的錯(cuò)配或簡并是可以容忍的。例如，對于約20個(gè)核苷酸的引物，通常一個(gè)或兩個(gè)左右的核苷酸不需要與相反鏈結(jié)合，如果錯(cuò)配的堿基在內(nèi)部或者在引物的相對于擴(kuò)增子的末端的話。下面提供了各種合適的雜交條件。合成的核苷酸類似物，如肌苷，也可以用在探針中。肽核酸(pna)探針、以及dna和rna探針，也可以使用。重要的是，這些探針和引物能鑒別(能夠唯一地鑒定和區(qū)分)本發(fā)明實(shí)施方案的事件的存在。應(yīng)當(dāng)注意的是，pcr擴(kuò)增可能會出現(xiàn)錯(cuò)誤，這可能導(dǎo)致例如輕微的測序錯(cuò)誤。也就是說，除非另有說明，本文中所列出的序列是通過從棉花基因組dna生成長擴(kuò)增子，然后對擴(kuò)增子進(jìn)行克隆和測序而確定的。這種方式產(chǎn)生和確定的多個(gè)序列中發(fā)現(xiàn)細(xì)微的不同和次要的差異并非罕事，考慮到需要多輪擴(kuò)增才能從基因組dna產(chǎn)生足夠的用于測序的擴(kuò)增子。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)會意識到并且注意到，由于這些類型的常見測序錯(cuò)誤或差異而需要進(jìn)行的任何調(diào)整都在本發(fā)明實(shí)施方案的范圍之內(nèi)。還應(yīng)當(dāng)注意，某些基因組序列被刪除并不罕見，例如當(dāng)創(chuàng)建事件的過程中插入某一序列時(shí)。因此，本主題側(cè)翼序列與例如genbank中列出的基因組序列之間也可能出現(xiàn)一些差異。附圖中列舉了dna序列“插入物”的組分，并在下面的實(shí)施例中進(jìn)行了更詳細(xì)的討論。這些組分或其片段的dna多核苷酸序列可以用作本發(fā)明實(shí)施方案的方法的dna引物或探針。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，提供了用于檢測植物和種子等中來自棉花植物的轉(zhuǎn)基因/基因組插入?yún)^(qū)的存在的組合物和方法。提供了這樣的dna序列，它們包括本文中提供的主題5′轉(zhuǎn)基因/基因組插入?yún)^(qū)域接點(diǎn)序列(seqidno：1的堿基對1354/1355之間)、其區(qū)段、和示例序列和其任意區(qū)段的互補(bǔ)物。提供了這樣的dna序列，其包括本文中提供的主題3′轉(zhuǎn)基因/基因組插入?yún)^(qū)域接點(diǎn)序列(seqidno：2的堿基對168/169之間)、其區(qū)段、和示例序列和其任意區(qū)段的互補(bǔ)物。插入?yún)^(qū)接點(diǎn)序列跨越下述二者之間的接點(diǎn)：插入到基因組中的異源dna，和來自棉花細(xì)胞的位于插入位點(diǎn)側(cè)翼的dna。這些序列可能能夠鑒別給定的事件。根據(jù)這些插入物和邊界序列，可以生成事件特異性的引物。pcr分析表明，可以通過分析用這些事件特異性的引物組所產(chǎn)生的pcr擴(kuò)增子，可以在不同棉花基因型中鑒定出本發(fā)明實(shí)施方案的棉花品系。這些和其他相關(guān)程序可用于唯一地鑒定這些棉花品系。因此，從這樣的引物對衍生的pcr擴(kuò)增子是唯一的，并可用于鑒定這些棉花品系。在一些實(shí)施方案中，包含新的轉(zhuǎn)基因/基因組插入?yún)^(qū)域的毗鄰片段的dna序列是本發(fā)明的一個(gè)方面。包括這樣的dna序列，其包含一段足夠長度的轉(zhuǎn)基因插入序列的多核苷酸和一段足夠長度的來自一個(gè)或多個(gè)前述棉花植物的棉花基因組序列的多核苷酸，和/或這樣的序列，它們可用作引物序列，用來產(chǎn)生能鑒別一種或多種這些棉花植物的擴(kuò)增子產(chǎn)物。相關(guān)實(shí)施方案涉及如下的dna序列，其包含在本文中鑒定的dna序列的轉(zhuǎn)基因部分(例如seqidno：1及其區(qū)段)的至少10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25或更多個(gè)毗鄰核苷酸，或其互補(bǔ)物，和類似長度的來自這些序列的側(cè)翼棉花dna序列，或其互補(bǔ)物。這些序列可以在dna擴(kuò)增方法中用作dna引物。使用這些引物產(chǎn)生的擴(kuò)增子能鑒別本文中提到的任何棉花事件。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案還包括由這樣的dna引物產(chǎn)生的擴(kuò)增子。本發(fā)明的實(shí)施方案還包括用于檢測樣品中對應(yīng)于本文中提到的棉花事件的dna的存在的方法。這些方法可以包括：(a)使包含dna的樣品與引物組接觸，該引物組在被用于使用來自所述棉花事件的dna進(jìn)行的核酸擴(kuò)增反應(yīng)中時(shí)，產(chǎn)生能鑒別該事件的擴(kuò)增子；(b)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生擴(kuò)增子；和(c)檢測該擴(kuò)增子。本發(fā)明實(shí)施方案進(jìn)一步的檢測方法包括檢測樣品中對應(yīng)于所述事件的dna的存在的方法，其中所述方法包括：(a)使包含dna的樣品與探針接觸，該探針在嚴(yán)格雜交條件下會與來自所述棉花事件的dna雜交，并且在嚴(yán)格雜交條件下不會與對照棉花植物(非感興趣的事件dna)雜交；(b)將該樣品和該探針置于嚴(yán)格的雜交條件下；和(c)檢測該探針與所述dna的雜交。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括產(chǎn)生包含本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的棉花事件pdab4468.19.10.3的棉花植物的方法，其中所述方法包括如下的步驟：(a)將第一親本棉花品系(包含本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的表達(dá)盒，該表達(dá)盒賦予所述品系的植物對2，4-d和草胺膦的耐受性)和第二親本棉花品系(其缺少上述除草劑耐受性性狀)有性雜交，從而產(chǎn)生多個(gè)后代植物；和(b)通過使用分子標(biāo)志物對所述后代植物進(jìn)行選擇。這些方法可以任選地包括使所述后代植物與第二親本棉花品系回交，從而產(chǎn)生包含抗除草劑性狀的純育(true-breeding)棉花植物的額外步驟。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用于確定與所述事件的雜交的后代的合子型(zygosity)的方法。所述方法可以包括使包含棉花dna的樣品與本發(fā)明實(shí)施方案的引物組接觸。所述的引物當(dāng)被用于與來自所述棉花事件的基因組dna進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，可產(chǎn)生能鑒別所述棉花事件的第一擴(kuò)增子。這些方法進(jìn)一步包括進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生所述第一擴(kuò)增子；檢測所述第一擴(kuò)增子；和使包含棉花dna的樣品與第二引物組接觸(所述第二引物組當(dāng)被用于與來自棉花植物的基因組dna進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，可產(chǎn)生第二擴(kuò)增子，該第二擴(kuò)增子含有天然棉花基因組的內(nèi)源序列，且不含有所述事件的多核苷酸序列)；和進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生所述第二擴(kuò)增子。該方法還包括檢測第二擴(kuò)增子，并比較樣品中的第一和第二擴(kuò)增子，其中兩個(gè)擴(kuò)增子的存在表明轉(zhuǎn)基因插入的合子型?？梢允褂帽疚墓_的組合物和dna檢測領(lǐng)域公知的方法開發(fā)dna檢測試劑盒。該試劑盒可用于鑒定樣品中的主題棉花事件，并可應(yīng)用于含有該dna的棉花植物的育種方法。該試劑盒含有與例如本文所公開的擴(kuò)增子互補(bǔ)的dna序列，或者含有與和主題事件的轉(zhuǎn)基因遺傳元件中所含有的dna互補(bǔ)的dna序列互補(bǔ)的dna序列。這些dna序列可以用于dna擴(kuò)增反應(yīng)或者作為dna雜交方法中的探針。該試劑盒還可以含有實(shí)施該檢測方法必需的試劑和材料。“探針”是一種分離的核酸分子，其附接有常規(guī)的可檢測標(biāo)記物或報(bào)告分子(例如放射性同位素、配體、化學(xué)發(fā)光劑或酶)。這種探針能夠與靶核酸的鏈雜交，在本發(fā)明實(shí)施方案的情況下，能夠與來自所述棉花事件之一(不管是來自棉花植物還是來自含有該事件dna的樣品)的基因組dna的鏈雜交。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的探針不僅包括脫氧核糖核酸或核糖核酸，還包括特異結(jié)合靶dna序列并能夠用于檢測該靶dna序列之存在的聚酰胺和其它探針材料?！耙铩笔欠蛛x的/合成的核酸，其通過核酸雜交與靶dna鏈退火，從而形成引物和靶dna鏈之間的雜交體，然后在聚合酶，例如dna聚合酶的作用下沿著靶dna鏈延伸。本發(fā)明實(shí)施方案的引物對，是指它們用于擴(kuò)增靶核酸序列，例如通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)或其它常規(guī)的核酸擴(kuò)增方法對擴(kuò)增靶核酸序列的用途。探針和引物的長度通常為5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，294，295，296，297，298，299，300，301，302，303，304，305，306，307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，320，321，322，323，324，325，326，327，328，329，330，331，332，333，334，335，336，337，338，339，340，341，342，343，344，345，346，347，348，349，350，351，352，353，354，355，356，357，358，359，360，361，362，363，364，365，366，367，368，369，370，371，372，373，374，375，376，377，378，379，380，381，382，383，384，385，386，387，388，389，390，391，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，402，403，404，405，406，407，408，409，410，411，412，413，414，415，416，417，418，419，420，421，422，423，424，425，426，427，428，429，430，431，432，433，434，435，436，437，438，439，440，441，442，443，444，445，446，447，448，449，450，451，452，453，454，455，456，457，458，459，460，461，462，463，464，465，466，467，468，469，470，471，472，473，474，475，476，477，478，479，480，481，482，483，484，485，486，487，488，489，490，491，492，493，494，495，496，497，498，499，500，或1000，或2000，或5000個(gè)多核苷酸或者更長。這些探針和引物在嚴(yán)格雜交條件下特異性雜交于靶序列。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的探針和引物與靶序列具有完全的序列相似性，盡管通過常規(guī)方法也可以設(shè)計(jì)出與靶序列不同但保持與靶序列雜交的能力的探針。用于制備和使用探針和引物的方法在例如molecularcloning：alaboratorymanual，第二版，第1-3卷，sambrook等編輯，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.，1989中有描述。pcr引物對可以使用例如用于該目的的計(jì)算機(jī)程序從已知的序列產(chǎn)生?；诒疚闹泄_的側(cè)翼dna和插入序列的引物和探針可用于通過常規(guī)方法確認(rèn)(并且，如果需要的話，修正)公開的序列，例如，通過對這些序列進(jìn)行重克隆和測序。本發(fā)明實(shí)施方案的核酸探針和引物在嚴(yán)格條件下與靶dna序列雜交。任何常規(guī)的核酸雜交或擴(kuò)增方法均可用于鑒定樣品中來自轉(zhuǎn)基因事件的dna的存在。在特定情況下，核酸分子或其片段能夠與其他的核酸分子特異性雜交。如本文所使用的，如果兩個(gè)分子能夠形成反平行的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，則可以說這兩個(gè)核酸分子能夠彼此特異性雜交。如果兩個(gè)核酸分子顯示出完全的互補(bǔ)性，則稱一個(gè)核酸分子是另一個(gè)核酸分子的“互補(bǔ)物”。如本文所使用的，當(dāng)一個(gè)分子的每一個(gè)核苷酸都與另一個(gè)分子的核苷酸互補(bǔ)時(shí)，則可以說分子表現(xiàn)出“完全互補(bǔ)性”。顯示完全互補(bǔ)性的分子通常會以足夠的穩(wěn)定性彼此雜交，穩(wěn)定性足以允許它們在常規(guī)的“高嚴(yán)格性”條件下保持彼此退火。常規(guī)的高嚴(yán)格性條件如sambrooketal.，1989所述。如果兩個(gè)分子能夠彼此雜交并且在至少常規(guī)的“低嚴(yán)格性”條件具有足夠的穩(wěn)定性以允許它們保持彼此退火，則稱兩個(gè)分子顯示“最小互補(bǔ)性”。常規(guī)的低嚴(yán)格性條件如sambrooketal.，1989所述。核酸分子只需要表現(xiàn)出序列的最小互補(bǔ)性，以便能夠在所用的特定溶劑和鹽濃度下形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，就能夠用作引物或探針。術(shù)語“嚴(yán)格條件”或“嚴(yán)格性條件”是關(guān)于核酸探針與靶核酸雜交(即，與感興趣的特定核酸序列雜交)的功能性定義，該雜交通過sambrooketal.，1989在9.52-9.55中討論的特定雜交程序?qū)嵤?。另外見sambrooketal.，1989的9.47-9.52和9.56-9.58。取決于預(yù)期的應(yīng)用，可以使用不同條件的嚴(yán)格條件或探針或引物的多核苷酸序列簡并性，以實(shí)現(xiàn)對靶序列不同程度的雜交選擇性。對于要求高選擇性的應(yīng)用，通常會采用相對嚴(yán)格的條件來雜交一個(gè)多核苷酸序列與第二個(gè)多核苷酸序列，例如，會選擇相對低鹽和/或高溫條件，例如大約0.02m-大約0.15mnacl和大約50℃-大約70℃的溫度。嚴(yán)格條件，例如，可能涉及用高嚴(yán)格性清洗緩沖液(0.2×ssc，0.1％sds，65℃)至少清洗雜交濾膜兩次。