本發(fā)明公開了一種淮陰苜蓿蛋白的提取方法，具體涉及一種淮陰苜蓿蛋白沉淀、雜質(zhì)分離和蛋白溶解，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

技術(shù)背景

蛋白質(zhì)是細(xì)胞生理功能的執(zhí)行者，了解淮陰苜蓿組織在不同階段的蛋白質(zhì)變化有助于分析造成淮陰苜蓿各個階段生理功能差異的原因，而了解蛋白質(zhì)的變化首先需要盡可能多地分離和分析其蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的提取成為蛋白分析最為關(guān)鍵的步驟。一種理想的蛋白質(zhì)分離方法，應(yīng)盡可能多地分離到不同的蛋白質(zhì)，并且對高豐度蛋白質(zhì)要有一定的消除作用及對低豐度蛋白有一定的富集作用。由于植物組織樣品富含色素、多酚、脂類、多糖等干擾性物質(zhì)，這些物質(zhì)可以與蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)形成復(fù)合物，因而較難獲得純凈的蛋白質(zhì)。三氯乙酸會導(dǎo)致溶液處于酸性環(huán)境，時間過長會導(dǎo)致蛋白的分解破壞，影響蛋白的完整性，因此，提取參數(shù)的調(diào)整對蛋白完整性起著重要作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種淮陰苜蓿蛋白的提取方法，本發(fā)明提取工藝簡單，蛋白提取容易，制得的蛋白豐度均勻，蛋白破壞小。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

(1)研磨：取0.5-1g葉片，放入液氮預(yù)冷的研缽，研磨好的粉末轉(zhuǎn)移到50mL離心管。

(2)沉淀：按1∶10的比例加入-20℃預(yù)冷含0.07％巰基乙醇、8-10％TCA的丙酮，混合充分后，-20℃放置30-50min，4℃，14000g離心15min，棄上清。

(3)清洗：沉淀加入-20℃預(yù)冷含0.07％巰基乙醇的90-100％丙酮溶液25mL，充分混合后，-20℃靜置1h，4℃，14000g離心15min，棄上清，重復(fù)3次。

(4)轉(zhuǎn)移：沉淀轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，4℃，14000g，5min，棄上清，室溫干燥2h。

(5)溶解：沉淀按10μl/mg的比例加入裂解液，充分裂解2h后，15℃，16000g離心10min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管，上清液即為提取好的蛋白溶液。

所述的淮陰苜蓿蛋白的提取方法，各溶液成分為：三氯乙酸的丙酮中三氯乙酸的含量為10％；清洗液所用丙酮濃度為90％；裂解液成分為7M尿素，2M硫脲，4％CHAPS，1％DTT，2％Ampholytes。

本發(fā)明的創(chuàng)新之處在于，通過調(diào)整三氯乙酸含量、提取溫度、提取時間、裂解液配方，實現(xiàn)了淮陰苜蓿不同豐度蛋白的提取。

具體實施方式

一種淮陰苜蓿蛋白的提取方法，包括以下步驟：

(1)研磨：取0.5g葉片，放入液氮預(yù)冷的研缽，研磨好的粉末轉(zhuǎn)移到50mL離心管。

(2)沉淀：按1∶10的比例加入-20℃預(yù)冷含0.07％巰基乙醇、8-10％TCA的丙酮，混合充分后，-20℃放置30～50min，4℃，14000g離心15min，棄上清。

(3)清洗：沉淀加入-20℃預(yù)冷含0.07％巰基乙醇的90-100％丙酮溶液25mL，充分混合后，-20℃靜置1h，4℃，14000g離心15min，棄上清，重復(fù)3次。

(4)轉(zhuǎn)移：沉淀轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，4℃，14000g，5min，棄上清，室溫干燥2h。

(5)溶解：沉淀按10μl/mg的比例加入裂解液，充分裂解2h后，15℃，16000g離心10min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管，上清液即為提取好的蛋白溶液。

所述的淮陰苜蓿蛋白的提取方法，各溶液成分為：三氯乙酸的丙酮中三氯乙酸的含量為10％；清洗液所用丙酮濃度為90％；裂解液成分為7M尿素，2M硫脲，4％CHAPS，1％DTT，2％Ampholytes。

本發(fā)明通過在液氮中對樣品進(jìn)行研磨，有效的避免了研磨中高溫對蛋白的破壞，蛋白質(zhì)經(jīng)過三氯乙酸丙酮充分沉淀并通過丙酮充分清洗，從而使蛋白質(zhì)的提取更充分并減少了提取的蛋白質(zhì)中的雜質(zhì)含量，避免了使用價格昂貴的蛋白純化試劑盒，提取時間短且操作簡便、成本較低，節(jié)省了提取時間和提取成本。