專利名稱：乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白基因在苜蓿中的誘導(dǎo)性表達的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白基因在轉(zhuǎn)基因苜蓿中同時進行誘導(dǎo)性表達的方法及其應(yīng)用。上述兩個抗原蛋白基因被分別置于苜蓿亞硝酸還原酶基因啟動子操控之下，在正常生長條件下，這兩個外源蛋白基因處于沉默狀態(tài)，無任何目標蛋自產(chǎn)生。但在硝酸鹽的誘導(dǎo)下，亞硝酸還原酶基因啟動子被激活，并隨后調(diào)控乙肝病毒包膜小蛋白和中蛋白基因在苜蓿體內(nèi)同時進行高效表達和積累。人或其他哺乳動物通過直接食用含有這兩種重組抗原蛋白的轉(zhuǎn)基因苜蓿、或通過腸道給藥的方式利用自這些轉(zhuǎn)基因苜蓿中部分或完全純化出乙型肝炎病毒膜小蛋白及中蛋白作為膠囊、沖劑或其它制劑的主要活性成分從而可能引起人或其他哺乳動物對乙肝病毒包膜抗原蛋白的免疫應(yīng)答反應(yīng)。
乙型肝炎(HBV)是一種廣泛傳播、世界性分布的傳染性疾病，根據(jù)世界衛(wèi)生組織1996年的報告，1995年全世界死于乙型肝炎的人數(shù)約有110萬，居各種傳染病死亡人數(shù)的第四位，而且近年來有逐漸增加的趨勢。中國也是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，約50-70％的人群受過HBV的感染，全國目前至少有1.2億人為乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)攜帶者，其中顯現(xiàn)臨床癥狀的病人約有3千萬人。
乙型肝炎病毒的感染，不僅可以引起急、慢性病毒性肝炎，而且還與肝硬化和肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。乙肝病毒的頑固性和多途徑的易傳性，使乙肝成為一個嚴重的公共衛(wèi)生問題。迄今為止，由于仍缺乏根治乙型肝炎的特效藥，因此，在日常生活中，如何保護健康人群，預(yù)防乙型肝炎的發(fā)生就成為人們要考慮的主要問題之一。
預(yù)防乙型肝炎的發(fā)生現(xiàn)在可以選擇注射疫苗，目前廣泛使用的乙肝疫苗為基因重組多肽疫苗。1986年，世界上第一個基因工程疫苗-酵母菌表達的重組乙肝疫苗(表達乙肝病毒包膜小蛋白，又稱S蛋白)在美國被批準使用，中國也在上個世紀九十年代初期研制成功了具有世界先進水平的基因工程重組乙肝疫苗。但這類疫苗仍需多次接種，價格較高，且一些人群(約占15％)在接種后不能夠產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。
對乙型肝炎病毒粒體結(jié)構(gòu)與組成的研究表明，其最外層的包膜中含有三種蛋白，依據(jù)分子量的大小，分別稱之為主要蛋白(S蛋白)、中蛋白(M)和大蛋白(L)(1)，而它們在人體內(nèi)均能夠產(chǎn)生中和抗體。
主要蛋白也稱為包膜小蛋白，由226個氨基酸殘基組成，為S基因所編碼，是病毒包膜及亞單位顆粒(HBsAg)的主要成分，因其分子量最小，因此又被稱為小蛋白。小蛋白是一種疏水性蛋白，包括糖基化的GP27和非糖基化的P24兩種形式，分子量分別為27kD和24kD而得名。在GP27的N末端146位的天門冬酰胺上連接著一種復(fù)雜的糖基，在122位賴氨酸殘基處有胰酶切割位點。S蛋白有三個疏水區(qū)段，分別位于7-23、80-98和169-226，被二個親水區(qū)段分開。疏水區(qū)段的氨基酸比較保守，氨基酸的變異主要發(fā)生在親水區(qū)段。
人們常提到的乙肝表面抗原HBsAg實際上是一種構(gòu)象性抗原，兩個小蛋白分子通過二硫鍵連在一起，構(gòu)成的二聚體代表著最小的HBsAg結(jié)構(gòu)單位并具有完整的HBsAg活性。
