本發(fā)明涉及一種基于酶促接枝/磷酸化進(jìn)行絲素仿生礦化的方法，其特征是先借助于漆酶催化氧化絲素與含氨基的殼寡糖反應(yīng)，再以己糖激酶催化殼寡糖磷酸化，最后進(jìn)行絲素膜仿生礦化，屬于紡織生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

絲素纖維來(lái)源于脫膠后的桑蠶絲，具有光澤優(yōu)雅、吸濕性好和機(jī)械性能優(yōu)良等諸多優(yōu)點(diǎn)，是較理想的紡織纖維原料。與此同時(shí)，絲素蛋白本身無(wú)毒、無(wú)刺激性，具有低免疫原性和良好的生物相容性，是一種性能優(yōu)良的醫(yī)用生物材料，可應(yīng)用于包括骨誘導(dǎo)支架材料在內(nèi)的多方面。

再生絲素材料的性能與其分子量及結(jié)構(gòu)組成有較大的相關(guān)性。絲素纖維經(jīng)鈣鹽、鋰鹽及其醇溶液溶解后，絲素蛋白發(fā)生溶解和部分水解，經(jīng)透析去除鹽離子后獲得絲素溶液，可用于制備不同用途的絲素支架材料。絲素溶液中分子量分布較寬泛，其中低分子量絲素分子會(huì)影響支架材料的力學(xué)性能，因此需借助于交聯(lián)劑等促進(jìn)絲素蛋白分子間交聯(lián)。考慮到絲素蛋白中極性基團(tuán)為羧基、氨基和羥基，通常借助戊二醛、碳化二亞胺(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)等化學(xué)試劑，使絲素大分子間共價(jià)交聯(lián)。此類方法在增加材料力學(xué)性能的同時(shí)，也存在一定的不足，如戊二醛交聯(lián)反應(yīng)中易產(chǎn)生化學(xué)有害物質(zhì)殘留；edc/nhs交聯(lián)后絲素中羧基數(shù)量減少，對(duì)鈣離子的絡(luò)合能力下降，使絲素蛋白的仿生礦化性能下降等。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，借助生物酶法催化絲素交聯(lián)及接枝改性日趨成為研究熱點(diǎn)。與傳統(tǒng)化學(xué)交聯(lián)法相比，酶法改性具有高效、專一、作用條件溫和、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。漆酶是一種具有催化氧化活性的氧化酶，能催化氧化絲素中酪氨酸和絲氨酸上羥基，形成反應(yīng)性較強(qiáng)的醌類活性基或醛基，通過(guò)進(jìn)一步與絲素中氨基反應(yīng)能引發(fā)絲素蛋白自交聯(lián)，也能與外源含氨基的功能性大分子共價(jià)接枝。此外，己糖激酶是六碳糖的磷酸化酶，能催化三磷酸腺苷(atp)上的γ-磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至葡萄糖或殼寡糖的c6位，使c6位羥基磷酸化。上述漆酶和己糖激酶的專一性為基于酶法的絲素蛋白交聯(lián)和功能化改性提供了新方法。

本發(fā)明中通過(guò)漆酶催化氧化絲素分子中酪氨酸和絲氨酸殘基的羥基，產(chǎn)生反應(yīng)性較強(qiáng)的醌類活性基和醛基，并與殼寡糖中氨基反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)殼寡糖在絲素表面接枝；在此基礎(chǔ)上，再以已糖激酶催化殼寡糖單體中c6位羥基磷酸化，形成含磷酸根的改性絲素蛋白。通過(guò)此方法，不僅形成以殼寡糖為連接的絲素蛋白分子間交聯(lián)，增加絲素分子量；而且通過(guò)己糖激酶催化殼寡糖磷酸化，在絲素表面引入較多的負(fù)電性磷酸基團(tuán)，也提升了絲素的仿生礦化性能，使絲素膜在sbf模擬體液或鈣離子-磷酸鹽溶液中獲得更好的仿生礦化效果，有利于絲素基仿生骨基質(zhì)支架材料的構(gòu)建。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的旨在提供一種基于酶促接枝/磷酸化進(jìn)行絲素仿生礦化的方法，使用本發(fā)明可在溫和反應(yīng)條件下，通過(guò)酶促接枝殼寡糖促進(jìn)絲素蛋白分子間交聯(lián)，結(jié)合酶催化殼寡糖磷酸化，改善絲素蛋白的仿生礦化效果。

本發(fā)明的技術(shù)方案：一種基于酶促接枝/磷酸化進(jìn)行絲素仿生礦化的方法，其特征是先通過(guò)漆酶催化氧化絲素蛋白中酪氨酸和絲氨酸殘基，將殼寡糖接枝到絲素分子上，再借助己糖激酶催化殼寡糖上羥基磷酸化，改善絲素蛋白的仿生礦化效果，具體工藝與步驟如下：