促進(jìn)dna雜交的合適嚴(yán)格條件，例如，6.0x檸檬酸鈉/氯化銨(ssc)，大約45℃，隨后用50℃的2.0xssc清洗，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，在清洗步驟中的鹽濃度可以從約2.0xssc，50℃的低嚴(yán)格性到大約0.2xssc，50℃的高嚴(yán)格性中進(jìn)行選擇。另外，清洗步驟中的溫度可以從低嚴(yán)格條件的室溫、大約約22℃增加到高嚴(yán)格條件的大約65℃?？梢宰兓瘻囟群望}二者，或者可以保持溫度或鹽濃度恒定，而改變另一個(gè)變量。這種選擇條件可容忍探針與模板或靶鏈之間的很小的(如果有的話)錯(cuò)配。通過雜交檢測dna序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，美國專利nos.4,965,188和5,176,995的教導(dǎo)是雜交分析方法的實(shí)例。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的核酸會在高嚴(yán)格度條件下與一個(gè)或多個(gè)本文舉例或建議的引物(或擴(kuò)增子或其他序列)，包括其互補(bǔ)物或片段，特異性雜交。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的標(biāo)志物核酸分子具有本文在一個(gè)或多個(gè)示例序列中表示的核酸序列，或其互補(bǔ)物和/或片段。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的標(biāo)志物核酸分子與這樣的核酸序列具有80％-100％或90％和100％的序列同一性。在本發(fā)明進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的標(biāo)記核酸分子與這樣的序列具有95％-100％的序列同一性。這樣的序列可以在植物育種方法中用作標(biāo)志物，以鑒定遺傳雜交的后代。探針與靶dna分子的雜交可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多方法中的任一種進(jìn)行檢測；包括但不限于，熒光標(biāo)簽、放射性標(biāo)簽、基于抗體的標(biāo)簽和化學(xué)發(fā)光標(biāo)簽。關(guān)于使用特定擴(kuò)增引物對的靶核酸序列的擴(kuò)增(例如通過pcr)，“嚴(yán)格條件”是允許引物對僅與這樣的靶核酸序列雜交的條件：具有相應(yīng)野生型序列(或其互補(bǔ)物)的引物會與該靶核酸序列結(jié)合，并優(yōu)選地產(chǎn)生獨(dú)特的擴(kuò)增產(chǎn)物——擴(kuò)增子。術(shù)語“對...(靶序列)特異性”是指，探針或引物在嚴(yán)格雜交條件下僅與包含靶序列的樣品中的靶序列雜交。如本文中所使用的，“擴(kuò)增的dna”或“擴(kuò)增子”是指，作為核酸模板一部分的靶核酸序列的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物。例如，為了確定由于有性雜交而產(chǎn)生的棉花植物是否含有來自本發(fā)明實(shí)施方案的棉花植物的轉(zhuǎn)基因事件基因組dna，可以對從棉花植物組織樣品提取的dna進(jìn)行核酸擴(kuò)增方法，其使用的引物對包括來自植物基因組中與所插入異源dna的插入位點(diǎn)相鄰的側(cè)翼序列的引物，和來自所插入異源dna的第二引物，從而產(chǎn)生能鑒別該事件dna的存在的擴(kuò)增子。擴(kuò)增子的長度及其具有的序列也能鑒別該事件。擴(kuò)增子的長度可以改變，從長度等于引物對的總長加一個(gè)核苷酸堿基對，到長度等于引物對的總長加上大約2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，294，295，296，297，298，299，300，301，302，303，304，305，306，307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，320，321，322，323，324，325，326，327，328，329，330，331，332，333，334，335，336，337，338，339，340，341，342，343，344，345，346，347，348，349，350，351，352，353，354，355，356，357，358，359，360，361，362，363，364，365，366，367，368，369，370，371，372，373，374，375，376，377，378，379，380，381，382，383，384，385，386，387，388，389，390，391，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，402，403，404，405，406，407，408，409，410，411，412，413，414，415，416，417，418，419，420，421，422，423，424，425，426，427，428，429，430，431，432，433，434，435，436，437，438，439，440，441，442，443，444，445，446，447，448，449，450，451，452，453，454，455，456，457，458，459，460，461，462，463，464，465，466，467，468，469，470，471，472，473，474，475，476，477，478，479，480，481，482，483，484，485，486，487，488，489，490，491，492，493，494，495，496，497，498，499，or500，750，1000，1250，1500，1750，2000或更多個(gè)核苷酸堿基對(加上或減去任意上述列舉的增量)。或者，引物對可以來自于插入dna兩側(cè)的側(cè)翼序列，從而產(chǎn)生一個(gè)包含整個(gè)插入核苷酸序列的擴(kuò)增子。從植物基因組序列衍生的引物對的成員可能位于與插入的dna序列有一定距離之處。這個(gè)距離的范圍可以從1個(gè)核苷酸堿基對到大約兩萬個(gè)核苷酸堿基對。使用的“擴(kuò)增子”一詞，明確排除可能在dna熱擴(kuò)增反應(yīng)中形成的引物二聚體。核酸擴(kuò)增可以通過任何本領(lǐng)域已知的各種核酸擴(kuò)增方法實(shí)現(xiàn)，包括聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)。多種擴(kuò)增方法是本領(lǐng)域已知的，并且特別在美國專利no.4683195和美國專利no.4,683,202中有描述。pcr擴(kuò)增方法已經(jīng)被發(fā)展用來擴(kuò)增高達(dá)22kb的基因組dna。這些方法以及dna擴(kuò)增領(lǐng)域中已知的其它方法可用于本發(fā)明實(shí)施方案的實(shí)施。來自主題棉花事件的異源轉(zhuǎn)基因dna插入物的序列或側(cè)翼基因組序列可以如下進(jìn)行驗(yàn)證(以及，如果有必要，校正)：使用從本文提供的序列衍生的引物從該事件擴(kuò)增此類序列，隨后對pcr擴(kuò)增子或克隆的dna進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)dna測序。通過這些方法產(chǎn)生的擴(kuò)增子可以通過多種技術(shù)來檢測。瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色是檢測dna擴(kuò)增子的公知方法。另一種這樣的方法是遺傳位分析(geneticbitanalysis)，其中設(shè)計(jì)一個(gè)與相鄰的側(cè)翼基因組dna序列和插入的dna序列均重疊的dna寡核苷酸。將該寡核苷酸固定在微孔板的孔中。對感興趣的區(qū)域進(jìn)行pcr(使用插入序列中的一個(gè)引物和相鄰側(cè)翼基因組序列中的一個(gè)引物)之后，單鏈pcr產(chǎn)物可以和該固定的寡核苷酸雜交，并作為模板，使用dna聚合酶和特異針對所預(yù)期的下一個(gè)堿基的標(biāo)記ddntp進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)。通過對熒光信號的量進(jìn)行定量，可以完成對結(jié)合產(chǎn)物的分析。熒光信號指示由于成功的擴(kuò)增、雜交和單堿基延伸造成的插入/側(cè)翼序列的存在。另一種方法是焦磷酸測序技術(shù)，如winge(innov.pharma.tech.00：18-24，2000)所述。在該方法中，設(shè)計(jì)與相鄰的基因組dna和插入dna的接點(diǎn)重疊的寡核苷酸。該寡核苷酸被設(shè)計(jì)成與來自感興趣的區(qū)域的單鏈pcr產(chǎn)物雜交(一個(gè)引物位于插入序列中，一個(gè)引物位于側(cè)翼基因組序列中)，并在dna聚合酶、atp、硫酸化酶、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶(apyrase)、腺苷5′磷酰硫酸和熒光素的存在下進(jìn)行溫育。分別添加dntp，摻入導(dǎo)致光信號，光信號被測量。光信號指示由于成功的擴(kuò)增、雜交和單或多堿基延伸造成的轉(zhuǎn)基因插入/側(cè)翼序列的存在。熒光偏振是另一種可用于檢測本發(fā)明的實(shí)施方案的擴(kuò)增子的方法。根據(jù)這種方法，設(shè)計(jì)成與基因組側(cè)翼和插入dna接點(diǎn)重疊的寡核苷酸。該寡核苷酸與來自感興趣的區(qū)域的單鏈pcr產(chǎn)物雜交(一個(gè)引物位于插入dna中，一個(gè)引物位于側(cè)翼基因組序列中)，并在dna聚合酶和熒光標(biāo)記的ddntp的存在下進(jìn)行溫育。單堿基延伸導(dǎo)致ddntp的摻入。熒光標(biāo)記的ddntp的摻入可以作為偏振變化用熒光儀加以測量。偏振的變化指示由于成功的擴(kuò)增、雜交、和單堿基延伸造成的轉(zhuǎn)基因插入/側(cè)翼序列的存在。(peappliedbiosystems，fostercity，calif.)是檢測和定量dna序列的存在的方法。簡要地說，設(shè)計(jì)與基因組側(cè)翼和插入dna接點(diǎn)重疊的fret寡核苷酸探針。將fret探針和pcr引物(一個(gè)引物位于插入dna序列中，一個(gè)位于側(cè)翼基因組序列中)在熱穩(wěn)定的聚合酶和dntp的存在下循環(huán)。在特定的擴(kuò)增期間，taqdna聚合酶的校對機(jī)構(gòu)從fret探針的淬滅部分上釋放出熒光部分。熒光信號指示由于成功的擴(kuò)增和雜交造成的側(cè)翼/轉(zhuǎn)基因插入序列的存在。分子信標(biāo)(molecularbeacon)已經(jīng)被描述用于多核苷酸序列的檢測。簡要地說，設(shè)計(jì)與側(cè)翼基因組和插入dna接點(diǎn)重疊的fret寡核苷酸探針。fret探針的獨(dú)特結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其含有二級結(jié)構(gòu)，該二級結(jié)構(gòu)保持熒光部分和淬滅部分緊密接近。將fret探針和pcr引物(一個(gè)引物位于插入dna序列中，一個(gè)位于側(cè)翼基因組序列中)在熱穩(wěn)定的聚合酶和dntp的存在下進(jìn)行循環(huán)。在成功的pcr擴(kuò)增之后，fret探針與靶序列的雜交導(dǎo)致探針二級結(jié)構(gòu)的除去和熒光部分和淬滅部分在空間上的分離。結(jié)果產(chǎn)生熒光信號。熒光信號指示由于成功的擴(kuò)增和雜交造成的側(cè)翼基因組/轉(zhuǎn)基因插入序列的存在。在公開了棉花基因組中的一個(gè)非常適于插入的位置的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的實(shí)施方案還包括在該基因組位置附近的區(qū)域內(nèi)含有至少一個(gè)非棉花事件pdab4468.19.10.3插入物的棉花種子和/或棉花植物。一個(gè)選擇是用其他不同的插入物代替來自本文例舉的棉花事件pdab4468.19.10.3的插入物。一般情況下，在特定的實(shí)施方案中采用，例如，靶向同源重組。此類技術(shù)是，例如，wo03/080809a2及相應(yīng)公布的美國申請(us20030232410)的主題。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案包括如下的植物和植物細(xì)胞，其含有異源插入物(代替或連同aad-12或pat基因的多個(gè)拷貝)，異源插入物的兩側(cè)是本文所鑒定的全部側(cè)翼序列的或可識別的部分(seqidno：1的bp1-1354和seqidno：2的bp169-2898)。aad-12或pat基因的一個(gè)額外拷貝(或多個(gè)額外拷貝)也可以通過這種/這些方式作為插入用的靶標(biāo)。下面的實(shí)施例被包括用于舉例說明用于實(shí)施本發(fā)明實(shí)施方案的程序，和證明本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案。這些實(shí)施例不應(yīng)被理解為具有限制意義。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)意識到，下面實(shí)施例中公開的技術(shù)只是代表用于例證其實(shí)踐的優(yōu)選模式的特定方法。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)，根據(jù)本公開，認(rèn)識到，在不背離本發(fā)明精神和范圍的前提下，可以對這些具體實(shí)施方案進(jìn)行許多變化，而仍然能夠獲得相同或類似的結(jié)果。除非另有說明，否則所有的百分比都是按重量計(jì)，所有溶劑混合物的比例均為體積比。除非另有說明，使用如下的縮寫。bp堿基對℃攝氏度dna脫氧核糖核酸edta乙二胺四乙酸kb千堿基μg微克μl微升ml毫升m摩爾量(molarmass)pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ptu植物轉(zhuǎn)錄單元或表達(dá)盒sds十二烷基硫酸鈉ssc含有氯化鈉和檸檬酸鈉混合物的緩沖溶液，ph7.0tbe含有tirs堿、硼酸和edta混合物的緩沖溶液，ph8.3實(shí)施例實(shí)施例1：aad-12和pat棉花事件pdab4468.19.10.3的轉(zhuǎn)化和選擇通過土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、并使用含有草胺膦的培養(yǎng)基進(jìn)行選擇，產(chǎn)生含有棉花事件pdab4468.19.10.3的轉(zhuǎn)基因棉花(陸地棉gossypiumhirsutum)。使用去甲(disarmed)土壤桿菌菌株eha101(hoodetal.，1993)啟動棉花植物品種coker310的轉(zhuǎn)化，上述菌株攜帶雙元載體pdab4468(圖1)，該載體在t-鏈dna區(qū)中含有可選擇標(biāo)志物pat和感興趣的基因aad-12。pdab4468的dnat-鏈序列在seqidno：3中示出，且在下面表1中有注釋。