中蛋白含有281個氨基酸殘基，由前S2和S基因共同編碼，它可以看作是在小蛋白的N端又另外增加了一個含55個氨基酸殘基的S2蛋白區(qū)段，因分子量居中，故被稱為中蛋白。中蛋白有一種非糖基化形式P31，兩種糖基化形式GP33和GP36。GP33含有一個配糖體，GP36有兩個配糖體，這兩個糖基位于S蛋白的146位和前S2區(qū)段。由前S2基因編碼的55個氨基酸通常是親水性的，富含不依賴二硫鍵的連續(xù)抗原決定簇，具有比小蛋白更強的免疫原性，但易被胃蛋白酶消化而喪失其活性。此外，前S2蛋白還含有一個多聚人血清白蛋白受體(PHSA-R)，能特異性地與人和黑猩猩血清中的多聚白蛋白(PHSA)結(jié)合，肝細胞本身也有該受體，多聚人血清白蛋白介導(dǎo)HBV附著肝細胞，這就是HBV易感染肝細胞的一個重要原因，也是決定HBV嗜肝特點的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
大蛋白含有389-400個氨基酸殘基，由前S1、前S2和S基因三部分共同編碼，其分子量在三種包膜蛋白中分子量最大，故又被稱為大蛋白。大蛋白也有兩種不同的形式，糖基化的GP42和非糖基化的P39，分子量分別為42kD和39kD。根據(jù)亞型的不同在長度上有所變化，ay亞型和ad亞型的變化范圍在389-400個氨基酸之間，在GP42有一個與N末端相連的糖基，由前S1區(qū)編碼的N末端位于包膜蛋白的表面。
一個完整的病毒粒體(包括病毒核酸、蛋白和包膜，直徑為42nm，又稱丁氏顆粒)，含有300-400個小蛋白(S蛋白)分子，40-80個中蛋白和大蛋白分子，管狀顆粒(不含有病毒核酸)的蛋白質(zhì)組成與完整病毒粒體相同，而直徑為22nm球形顆粒(也不含有病毒核酸)的蛋白質(zhì)成份則完全不同在有病毒復(fù)制的慢性攜帶者血清里，S蛋白和中蛋白的含量與在HBV顆粒中的含量大約有同樣的比例(10∶1)，但大蛋白少于1/20；而在病毒的非復(fù)制期，則22nm的球形顆粒所含有的幾乎全是S蛋白，中蛋白少于1％，無大蛋白。
對前S2蛋白的免疫原性的研究，提供了一些制備高效乙肝疫苗的依據(jù)，目前世界上大多數(shù)血源疫苗的純化都經(jīng)胃蛋白酶處理，因而將許多前S2蛋白的免疫原性破壞掉了，因此，有必要在未來的、新的乙肝疫苗中，添加適量的包膜中蛋白或前S2蛋白的成份，以提高其免疫原性。特別是對S蛋白免疫應(yīng)答差的機體，在接種前S2蛋白以后，也有希望獲得中和抗體，這已在動物實驗中得到了很好的證實。
現(xiàn)在人們已經(jīng)清楚地認識到，普遍接種乙肝疫苗是控制乙型肝炎大規(guī)模發(fā)生唯一和有效的方法。在一些發(fā)達國家中，已對乙肝病毒感染高危人群進行接種。例如，在加拿大和美國，普遍接種的對象是嬰幼兒和青少年，采用這種免疫方式使乙肝病毒感染的新病例減少90％以上，因此，如何使乙肝疫苗更加安全、經(jīng)濟、有效和更容易推廣使用將是今后各國研究的主要方向。
大量的實驗研究表明，人或其它哺乳類動物在受到病原感染后會產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)以抵御這種病原的入侵。該過程至少要涉及到以下三種免疫機制之一粘膜、體液或細胞。粘膜免疫應(yīng)答產(chǎn)生分泌型抗體IgA，可保護呼吸道、消化道、生殖系統(tǒng)和腺體表面不受侵染。粘膜抗體可阻止病原在粘膜表面定居從而構(gòu)成機體的第一道防御屏障。粘膜抗體的產(chǎn)生可通過分泌性腺體和組織的局部免疫而獲得，也可通過刺激腸道和呼吸道淋巴組織產(chǎn)生。體液免疫主要涉及IgG和IgM，它們在血液中參與侵入病原的吞噬、病毒中和或有補體介導(dǎo)的細胞毒性。
研究人員已經(jīng)注意到口服接種可誘導(dǎo)血液和粘膜抗體的產(chǎn)生，通常的情況是口服接種需要比較多的抗原，這是因為抗原被機體實際吸附和利用的數(shù)量比較低。因此，口服接種所需要的抗原數(shù)量遠遠超過注射接種(2)。然而，也有例外，人們發(fā)現(xiàn)一些蛋白只需口服少量就能產(chǎn)生體液和粘膜免疫應(yīng)答，原因是這些蛋白常常能夠與粘膜細胞膜表面的糖脂或糖蛋白受體進行特異性結(jié)合，因此，這些蛋白也被稱為粘膜性抗原，例如病毒性血凝素?？诜图∪庾⑸鋭┝勘容^實驗表明，粘膜類抗原也能夠非常有效地引起體液免疫，與肌肉注射相比，二者之間只有輕微的差別。并不是所有的蛋白都具有這種能力，現(xiàn)僅發(fā)現(xiàn)少數(shù)病毒和細菌含有這種抗原。
乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白可能也屬于粘膜性抗原，因此，它們在經(jīng)過口服接種或以腸道給藥的方式進入人體和其他哺乳動物后也能夠刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)并進而產(chǎn)生中和抗體。
基因工程研究領(lǐng)域的最新進展使植物表達外源基因成為可能。含有外源基因的植物細胞可再生成完整的植株，并將外源基因穩(wěn)定地遺傳給后代。迄今有些單子葉和雙子葉植物都已經(jīng)進行了成功的遺傳轉(zhuǎn)化。例如煙草、馬鈴薯、番茄、大豆、玉米、水稻、小麥和苜蓿等。
農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)的雙子葉植物轉(zhuǎn)化已有眾多報道。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法可有效地進行外源基因的轉(zhuǎn)移、選擇和再生。
單子葉植物經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化比較困難，但也可以利用其它的轉(zhuǎn)化方法如PEG和電融合法。有人成功地將外源基因?qū)胗衩?、水稻和小麥的原生質(zhì)體中。然后從轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體再生出完整的植株。一些新的轉(zhuǎn)化方法如微管注射法和基因槍法在單子葉植物和農(nóng)桿菌難以侵染的雙子葉植物轉(zhuǎn)化和再生中可能更加有效。
特別值得提出的是，在迄今為止所有已轉(zhuǎn)化的植物中，苜?？赡苁巧a(chǎn)藥用蛋白(尤其是口服疫苗)最好的宿主之一，原因是1)苜蓿是一種多年生的豆科植物，即使在北方寒冷地區(qū)，也能夠安全越冬，因此，每年不需要為留種和再次播種問題擔憂，田間維護管理的成本很低；2)苜蓿地上綠色部分(營養(yǎng)體)的蛋白質(zhì)含量很高，一般可達到植物干重的10％(每克鮮重的苜蓿地上部分約含有30mg的總蛋白)，因此，外源蛋白在轉(zhuǎn)基因苜蓿中有可能得到比較高的生物產(chǎn)量；3)苜?？梢酝ㄟ^扦插的辦法大量進行繁殖，一旦獲得一個高表達的轉(zhuǎn)基因植株，則勿需等待外源基因純合，可通過扦插的方法進行大規(guī)模的擴繁。當然，選擇苜蓿作為宿主表達外源蛋白也有缺點，那就是苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化工作是非常困難的(豆科植物的遺傳轉(zhuǎn)化通常都非常困難)，因為它們的細胞分化和再生屬于嚴重基因依賴型的。
已有人嘗試在馬鈴薯、煙草和番茄等植物中表達乙型肝炎病毒包膜小蛋白(S)基因，發(fā)現(xiàn)在上述植物中所產(chǎn)生的HBsAg抗原蛋白與源自人血液或基因工程酵母中的HBsAg蛋白具有相似的抗原特性和物理特性，并進而提出了“食物疫苗”的概念，為此，還申請了相關(guān)專利(3)。然而，在本發(fā)明之前，還沒有人利用轉(zhuǎn)基因苜蓿表達過乙型肝炎病毒包膜小蛋白或中蛋白基因，更沒有人嘗試在苜蓿中同時表達這兩種抗原蛋白基因。
本發(fā)明的目的之一是要在轉(zhuǎn)基因苜蓿體內(nèi)同時表達乙型肝炎病毒包膜小蛋白和中蛋白基因，以這種方式生產(chǎn)出的植物食用疫苗，因同時含有兩種抗原蛋白，其免疫原性比僅表達其中的任何一種抗原蛋白時可能會更強。此外，如前文所述，因為中蛋白分子中含有前S2蛋白區(qū)段及多聚人血清白蛋白受體，因而有比較強的免疫原性。那些對S蛋白免疫應(yīng)答差的人群，在接受含前S2蛋白的植物食用疫苗接種以后，也有希望產(chǎn)生專門針對乙型肝炎病毒的中和抗體，從而也能夠獲得乙肝疫苗有效的保護。
