本發(fā)明屬于植物細胞原生質(zhì)體分離純化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種植物細胞原生質(zhì)體純化儀及純化方法。

背景技術(shù)：

植物細胞原生質(zhì)體是指將植物細胞壁去除后的原生質(zhì)團，在適宜的滲透液中保持球型的細胞。目前原生質(zhì)體在植物細胞工程中占據(jù)很重要的位置，不但是植物細胞雜交的良好親本，還是植物遺傳工程的理想受體是細胞生物學(xué)研究的重要材料。植物細胞原生質(zhì)體分離是達到這些目的的重要技術(shù)基礎(chǔ)。

傳統(tǒng)的原生質(zhì)體純化方法有自然沉降法、密度梯度離心法。自然沉降法將過濾和沉降相結(jié)合，酶解液濾網(wǎng)過濾后置于試管內(nèi)，組織碎片、未去壁細胞、原生質(zhì)體和葉綠體等細胞器在重力作用下下降速度不同，根據(jù)經(jīng)驗吸取原生質(zhì)體較多的懸浮液以獲得原生質(zhì)的純化；離心漂浮法是將酶解液置于離心管內(nèi)，再將高滲溶液加至離心管底部(如25％蔗糖溶液)，在酶解液和高滲溶液之間形成一個界面，再通過一定速度的水平離心，組織碎片、未完全去壁的細胞破碎的細胞體沉于離心管底部，完好的原生質(zhì)體集中在高滲上層和酶解液之間的界面上，細胞器如葉綠體則仍留在酶解液中，小心吸取原生質(zhì)體液層以獲得純化。

然而傳統(tǒng)的自然沉降法、密度梯度離心法等繁瑣，損壞嚴重，得率低，且通過密度梯度離心的對原生質(zhì)體的破壞較大，得率低。有必要開發(fā)一種步驟簡化、得率高的原生質(zhì)體純化裝置。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供的一種植物細胞原生質(zhì)體純化儀及純化方法，解決了傳統(tǒng)的自然沉降法、密度梯度離心法等繁瑣，損壞嚴重，得率低，且通過密度梯度離心的對原生質(zhì)體的破壞較大，得率低的問題。

本發(fā)明的目的是提供一種植物細胞原生質(zhì)體純化儀及純化方法，包括電泳池，所述電泳池內(nèi)從上到下依次劃分為加樣室、滴漏室和電泳室，所述滴漏室為漏斗形狀，所述加樣室與所述滴漏室連通、并且所述滴漏室上端與所述加樣室通過濾膜隔開，所述電泳室的左側(cè)設(shè)置有負電極，右側(cè)設(shè)置有正電極，所述電泳室的底部從左至右分別連通有細胞碎片收集盤、原生質(zhì)體收集盤和葉綠體收集盤，所述細胞碎片收集盤位于所述滴漏室的下方，所述葉綠體收集盤靠近所述正電極設(shè)置，所述電泳室內(nèi)還縱向設(shè)置有濾網(wǎng)，所述濾網(wǎng)位于原生質(zhì)體收集盤的右側(cè)壁上方。

優(yōu)選的，所述的植物細胞原生質(zhì)體純化儀中，所述濾膜的孔徑φ為50-100微米。

優(yōu)選的，所述的植物細胞原生質(zhì)體純化儀中，所述濾膜擱置在滴漏室上端端口處。

優(yōu)選的，所述的植物細胞原生質(zhì)體純化儀中，所述濾網(wǎng)的孔徑φ為10微米。

優(yōu)選的，所述的植物細胞原生質(zhì)體純化儀中，所述電泳室的上端靠近所述正電極處開設(shè)有濾網(wǎng)插孔，并且電泳室的兩個相對的側(cè)壁上分別開設(shè)有濾網(wǎng)滑槽，所述濾網(wǎng)的寬度小于所述濾網(wǎng)插孔的長度，所述濾網(wǎng)的厚度小于所述濾網(wǎng)插孔的寬度，并且所述濾網(wǎng)的兩側(cè)與兩個濾網(wǎng)滑槽一一對應(yīng)滑動連接。

優(yōu)選的，所述的植物細胞原生質(zhì)體純化儀中，所述電泳池的外部還設(shè)置有直流電泳儀，并且所述直流電泳儀的負極與所述負電極電連接，正極與所述正電極電連接。

優(yōu)選的，所述的植物細胞原生質(zhì)體純化儀中，所述細胞碎片收集盤、所述原生質(zhì)體收集盤和所述葉綠體收集盤均可拆卸的連接在所述電泳室的底部，具體結(jié)構(gòu)為：所述電泳室的底部從左至右分別連通有細胞碎片流通管、原生質(zhì)體收流通管和葉綠體流通管，所述細胞碎片收集盤的開口端與所述細胞碎片流通管底部螺接，所述原生質(zhì)體收集盤的開口端與所述原生質(zhì)體收流通管底部螺接，所述葉綠體收集盤的開口端與所述葉綠體流通管底部螺接。