表1：位于pdab4468上的基因元件實(shí)施例2：來自棉花事件pdab4468.19.10.3的aad-12蛋白的表征對來自轉(zhuǎn)基因棉花事件pdab4468.19.10.3的重組aad-12蛋白的生物化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了表征。使用定量酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)表征蛋白的生物化學(xué)性質(zhì)并確認(rèn)aad-12蛋白的表達(dá)。確定了棉花事件pdab4468.19.10.3中aad-12蛋白的水平。從試驗(yàn)植物中分離了棉葉組織樣品，并準(zhǔn)備用于表達(dá)分析。用含有去污劑brij-56tm(sigma-aldrich，st.louis，mo)的tris-hcl溶液從棉花植物組織中提取aad-12蛋白。對植物組織進(jìn)行離心；收集水相上清液，根據(jù)需要用適當(dāng)?shù)木彌_液稀釋，并用aad-12elisa試劑盒(beacondiagnostics，eastfalmouth，ma)以夾心模式進(jìn)行分析。該試劑盒按照制造商建議的規(guī)程使用。進(jìn)行檢測分析以研究棉花事件pdab4468.19.10.3的表達(dá)穩(wěn)定性和縱向(兩代之間)和橫向(同代的世系之間)的可遺傳性。棉花事件pdab4468.19.10.3的aad-12蛋白的表達(dá)穩(wěn)定(不分離)并且在所有世系之間恒定。對溫室種植的棉花事件pdab4468.19.10.3植物確定了aad-12蛋白表達(dá)水平的垂直比較(世代之間)。表達(dá)水平在t3-t4代一致并且穩(wěn)定，平均表達(dá)水平為大約110-125ng/cm2的分離的aad-12蛋白質(zhì)。對田間種植的棉花事件pdab4468.19.10.3植物確定了aad-12蛋白表達(dá)水平的水平比較(相同世代的世系之間)。對數(shù)株t4代棉花事件pdab4468.19.10.3植物進(jìn)行了田間表達(dá)水平研究。蛋白表達(dá)的平均水平一致并且穩(wěn)定，大約為50-150ng/cm2的分離的aad-12蛋白質(zhì)。實(shí)施例3：棉花事件pdab4468.19.10.3的基因組側(cè)翼邊界區(qū)域的克隆和表征分離、克隆并表征了鄰近棉花事件pdab4468.19.10.3t-鏈插入物的基因組側(cè)翼邊界區(qū)。為了表征邊界區(qū)和描述基因組插入位點(diǎn)，分離了棉花事件pdab4468.19.10.3的基因組側(cè)翼區(qū)，其包括5’基因組側(cè)翼邊界區(qū)序列(seqidno：1)的1，354bp和3’基因組側(cè)翼邊界區(qū)序列(seqidno：2)的2,730bp。5’基因組側(cè)翼邊界序列被發(fā)現(xiàn)含有高度重復(fù)序列，這些序列在確認(rèn)5’基因組側(cè)翼邊界序列的基因組序列時(shí)產(chǎn)生了技術(shù)上的困難。3’邊界序列使用轉(zhuǎn)基因特異性引物和基因組引物進(jìn)行了確認(rèn)。用棉花事件pdab4468.19.10.3的基因組側(cè)翼邊界序列對ncbi核苷酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了blast，以確認(rèn)這些區(qū)域是棉花來源的。3′側(cè)翼邊界的blast表明，該序列與單個(gè)的bac克隆(陸地棉(gossypiumhirsutum)mx008c17)部分對齊。進(jìn)一步，blast搜索表明，棉花事件pdab4468.19.10.3位于棉花基因組a亞基因組的3號染色體上?？傊?，對棉花事件pdab4468.19.10.3基因組側(cè)翼邊界序列的表征表明，在棉花基因組中存在來自pdab4468的t-鏈的一個(gè)拷貝。實(shí)施例3.1：棉花基因組序列的確認(rèn)為了確認(rèn)棉花事件pdab4468.19.10.3的基因組插入位點(diǎn)的序列，用不同的引物對進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)(圖2和表2和表3)。使用來自棉花事件pdab4468.19.10.3的基因組dna、和來自其它轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因棉花對照品系的基因組dna作為模板。反應(yīng)使用lataq試劑盒(takara，日本)。表2：用于分析棉花事件pdab4468.19.10.3的pcr引物和序列表3：用于擴(kuò)增棉花事件pdab4468.19.10.3中的邊界區(qū)域和事件特異性序列的pcr條件和反應(yīng)混合物對5′基因組側(cè)翼邊界序列進(jìn)行pcr擴(kuò)增和測序。這些反應(yīng)使用aad-12表達(dá)盒特異性引物(例如，5endt1，5endt2和5endt3)和根據(jù)從棉花基因組獲得的克隆的5′末端邊界序列設(shè)計(jì)的引物(例如，5endg1和5endg2和5endg3)，來擴(kuò)增跨越aad-12基因和5′端基因組側(cè)翼邊界序列的基因組dna區(qū)段。類似地，為了確認(rèn)所克隆的3′端基因組側(cè)翼邊界序列，使用pat表達(dá)盒特異性引物(例如，3endt1，3endt2和3endt3)和根據(jù)所克隆的3′末端邊界序列設(shè)計(jì)的引物(例如，3endg1，3endg2和3endg3)，擴(kuò)增了跨越pat基因和3′端基因組側(cè)翼邊界序列的基因組dna片段。使用每個(gè)引物對(一個(gè)位于棉花事件pdab4468.19.10.3的側(cè)翼邊界上的引物，和一個(gè)轉(zhuǎn)基因特異性引物)從棉花事件pdab4468.19.10.3的基因組dna擴(kuò)增出了預(yù)期大小的dna片段。對照樣品(其它轉(zhuǎn)基因棉花品系或者非轉(zhuǎn)基因棉花，coker310對照)使用這些引物沒有產(chǎn)生pcr擴(kuò)增子。將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物亞克隆到質(zhì)粒中并測序。利用這個(gè)數(shù)據(jù)來確定與棉花事件pdab4468.19.10.3t-鏈插入物相鄰的5′和3′基因組側(cè)翼邊界序列。實(shí)施例4：通過southern印跡表征棉花事件pdab4468.19.10.3使用southern印跡分析來建立棉花事件pdab4468.19.10.3的整合模式。這些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)證明了aad-12和pat轉(zhuǎn)基因在棉花基因組中的整合以及完整性。棉花事件pdab4468.19.10.3被表征為一個(gè)全長、簡單整合事件，含有來自質(zhì)粒pdab4468的aad-12和pat表達(dá)盒的單個(gè)拷貝。southern印跡數(shù)據(jù)提示，t-鏈片段插入到了棉花事件pdab4468的基因組中。使用特異性針對包含在pdab4468的t-鏈整合區(qū)內(nèi)的aad-12和pat基因的探針、和描述性的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行了詳細(xì)的southern印跡分析，這些酶在所述質(zhì)粒中具有切割位點(diǎn)，并產(chǎn)生質(zhì)粒內(nèi)雜交片段或跨越質(zhì)粒與棉花基因組dna接點(diǎn)的片段(邊界片段)。從southern雜交可見的限制性內(nèi)切酶和探針的組合的分子量對該事件是唯一的，并建立了該事件的鑒定模式。這些分析還表明，pdab4468的t-鏈片段已經(jīng)被插入到棉花基因組dna中，而不存在aad-12或pat表達(dá)盒的重排。實(shí)施例4.1：棉花葉樣品收集和基因組dna分離從收獲自含有棉花事件pdab4468.19.10.3的個(gè)體棉花植物的葉組織中提取基因組dna。此外，從常規(guī)棉花植物coker310分離了gdna，coker310包含用于轉(zhuǎn)化的棉花品系的代表性遺傳背景，并且不含有aad-12或pat基因。使用qiagenminiprepdna提取(qiagen，ca)按照經(jīng)過改良的制造商方案從冷凍干燥的葉組織提取個(gè)體基因組dna。提取之后，使用pico試劑(invitrogen，carlsbad，ca)并用設(shè)備(invitrogen)對dna進(jìn)行熒光光譜定量分析。然后在瓊脂糖凝膠上使dna可視化，以確認(rèn)pico分析的值并確定dna品質(zhì)。實(shí)施例4.2：gdna消化和分離為了棉花事件pdab4468.19.10.3的southern印跡表征，對10微克(10μg)基因組dna進(jìn)行消化。通過向每個(gè)dna樣品添加大約10單位選定的限制性內(nèi)切酶/μgdna和相應(yīng)的反應(yīng)緩沖液，消化來自棉花事件pdab4468.19.10.3和非轉(zhuǎn)基因棉花品系coker310的基因組dna。將每個(gè)樣品在約37℃下溫育過夜。將限制性內(nèi)切酶nsii，ncoi，sbfli，swai，和ndei(newenglandbiolabs，ipswich，ma)單獨(dú)用于消化反應(yīng)。此外，通過將質(zhì)粒dnapdab4468與來自非轉(zhuǎn)基因棉花品種coker310的基因組dna混合來制備陽性雜交對照樣品。使用與測試樣品相同的程序和限制性內(nèi)切酶消化質(zhì)粒dna/基因組dna雞尾酒。將消化體系過夜溫育后，添加終濃度至0.1m的nacl來終止酶消化反應(yīng)。用異丙醇沉淀經(jīng)過消化的dna樣品。將沉淀的dna離心沉淀重懸于15μl3x上樣緩沖液(0.01％溴酚藍(lán)、10.0mmedta、5.0％甘油、1.0mmtrisph7.5)中。然后在0.85％瓊脂糖凝膠上，用0.4xtae緩沖液(fisherscientific，pittsburgh，pa)以45伏對dna樣品和分子量標(biāo)記物電泳大約18-22小時(shí)，實(shí)現(xiàn)片段分離。用溴化乙錠(invitrogen，carlsbad，ca)對凝膠進(jìn)行染色，并在紫外(uv)光下將dna可視化。實(shí)施例4.3：southern轉(zhuǎn)移和膜處理southern印跡基本上如memelink，j.，swords，k.，harryj.，hoge，c.，(1994)southern，northern，andwesternblotanalysis.plantmol.biol.manualf1：1-23所述實(shí)施。簡而言之，電泳分離和可視化dna片段之后，用1x變性溶液(1.5mnaoh，20mmedta)將凝膠變性20分鐘整，然后用1x中和溶液(1.5mnapo4，ph7.8)清洗至少20分鐘。使用芯吸(wicking)系統(tǒng)，用1x轉(zhuǎn)膜液(0.25m焦磷酸鈉，ph10)使用尼龍膜進(jìn)行過夜southern轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移之后，通過將膜在65℃加熱1小時(shí)或通過uv交聯(lián)使dna與膜結(jié)合，隨后用1x轉(zhuǎn)膜液短暫清洗膜。這個(gè)處理過程產(chǎn)生了準(zhǔn)備好用于雜交的southern印跡膜。實(shí)施例4.4：dna探針標(biāo)記和雜交用p32放射性標(biāo)記的探針檢測與尼龍膜結(jié)合的dna片段。探針是通過基于pcr的方法，使用特異性針對基因元件的引物、并按照taq聚合酶(qiagen，ca)的標(biāo)準(zhǔn)制造商程序生成的。按照制造商的說明使用readytogolabeling(amersham，piscataway，nj)，用p32標(biāo)記50ng特異針對每個(gè)基因元件的探針dna和25ng1kbplus分子量梯(ladder)(invitrogen，carlsbad，ca)。使用amersham生產(chǎn)的nucleotide旋柱，并遵循制造商的實(shí)驗(yàn)方案純化探針。在添加p32放射性標(biāo)記的探針之前，用封閉緩沖液(2％sds，0.5％bsa，1mmedta，1mm鄰二氮菲)在室溫下在振蕩器上將含有固定的dna的尼龍膜印跡封閉至少2小時(shí)，然后用10mlperfecthybplus(sigma-aldrich，st.louis，mo)在65℃在雜交爐中進(jìn)行預(yù)雜交至少1小時(shí)。純化的標(biāo)記探針在沸水浴中變性5分鐘，在冰上放置5分鐘，然后加入到經(jīng)封閉和預(yù)雜交的膜上，并在雜交爐中在65℃下放置過夜。探針雜交之后，將探針溶液丟棄到放射性廢物中。將膜印跡在它們原來的雜交管中用1xribowashtm：(200mm磷酸鈉，50mm焦磷酸鈉，10mmedta，2％sds，ph至7.8)清洗緩沖液在65℃雜交爐中清洗2次，每次15分鐘。按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序，將每次清洗液丟棄到放射性廢液中。從試管中取出膜，并置于干凈的漂洗托盤上，并再次在震蕩溫育器上在65℃額外清洗15分鐘。用塑料膜包裹膜，置于膠片暗盒(filmcassette)中，并暴露于感光成像儀(phoshorimager)屏1-3天。使用bioradpersonalfxphosphor并按照設(shè)備和軟件的指導(dǎo)進(jìn)行圖像獲取。表4中描述了用于雜交的探針。使用1kbplusdna分子量梯(invitrogen，carlsbad，ca)確定southern印跡上的片段大小。表4：在棉花事件pdab4468.19.10.3的southern分析中使用的探針長度探針名基因元件長度(bp)aad-12aad-12671patpat525specr抗壯觀霉素基因750orirep復(fù)制起點(diǎn)852trfa復(fù)制起始蛋白trfa1,119實(shí)施例4.5：southern印跡結(jié)果表5中提出了基于aad-12和pat基因表達(dá)盒的已知限制性酶切位點(diǎn)預(yù)測的特定消化和探針的片段大小，以及觀察到的片段大小。預(yù)測的片段大小是基于pdab4468的質(zhì)粒圖，觀察到的片段大小是來自這些分析的近似結(jié)果，并且是基于條帶與1kbplusdna分子量梯所指示的大小的對應(yīng)關(guān)系。從這些消化物和雜交鑒定了兩種類型的片段：內(nèi)部片段，其中已知的酶位點(diǎn)位于探針區(qū)域的兩側(cè)，并且被完全包含在aad-12表達(dá)盒的插入?yún)^(qū)域內(nèi)，和邊界片段，其中一個(gè)已知的酶位點(diǎn)位于探針區(qū)的一端，另一個(gè)位點(diǎn)預(yù)期位于棉花基因組中。每個(gè)事件的邊界片段的大小不同，因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)情況下，對每個(gè)事件而言dna片段的整合位點(diǎn)是獨(dú)特(unique)的。邊界片段提供了一種定位限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)與整合的dna的相對位置、以及評估dna插入物的數(shù)量的手段。對多個(gè)世代的含有棉花事件pdab4468.19.10.3的棉花品系進(jìn)行的southern印跡分析產(chǎn)生的數(shù)據(jù)表明，在棉花基因組中插入了一個(gè)來自質(zhì)粒pdab4468的低拷貝的、完整的aad-12表達(dá)盒，從而產(chǎn)生了棉花事件pdab4468.19.10.3。