本發(fā)明涉及一種生物芯片，尤其涉及到一種用于篩選定位及檢測(cè)血液中稀有細(xì)胞的生物芯片。

背景技術(shù)：

近年來，ctc(circulatingtumorcell：循環(huán)腫瘤細(xì)胞)研究得到了越來越多的關(guān)注，許多研究報(bào)告已經(jīng)證實(shí)ctc在腫瘤轉(zhuǎn)移的早期診斷、療效監(jiān)控、個(gè)體化治療及探索腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制等方面具有潛在的價(jià)值，然而ctc在循環(huán)系統(tǒng)中的含量極低，往往大約一千萬個(gè)正常血細(xì)胞中才會(huì)發(fā)現(xiàn)一個(gè)或數(shù)個(gè)ctc，要想有效富集這些細(xì)胞極其困難，需要借助專門的生物芯片和靈敏的檢測(cè)設(shè)備，這成為限制其臨床相關(guān)應(yīng)用的主要難點(diǎn)。

目前對(duì)ctc的分選富集方法主要分為生物學(xué)方法和物理學(xué)方法兩大類。生物學(xué)方法指的是選擇特異性抗體對(duì)細(xì)胞表面表達(dá)的生物標(biāo)志物進(jìn)行特異性的抗原抗體吸附，從而能動(dòng)分選富集目的細(xì)胞或特異性去除非目的細(xì)胞以外的細(xì)胞與蛋白，僅保留目的細(xì)胞。其最大的優(yōu)點(diǎn)是高特異性，能夠高效識(shí)別ctc，其缺點(diǎn)主要有：1、由于抗原抗體的吸附作用不能在較高流速下進(jìn)行，因此限制了其流速，從而較為耗時(shí)，通量低；2、抗原抗體反應(yīng)會(huì)影響細(xì)胞活性，導(dǎo)致細(xì)胞表面的抗原(表面標(biāo)志物)表達(dá)不確定；3、抗體試劑價(jià)格較為高昂。

物理方法指的是利用外力場(chǎng)(例如磁場(chǎng)、電場(chǎng)、流體場(chǎng)、超聲波等)基于細(xì)胞間的物理特性差異(大小、變形性、密度、介電性等)進(jìn)行分離。例如申請(qǐng)?zhí)枮?01210477243.5的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)文件公開了“一種用于篩選血液中稀有細(xì)胞的生物芯片”，其結(jié)構(gòu)如下：包括具有凹槽的薄片和載玻片，薄片上的凹槽朝向載玻片并將薄片緊貼在所述的載玻片上，使薄片和載玻片之間形成一個(gè)密閉的微流體通道；所述的薄片上開設(shè)有連通所述的微流體通道的出液孔和進(jìn)液孔。其在血液樣本內(nèi)放入磁性納米粒子，磁性納米粒子吸附在目標(biāo)細(xì)胞上，然后將稀有細(xì)胞已被標(biāo)記的血液樣本流經(jīng)微流體通道，血液樣本中的附著有磁性納米粒子的稀有細(xì)胞被放置于生物芯片下方的磁性體發(fā)出的梯度磁場(chǎng)引導(dǎo)，等采集工作完成后，將載玻片與薄片分離，對(duì)載玻片上的稀有細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)分析。該結(jié)構(gòu)的生物芯片在使用過程中存在如下缺點(diǎn)：1、自由納米粒子和被標(biāo)記的納米粒子腫瘤細(xì)胞往往會(huì)被吸附并聚集在載玻片上的一個(gè)小范圍內(nèi)，這種聚集可能會(huì)在識(shí)別過程中干擾甚至損壞腫瘤細(xì)胞；2、標(biāo)記的目標(biāo)納米粒子腫瘤細(xì)胞在弱磁場(chǎng)區(qū)域內(nèi)滾動(dòng)，在沒有被磁性體捕獲的情況下容易從微流體通道內(nèi)逃脫。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的在于提供一種能高效捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞、不損壞循環(huán)腫瘤細(xì)胞且方便后續(xù)檢測(cè)的用于篩選定位及檢測(cè)血液中稀有細(xì)胞的生物芯片。

為達(dá)到以上目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種用于篩選定位及檢測(cè)血液中稀有細(xì)胞的生物芯片，包括基層和微流控通道層，所述的微流控通道層緊貼設(shè)置在所述的基層上，所述的微流控通道層的上表面設(shè)置有捕獲槽，所述的捕獲槽的槽底設(shè)置有多個(gè)富集坑，所述的富集坑的深度為15～50微米，所述的微流控通道層的上表面緊貼設(shè)置有信號(hào)放大層，所述的信號(hào)放大層的上表面上與所述的捕獲槽對(duì)應(yīng)的位置處設(shè)置有納米金層，貫穿所述的納米金層以及所述的信號(hào)放大層設(shè)置有進(jìn)入通道和排出通道，所述的進(jìn)入通道和所述的排出通道分別與所述的捕獲槽連通。