優(yōu)選的，所述的植物細胞原生質(zhì)體純化儀中，所述細胞碎片收集盤與所述細胞碎片流通管之間、所述原生質(zhì)體收集盤與所述原生質(zhì)體收流通管之間，所述葉綠體收集盤與所述葉綠體流通管之間均設(shè)置有密封圈。

本發(fā)明還提供了一種所述的植物細胞原生質(zhì)體純化儀的純化方法，包括以下步驟：

s1，電泳室(3)內(nèi)裝滿0.5mol/l的甘露醇緩沖液，將直流電泳儀(7)的電場強度調(diào)節(jié)在1.5-5v/cm，進行電泳；

s2，電泳開始后，將制備好的原生質(zhì)體混合物懸浮液按照6-12滴/分鐘的速度滴加入加樣室(1)內(nèi)直至滴加完畢，然后繼續(xù)電泳30min；

s3，關(guān)閉電源，收集原生質(zhì)體收集盤(5)內(nèi)的原生質(zhì)體。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本實用發(fā)明提供的一種植物細胞原生質(zhì)體純化儀及純化方法，具有以下有益效果：

1、本發(fā)明的植物細胞原生質(zhì)體純化儀利用植物原生質(zhì)體帶電不同通過電泳的方式分離原生質(zhì)體的方法，整個過程只需要一種緩沖液，簡化了步驟，降低了原生質(zhì)體的損壞和污染率，可以批量篩分。解決了現(xiàn)有技術(shù)中自然沉降法、密度梯度離心法等步驟復(fù)雜，得率低，且通過密度梯度離心的對原生質(zhì)體的破壞較大，得率低的問題。

2、本發(fā)明的純化方法通過一種高滲溶液將不同組分分離開來，減少試劑的使用，在緩沖液中條件溫和，減少了操作步驟及其傳統(tǒng)離心步驟對原生質(zhì)體的破壞，提高了得率。

附圖說明

圖1為本發(fā)明植物細胞原生質(zhì)體純化儀的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為本發(fā)明植物細胞原生質(zhì)體純化儀的工作原理圖。

附圖標(biāo)記說明：1.加樣室，11.濾膜，2.滴漏室，3.電泳室，31.負電極，32.正電極，4.細胞碎片收集盤，5.原生質(zhì)體收集盤，6.葉綠體收集盤，33.濾網(wǎng)，331.濾網(wǎng)滑槽，7.直流電泳儀。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明，但不應(yīng)理解為本發(fā)明的限制。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法，通常按照常規(guī)條件操作。當(dāng)實施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。

本發(fā)明提供一種植物細胞原生質(zhì)體純化儀，具體如圖1所示，包括由絕緣材料制備而成的電泳池，所述電泳池內(nèi)從上到下依次劃分為加樣室1、滴漏室2和電泳室3，所述滴漏室2為漏斗形狀，加樣室1與滴漏室2連通、并且所述滴漏室2上端端口與所述加樣室1通過濾膜11隔開，所述濾膜11的孔徑φ為50-100微米，所述電泳室3的左側(cè)設(shè)置有負電極31，右側(cè)設(shè)置有正電極32，所述電泳室3的底部從左至右分別連通有細胞碎片收集盤4、原生質(zhì)體收集盤5和葉綠體收集盤6，細胞碎片收集盤4、原生質(zhì)體收集盤5和葉綠體收集盤6之間的間距為2-5cm，所述細胞碎片收集盤4位于所述滴漏室2的正下方，并且細胞碎片收集盤4和滴漏室2的寬度、長度相等，寬度、長度均為2-8cm，所述原生質(zhì)體收集盤5的寬度、長度為2-8cm，原生質(zhì)體收集盤5位于所述細胞碎片收集盤4的右側(cè)，所述葉綠體收集盤6位于原生質(zhì)體收集盤5的右側(cè)、并且靠近所述正電極32設(shè)置，所述葉綠體收集盤6與所述正電極32之間的距離為0-1cm，所述電泳室3內(nèi)還縱向設(shè)置有可拆卸的濾網(wǎng)33，所述濾網(wǎng)33的孔徑φ為10微米，所述濾網(wǎng)33位于原生質(zhì)體收集盤5的右側(cè)壁上方。

需要說明的是，所述電泳池的外部還設(shè)置有直流電泳儀7(夠自六一儀器廠)，并且所述直流電泳儀7的負極與所述負電極31電連接，正極與所述正電極32電連接，以實現(xiàn)電泳池的電泳功能。