(1)絲素蛋白溶液制備：以溴化鋰或氯化鈣溶解脫膠后的桑蠶絲，制備絲素溶液；

處理工藝處方及條件：將脫膠后的桑蠶絲加入到溴化鋰或氯化鈣的水溶液中，在60～80℃溶解后，以去離子水中透析8～36小時(shí)后過(guò)濾，制得濃度為10～40g/l絲素溶液；

(2)漆酶催化絲素接枝殼寡糖：在步驟(1)處理后的絲素蛋白溶液中加入漆酶和殼寡糖處理；

處理工藝處方及條件：漆酶1～10u/ml，殼寡糖0.5～5g/l，處理溫度20～60℃，ph范圍4.0～7.0，處理時(shí)間2～24小時(shí)；然后以去離子水中透析8～36小時(shí)，去除未反應(yīng)的殼寡糖，制得濃度為20～40g/l的改性絲素溶液；

(3)己糖激酶催化殼寡糖磷酸化：在步驟(2)處理后的改性絲素溶液中加入己糖激酶和三磷酸腺苷處理；

處理工藝處方及條件：己糖激酶1～15u/ml，三磷酸腺苷0.5～10g/l，環(huán)磷酸腺苷0～5g/l，處理溫度20～40℃，ph范圍6.0～8.0，處理時(shí)間2～24小時(shí)；然后以去離子水中透析8～24小時(shí)，制得濃度為20～40g/l的改性絲素溶液；

(4)改性絲素蛋白膜成型：取步驟(3)反應(yīng)后的溶液，在-50～-20℃條件下真空冷凍干燥成膜；然后將該絲素膜材料在50～80％乙醇溶液中浸漬0.25～1小時(shí)，在30℃烘干；

(5)絲素蛋白膜仿生礦化：將步驟(4)處理后的絲素膜浸漬在1.5倍sbf模擬體液中，在37℃條件下仿生礦化1～7天，期間每天更換一次模擬體液；仿生礦化結(jié)束后以去離子水清洗，在30℃烘干后得到礦化絲素膜。

一種基于酶促接枝/磷酸化進(jìn)行絲素仿生礦化的方法，所述漆酶來(lái)源于動(dòng)物、植物或微生物；所述己糖激酶來(lái)源于動(dòng)物、植物或微生物。

本發(fā)明的有益后果

本發(fā)明利用漆酶催化殼寡糖與絲素蛋白接枝，結(jié)合己糖激酶催化殼寡糖磷酸化，賦予絲素蛋白較好的仿生礦化效果。與傳統(tǒng)化學(xué)法交聯(lián)接枝相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)酶催化反應(yīng)效率高，利用漆酶催化絲素蛋白產(chǎn)生醌類活性基和醛基，再與含氨基的殼寡糖接枝，具有專一性強(qiáng)和反應(yīng)效率高的優(yōu)點(diǎn)；

(2)接枝反應(yīng)條件緩和，在低溫近中性條件下實(shí)現(xiàn)絲素蛋白的酶促接枝殼寡糖及磷酸化，避免了化學(xué)整理時(shí)容易造成交聯(lián)劑殘留、或反應(yīng)條件劇烈影響絲素材料性能等問(wèn)題；

(3)絲素蛋白礦化效果好，借助酶法構(gòu)建以殼寡糖為連接的絲素分子間交聯(lián)，通過(guò)催化殼寡糖磷酸化，增加對(duì)鈣離子絡(luò)合能力，增強(qiáng)了絲素蛋白的仿生礦化效果。

具體實(shí)施方式

采用漆酶酶催化氧化絲素接枝含氨基殼寡糖，結(jié)合己糖激酶催化殼寡糖磷酸化，改善絲素蛋白的仿生礦化效果的具體實(shí)施例如下：

實(shí)施例1

以本發(fā)明述及的方法進(jìn)行絲素酶促接枝/磷酸化及絲素蛋白膜仿生礦化；

(1)絲素溶液制備：將脫膠后的桑蠶絲加入到溴化鋰溶液中，在70℃溶解后以去離子水透析24小時(shí)后過(guò)濾，制得濃度為20g/l絲素溶液；

(2)漆酶催化絲素接枝殼寡糖：在步驟(1)處理后的絲素蛋白溶液中加入漆酶和殼寡糖處理，其中漆酶5.5u/ml，殼寡糖2.4g/l，處理溫度45℃，ph5.5，處理時(shí)間12小時(shí)；然后以去離子水中透析24小時(shí)，去除未反應(yīng)的殼寡糖，制得濃度為25g/l的改性絲素溶液；

(3)己糖激酶催化殼寡糖磷酸化：在步驟(2)處理后的改性絲素溶液中加入己糖激酶和三磷酸腺苷處理，其中己糖激酶2.5u/ml，三磷酸腺苷2.5g/l，環(huán)磷酸腺苷1g/l，處理溫度30℃，ph7.0，處理時(shí)間8小時(shí)；然后以去離子水中透析20小時(shí)，制得濃度為25g/l的改性絲素溶液；