限制性內(nèi)切酶nsii和swai結(jié)合并切割質(zhì)粒pdab4468內(nèi)的獨(dú)特限制位點(diǎn)。隨后，選用這些酶對棉花事件pdab4468.19.10.3中的aad-12基因插入物進(jìn)行表征。大于6.3kb或大于4.3kb的邊界片段預(yù)計(jì)會在消化后分別與探針雜交(表5)。當(dāng)使用nsii和swai時(shí)，分別觀察到了大約7.0kb和大約5.5kb的單一aad-12雜交條帶。此外，選用限制性內(nèi)切酶ncoi來表征aad-12基因插入物。用于產(chǎn)生棉花事件pdab4468.19.10.3的質(zhì)粒，pdab4468，含有一個(gè)獨(dú)特的位于質(zhì)粒pdab4468的表達(dá)盒中的ncoi限制位點(diǎn)，和兩個(gè)位于質(zhì)粒pdab4468的“主鏈”區(qū)中的額外位點(diǎn)。預(yù)計(jì)一個(gè)大于2.8kb的邊界片段在消化后與探針雜交(表5)。觀察到一個(gè)大約9.75kb的單一aad-12雜交條帶。探針與這樣大小的條帶的雜交，表明用于棉花事件pdab4468.19.10.3的棉花基因組中的aad-12基因的單個(gè)插入位點(diǎn)的存在。選用三種限制性內(nèi)切酶組合，nde、nsii+ncoi和nsii+sbfi，來釋放含有aad-12表達(dá)盒和pat表達(dá)盒的不同區(qū)域的片段(表5)。ndei限制性內(nèi)切酶包括從ubi10啟動子到atuorf23utr終止子的aad-12表達(dá)盒元件。在用ndei消化后，在用aad-12探針探查的印跡上觀察到一個(gè)3.5kb的預(yù)測片段。nsii和ncoi的雙消化包括aad-12和pat表達(dá)盒元件。雙酶消化后，在用aad-12探針探查的印跡上觀察到一個(gè)3.5kb的預(yù)測片段(表5)。nsii和sbfi的雙消化產(chǎn)物同時(shí)含有aad-12和pat表達(dá)盒元件。用雙酶消化后，在用aad-12探針探查的印跡上觀察到一個(gè)4.8kb的預(yù)測片段(表5)。此外，在用pat探針探查并用上述限制性內(nèi)切酶(nsii，ncoi，swai，ndei，nsii+ncoi和nsii+sbfi)消化的印跡上，觀察到了雜交條帶。所得到的印跡產(chǎn)生的條帶表明pat表達(dá)盒存在于棉花事件pdab4468.19.10.3中。表5列出了根據(jù)pdab4468的質(zhì)粒圖預(yù)測的片段大小，以及通過用pat探測從southern印跡觀察到的片段大小。針對棉花事件pdab4468.19.10.3得到的這些結(jié)果表明，在棉花事件pdab4468.19.10.3的棉花基因組中插入了一個(gè)完整的來自質(zhì)粒pdab4468的aad-12表達(dá)盒和pat表達(dá)盒。實(shí)施例4.6：不存在主鏈序列還進(jìn)行了southern印跡分析以驗(yàn)證在棉花事件pdab4468.19.10.3中不存在壯觀霉素抗性基因(specr)、復(fù)制起點(diǎn)(orirep)元件和復(fù)制起始蛋白trfa(trfa元件)。在nsii消化和用specr特異性探針雜交之后，在陽性對照樣品(pdab4468+coker310)中觀察到一個(gè)大約12kb的預(yù)測大小的條帶，但在陰性對照和棉花事件pdab4468.19.10.3中則沒有。類似地，在用ncoi消化和用orirep特異性探針和trfa特異性探針的混合物雜交之后，在陽性對照樣品(pdab4468+coker310)中觀察到一個(gè)大約7.25kb的預(yù)測大小條帶，但在陰性對照和棉花事件pdab4468.19.10.3中則沒有。這些數(shù)據(jù)表明在棉花事件pdab4468.19.10.3中不存在壯觀霉素抗性基因、orirep元件和復(fù)制起始蛋白trfa。表5：在southern印跡分析中預(yù)測和觀察到的雜交片段。1.根據(jù)pdab4468的質(zhì)粒圖預(yù)測的片段大小。2.觀察到的片段大小被認(rèn)為是來自這些分析的近似，并且基于p32-標(biāo)記的dna分子量片段的指示大小。實(shí)施例5：在田間試驗(yàn)中對2，4-d耐受在2010年種植季中，在田間試驗(yàn)中研究了棉花事件pdab4468.19.10.3對萌發(fā)后施用苯氧乙酸除草劑2，4-d的耐受性。在對2-4葉的棉花事件pdab4468.19.10.3進(jìn)行了單次萌發(fā)后2，4-d施用之后評估除草劑耐受性。對處于此發(fā)育階段的棉花施用2，4-d代表了棉花種植者農(nóng)通常用于實(shí)現(xiàn)滿意的雜草控制的施用時(shí)機(jī)。通過在藥物施用后0-1天(daa)、7-8daa、12-16daa、和24-32daa對棉花植物的損傷進(jìn)行評估來測量2，4-d的耐受性。對于上述0-1天的時(shí)間增量，測量從施用后6-24小時(shí)開始。通過使用線性百分比量表(1-100％)對百分比可見損傷進(jìn)行等級評定來評估傷害，其中0％表示沒有可見的除草劑傷害，而100％代表植物死亡。等級評定是對包括偏上性(epinasty)、失綠、葉片壞死和植物死亡在內(nèi)的任何除草征候的綜合評分。0-1daa出現(xiàn)的除草征候主要是偏上性，在以后的評估中出現(xiàn)的征候主要是失綠和壞死。田間試驗(yàn)在橫跨美國典型棉花產(chǎn)區(qū)的11個(gè)地點(diǎn)進(jìn)行：阿拉巴馬州，阿肯色州，加利福尼亞州，佐治亞州，路易斯安那州，密西西比州，北卡羅來納州，南卡羅來納州，和田納西州。試驗(yàn)設(shè)計(jì)為每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。每個(gè)重復(fù)間隔一個(gè)寬10-15英尺(3.04米至4.57米)的裸土小徑(bare-soilalley)。每個(gè)處理的小地塊(plot)大小為2行20英尺(6.09米)長，行間通常間隔36-40英寸(91.44cm-101.6cm)。試驗(yàn)處理是用2，4-d胺(weedar64tm，nufarm，burrridge，il)以0，1120，2240，或4480克酸當(dāng)量/公頃(gae/ha)噴灑棉花事件pdab4468.19.10.3，每英畝噴灑最終溶液15加侖(56.78升)。因?yàn)橐阎眠h(yuǎn)低于測試的最低比率(1120gae/ha)的比率的2，4-d處理即可導(dǎo)致植物死亡，所以在這些實(shí)驗(yàn)中沒有包含非轉(zhuǎn)化棉花對照處理。表6提供了萌發(fā)后施用2，4-d造成的可見損傷的處理平均值。除了在0-1daa出現(xiàn)短暫偏上之外，在這些實(shí)驗(yàn)中沒有觀察到農(nóng)藝學(xué)上顯著的除草劑損傷。用4480gae/ha的2，4-d進(jìn)行處理(其是預(yù)期實(shí)現(xiàn)廣譜雜草控制所需的比率的＞4x)，在7-8daa評估間隔后幾乎沒有導(dǎo)致作物損傷，證明了棉花事件pdab4468.19.10.3對2，4-d的強(qiáng)耐受性。表6：棉花事件pdab4468.19.10.3在萌發(fā)后施用2，4-d之后的可見百分比可見損傷2，4-d比率(gae/ha)0-1daa7-8daa12-16daa24-32daa00.00.00.00.011203.61.40.60.0224011.83.52.70.1448019.411.05.90.6實(shí)施例6：在田間試驗(yàn)中對草胺膦的耐受性在2010種植季的田間試驗(yàn)中，研究了棉花事件pdab4468.19.10.3對萌發(fā)后施用草胺膦的耐受性。除草劑耐受性的評估在對6-8葉棉花事件pdab4468.19.10.3進(jìn)行了單次萌發(fā)后施用草胺膦之后進(jìn)行，這代表了通常使用草胺膦實(shí)現(xiàn)滿意雜草控制的除草劑施用時(shí)機(jī)。草胺膦的耐受性通過在藥物施用后2-4天(daa)，7-9daa，13-19daa，和22-29daa對棉花植物進(jìn)行評估來加以測量。傷害的評估是通過使用線性百分比量表(1-100％)對百分比可見損傷進(jìn)行等級評定來實(shí)施，其中0％表示沒有可見的除草劑傷害，而100％代表植物死亡。等級評定是包括失綠、葉片壞死、生長停滯和植物死亡在內(nèi)的任何除草征候的綜合評分。除草征候(當(dāng)存在時(shí))主要是失綠和壞死。田間試驗(yàn)在橫跨美國典型棉花產(chǎn)區(qū)的11個(gè)地點(diǎn)進(jìn)行：阿拉巴馬州，阿肯色州，加利福尼亞州，佐治亞州，路易斯安那州，密西西比州，北卡羅來納州，南卡羅來納州，和田納西州。試驗(yàn)設(shè)計(jì)為每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。每個(gè)重復(fù)間隔一個(gè)10-15英尺(3.04米至4.57米)寬的裸土小徑。每個(gè)處理的小地塊(plot)大小為2行20英尺(6.09米)長，并且行間通常間隔36-40英寸(91.44cm-101.6cm)。試驗(yàn)處理是用草胺膦銨鹽(ignite280sltm，bayer，researchtriangle，nc)以0、542、1084或2168克酸當(dāng)量/公頃(gae/ha)噴灑棉花事件pdab4468.19.10.3，每英畝噴灑最終溶液15加侖(56.78升)。因?yàn)楸葴y試的最低比率(542gae/ha)還低得多的草胺膦處理比率預(yù)期會導(dǎo)致植物死亡，因此在這些實(shí)驗(yàn)中沒有包含非轉(zhuǎn)化棉花比照處理。表7提供了萌發(fā)后施用草胺膦造成的可見損傷的處理平均值。除了在用2168gae/ha(＞4x典型使用比率)處理的小地塊中在2-4和7-9daa出現(xiàn)短暫失綠之外，在這些實(shí)驗(yàn)中沒有觀察到農(nóng)藝學(xué)顯著上的除草劑損傷。用2168gae/ha的草胺膦進(jìn)行處理(其代表＞4x預(yù)期實(shí)現(xiàn)廣譜雜草控制所需的比率)，在超出7-9daa評估間隔后幾乎沒有導(dǎo)致作物損傷，證明了棉花事件pdab4468.19.10.3的強(qiáng)耐受性。表7：棉花事件pdab4468.19.10.3的在萌發(fā)后施用草胺膦之后的百分比可見損傷草胺膦比率(gae/ha)2-4daa7-9daa13-19daa22-29daa00.00.00.00.05422.71.90.10.010846.64.00.20.0216813.510.02.30.3實(shí)施例7：在溫室試驗(yàn)中對綠草定和氟草煙的耐受性在溫室試驗(yàn)中研究了棉花事件pdab4468.19.10.3對萌發(fā)后施用吡啶氧基乙酸除草劑綠草定和氟草煙的耐受性。在單次萌發(fā)后施用綠草定和氟草煙后評估除草劑耐受性。來自棉花事件pdab4468.19.10.3的種子在82.5℃的水浴中加熱處理1分鐘，然后種植在metromix360培養(yǎng)基中，并在溫室中使其生長。溫室中的溫度平均為27℃，光周期設(shè)定為16小時(shí)光照和8小時(shí)黑暗，使用最大光強(qiáng)。讓植物生長到發(fā)育的3葉期，進(jìn)行非隨機(jī)化研究，每種除草劑進(jìn)行三次處理，三個(gè)重復(fù)。用履帶式噴霧器噴灑植物，噴霧器調(diào)節(jié)為施用187l/ha的綠草定(garlon4tm，dowagrosciences，indianapolis，in)和氟草煙(staranetm，dowagrosciences，indianapolis，in)商業(yè)制劑。使用非轉(zhuǎn)化的coker310棉花品種作為陰性對照。在3daa(施用后天數(shù))和11daa評估可見損傷，在除草劑的每個(gè)比率之間進(jìn)行比較。傷害通過目測評估，以使用線性百分比量表(1-100％)的棉花植物葉子的偏上性百分比來量度，其中0％表示沒有可見的除草劑傷害，而100％代表植物死亡。到3daa為止，棉花事件pdab4468.19.10.3提供了對高達(dá)280gae/ha的氟草煙水平的耐受性(表8)。此外，棉花事件pdab4468.19.10.3提供了對綠草定的耐受性(表8)。在3daa，棉花事件pdab4468.19.10.3植物顯示對綠草定具有中等水平的耐受性，但到11daa為止，該植物已經(jīng)從最初的偏上性響應(yīng)中恢復(fù)，并與非轉(zhuǎn)化對照相比提供了強(qiáng)耐受性。由此，研究證明，棉花事件pdab4468.19.10.3提供了對吡啶氧基乙酸除草劑綠草定和氟草煙的耐受性。表8：在萌發(fā)后施用除草劑綠草定和氟草煙之后觀察到的棉花事件pdab4468.19.10.3的百分比可見損傷用相同字母后注的平均值沒有顯著差異(p＝.05，student-newman-keuls)。實(shí)施例8：棉花事件pdab4468.19.10.3的農(nóng)藝學(xué)表征在2010年，在橫跨整個(gè)棉花帶的不同地理位置進(jìn)行的田間試驗(yàn)中，對棉花事件pdab4468.19.10.3的農(nóng)藝學(xué)特征進(jìn)行了定量。這些研究比較了棉花事件pdab4468.19.10.3(施用和不施用除草劑2，4-d和草胺膦)與非轉(zhuǎn)基因近同系(near-isoline)對照coker310的農(nóng)藝學(xué)性能。在棉花事件pdab4468.19.10.3和coker310對照植物之間，沒有觀察到農(nóng)藝學(xué)有意義的出乎意料的差異。這些田間試驗(yàn)的結(jié)果表明，棉花事件pdab4468.19.10.3和coker310對照植物在農(nóng)藝學(xué)上等價(jià)，并且來自pdab4468的t-鏈插入物的存在未改變棉花事件pdab4468.19.10.3的期望的農(nóng)藝性能。此外，與沒有用除草劑處理噴灑的棉花事件pdab4468.19.10.3植物相比，棉花事件pdab4468.19.10.3的農(nóng)藝性能未由于除草劑2，4-d和草胺膦的施用而改變。農(nóng)藝學(xué)特征的評估包括幼苗活力、％植物萌發(fā)、花芽形成、白花以上主莖節(jié)數(shù)(nodesabovewhiteflower)(nawf)，和產(chǎn)量確定，并用表9所示的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評價(jià)。將收獲的纖維送到fiberandbiopolymerresearchinstitute，lubbock，texas，使用高容量儀器(hvi)對纖維進(jìn)行評估。表9：產(chǎn)量試驗(yàn)中評估的農(nóng)藝學(xué)特征將棉花事件pdab4468.19.10.3的種子和近等基因系對照系coker310的種子以每20英尺行80粒種子、行間距34-38英寸(86.36cm-96.52cm)的比率進(jìn)行種植。該種植設(shè)計(jì)在每個(gè)地點(diǎn)重復(fù)4次。每個(gè)地點(diǎn)都按照一個(gè)完全隨機(jī)的地塊設(shè)計(jì)(crbd)來安排，其構(gòu)成為每個(gè)重復(fù)3個(gè)不噴灑地塊和4個(gè)噴灑地塊。使用標(biāo)準(zhǔn)田間施用率和如上所述的方法用除草劑2，4-d和草胺膦噴灑植物。利用中央的兩行(第2和3行)測量農(nóng)藝學(xué)特征和評估植物。