所述的捕獲槽由依次連通的呈三角形的入口區(qū)域、呈矩形的捕獲區(qū)域和呈三角形的出口區(qū)域組成，所述的進(jìn)入通道與所述的入口區(qū)域位置對(duì)應(yīng)且連通，多個(gè)所述的富集坑設(shè)置在所述的捕獲區(qū)域內(nèi)，所述的排出通道與所述的出口區(qū)域位置對(duì)應(yīng)且連通。該結(jié)構(gòu)中，捕獲槽整體呈六邊形設(shè)計(jì)，從流體力學(xué)角度出發(fā)，經(jīng)過程序模擬運(yùn)算，得出的結(jié)論是六邊型形體分布最均勻，其能夠支持高流量的細(xì)胞分選捕獲。

多個(gè)所述的富集坑呈陣列分布設(shè)置在所述的捕獲區(qū)域內(nèi)。在本芯片的外部設(shè)置有磁場(chǎng)，當(dāng)磁性納米粒子標(biāo)記的循環(huán)腫瘤細(xì)胞流經(jīng)捕獲區(qū)域時(shí)，就會(huì)在磁場(chǎng)力的作用下發(fā)生垂直于流速方向的偏轉(zhuǎn)，進(jìn)入到富集坑，從而實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分選，多個(gè)富集坑的設(shè)置提高了分選捕獲的效率。

所述的基層為二氧化硅層，所述的微流控通道層為二氧化硅層、塑料層或者樹脂層，所述的信號(hào)放大層為二氧化硅層。在加工時(shí)，將基層、微流控通道層、信號(hào)放大層和納米金層依次整齊疊加，放入到80℃的烘箱當(dāng)中進(jìn)行固化，得到完整的結(jié)構(gòu)。

所述的基層的厚度為1～2毫米，所述的微流控通道層的厚度為0.1～0.3毫米，所述的信號(hào)放大層的厚度為10～30微米。該結(jié)構(gòu)中，各個(gè)層的厚度經(jīng)過實(shí)驗(yàn)對(duì)比以后，達(dá)到以上數(shù)據(jù)，在達(dá)到高效捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞的情況下節(jié)省芯片制作成本。

所述的捕獲槽的表面修飾有特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞的anti-epcam抗體或者anti-cd45抗體。該結(jié)構(gòu)中，anti-epcam抗體用于捕獲表面具有epcam抗原的內(nèi)源性的ctc細(xì)胞，而cd45是白細(xì)胞的通用抗原，使用cd45抗體的目的在于去除血液中表達(dá)cd45抗原的其它細(xì)胞，如白細(xì)胞，單球等與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)量的免疫系統(tǒng)的細(xì)胞與蛋白，結(jié)合物理篩選方法，與純生物學(xué)篩選相比，降低了制作成本，進(jìn)一步達(dá)到分選純度高的目的。

所述的基層緊貼設(shè)置在所述的微流控通道層上，所述的微流控通道層的上表面設(shè)置有捕獲槽，所述的捕獲槽的槽底設(shè)置有多個(gè)富集坑，所述的富集坑的深度為15～50微米，所述的基層的上表面緊貼設(shè)置有信號(hào)放大層，所述的信號(hào)放大層的上表面上與所述的捕獲槽對(duì)應(yīng)的位置處設(shè)置有納米金層，貫穿所述的納米金層、所述的信號(hào)放大層及所述的基層設(shè)置有進(jìn)入通道和排出通道，所述的進(jìn)入通道和所述的排出通道分別與所述的捕獲槽連通。為了便于圖示及兼顧微流控芯片的整體結(jié)構(gòu)，本芯片富集與捕獲ctc的核心部位被設(shè)計(jì)在三層結(jié)構(gòu)微流控芯片的中間，但是出于預(yù)防ctc富集與染色標(biāo)記時(shí)可能出現(xiàn)的交叉污染與實(shí)際應(yīng)用的便利性，產(chǎn)品化的該微流控芯片可能將微流控通道層放置在底部，直接連接待富集標(biāo)本的進(jìn)入通道和排出通道，基層緊貼設(shè)置在所述的微流控通道層上提供支撐，而信號(hào)放大層的位置不變。