(4)改性絲素蛋白膜成型：取步驟(3)反應(yīng)后的溶液，在-50℃條件下真空冷凍干燥成膜；然后將該絲素膜材料在75％乙醇溶液中浸漬0.6小時(shí)，在30℃烘干；

(5)絲素蛋白膜仿生礦化：將步驟(4)處理后絲素膜浸漬在1.5倍sbf模擬體液中，在37℃條件下仿生礦化6天，期間每天更換一次模擬體液；仿生礦化結(jié)束后以去離子水清洗，在30℃烘干后得到礦化絲素膜。

試樣1：僅經(jīng)步驟(1)、(4)和(5)處理，不經(jīng)過(guò)步驟(2)和(3)處理；

試樣2：僅經(jīng)步驟(1)、(2)、(4)和(5)處理；不經(jīng)過(guò)步驟(3)處理；

試樣3：經(jīng)步驟(1)、(2)、(3)、(4)和(5)處理；

經(jīng)上述工藝處理后，試樣1表面鈣、磷含量分別為12.1％和7.2％，彈性模量為10.2mpa；試樣2表面鈣、磷含量分別為11.9％和7.5％，彈性模量為12.5mpa；試樣2表面鈣、磷含量分別為15.0％和11.1％，彈性模量為12.8mpa。

實(shí)施例2

以本發(fā)明述及的方法進(jìn)行絲素酶促接枝/磷酸化及絲素蛋白膜仿生礦化；

(1)絲素溶液制備：將脫膠后的桑蠶絲加入到溴化鋰溶液體系中，在72℃溶解后以去離子水透析20小時(shí)后過(guò)濾，制得濃度為25g/l絲素溶液；

(2)漆酶催化絲素接枝殼寡糖：在步驟(1)處理后的絲素蛋白溶液中加入漆酶和殼寡糖處理，其中漆酶7.5u/ml，殼寡糖3.0g/l，溫度45℃，ph5.5，處理時(shí)間8小時(shí)；然后以去離子水中透析20小時(shí)，去除未反應(yīng)的殼寡糖，制得濃度為20g/l的改性絲素溶液；

(3)己糖激酶催化殼寡糖磷酸化：在步驟(2)處理后的改性絲素溶液中加入己糖激酶和三磷酸腺苷處理，其中己糖激酶6u/ml，三磷酸腺苷9g/l，環(huán)磷酸腺苷1g/l，溫度25℃，ph7.5，處理時(shí)間8小時(shí)；然后以去離子水中透析20小時(shí)，制得濃度為20g/l改性絲素溶液；

(4)改性絲素蛋白膜成型：取步驟(3)反應(yīng)后的溶液，在-50℃條件下真空冷凍干燥成膜；然后將該絲素膜材料在70％乙醇溶液中浸漬0.5小時(shí)，在30℃烘干；

(5)絲素蛋白膜仿生礦化：將步驟(4)處理后絲素膜浸漬在1.5倍sbf模擬體液中，在37℃條件下仿生礦化7天，期間每天更換一次模擬體液；仿生礦化結(jié)束后以去離子水清洗，在30℃烘干后得到礦化絲素膜。

試樣4：僅經(jīng)步驟(1)、(4)和(5)處理，不經(jīng)過(guò)步驟(2)和(3)處理；

試樣5：僅經(jīng)步驟(1)、(2)、(4)和(5)處理；不經(jīng)過(guò)步驟(3)處理；

試樣6：經(jīng)步驟(1)、(2)、(3)、(4)和(5)處理；

經(jīng)上述工藝處理后，試樣4表面鈣、磷含量分別為12.0％和8.7％，彈性模量為9.4mpa；試樣5表面鈣、磷含量分別為11.2％和8.8％，彈性模量為11.9mpa；試樣6表面鈣、磷含量分別為15.4％和11.6％，彈性模量為12.3mpa。

通過(guò)對(duì)實(shí)施例數(shù)據(jù)分析：以未經(jīng)酶處理絲素制備的絲素蛋白礦化膜(試樣1、試樣4)鈣磷含量及彈性模量較低；以經(jīng)漆酶處理的絲素為原料制備的絲素礦化膜(試樣2、試樣5)彈性模量增加，表明漆酶催化接枝殼寡糖能提升了絲素材料力學(xué)性能；以本發(fā)明述及的方法制備的絲素蛋白礦化膜(試樣3、試樣6)彈性模量增加更明顯，絲素膜表面鈣和磷含量高，表明具有較好的礦化效果。由此可見(jiàn)，以本發(fā)明述及的方法進(jìn)行酶促絲素接枝殼寡糖，結(jié)合酶催化磷酸化和仿生礦化，制備的絲素蛋白礦化膜具有較好的性能。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。