需要說明的是，為了方便裝置的拆卸和清洗，細胞碎片收集盤4、原生質(zhì)體收集盤5和葉綠體收集盤6均可拆卸的連接在所述電泳室3的底部，具體結(jié)構(gòu)為：所述電泳室3的底部分別連通有細胞碎片流通管、原生質(zhì)體收流通管和葉綠體流通管，所述細胞碎片收集盤4的開口端與所述細胞碎片流通管底部螺接，所述原生質(zhì)體收集盤5的開口端與所述原生質(zhì)體收流通管底部螺接，所述葉綠體收集盤6的開口端與所述葉綠體流通管底部螺接。

所述細胞碎片收集盤4與所述細胞碎片流通管之間、所述原生質(zhì)體收集盤5與所述原生質(zhì)體收流通管之間，所述葉綠體收集盤6與所述葉綠體流通管之間均設(shè)置有密封圈，用于防止漏液。

需要說明的是，所述濾膜11擱置在滴漏室2上端端口處，以實現(xiàn)濾膜11可拆卸的連接在滴漏室2上，便于更換濾膜11。

需要說明的是，所述電泳室3的上端靠近所述正電極32處開設(shè)有濾網(wǎng)插孔，濾網(wǎng)插孔與葉綠體收集盤6的距離為0-0.5cm，并且電泳室3的兩個相對的側(cè)壁上分別開設(shè)有濾網(wǎng)滑槽331，所述濾網(wǎng)33的寬度小于所述濾網(wǎng)插孔的長度，所述濾網(wǎng)33的厚度小于所述濾網(wǎng)插孔的寬度，并且所述濾網(wǎng)33的兩側(cè)與兩個濾網(wǎng)滑槽331一一對應(yīng)滑動連接，使濾網(wǎng)33能穿過所述濾網(wǎng)插孔、并且沿兩個濾網(wǎng)滑槽331滑滑出，便于更換濾網(wǎng)33。

本發(fā)明的植物細胞原生質(zhì)體純化儀使用原理如圖2所示，為：原生質(zhì)體表面帶有負電荷(-10-30mv)，利用原生質(zhì)體、葉綠體、組織碎片和未完全去壁細胞在有電場的懸浮溶液中電荷不同、形狀不同、重力大小不同形成的側(cè)向漂移速度不同實現(xiàn)分離純化之目的。

電泳室3放入電泳液，所述直流電泳儀7的負極與所述負電極31電連接，正極與所述正電極32電連接，將酶解等方法制備好的原生質(zhì)體混合物懸浮液按一定速度滴加在加樣室1內(nèi)，原生質(zhì)體混合物懸浮液經(jīng)過濾膜11進入滴漏室2，然后經(jīng)滴漏室2逐漸滴入電泳室3內(nèi)，電泳室3內(nèi)的植物原生質(zhì)體向正電極32方向移動，停滯于正電極32前的濾網(wǎng)33上，電泳停止后原生質(zhì)體沉降落入原生質(zhì)體收集盤5，把原生質(zhì)體收集盤5取出即獲得純化的原生質(zhì)體，而細胞碎片和未破壁的細胞則因重力作用掉落入細胞碎片收集盤4；葉綠體則透過濾網(wǎng)33落入葉綠體收集盤6內(nèi)。

這種植物細胞原生質(zhì)體純化儀，克服現(xiàn)了有技術(shù)存在的一系列問題，利用植物原生質(zhì)體帶電不同通過電泳的方式分離原生質(zhì)體的方法，整個過程只需要一種緩沖液，簡化了步驟，降低了原生質(zhì)體的損壞和污染率，可以批量篩分。

本發(fā)明還提供了一種上述植物細胞原生質(zhì)體純化儀的純化方法，包括以下實施例：

實施例1

一種上述植物細胞原生質(zhì)體純化儀的純化方法，包括以下步驟：

s1，電泳室3內(nèi)裝滿0.5mol/l的甘露醇溶液，作為緩沖液，開啟電源，調(diào)節(jié)直流電泳儀，使直流電泳儀的電場強度調(diào)節(jié)在1.5-5v/cm，進行電泳；

s2，電泳開始后，將制備好的10ml菠菜原生質(zhì)體混合物懸浮液按照6-12滴/分鐘的速度滴加入加樣室1內(nèi)直至滴加完畢，然后繼續(xù)電泳30min；

s3，關(guān)閉電源，收集原生質(zhì)體收集盤5內(nèi)的原生質(zhì)體；

制片觀察收集到的原生質(zhì)體的純度和受損程度，原生質(zhì)體基本沒有損壞，原生質(zhì)體得率≥70％，獲得的原生質(zhì)體純度≥95％，純化率比較高。

此外，我們對生菜、洋蔥、空心菜等的原生質(zhì)體進行分離，原生質(zhì)體得率≥70％，獲得的原生質(zhì)體純度≥95％，純化率比較高。

盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對這些實施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。

顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明進行各種改動和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動和變型在內(nèi)。