本發(fā)明涉及一種基于酪氨酸的腸溶性雜化水凝膠的制備方法。

背景技術(shù)：

目前，某些在腸道發(fā)揮活性的物質(zhì)（如藥物、酶制劑、乳酸菌等），在通過(guò)口服時(shí)，會(huì)被胃液破壞，無(wú)法到達(dá)腸道發(fā)揮作用（人體胃部的ph值大約是2.0,而小腸的ph值大約是7.4-7.6）。針對(duì)此問(wèn)題，目前，設(shè)計(jì)口服腸道釋放包埋材料，是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。目前腸道釋放包埋材料多為纖維素類、聚甲基乙烯醚-馬來(lái)酸共聚物、甲醛明膠、丙烯酸-甲基丙烯酸共聚物類、蟲膠等。但這些材料都存在一定的問(wèn)題：纖維素類材料、聚甲基乙烯醚-馬來(lái)酸共聚物、甲醛明膠等需要在基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)上進(jìn)行改性，操作復(fù)雜，工序較多；丙烯酸-甲基丙烯酸共聚物類材料脆性大，需要加入增塑劑成膠；蟲膠在腸道崩解性不穩(wěn)定。

水凝膠（hydrogel）是由凝膠因子和水制備的半固體膠狀物質(zhì)。近年來(lái)，以多肽或氨基酸為凝膠因子的超分子水凝膠受到了大量的關(guān)注。由于多肽水凝膠的制備過(guò)程一般是在水性環(huán)境中，水凝膠因子通過(guò)分子間的非化學(xué)鍵力（氫鍵、離子鍵、疏水作用、π-π堆積、范德華力等等），自組裝形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，以此束縛水分子形成半固體果凍狀凝膠物質(zhì)。因此多肽水凝膠比其他超分子水凝膠和高分子凝膠具有更好的生物相容性和生物可降解性，并且其可以自組裝形成膠體，制作成本低廉、操作簡(jiǎn)便。

商用氨基酸包括帶保護(hù)的商用氨基酸，一般有叔丁氧羰基（boc）保護(hù)氨基酸與n-芴甲氧羰基（fmoc）保護(hù)氨基酸，這些帶保護(hù)氨基酸已經(jīng)工業(yè)化，主要用于多肽或蛋白質(zhì)的合成。自從1984年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主r.brucemerrifield開發(fā)出多肽固相合成法之后，多肽的人工合成很快地實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。直到現(xiàn)今，大多數(shù)商業(yè)化定制多肽鏈都是利用fmoc保護(hù)的氨基酸通過(guò)多肽固相合成技術(shù)得到的。fmoc氨基酸的商業(yè)化極大地促進(jìn)了多肽與蛋白質(zhì)的研究與應(yīng)用。

作為多肽水凝膠因子中的一員，n-芴甲氧羰基（fmoc）的氨基酸或短肽水凝膠具備生物相容好、生物易降解、化學(xué)可修飾及廉價(jià)易制備等諸多優(yōu)良性質(zhì)，現(xiàn)已被廣泛用于細(xì)胞培養(yǎng)、組織工程、藥物緩釋、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域。fmoc-y（fmoc-tyrosine，n-芴甲氧羰基-酪氨酸）作為n-芴甲氧羰基氨基酸中的一員，具有芳香性，能夠在π-π堆積和氫鍵的作用下發(fā)生自組裝作用。商用酪氨酸自組裝形成的凝膠對(duì)ph有特殊相應(yīng)性：能夠在酸性條件下成膠、中性偏堿性環(huán)境下溶膠（aufderhorst-roberts,et.al,softmatter,2012,8,5940-5946）。然而，商用酪氨酸水凝膠機(jī)械性較低，孔徑較大，使得商用酪氨酸水凝膠并不能抵御胃酸中酸分子對(duì)包埋物（比如酶類物質(zhì)）的破壞。因此，單一由商用酪氨酸形成的水凝膠并不能很好達(dá)到胃液內(nèi)保護(hù)包埋物、腸道釋放包埋物的效果。