所述的捕獲槽由依次連通的呈三角形的入口區(qū)域、呈矩形的捕獲區(qū)域和呈三角形的出口區(qū)域組成，所述的進(jìn)入通道與所述的入口區(qū)域位置對(duì)應(yīng)且連通，多個(gè)所述的富集坑設(shè)置在所述的捕獲區(qū)域內(nèi)，所述的排出通道與所述的出口區(qū)域位置對(duì)應(yīng)且連通。該結(jié)構(gòu)中，捕獲槽整體呈六邊形設(shè)計(jì)，從流體力學(xué)角度出發(fā)，經(jīng)過程序模擬運(yùn)算，得出的結(jié)論是六邊型形體分布最均勻，其能夠支持高流量的細(xì)胞分選捕獲。

多個(gè)所述的富集坑呈陣列分布設(shè)置在所述的捕獲區(qū)域內(nèi)。在本芯片的外部設(shè)置有磁場(chǎng)，當(dāng)磁性納米粒子標(biāo)記的循環(huán)腫瘤細(xì)胞流經(jīng)捕獲區(qū)域時(shí)，就會(huì)在磁場(chǎng)力的作用下發(fā)生垂直于流速方向的偏轉(zhuǎn)，進(jìn)入到富集坑，從而實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分選，多個(gè)富集坑的設(shè)置提高了分選捕獲的效率。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：通過在微流控通道層設(shè)置捕獲槽，捕獲槽設(shè)置有多個(gè)富集坑，待分選的血液從進(jìn)入通道進(jìn)入到捕獲槽后，在外界磁場(chǎng)的作用下，事先被磁性納米粒子標(biāo)記的循環(huán)腫瘤細(xì)胞流經(jīng)富集坑時(shí)，就會(huì)在磁場(chǎng)力的作用下發(fā)生垂直于流速方向的偏轉(zhuǎn)，進(jìn)入到富集坑，避免了循壞腫瘤細(xì)胞過度聚集，而未被標(biāo)記的細(xì)胞則從排出通道流出，從而實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲；信號(hào)放大層不直接參與捕獲細(xì)胞前后的各種工序，依靠表層納米金的信號(hào)放大效應(yīng)，放大檢測(cè)信號(hào)，能夠?qū)崿F(xiàn)后續(xù)的快速分析；本發(fā)明能高效捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞、不損壞循環(huán)腫瘤細(xì)胞，同時(shí)方便后續(xù)檢測(cè)。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例一、實(shí)施例二和實(shí)施例三的分解狀態(tài)的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例四的分解狀態(tài)的結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。

實(shí)施例一：如圖所示，一種用于篩選定位及檢測(cè)血液中稀有細(xì)胞的生物芯片，包括基層1和微流控通道層2，微流控通道層2緊貼設(shè)置在基層1上，微流控通道層2的上表面設(shè)置有捕獲槽21，捕獲槽21的槽底設(shè)置有多個(gè)富集坑22，富集坑22的深度為15～50微米，微流控通道層2的上表面緊貼設(shè)置有信號(hào)放大層3，信號(hào)放大層3的上表面上與捕獲槽21對(duì)應(yīng)的位置處設(shè)置有納米金層4，貫穿納米金層4以及信號(hào)放大層3設(shè)置有進(jìn)入通道5和排出通道6，進(jìn)入通道5和排出通道6分別與捕獲槽21連通。

實(shí)施例二：如圖所示，一種用于篩選定位及檢測(cè)血液中稀有細(xì)胞的生物芯片，包括基層1和微流控通道層2，微流控通道層2緊貼設(shè)置在基層1上，微流控通道層2的上表面設(shè)置有捕獲槽21，捕獲槽21的槽底設(shè)置有多個(gè)富集坑22，富集坑22的深度為15～50微米，微流控通道層2的上表面緊貼設(shè)置有信號(hào)放大層3，信號(hào)放大層3的上表面上與捕獲槽21對(duì)應(yīng)的位置處設(shè)置有納米金層4，貫穿納米金層4以及信號(hào)放大層3設(shè)置有進(jìn)入通道5和排出通道6，進(jìn)入通道5和排出通道6分別與捕獲槽21連通。

本實(shí)施例中，捕獲槽21由依次連通的呈三角形的入口區(qū)域23、呈矩形的捕獲區(qū)域24和呈三角形的出口區(qū)域25組成，進(jìn)入通道5與入口區(qū)域23位置對(duì)應(yīng)且連通，多個(gè)富集坑22設(shè)置在捕獲區(qū)域24內(nèi)，排出通道6與出口區(qū)域25位置對(duì)應(yīng)且連通。