本發(fā)明的目的之二是采用誘導(dǎo)型的啟動子，以便在轉(zhuǎn)基因苜蓿體內(nèi)對乙型肝炎病毒包膜小蛋白和中蛋白基因同時進行誘導(dǎo)性表達。進行誘導(dǎo)表達的必要性在于1)上述兩種抗原蛋白基因?qū)俎６?，屬于外源性的，它們的高效表達及累積將會對苜蓿的生長產(chǎn)生不利的影響；2)如采用組成型的啟動子，如花椰菜花葉病毒35S啟動子，上述兩種抗原蛋白將在苜蓿的各個發(fā)育時期及各個器官和組織內(nèi)都會大量積累，當該轉(zhuǎn)基因苜蓿在田間進行大規(guī)模種植時，一旦散播出去，將會對生態(tài)環(huán)境及人類帶來潛在的危險，盡管目前我們已經(jīng)知道人類和其他哺乳類動物食用上述兩種抗原蛋白是安全的。而采用誘導(dǎo)性表達就可以避免上述現(xiàn)象的產(chǎn)生，因為在正常的生長條件下，誘導(dǎo)性啟動子處于沉默狀態(tài)，它并不會操控外源基因的表達，也就是說在誘導(dǎo)因子缺乏的情況下，在轉(zhuǎn)基因苜蓿體內(nèi)是檢測不到乙肝病毒包膜小蛋白和中蛋白重組抗原的。
在本發(fā)明之前，盡管已有人提出“食物疫苗”的概念，但在具體操作中存在著很大的困難，原因在于植物中表達的抗原蛋白含量不確定，且植物不同個體或同一植物個體的不同器官之間存在很大差異，若人或動物直接食用這種轉(zhuǎn)基因植物就會產(chǎn)生很大風險，例如，長時間食用含少量抗原蛋白的植物材料會引起免疫耐受性，而短時間食用過多的抗原又會引起超敏反應(yīng)。本發(fā)明首次提出將含有乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白抗原的轉(zhuǎn)基因苜蓿加工成膠囊、沖劑或其它制劑的方法，由于可對各種制劑中所含的抗原蛋白進行嚴格的定量，從而使人或其他哺乳動物的食用間隔和食用量有了可以參考的依據(jù)，由此克服了直接食用轉(zhuǎn)基因植物所潛在的一些缺點。
本發(fā)明提供乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白基因如何在轉(zhuǎn)基因苜蓿中同時進行誘導(dǎo)性表達的方法以及如何應(yīng)用含上述兩種重組抗原蛋白轉(zhuǎn)基因苜蓿的方法。本項發(fā)明特別適用于中國或其它發(fā)展中國家。
本發(fā)明利用可以食用的轉(zhuǎn)基因苜蓿生產(chǎn)乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白抗原，這兩個重組抗原蛋白在免疫原性方面與天然蛋白類似。按照一個優(yōu)先的實施方案，就是本發(fā)明提供了乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白基因在轉(zhuǎn)基因苜蓿中同時進行誘導(dǎo)性表達的方法以及如何具體應(yīng)用這種含乙肝抗原蛋白轉(zhuǎn)基因苜蓿的方法。
本發(fā)明克服了以前其他一些轉(zhuǎn)基因植物組成型表達乙型肝炎病毒抗原蛋白所存在的一些缺點，轉(zhuǎn)基因苜蓿在經(jīng)過誘導(dǎo)后才能夠表達目標外源蛋白基因，這樣就可以最大限度地減少乙肝病毒抗原蛋白轉(zhuǎn)基因苜蓿對人和生態(tài)環(huán)境所帶來的潛在的危險。
本發(fā)明利用轉(zhuǎn)基因苜蓿誘導(dǎo)性生產(chǎn)乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白重組抗原，如果將其加工成口服膠囊、沖劑或其它制劑，則具有廉價、安全和使用方便的特點，會使更多的人或其他哺乳動物得到保護。按照一個優(yōu)先的實施方案，人或其他哺乳動物只需食用這種轉(zhuǎn)基因苜蓿的葉、根和莖，或以腸道給藥的方式利用該轉(zhuǎn)基因苜蓿、或者是轉(zhuǎn)基因苜蓿粗提取物或完全純化物所制備的膠囊、沖劑或其它制劑便可獲得對乙型肝炎病毒的免疫能力。