明膠是膠原經(jīng)過(guò)部分酸法水解（a型明膠）、堿法水解（b型明膠）及酶法水解，提純而獲得的一種大分子蛋白。明膠分子結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，能夠吸水膨脹形成水凝膠，并且具有良好的生物相容性和口感，廣泛地作為食品功能物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分使用。同時(shí)，明膠獨(dú)特的大分子蛋白結(jié)構(gòu)特性也使得它具有抵御胃酸的能力。但其熱穩(wěn)定性差，在人體正常體溫的37℃下已經(jīng)融化，并且其沒(méi)有環(huán)境響應(yīng)性，因此限制了它單獨(dú)作為口服腸道釋放包埋材料的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，克服現(xiàn)有包埋材料存在的上述缺陷，提供一種基于酪氨酸的腸溶性雜化水凝膠的制備方法，所得腸溶性雜化水凝膠在33℃以上，在酸性條件下成膠，在中性或者堿性條件下溶膠。

本發(fā)明進(jìn)一步要解決的技術(shù)問(wèn)題是，克服現(xiàn)有包埋材料存在的上述缺陷，提供一種生物相容性好，制備方法簡(jiǎn)便，成本低的基于酪氨酸的腸溶性雜化水凝膠的制備方法。

本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案如下：

一種基于酪氨酸的腸溶性雜化水凝膠的制備方法，將酪氨酸溶液和明膠攪拌混合，即成。

所述酪氨酸溶液中的酪氨酸與明膠的質(zhì)量比為1：1~18（優(yōu)選1：12~16）。

進(jìn)一步，所述酪氨酸優(yōu)選為n-芴甲氧羰基-酪氨酸（即fmoc-酪氨酸，簡(jiǎn)寫為fmoc-tyr-oh）。

所述明膠可通過(guò)市售途徑取得。

進(jìn)一步，所述酪氨酸溶液中含有食用燒堿，為酪氨酸的燒堿溶液。

進(jìn)一步，本發(fā)明包括以下步驟：將酪氨酸的燒堿溶液與明膠混合，在50-57℃下用40-80轉(zhuǎn)/分鐘的速度均勻攪拌至明膠固體完全溶解后，超聲10-50s，再調(diào)節(jié)ph至6.5以下（優(yōu)選1.5-6.4），在1000~1200轉(zhuǎn)/分鐘的速度下振蕩10-30s,在0~50℃下靜置10分鐘以上，待其成膠，即成。

進(jìn)一步，所述酪氨酸的燒堿溶液中，酪氨酸的濃度為1.05-147.5mg/ml。酪氨酸的濃度若低于1.05mg/ml，不利于后面雜化水凝膠成膠，且影響其ph響應(yīng)性，而酪氨酸的濃度若高于147.5mg/ml，由于酪氨酸的溶解度不高，會(huì)造成酪氨酸在溶液中的濃度不準(zhǔn)確，且與明膠混合不均勻，最終導(dǎo)致雜化水凝膠不均勻，性質(zhì)不穩(wěn)定。

進(jìn)一步，所述酪氨酸溶液中加入食用燒堿，目的是調(diào)節(jié)ph，且食用燒堿的添加量為酪氨酸溶液中所含酪氨酸的8-12%。食用燒堿的濃度小于酪氨酸的8%，則會(huì)降低酪氨酸的溶解度，食用燒堿的濃度大于酪氨酸的12%，則會(huì)影響溶液的ph，最終影響雜化水凝膠的形成。

進(jìn)一步，所述酪氨酸溶液中的酪氨酸與明膠的質(zhì)量比為1：1~18，明膠所占比例低于該比例時(shí)，雜化水凝膠的耐酸性不高；明膠所占比例高于該比例時(shí)，雜化水凝膠的溫度耐受性降低，即在人體溫度的37℃會(huì)溶膠。

進(jìn)一步，成膠溫度在0~50℃之間；低于0℃，或者高于50℃，雜化膠很難成型。

本發(fā)明的原理是：在酸性條件下，酪氨酸和明膠通過(guò)芳香堆積和氫鍵協(xié)同作用，自組裝形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，以此束縛水分子、酶類或者藥物分子。而在中性或者堿性條件下，商用酪氨酸攜帶的電荷發(fā)生變化，分子間排斥力增加，斥力大于芳香堆積和氫鍵協(xié)同作用的力，從而導(dǎo)致與酪氨酸相關(guān)的交聯(lián)結(jié)構(gòu)坍塌，從而導(dǎo)致膠體溶解。

本發(fā)明制得之基于酪氨酸的腸溶性雜化水凝膠，該膠體特性在于：在33℃以上，膠體在酸性環(huán)境中會(huì)形成膠體，且不受酸性溶液，或者模擬胃液的影響；將形成的雜化水凝膠放入中性、或者堿性的溶液中，或者模擬腸道溶液中，膠體會(huì)自動(dòng)溶膠。因此本發(fā)明制得之雜化水凝膠可以包裹直接紅80等染料、酶類、藥物分子，其成膠性不受這些染料、酶或藥物分子的影響。因此本發(fā)明有望應(yīng)用于藥物，或者易被胃酸破壞、需要到腸道以達(dá)到控制釋放作用的酶類等活性物質(zhì)的腸道控制釋放。