對于所有經(jīng)過測量并進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的農(nóng)藝學(xué)性狀，棉花事件pdab4468.19.10.3的測量農(nóng)藝性狀與coker310近等基因系對照植物相當(dāng)。鑒定出的一個(gè)例外是棉花事件pdab4468.19.10.3的除草劑噴灑地塊內(nèi)產(chǎn)生的“％植物萌發(fā)”結(jié)果。然而，“％植物萌發(fā)”數(shù)據(jù)點(diǎn)是在施用任何除草劑之前采集的，并且該測量結(jié)果中的變異可以歸因于環(huán)境因素。在棉花事件pdab4468.19.10.3和coker310對照植物之間沒有觀察到農(nóng)藝學(xué)上有意義的出乎意料的差異。這些田間試驗(yàn)表明，棉花事件pdab4468.19.10.3在農(nóng)藝上與coker310對照植物等效，并且來自pdab4468的t-鏈插入物的存在未改變棉花事件pdab4468.19.10.3的預(yù)期農(nóng)藝學(xué)性狀。此外，與沒有用除草劑噴灑的棉花事件pdab4468.19.10.3植物相比，除草劑2，4-d和草胺膦的施用并沒有導(dǎo)致棉花事件pdab4468.19.10.3的農(nóng)藝學(xué)性能改變。表10：處理(噴灑除草劑)和未處理(未噴灑除草劑)事件的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，與近等基因系對照棉花植物比較實(shí)施例9：棉花事件pdab4468.19.10.3的全長序列seqidno：21提供了棉花事件pdab4468.19.10.3的序列。該序列含有5’基因組側(cè)翼序列、pdab4468的t-鏈插入物和3’基因組側(cè)翼序列。對于seqidno：21，殘基1-1，354是5’基因組側(cè)翼序列，殘基1,355-7,741是pdab4468t-鏈插入物的殘基，而殘基7,742-10,471是3’側(cè)翼序列。因此，關(guān)于插入物5’端的接點(diǎn)序列或過渡出現(xiàn)在seqidno：21的殘基1,354/1,355。關(guān)于插入物3’端的接點(diǎn)序列或過渡出現(xiàn)在seqidno：21的殘基7,741/7,742。應(yīng)當(dāng)注意到，在從棉花事件pdab4468.19.10.3衍生的后續(xù)世代植物中，棉花事件pdab4468.19.10.3的t-鏈插入物的實(shí)際序列可能略微偏離seqidno：21。在基因滲入過程中，插入物發(fā)生缺失或其他改變并不是罕見的。本領(lǐng)域技術(shù)人員會預(yù)期從棉花事件pdab4468.19.10.3衍生的后續(xù)世代植物中找到序列的細(xì)微差別和微小的差異。因此，本文提供的質(zhì)粒序列的相關(guān)區(qū)段在從棉花事件pdab4468.19.10.3衍生的后續(xù)世代植物中可能包含一些微小變異。因此，包括具有與主題插入序列具有一定范圍的同一性的多核苷酸的植物也在本發(fā)明實(shí)施方案的范圍之內(nèi)。與seqidno：21的序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性的多核苷酸序列，在本發(fā)明實(shí)施方案的范圍內(nèi)。側(cè)翼序列加上插入序列的序列可參考所保藏的種子進(jìn)行確認(rèn)。因此，seqidno：21與從棉花事件pdab4468.19.10.3衍生的后續(xù)世代植物中的實(shí)際t-鏈插入物之間可能鑒定出一些差異，這些差異在本發(fā)明實(shí)施方案的范圍內(nèi)。實(shí)施例10：在溫室試驗(yàn)中對綠草定及氟草煙的丁酸的耐受性在溫室試驗(yàn)中研究了棉花事件pdab4468.19.10.3對萌發(fā)后施用包含丁酸基團(tuán)的除草劑——綠草定-b和氟草煙-b的耐受性。在單次萌發(fā)后施用這兩種分子后，評估除草劑耐受性。將來自棉花事件pdab4468.19.10.3的種子在82.5℃的水浴中加熱處理1分鐘，然后種植在metromix360培養(yǎng)基中，并在溫室中使其生長。溫室中的溫度平均為27℃，光周期設(shè)定為16小時(shí)光照和8小時(shí)黑暗，使用最大光強(qiáng)。讓植物生長到發(fā)育的2-3葉期，用每種除草劑進(jìn)行非隨機(jī)化研究，實(shí)施三次處理，每次4個(gè)重復(fù)。獲取包含額外的丁酸部分的吡啶基氧基乙酸除草劑氟草煙-b和綠草定-b，并施用給棉花植物。分別在97％丙酮和3％dmso的溶液中配制活性成分。此外，添加作物油濃縮液至終濃度為1.25％。用履帶式噴霧器噴灑植物，該噴霧器被調(diào)節(jié)以施用187l/ha的配好的技術(shù)物料。使用非轉(zhuǎn)化的coker310棉花品種作為陰性對照。在6haa(施用后小時(shí)數(shù))，1daa(施用后天數(shù))，3daa，6daa和14daa評估可見損傷，并在每個(gè)除草劑比率之間進(jìn)行比較。對傷害進(jìn)行目測評估，以使用線性百分比量表(1-100％)的棉花植物葉子的偏上性百分比來量度，其中0％表示沒有可見的除草劑傷害，而100％代表植物死亡。棉花事件pdab4468.19.10.3提供了對不同濃度的氟草煙-b和綠草定-b的耐受性(表11和表12)。在6haa，棉花事件pdab4468.19.10.3植物顯示對氟草煙-b和綠草定-b具有中等水平的耐受性，但到14daa為止，該植物已經(jīng)從最初的偏上性響應(yīng)中恢復(fù)，并與非轉(zhuǎn)化對照相比提供了強(qiáng)耐受性。由此，研究證明，棉花事件pdab4468.19.10.3提供了對丁酸形式的吡啶氧基乙酸除草劑氟草煙-b和綠草定-b的耐受性。序列表<110>陶氏益農(nóng)公司cui,yunxingking,rainakaiser,tinarobinson,andrewpareddy,dayakartoledo,sandrabraxton,leonanderson,david<120>除草劑耐受性棉花事件pdab4468.19.10.3<130>70443<160>21<170>patentinversion3.5<210>1<211>1672<212>dna<213>人工序列<220><223>棉花事件pdab4468.19.10.3的5’dna側(cè)翼邊界序列.核苷酸1-1354是基因組序列.核苷酸1355-1672是插入序列.<400>1atttaccctagtcgggaagtggtttcgggaccacaagaccgagtcgtaaaaataattact60tgctatattctatgcttattatgtgtgaacatgggtatgtggaagtttcactccctaatt120ttaccaattgcatgagaaattattaattgggatcaatttgagacattgtaaaaatatgat180agtctaattcaaatggtcaattagtgcatgtaccaaaaagagtggttttgcatgtcaaat240tgcccaaaagatgatgggtggccggccaaggagtgataatgctccactcattctaattta300aaatgtttccttggtgaacaaatgatgggattaataatagaaaagggaacaaaaaaaaag360ggtgtcatacttgccatcacctagccgaaaaaccaagaaaaagaaggggataaaagaact420tggggggggggattcggccattgcttgcctagggagagtgtttgatgttgtggcataaaa480aatgagggagtttgaatgcttaacaaggagggaagaaggagtgttcatattttctttctt540ttgcaattgttctaactagaggaagaaggggaaacaagattcggccaaggtggtccttta600gaccaaggtatgtttaatgttgtcttagagatgcatgcatgttttaaatagcccatgttc660aaaccttgaatcttgttgataacatgagcaatcggtcatgagaaagtgttggatggagct720ttcggttatggtatgtgtgagaagaacttgattctttcttacctttaagttttgatggat780caagaaaacaaaaggttgttgatgaaagaaattaatgtattaagagattatatgaaactt840attcatgtttatatatgttatatgcaacgaaaatggttgatgattttggaggtgattagc900ttgaatcggccacggtatatccataaacacgatctatgcttgttatgttactcatggtta960aaacaattcggctatgacattcggccatggatggttgtattttttttgatgttgtttttg1020atgctttagggcattgagggttgattatagatgaggtgagtttcttgatttaaaatttga1080tggatgttaagctaattgggcaaccaaaggttcaatatttttgttatgaggtcatatgtg1140catttcggccatggtctttgcttgaatatgagatttgtaatgtgattttcctaaattgtc1200tatgaatttggttgttgatttcatggtaatggtatattgaatccatgagaatttagtaag1260gttgcattcggcaacttacttgaaattaaaaatcgatgtctaagcttaggtgatttcgat1320gatgatatatgtgtatatacataagtatatttccagtcagcatcatcacaccaaaagtta1380ggcccgaatagtttgaaattagaaagctcgcaattgaggtctacaggccaaattcgctct1440tagccgtacaatattactcaccggatcctaaccggtgtgatcatgggccgcgattaaaaa1500tctcaattatatttggtctaatttagtttggtattgagtaaaacaaattcgaaccaaacc1560aaaatataaatatatagtttttatatatatgcctttaagactttttatagaattttcttt1620aaaaaatatctagaaatatttgcgactcttctggcatgtaatatttcgttaa1672<210>2<211>2898<212>dna<213>人工序列<220><223>棉花事件pdab4468.19.10.3的3’dna側(cè)翼邊界序列.核苷酸1-168是插入序列.核苷酸169-2898是基因組序列.<400>2gcacatagacacacacatcatctcattgatgcttggtaataattgtcattagattgtttt60tatgcatagatgcactcgaaatcagccaattttagacaagtatcaaacggatgtgacttc120agtacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcgtcaaagaaaaggtta180tcgagtagccgagttggaaccgtcttacccaacacgaggtaagtcattaagcatgtagtg240ggtgttattttaaatggtcataatgtgtatgtattgatgctgattggaatgaataaatat300acatatatatatatgcatgtacgtatgtgatgatgaaattgttgaatgaatgaaaagagg360taagatgtactgagttgttgatctcggcactaaacatgcgggataaccatttatgaccat420gagattggcgctaagtgcgcgggattaaattgtacagcactaagtgtgcgattcgactat480gttgcactaagtgtgcgaaatggatatgatgcactaagtgtgcgaattgaccatgcggca540ctaagtgtgcgagatggactatgtggcactaagtgtgcgatttgattacgtagcactaag600tgtgcgatttgattacgtagcactaagtgtgcgagttgattatatagcactgagtgtgcg660ggctcaataaatattcgtgaatcattacggacactatgtgtgcgacactattgagtcgat720cgcggacagcggatcgggtaagtgttttgagtacatggctattatgtgctatgcttatac780ttggtgttgagctcggtaagttcgaacctatgtgacaaatatacttgaagtcacgtacat840aaaatttatcgtaggatgggtgaaaggccgtatagtcgtttggttgtaacgaaaataaat900cgatttacgaaattgcttcaatgtcctattgatgagtatatagaatgtgaatgcatgaat960tgatatgaaattgaattgataagttggaggaactatggtatggttcggtatggatggagt1020aaattgtctcgttccattttgtttcctcttgtgataatgtcgttgatagatggtagtgca1080ttgcttatgacttactgagttataaactcactcgatgtttccttgtcacccactataggt1140tgcttggactcatctatttttgcggggtcgggccgtcattgaagtcatcacaccggatag1200caagttttggtactttcttcttagtgtgcttagaagatcattttggcatgtataagctag1260tacgttgtgtttgaattatggcatgtaaactttaagccatgcgaaaatggcacgaatgtt1320cgattgagttggatcaagggtaggcatgaaatggacatagttactttcgtaacagatgct1380ggcggcagcagtgtcatgagattgaaaaatcactaaaaatagtaggagtggaattaattg1440atgaataaattatgtaatcgaagctcgatgagtctgctttcatgaggaagtaacgaaatg1500atcatatgggcagtatattaagagataatcagatttttgtgggacagggccagaacggtt1560tctggattccctgctccgactttggtaattcattataaattaaccagagataattagggg1620tcgtaccatatatgtacagattcctctctaagtctagttttcatagaaacaaacggcaac1680agtattgaagccccgtgcagggagatatcccagtcgtaatgggaaaaggtcagtgtagtc1740gacacctgcaacttgggggactttgactaataaactgtaataattggcccaaccaaaaat1800tctagaaaaaaatacatagatgggcaaatgagtctagtttctgggaaaaattacgaaact1860gattttcgagttacgaaactcaagatatgatttttaaagcggctagtacacagattgggc1920agtgtctggaaaataaattttgtaaggggttaaagccagataacacctcgtgttcgactc1980cggtgtcggtttcgggttcggggtgttacattttattggtatcagagctatggtttagtc2040ggttctaggactaccatagcacgtatgagtctagctatacatgccataatgttaatgttt2100aaaagggtgatgacttctgacggttgaaatgtttttgtcttgattagtaaatggatcccg2160gtgaagaaagaaccctagcggatgacgttgagagcgtagcggctgctcctgcacaaggga2220cgccgcctgttgaacctcagtcatctgcgaataatcaaggtgagggggctaaacaagcct2280tctttaccatgatgaatgagtgggtcgcgcagtatgcccgagccaacccggctgtccaac2340aattcccaaatttgaataatccaccccaagagcctgtaatgccatcagtcgctgatcctg2400tgaggctgagtaagccaccggtagacttgattaggaagcgtggggccgaggagttcaagg2460ccatagtaactgatgatgccgaaagggccgagttctggcttgataacaccattcgggtgc2520tcgatgaattgtcatgcacacccgatgaatgtctaaaatgtgctgtatctttgttgcgag2580actcagcctactattggtggaggaccttgatttccatagtcccgaacgagcgagtaactt2640gggacttctttcaaacgaaattccgaaagaaatttattagccagcggttcattgatcaga2700agcgtaaggagttcttggaactcaagcaaggccgtatgactgtatctgaatacgaacatg2760aattcgtaagacttagtaggtatgcccgggagtgtgtagctgatgaggttgctatgtgca2820aaagatttgaggaaggattgaatgaagatttaaagctactaatgggtattttggaaataa2880aggaatttgtaacactag2898<210>3<211>6387<212>dna<213>人工序列<220><223>pdab4468的t鏈dna序列<400>3agtcagcatcatcacaccaaaagttaggcccgaatagtttgaaattagaaagctcgcaat60tgaggtctacaggccaaattcgctcttagccgtacaatattactcaccggatcctaaccg120gtgtgatcatgggccgcgattaaaaatctcaattatatttggtctaatttagtttggtat180tgagtaaaacaaattcgaaccaaaccaaaatataaatatatagtttttatatatatgcct240ttaagactttttatagaattttctttaaaaaatatctagaaatatttgcgactcttctgg300catgtaatatttcgttaaatatgaagtgctccatttttattaactttaaataattggttg360tacgatcactttcttatcaagtgttactaaaatgcgtcaatctctttgttcttccatatt420catatgtcaaaacctatcaaaattcttatatatctttttcgaatttgaagtgaaatttcg480ataatttaaaattaaatagaacatatcattatttaggtatcatattgatttttatactta540attactaaatttggttaactttgaaagtgtacatcaacgaaaaattagtcaaacgactaa600aataaataaatatcatgtgttattaagaaaattctcctataagaatattttaatagatca660tatgtttgtaaaaaaaattaatttttactaacacatatatttacttatcaaaaatttgac720aaagtaagattaaaataatattcatctaacaaaaaaaaaaccagaaaatgctgaaaaccc780ggcaaaaccgaaccaatccaaaccgatatagttggtttggtttgattttgatataaaccg840aaccaactcggtccatttgcacccctaatcataatagctttaatatttcaagatattatt900aagttaacgttgtcaatatcctggaaattttgcaaaatgaatcaagcctatatggctgta960atatgaatttaaaagcagctcgatgtggtggtaatatgtaatttacttgattctaaaaaa1020atatcccaagtattaataatttctgctaggaagaaggttagctacgatttacagcaaagc1080cagaatacaatgaaccataaagtgattgaagctcgaaatatacgaaggaacaaatatttt1140taaaaaaatacgcaatgacttggaacaaaagaaagtgatatattttttgttcttaaacaa1200gcatcccctctaaagaatggcagttttcctttgcatgtaactattatgctcccttcgtta1260caaaaattttggactactattgggaacttcttctgaaaatagtggccaccgcttaattaa1320ggcgcgccatgcccgggcaagcggccgcacaagtttgtacaaaaaagcaggctccgcggt1380gactgactgaaaagcttgtcgacctgcaggtcaacggatcaggatattcttgtttaagat1440gttgaactctatggaggtttgtatgaactgatgatctaggaccggataagttcccttctt1500catagcgaacttattcaaagaatgttttgtgtatcattcttgttacattgttattaatga1560aaaaatattattggtcattggactgaacacgagtgttaaatatggaccaggccccaaata1620agatccattgatatatgaattaaataacaagaataaatcgagtcaccaaaccacttgcct1680tttttaacgagacttgttcaccaacttgatacaaaagtcattatcctatgcaaatcaata1740atcatacaaaaatatccaataacactaaaaaattaaaagaaatggataatttcacaatat1800gttatacgataaagaagttacttttccaagaaattcactgattttataagcccacttgca1860ttagataaatggcaaaaaaaaacaaaaaggaaaagaaataaagcacgaagaattctagaa1920aatacgaaatacgcttcaatgcagtgggacccacggttcaattattgccaattttcagct1980ccaccgtatatttaaaaaataaaacgataatgctaaaaaaatataaatcgtaacgatcgt2040taaatctcaacggctggatcttatgacgaccgttagaaattgtggttgtcgacgagtcag2100taataaacggcgtcaaagtggttgcagccggcacacacgagtcgtgtttatcaactcaaa2160gcacaaatacttttcctcaacctaaaaataaggcaattagccaaaaacaactttgcgtgt2220aaacaacgctcaatacacgtgtcattttattattagctattgcttcaccgccttagcttt2280ctcgtgacctagtcgtcctcgtcttttcttcttcttcttctataaaacaatacccaaagc2340ttcttcttcacaattcagatttcaatttctcaaaatcttaaaaactttctctcaattctc2400tctaccgtgatcaaggtaaatttctgtgttccttattctctcaaaatcttcgattttgtt2460ttcgttcgatcccaatttcgtatatgttctttggtttagattctgttaatcttagatcga2520agacgattttctgggtttgatcgttagatatcatcttaattctcgattagggtttcataa2580atatcatccgatttgttcaaataatttgagttttgtcgaataattactcttcgatttgtg2640atttctatctagatctggtgttagtttctagtttgtgcgatcgaatttgtcgattaatct2700gagtttttctgattaacagagatctccatggctcagaccactctccaaatcacacccact2760ggtgccaccttgggtgccacagtcactggtgttcaccttgccacacttgacgatgctggt2820ttcgctgccctccatgcagcctggcttcaacatgcactcttgatcttccctgggcaacac2880ctcagcaatgaccaacagattacctttgctaaacgctttggagcaattgagaggattggc2940ggaggtgacattgttgccatatccaatgtcaaggcagatggcacagtgcgccagcactct3000cctgctgagtgggatgacatgatgaaggtcattgtgggcaacatggcctggcacgccgac3060tcaacctacatgccagtcatggctcaaggagctgtgttcagcgcagaagttgtcccagca3120gttgggggcagaacctgctttgctgacatgagggcagcctacgatgcccttgatgaggca3180acccgtgctcttgttcaccaaaggtctgctcgtcactcccttgtgtattctcagagcaag3240ttgggacatgtccaacaggccgggtcagcctacataggttatggcatggacaccactgca3300actcctctcagaccattggtcaaggtgcatcctgagactggaaggcccagcctcttgatc3360ggccgccatgcccatgccatccctggcatggatgcagctgaatcagagcgcttccttgaa3420ggacttgttgactgggcctgccaggctcccagagtccatgctcaccaatgggctgctgga3480gatgtggttgtgtgggacaaccgctgtttgctccaccgtgctgagccctgggatttcaag3540ttgccacgtgtgatgtggcactccagactcgctggacgcccagaaactgagggtgctgcc3600ttggtttgagtagttagcttaatcacctagagctcggtcaccagcataatttttattaat3660gtactaaattactgttttgttaaatgcaattttgctttctcgggattttaatatcaaaat3720ctatttagaaatacacaatattttgttgcaggcttgctggagaatcgatctgctatcata3780aaaattacaaaaaaattttatttgcctcaattattttaggattggtattaaggacgctta3840aattatttgtcgggtcactacgcatcattgtgattgagaagatcagcgatacgaaatatt3900cgtagtactatcgataatttatttgaaaattcataagaaaagcaaacgttacatgaattg3960atgaaacaatacaaagacagataaagccacgcacatttaggatattggccgagattactg4020aatattgagtaagatcacggaatttctgacaggagcatgtcttcaattcagcccaaatgg4080cagttgaaatactcaaaccgccccatatgcaggagcggatcattcattgtttgtttggtt4140gcctttgccaacatgggagtccaaggttgcggccgcgcgccgacccagctttcttgtaca4200aagtggttgcggccgcttaattaaatttaaatgcccgggcgtttaaacgcggccgcttaa4260ttaaggccggcctgcagcaaacccagaaggtaattatccaagatgtagcatcaagaatcc4320aatgtttacgggaaaaactatggaagtattatgtaagctcagcaagaagcagatcaatat4380gcggcacatatgcaacctatgttcaaaaatgaagaatgtacagatacaagatcctatact4440gccagaatacgaagaagaatacgtagaaattgaaaaagaagaaccaggcgaagaaaagaa4500tcttgaagacgtaagcactgacgacaacaatgaaaagaagaagataaggtcggtgattgt4560gaaagagacatagaggacacatgtaaggtggaaaatgtaagggcggaaagtaaccttatc4620acaaaggaatcttatcccccactacttatccttttatatttttccgtgtcatttttgccc4680ttgagttttcctatataaggaaccaagttcggcatttgtgaaaacaagaaaaaatttggt4740gtaagctattttctttgaagtactgaggatacaacttcagagaaatttgtaagtttgtag4800atctccatgtctccggagaggagaccagttgagattaggccagctacagcagctgatatg4860gccgcggtttgtgatatcgttaaccattacattgagacgtctacagtgaactttaggaca4920gagccacaaacaccacaagagtggattgatgatctagagaggttgcaagatagataccct4980tggttggttgctgaggttgagggtgttgtggctggtattgcttacgctgggccctggaag5040gctaggaacgcttacgattggacagttgagagtactgtttacgtgtcacataggcatcaa5100aggttgggcctaggatccacattgtacacacatttgcttaagtctatggaggcgcaaggt5160tttaagtctgtggttgctgttataggccttccaaacgatccatctgttaggttgcatgag5220gctttgggatacacagcccggggtacattgcgcgcagctggatacaagcatggtggatgg5280catgatgttggtttttggcaaagggattttgagttgccagctcctccaaggccagttagg5340ccagttacccagatctgaggtaccctgagcttgagcttatgagcttatgagcttagagct5400cggatccactagtaacggccgccagtgtgctggaattcgcccttgactagataggcgccc5460agatcggcggcaatagcttcttagcgccatcccgggttgatcctatctgtgttgaaatag5520ttgcggtgggcaaggctctctttcagaaagacaggcggccaaaggaacccaaggtgaggt5580gggctatggctctcagttccttgtggaagcgcttggtctaaggtgcagaggtgttagcgg5640gatgaagcaaaagtgtccgattgtaacaagatatgttgatcctacgtaaggatattaaag5700tatgtattcatcactaatataatcagtgtattccaatatgtactacgatttccaatgtct5760ttattgtcgccgtatgtaatcggcgtcacaaaataatccccggtgactttcttttaatcc5820aggatgaaataatatgttattataatttttgcgatttggtccgttataggaattgaagtg5880tgcttgcggtcgccaccactcccatttcataattttacatgtatttgaaaaataaaaatt5940tatggtattcaatttaaacacgtatacttgtaaagaatgatatcttgaaagaaatatagt6000ttaaatatttattgataaaataacaagtcaggtattatagtccaagcaaaaacataaatt6060tattgatgcaagtttaaattcagaaatatttcaataactgattatatcagctggtacatt6120gccgtagatgaaagactgagtgcgatattatggtgtaatacatagcggccgggtttctag6180tcaccggttaggatccgtttaaactcgaggctagcgcatgcacatagacacacacatcat6240ctcattgatgcttggtaataattgtcattagattgtttttatgcatagatgcactcgaaa6300tcagccaattttagacaagtatcaaacggatgtgacttcagtacattaaaaacgtccgca6360atgtgttattaagttgtctaagcgtca6387<210>4<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>寡核苷酸引物3endg1<400>4tcagagaatcctaactgcttgcca24<210>5<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>寡核苷酸引物3endg2<400>5ttggttgttgatttcatggtaatggt26<210>6<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>寡核苷酸引物3endg3<400>6gagaatttagtaaggttgcattcggc26<210>7<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>寡核苷酸引物5endg1<400>7cgcatgtttagtgccgagatcaac24<210>8<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>寡核苷酸引物5endg2<400>8acatagtgtccgtaatgattcacg24<210>9<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>寡核苷酸引物5endg3<400>9gtgccgagatcaacaactcagtac24<210>10<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>寡核苷酸引物5endt1<400>10gtgttgcccagggaaga17<210>11<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>寡核苷酸引物5endt2<400>11atgttgaagccaggctgc18<210>12<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>寡核苷酸引物5endt3<400>12cacagaaatttaccttgatcacgg24<210>13<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>寡核苷酸引物3endt1<400>13ccagaaggtaattatccaagatgt24<210>14<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>寡核苷酸引物3endt2<400>14gacagagccacaaacaccacaaga24<210>15<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>寡核苷酸引物3endt3<400>15agatcggcggcaatagcttct21<210>16<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>寡核苷酸引物bacg6<400>16agaagaagggagtgaagcaatcggtcat28<210>17<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>寡核苷酸引物ubirev<400>17cggtcctagatcatcagttcataca25<210>18<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>寡核苷酸引物ghbaca6<400>18ataggtgcctaatgtgacagcccaaa26<210>19<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223>寡核苷酸引物aad3b1<400>19cgtttagcaaaggtaatctgttggtca27<210>20<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223>寡核苷酸引物5endpls<400>20ttaacgaaatattacatgccagaagagtcg30<210>21<211>10471<212>dna<213>人工序列<220><223>棉花事件pdab4468.19.10.3的全長序列<400>21atttaccctagtcgggaagtggtttcgggaccacaagaccgagtcgtaaaaataattact60tgctatattctatgcttattatgtgtgaacatgggtatgtggaagtttcactccctaatt120ttaccaattgcatgagaaattattaattgggatcaatttgagacattgtaaaaatatgat180agtctaattcaaatggtcaattagtgcatgtaccaaaaagagtggttttgcatgtcaaat240tgcccaaaagatgatgggtggccggccaaggagtgataatgctccactcattctaattta300aaatgtttccttggtgaacaaatgatgggattaataatagaaaagggaacaaaaaaaaag360ggtgtcatacttgccatcacctagccgaaaaaccaagaaaaagaaggggataaaagaact420tggggggggggattcggccattgcttgcctagggagagtgtttgatgttgtggcataaaa480aatgagggagtttgaatgcttaacaaggagggaagaaggagtgttcatattttctttctt540ttgcaattgttctaactagaggaagaaggggaaacaagattcggccaaggtggtccttta600gaccaaggtatgtttaatgttgtcttagagatgcatgcatgttttaaatagcccatgttc660aaaccttgaatcttgttgataacatgagcaatcggtcatgagaaagtgttggatggagct720ttcggttatggtatgtgtgagaagaacttgattctttcttacctttaagttttgatggat780caagaaaacaaaaggttgttgatgaaagaaattaatgtattaagagattatatgaaactt840attcatgtttatatatgttatatgcaacgaaaatggttgatgattttggaggtgattagc900ttgaatcggccacggtatatccataaacacgatctatgcttgttatgttactcatggtta960aaacaattcggctatgacattcggccatggatggttgtattttttttgatgttgtttttg1020atgctttagggcattgagggttgattatagatgaggtgagtttcttgatttaaaatttga1080tggatgttaagctaattgggcaaccaaaggttcaatatttttgttatgaggtcatatgtg1140catttcggccatggtctttgcttgaatatgagatttgtaatgtgattttcctaaattgtc1200tatgaatttggttgttgatttcatggtaatggtatattgaatccatgagaatttagtaag1260gttgcattcggcaacttacttgaaattaaaaatcgatgtctaagcttaggtgatttcgat1320gatgatatatgtgtatatacataagtatatttccagtcagcatcatcacaccaaaagtta1380ggcccgaatagtttgaaattagaaagctcgcaattgaggtctacaggccaaattcgctct1440tagccgtacaatattactcaccggatcctaaccggtgtgatcatgggccgcgattaaaaa1500tctcaattatatttggtctaatttagtttggtattgagtaaaacaaattcgaaccaaacc1560aaaatataaatatatagtttttatatatatgcctttaagactttttatagaattttcttt1620aaaaaatatctagaaatatttgcgactcttctggcatgtaatatttcgttaaatatgaag1680tgctccatttttattaactttaaataattggttgtacgatcactttcttatcaagtgtta1740ctaaaatgcgtcaatctctttgttcttccatattcatatgtcaaaacctatcaaaattct1800tatatatctttttcgaatttgaagtgaaatttcgataatttaaaattaaatagaacatat1860cattatttaggtatcatattgatttttatacttaattactaaatttggttaactttgaaa1920gtgtacatcaacgaaaaattagtcaaacgactaaaataaataaatatcatgtgttattaa1980gaaaattctcctataagaatattttaatagatcatatgtttgtaaaaaaaattaattttt2040actaacacatatatttacttatcaaaaatttgacaaagtaagattaaaataatattcatc2100taacaaaaaaaaaaccagaaaatgctgaaaacccggcaaaaccgaaccaatccaaaccga2160tatagttggtttggtttgattttgatataaaccgaaccaactcggtccatttgcacccct2220aatcataatagctttaatatttcaagatattattaagttaacgttgtcaatatcctggaa2280attttgcaaaatgaatcaagcctatatggctgtaatatgaatttaaaagcagctcgatgt2340ggtggtaatatgtaatttacttgattctaaaaaaatatcccaagtattaataatttctgc2400taggaagaaggttagctacgatttacagcaaagccagaatacaatgaaccataaagtgat2460tgaagctcgaaatatacgaaggaacaaatatttttaaaaaaatacgcaatgacttggaac2520aaaagaaagtgatatattttttgttcttaaacaagcatcccctctaaagaatggcagttt2580tcctttgcatgtaactattatgctcccttcgttacaaaaattttggactactattgggaa2640cttcttctgaaaatagtggccaccgcttaattaaggcgcgccatgcccgggcaagcggcc2700gcacaagtttgtacaaaaaagcaggctccgcggtgactgactgaaaagcttgtcgacctg2760caggtcaacggatcaggatattcttgtttaagatgttgaactctatggaggtttgtatga2820actgatgatctaggaccggataagttcccttcttcatagcgaacttattcaaagaatgtt2880ttgtgtatcattcttgttacattgttattaatgaaaaaatattattggtcattggactga2940acacgagtgttaaatatggaccaggccccaaataagatccattgatatatgaattaaata3000acaagaataaatcgagtcaccaaaccacttgccttttttaacgagacttgttcaccaact3060tgatacaaaagtcattatcctatgcaaatcaataatcatacaaaaatatccaataacact3120aaaaaattaaaagaaatggataatttcacaatatgttatacgataaagaagttacttttc3180caagaaattcactgattttataagcccacttgcattagataaatggcaaaaaaaaacaaa3240aaggaaaagaaataaagcacgaagaattctagaaaatacgaaatacgcttcaatgcagtg3300ggacccacggttcaattattgccaattttcagctccaccgtatatttaaaaaataaaacg3360ataatgctaaaaaaatataaatcgtaacgatcgttaaatctcaacggctggatcttatga3420cgaccgttagaaattgtggttgtcgacgagtcagtaataaacggcgtcaaagtggttgca3480gccggcacacacgagtcgtgtttatcaactcaaagcacaaatacttttcctcaacctaaa3540aataaggcaattagccaaaaacaactttgcgtgtaaacaacgctcaatacacgtgtcatt3600ttattattagctattgcttcaccgccttagctttctcgtgacctagtcgtcctcgtcttt3660tcttcttcttcttctataaaacaatacccaaagcttcttcttcacaattcagatttcaat3720ttctcaaaatcttaaaaactttctctcaattctctctaccgtgatcaaggtaaatttctg3780tgttccttattctctcaaaatcttcgattttgttttcgttcgatcccaatttcgtatatg3840ttctttggtttagattctgttaatcttagatcgaagacgattttctgggtttgatcgtta3900gatatcatcttaattctcgattagggtttcataaatatcatccgatttgttcaaataatt3960tgagttttgtcgaataattactcttcgatttgtgatttctatctagatctggtgttagtt4020tctagtttgtgcgatcgaatttgtcgattaatctgagtttttctgattaacagagatctc4080catggctcagaccactctccaaatcacacccactggtgccaccttgggtgccacagtcac4140tggtgttcaccttgccacacttgacgatgctggtttcgctgccctccatgcagcctggct4200tcaacatgcactcttgatcttccctgggcaacacctcagcaatgaccaacagattacctt4260tgctaaacgctttggagcaattgagaggattggcggaggtgacattgttgccatatccaa4320tgtcaaggcagatggcacagtgcgccagcactctcctgctgagtgggatgacatgatgaa4380ggtcattgtgggcaacatggcctggcacgccgactcaacctacatgccagtcatggctca4440aggagctgtgttcagcgcagaagttgtcccagcagttgggggcagaacctgctttgctga4500catgagggcagcctacgatgcccttgatgaggcaacccgtgctcttgttcaccaaaggtc4560tgctcgtcactcccttgtgtattctcagagcaagttgggacatgtccaacaggccgggtc4620agcctacataggttatggcatggacaccactgcaactcctctcagaccattggtcaaggt4680gcatcctgagactggaaggcccagcctcttgatcggccgccatgcccatgccatccctgg4740catggatgcagctgaatcagagcgcttccttgaaggacttgttgactgggcctgccaggc4800tcccagagtccatgctcaccaatgggctgctggagatgtggttgtgtgggacaaccgctg4860tttgctccaccgtgctgagccctgggatttcaagttgccacgtgtgatgtggcactccag4920actcgctggacgcccagaaactgagggtgctgccttggtttgagtagttagcttaatcac4980ctagagctcggtcaccagcataatttttattaatgtactaaattactgttttgttaaatg5040caattttgctttctcgggattttaatatcaaaatctatttagaaatacacaatattttgt5100tgcaggcttgctggagaatcgatctgctatcataaaaattacaaaaaaattttatttgcc5160tcaattattttaggattggtattaaggacgcttaaattatttgtcgggtcactacgcatc5220attgtgattgagaagatcagcgatacgaaatattcgtagtactatcgataatttatttga5280aaattcataagaaaagcaaacgttacatgaattgatgaaacaatacaaagacagataaag5340ccacgcacatttaggatattggccgagattactgaatattgagtaagatcacggaatttc5400tgacaggagcatgtcttcaattcagcccaaatggcagttgaaatactcaaaccgccccat5460atgcaggagcggatcattcattgtttgtttggttgcctttgccaacatgggagtccaagg5520ttgcggccgcgcgccgacccagctttcttgtacaaagtggttgcggccgcttaattaaat5580ttaaatgcccgggcgtttaaacgcggccgcttaattaaggccggcctgcagcaaacccag5640aaggtaattatccaagatgtagcatcaagaatccaatgtttacgggaaaaactatggaag5700tattatgtaagctcagcaagaagcagatcaatatgcggcacatatgcaacctatgttcaa5760aaatgaagaatgtacagatacaagatcctatactgccagaatacgaagaagaatacgtag5820aaattgaaaaagaagaaccaggcgaagaaaagaatcttgaagacgtaagcactgacgaca5880acaatgaaaagaagaagataaggtcggtgattgtgaaagagacatagaggacacatgtaa5940ggtggaaaatgtaagggcggaaagtaaccttatcacaaaggaatcttatcccccactact6000tatccttttatatttttccgtgtcatttttgcccttgagttttcctatataaggaaccaa6060gttcggcatttgtgaaaacaagaaaaaatttggtgtaagctattttctttgaagtactga6120ggatacaacttcagagaaatttgtaagtttgtagatctccatgtctccggagaggagacc6180agttgagattaggccagctacagcagctgatatggccgcggtttgtgatatcgttaacca6240ttacattgagacgtctacagtgaactttaggacagagccacaaacaccacaagagtggat6300tgatgatctagagaggttgcaagatagatacccttggttggttgctgaggttgagggtgt6360tgtggctggtattgcttacgctgggccctggaaggctaggaacgcttacgattggacagt6420tgagagtactgtttacgtgtcacataggcatcaaaggttgggcctaggatccacattgta6480cacacatttgcttaagtctatggaggcgcaaggttttaagtctgtggttgctgttatagg6540ccttccaaacgatccatctgttaggttgcatgaggctttgggatacacagcccggggtac6600attgcgcgcagctggatacaagcatggtggatggcatgatgttggtttttggcaaaggga6660ttttgagttgccagctcctccaaggccagttaggccagttacccagatctgaggtaccct6720gagcttgagcttatgagcttatgagcttagagctcggatccactagtaacggccgccagt6780gtgctggaattcgcccttgactagataggcgcccagatcggcggcaatagcttcttagcg6840ccatcccgggttgatcctatctgtgttgaaatagttgcggtgggcaaggctctctttcag6900aaagacaggcggccaaaggaacccaaggtgaggtgggctatggctctcagttccttgtgg6960aagcgcttggtctaaggtgcagaggtgttagcgggatgaagcaaaagtgtccgattgtaa7020caagatatgttgatcctacgtaaggatattaaagtatgtattcatcactaatataatcag7080tgtattccaatatgtactacgatttccaatgtctttattgtcgccgtatgtaatcggcgt7140cacaaaataatccccggtgactttcttttaatccaggatgaaataatatgttattataat7200ttttgcgatttggtccgttataggaattgaagtgtgcttgcggtcgccaccactcccatt7260tcataattttacatgtatttgaaaaataaaaatttatggtattcaatttaaacacgtata7320cttgtaaagaatgatatcttgaaagaaatatagtttaaatatttattgataaaataacaa7380gtcaggtattatagtccaagcaaaaacataaatttattgatgcaagtttaaattcagaaa7440tatttcaataactgattatatcagctggtacattgccgtagatgaaagactgagtgcgat7500attatggtgtaatacatagcggccgggtttctagtcaccggttaggatccgtttaaactc7560gaggctagcgcatgcacatagacacacacatcatctcattgatgcttggtaataattgtc7620attagattgtttttatgcatagatgcactcgaaatcagccaattttagacaagtatcaaa7680cggatgtgacttcagtacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcgtc7740aaagaaaaggttatcgagtagccgagttggaaccgtcttacccaacacgaggtaagtcat7800taagcatgtagtgggtgttattttaaatggtcataatgtgtatgtattgatgctgattgg7860aatgaataaatatacatatatatatatgcatgtacgtatgtgatgatgaaattgttgaat7920gaatgaaaagaggtaagatgtactgagttgttgatctcggcactaaacatgcgggataac7980catttatgaccatgagattggcgctaagtgcgcgggattaaattgtacagcactaagtgt8040gcgattcgactatgttgcactaagtgtgcgaaatggatatgatgcactaagtgtgcgaat8100tgaccatgcggcactaagtgtgcgagatggactatgtggcactaagtgtgcgatttgatt8160acgtagcactaagtgtgcgatttgattacgtagcactaagtgtgcgagttgattatatag8220cactgagtgtgcgggctcaataaatattcgtgaatcattacggacactatgtgtgcgaca8280ctattgagtcgatcgcggacagcggatcgggtaagtgttttgagtacatggctattatgt8340gctatgcttatacttggtgttgagctcggtaagttcgaacctatgtgacaaatatacttg8400aagtcacgtacataaaatttatcgtaggatgggtgaaaggccgtatagtcgtttggttgt8460aacgaaaataaatcgatttacgaaattgcttcaatgtcctattgatgagtatatagaatg8520tgaatgcatgaattgatatgaaattgaattgataagttggaggaactatggtatggttcg8580gtatggatggagtaaattgtctcgttccattttgtttcctcttgtgataatgtcgttgat8640agatggtagtgcattgcttatgacttactgagttataaactcactcgatgtttccttgtc8700acccactataggttgcttggactcatctatttttgcggggtcgggccgtcattgaagtca8760tcacaccggatagcaagttttggtactttcttcttagtgtgcttagaagatcattttggc8820atgtataagctagtacgttgtgtttgaattatggcatgtaaactttaagccatgcgaaaa8880tggcacgaatgttcgattgagttggatcaagggtaggcatgaaatggacatagttacttt8940cgtaacagatgctggcggcagcagtgtcatgagattgaaaaatcactaaaaatagtagga9000gtggaattaattgatgaataaattatgtaatcgaagctcgatgagtctgctttcatgagg9060aagtaacgaaatgatcatatgggcagtatattaagagataatcagatttttgtgggacag9120ggccagaacggtttctggattccctgctccgactttggtaattcattataaattaaccag9180agataattaggggtcgtaccatatatgtacagattcctctctaagtctagttttcataga9240aacaaacggcaacagtattgaagccccgtgcagggagatatcccagtcgtaatgggaaaa9300ggtcagtgtagtcgacacctgcaacttgggggactttgactaataaactgtaataattgg9360cccaaccaaaaattctagaaaaaaatacatagatgggcaaatgagtctagtttctgggaa9420aaattacgaaactgattttcgagttacgaaactcaagatatgatttttaaagcggctagt9480acacagattgggcagtgtctggaaaataaattttgtaaggggttaaagccagataacacc9540tcgtgttcgactccggtgtcggtttcgggttcggggtgttacattttattggtatcagag9600ctatggtttagtcggttctaggactaccatagcacgtatgagtctagctatacatgccat9660aatgttaatgtttaaaagggtgatgacttctgacggttgaaatgtttttgtcttgattag9720taaatggatcccggtgaagaaagaaccctagcggatgacgttgagagcgtagcggctgct9780cctgcacaagggacgccgcctgttgaacctcagtcatctgcgaataatcaaggtgagggg9840gctaaacaagccttctttaccatgatgaatgagtgggtcgcgcagtatgcccgagccaac9900ccggctgtccaacaattcccaaatttgaataatccaccccaagagcctgtaatgccatca9960gtcgctgatcctgtgaggctgagtaagccaccggtagacttgattaggaagcgtggggcc10020gaggagttcaaggccatagtaactgatgatgccgaaagggccgagttctggcttgataac10080accattcgggtgctcgatgaattgtcatgcacacccgatgaatgtctaaaatgtgctgta10140tctttgttgcgagactcagcctactattggtggaggaccttgatttccatagtcccgaac10200gagcgagtaacttgggacttctttcaaacgaaattccgaaagaaatttattagccagcgg10260ttcattgatcagaagcgtaaggagttcttggaactcaagcaaggccgtatgactgtatct10320gaatacgaacatgaattcgtaagacttagtaggtatgcccgggagtgtgtagctgatgag10380gttgctatgtgcaaaagatttgaggaaggattgaatgaagatttaaagctactaatgggt10440attttggaaataaaggaatttgtaacactag104711當(dāng)前第1頁12