本實(shí)施例中，多個(gè)富集坑22呈陣列分布設(shè)置在捕獲區(qū)域24內(nèi)。富集坑22的截面形狀為三角形、矩形、圓形等，優(yōu)選的是圓形，且截面的尺徑范圍為10-20微米。

在具體使用時(shí)，首先在血液樣本內(nèi)放入磁性納米粒子，磁性納米粒子表面帶有抗體，通過免疫反應(yīng)吸附在目標(biāo)細(xì)胞上，然后將目標(biāo)細(xì)胞已被標(biāo)記的血液樣本從進(jìn)入通道5進(jìn)入到捕獲槽21當(dāng)中，在外置磁場(chǎng)的作用下，已被標(biāo)記的ctc發(fā)生垂直于流速方向的偏轉(zhuǎn)，進(jìn)入到富集坑22，一個(gè)富集坑22只能容納一個(gè)被標(biāo)記的細(xì)胞，未被標(biāo)記的細(xì)胞則從排出通道6流出，之后取出芯片，往捕獲槽21注入少量紅外熒光染料，結(jié)合納米金層4，可放大的檢出信號(hào)強(qiáng)度優(yōu)于傳統(tǒng)的熒光信號(hào)，極大方便了后續(xù)分析。

實(shí)施例三：如圖所示，一種用于篩選定位及檢測(cè)血液中稀有細(xì)胞的生物芯片，包括基層1和微流控通道層2，微流控通道層2緊貼設(shè)置在基層1上，微流控通道層2的上表面設(shè)置有捕獲槽21，捕獲槽21的槽底設(shè)置有多個(gè)富集坑22，富集坑22的深度為15～50微米，微流控通道層2的上表面緊貼設(shè)置有信號(hào)放大層3，信號(hào)放大層3的上表面上與捕獲槽21對(duì)應(yīng)的位置處設(shè)置有納米金層4，貫穿納米金層4以及信號(hào)放大層3設(shè)置有進(jìn)入通道5和排出通道6，進(jìn)入通道5和排出通道6分別與捕獲槽21連通。

本實(shí)施例中，捕獲槽21由依次連通的呈三角形的入口區(qū)域23、呈矩形的捕獲區(qū)域24和呈三角形的出口區(qū)域25組成，進(jìn)入通道5與入口區(qū)域23位置對(duì)應(yīng)且連通，多個(gè)富集坑22設(shè)置在捕獲區(qū)域24內(nèi)，排出通道6與出口區(qū)域25位置對(duì)應(yīng)且連通。

本實(shí)施例中，多個(gè)富集坑22呈陣列分布設(shè)置在捕獲區(qū)域24內(nèi)。富集坑22的截面形狀為三角形、矩形、圓形等，優(yōu)選的是圓形，且截面的尺徑范圍為10～20微米。

本實(shí)施例中，基層1為二氧化硅層，微流控通道層2為二氧化硅層、塑料層或者樹脂層，信號(hào)放大層3為二氧化硅層。

本實(shí)施例中，基層1的厚度為1～2毫米，微流控通道層2的厚度為0.1～0.3毫米，信號(hào)放大層3的厚度為10～30微米。

本實(shí)施例中，捕獲槽21的表面修飾有特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞的anti-epcam抗體或者anti-cd45抗體。特別是富集坑22的表面也設(shè)置有anti-epcam抗體或者anti-cd45抗體。

實(shí)施例四：如圖所示，一種用于篩選定位及檢測(cè)血液中稀有細(xì)胞的生物芯片，包括微流控通道層2和基層1，基層1緊貼設(shè)置在微流控通道層2上，微流控通道層2的上表面設(shè)置有捕獲槽21，捕獲槽21的槽底設(shè)置有多個(gè)富集坑22，富集坑22的深度為15～50微米，基層1的上表面緊貼設(shè)置有信號(hào)放大層3，信號(hào)放大層3的上表面上與捕獲槽21對(duì)應(yīng)的位置處設(shè)置有納米金層4，貫穿納米金層4、信號(hào)放大層3及基層1設(shè)置有進(jìn)入通道5和排出通道6，進(jìn)入通道5和排出通道6分別與捕獲槽21連通。

本實(shí)施例中，捕獲槽21由依次連通的呈三角形的入口區(qū)域23、呈矩形的捕獲區(qū)域24和呈三角形的出口區(qū)域25組成，進(jìn)入通道5與入口區(qū)域23位置對(duì)應(yīng)且連通，多個(gè)富集坑22設(shè)置在捕獲區(qū)域24內(nèi)，排出通道6與出口區(qū)域25位置對(duì)應(yīng)且連通。

本實(shí)施例中，多個(gè)富集坑22呈陣列分布設(shè)置在捕獲區(qū)域24內(nèi)。