本發(fā)明的有益效果如下：

（1）本發(fā)明制備的雜化水凝膠具有ph響應(yīng)性，在33℃以上（明膠不能成膠的溫度中），可以在酸性下成膠，在中性或者堿性環(huán)境中溶膠，符合腸溶性智能材料的要求。本發(fā)明制備方法步驟簡(jiǎn)單、成本低，只需混合攪拌即可成膠，不易變質(zhì)，環(huán)境友好，且可在模擬胃液環(huán)境中保持膠體狀態(tài)，模擬腸道環(huán)境中溶解。

（2）本發(fā)明制備的雜化水凝膠可以包裹直接紅80等染料、酶類物質(zhì)或藥物分子，其凝膠性不受這些染料、酶類或藥物分子的影響，此外，鑒于酪氨酸、明膠具有良好的生物相容性，本發(fā)明制備的雜化水凝膠有望應(yīng)用于藥物等活性物質(zhì)（如酶、酸不耐性乳酸菌等）的腸道控制釋放領(lǐng)域。

（3）本發(fā)明制備的雜化水凝膠在高濃度鹽溶液中仍然可以存在，即，離子強(qiáng)度對(duì)其凝膠性影響不大。因此，該水凝膠為耐鹽性水凝膠。

（4）本發(fā)明制備方法步驟簡(jiǎn)單，成本低廉，不易變質(zhì)，環(huán)境友好。

附圖說(shuō)明

圖1為不同比例酪氨酸/明膠的數(shù)碼照片。a~e分別為酪氨酸的濃度為10mg/ml、明膠的質(zhì)量濃度分別為10,50,100，140,180mg/ml，ph在5.5時(shí)形成的雜化水凝膠。f為對(duì)應(yīng)a的膠體在加入ph為7.5的緩沖溶液后1h的圖片，依次類推，g~j為分別對(duì)應(yīng)b~e的雜化水凝膠在加入ph為7.5的緩沖溶液后1h的數(shù)碼照片。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1（酪氨酸與明膠質(zhì)量比為1:8）制成的雜化水凝膠的掃描電鏡圖。（由圖中可以看出，酪氨酸/明膠雜化水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)中有10-50μm的孔，可以用來(lái)包埋染料、酶類或藥物）。

圖3為實(shí)施例3的雜化水凝膠包埋直接紅80染料，在不同ph下的釋放曲線。(由上至下ph依次為9.0、7.5、7.0、6.0、1.7)。

圖4是本發(fā)明實(shí)施例4中所測(cè)得的不同處理方法處理的乳糖酶的活性；

未經(jīng)包埋的乳糖酶、明膠包埋的乳糖酶為加入模擬胃液后的模擬胃液中的酶活保留率；酪氨酸水凝膠包埋的乳糖酶、雜化水凝膠包埋的乳糖酶為通過(guò)模擬胃液、加入模擬腸液后，模擬腸液中乳糖酶的酶活保留率。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。

本發(fā)明實(shí)施例所使用的酪氨酸為n-芴甲氧羰基-酪氨酸（即fmoc-酪氨酸，簡(jiǎn)寫為fmoc-tyr-oh），購(gòu)于吉爾生化（上海）有限公司；其它所使用的化學(xué)試劑，如無(wú)特殊說(shuō)明，均通過(guò)常規(guī)商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例1

本實(shí)施例之基于酪氨酸的腸溶性雜化水凝膠的制備方法，包括以下步驟：稱取食用燒堿4mg，加入1ml去離子水，充分溶解后，得燒堿溶液；取fmoc-酪氨酸粉末40mg，加入燒堿溶液中，超聲溶解后，加入320mg明膠，放入50℃磁力攪拌器中以60轉(zhuǎn)/min的速度均勻攪拌至明膠固體完全溶解后，超聲10s，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)ph至5.5，用1000rpm的渦旋振蕩儀振蕩10s，靜置在37℃水浴中0.5小時(shí)，即成。

實(shí)施例2

本實(shí)施例之基于酪氨酸的腸溶性雜化水凝膠的制備方法，包括以下步驟：稱取食用燒堿1mg，加入1ml去離子水，充分溶解后，取fmoc-酪氨酸粉末10mg，加入燒堿溶液中，超聲溶解后，加入140mg明膠，放入50℃磁力攪拌器中60轉(zhuǎn)/min的速度均勻攪拌至明膠固體完全溶解后，超聲20s，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)ph至5.5，用1000rpm的渦旋振蕩儀振蕩10s，在室溫下靜置70分鐘，即得基于酪氨酸的腸溶性雜化水凝膠（參見圖1，d）。向雜化水凝膠加入ph為7.5的磷酸緩沖溶液，1h后膠體溶膠（參見圖1，l）。

實(shí)施例3

本實(shí)施例之基于酪氨酸的腸溶性雜化水凝膠的制備方法，包括以下步驟（酪氨酸/明膠雜化水凝膠包埋直接紅80染料，并研究雜化膠在不同ph下對(duì)直接紅80染料的釋放作用）：稱取食用燒堿2mg，加入1ml去離子水，充分溶解后，取fmoc-酪氨酸粉末20mg，加入燒堿溶液中，超聲溶解后，加入100mg明膠，放入50℃磁力攪拌器中以60轉(zhuǎn)/min的速度均勻攪拌至明膠固體完全溶解后，超聲20s，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)ph至5.5，迅速加入0.7mmol/l的直接紅80染料，用1000rpm的渦旋振蕩儀振蕩10s，靜置在室溫下，100分鐘后包埋了直接紅80的腸溶性雜化水凝膠生成。將包埋了直接紅80染料的腸溶性雜化水凝膠分別置于ph為1.7、6、7、7.5、9的緩沖溶液中，每隔30分鐘，利用紫外分光光度計(jì)在525nm下檢測(cè)溶液的吸光度。并與沒(méi)有包埋的同樣濃度的直接紅80染料在525nm處的吸光度做對(duì)比，檢測(cè)在不同的ph值的緩沖溶液中雜化膠對(duì)包埋的直接紅80染料的釋放作用（參見圖3）。

實(shí)施例4

本實(shí)施例之基于酪氨酸的腸溶性雜化水凝膠的制備方法，包括以下步驟（為雜化水凝膠包埋乳糖酶，并研究雜化膠在不同ph下對(duì)乳糖酶的釋放作用）：稱取食用燒堿6mg，加入1ml去離子水，充分溶解后，取fmoc-酪氨酸粉末60mg，加入燒堿溶液中，超聲溶解后，加入300mg明膠，放入50℃磁力攪拌器中以60轉(zhuǎn)/min的速度均勻攪拌至明膠固體完全溶解后，超聲20s，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)ph至6，迅速加入10mg/ml的乳糖酶水溶液0.5ml，用1000rpm的渦旋振蕩儀振蕩10s，在37℃下靜置120分鐘后，即得包埋乳糖酶的雜化水凝膠。

取本實(shí)施例中包埋乳糖酶的雜化水凝膠、包埋同樣量的乳糖酶的酪氨酸水凝膠（只采用酪氨酸包埋）、包埋同樣量的乳糖酶的明膠塊（只采用明膠包埋）各0.5g，和包埋量相同的單獨(dú)的乳糖酶（各試管中加入的乳糖酶的量都是相同的），放入裝有5ml模擬胃液的試管中（分別對(duì)應(yīng)1、2、3、4號(hào)試管），于37℃、100rpm/min水浴振蕩器中2h。

結(jié)果顯示，包埋同樣量的乳糖酶的明膠塊在37℃下已經(jīng)溶解。利用鄰硝基苯-β-d-半乳糖苷法直接測(cè)定加入未包埋的單獨(dú)的乳糖酶的模擬胃液（4號(hào)試管）、加入包埋同樣量的乳糖酶的明膠塊的模擬胃液（3號(hào)試管）的乳糖酶的酶活。

經(jīng)過(guò)同樣模擬胃液處理，利用酪氨酸水凝膠包埋的乳糖酶膠塊（2號(hào)試管）和利用雜化水凝膠包埋的乳糖酶膠塊（1號(hào)試管）并沒(méi)有溶解，因此取出模擬胃液中的膠塊放于裝有5mlph為7.5的模擬腸液中（分別對(duì)應(yīng)5、6號(hào)試管），在37℃下待膠塊完全溶解，利用鄰硝基苯-β-d-半乳糖苷法測(cè)定5、6號(hào)試管溶液中的酶活。

以未經(jīng)模擬胃液處理的相同量的乳糖酶的酶活為100%酶活，一式三份，計(jì)算相對(duì)酶活，即為酶活保留率（結(jié)果參見圖4）。