按照一個實施方案，本發(fā)明涉及利用轉(zhuǎn)基因苜蓿生產(chǎn)含乙肝病毒包膜重組抗原蛋白膠囊、沖劑或其它制劑的方法。生產(chǎn)這種膠囊、沖劑或其它制劑的轉(zhuǎn)基因苜蓿材料可以有多種方式，可以是完整的植株，或者是苜蓿的一部分如葉子、莖和根，或者是苜蓿某一部分的粗提物、或者是雖源自轉(zhuǎn)基因苜蓿但已經(jīng)過部分純化或完全純化的乙肝病毒包膜重組抗原蛋白?？傊捎煤畏N方式主要取決于產(chǎn)生粘膜免疫應(yīng)答反應(yīng)所需這兩種源自轉(zhuǎn)基因苜蓿的乙肝病毒抗原蛋白的劑量以及在制劑中所含的干擾免疫應(yīng)答反應(yīng)的物質(zhì)的多少，如糖類、熱原和毒素等，并盡量降低免疫耐受性的產(chǎn)生。
本發(fā)明所指的乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白抗原是指在轉(zhuǎn)基因苜蓿中經(jīng)過誘導(dǎo)表達后才生產(chǎn)的，首先是編碼上述兩種抗原蛋白的基因被分離出來，然后同時插入到一個含有選擇標記的質(zhì)粒載體上，在每個基因的上游分別插入一個誘導(dǎo)型的啟動子，它操縱該基因在苜蓿中的表達。在經(jīng)過誘導(dǎo)后，上述兩種抗原蛋白基因在苜蓿的各器官中表達，人或其他哺乳動物可食用這部分組織。誘導(dǎo)物可以是溫度、光照、金屬離子、化合物及其他物理和化學(xué)因子，按照一個優(yōu)先的實施方案，所使用的誘導(dǎo)型啟動子是亞硝酸鹽還原酶基因啟動子(NIR)，該啟動子可在硝酸鹽的誘導(dǎo)下被激活，從而開始調(diào)控乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白基因在苜蓿中的表達。
本發(fā)明提供了在苜蓿細胞中誘導(dǎo)表達和生產(chǎn)乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重組抗原的方法，而這兩種蛋白已知在天然狀態(tài)下可引起人或哺乳動物產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)?；蛘哒f，本發(fā)明所指的乙肝病毒重組包膜小蛋白及中蛋白可作為抗原，具有與源自哺乳動物血液和其它常規(guī)表達系統(tǒng)如酵母和細菌產(chǎn)生的該抗原蛋白一樣的免疫原性?；蛘吒_切說，本發(fā)明的重組抗原蛋白與源自哺乳動物血液和其它常規(guī)表達系統(tǒng)產(chǎn)生的該抗原蛋白一樣，均能夠通過口服和腸道給藥的方式引起免疫應(yīng)答反應(yīng)。按照一個優(yōu)先的實施方案，乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白屬于粘膜性抗原，它可以在苜蓿中經(jīng)誘導(dǎo)表達而產(chǎn)生，且具有與源自哺乳動物或其它常規(guī)表達系統(tǒng)所產(chǎn)生的該類抗原蛋白相似的免疫原性。
本發(fā)明的乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白抗原可以是乙肝病毒天然抗原蛋白的全部。然而，在某些具體實施方案中，抗原也可能只是該天然蛋白分子的一部分。有時，上述抗原蛋白可與另外一個多肽或蛋白分子如細菌病原蛋白多肽結(jié)合在一起形成融合蛋白。蛋白的融合可以通過蛋白翻譯后加工、共價結(jié)合的方式，或者通過DNA重組技術(shù)使基因在翻譯前就連接在一起。這兩種技術(shù)是本領(lǐng)域?qū)＜以缫咽熘募夹g(shù)。
按照一個優(yōu)先的實施方案，本發(fā)明涉及到了一種食物的組成問題，該食物中至少含有轉(zhuǎn)基因苜蓿的某些食用部分，如葉、莖和根部等，這里所指的轉(zhuǎn)基因苜蓿應(yīng)能夠誘導(dǎo)表達和生產(chǎn)乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白重組抗原，已知這些抗原蛋白能夠引起人和其他哺乳類動物免疫應(yīng)答反應(yīng)，特別是粘膜免疫應(yīng)答反應(yīng)，就如同天然蛋白或其它表達系統(tǒng)產(chǎn)生的該類抗原蛋白一樣。
按照一個優(yōu)先的實施方案，本發(fā)明涉及到了一種膠囊、沖劑或其它制劑的組成成份問題，膠囊、沖劑或其它制劑中至少含有轉(zhuǎn)基因苜蓿的某些食用部分，如葉、莖和根部等，這里所指的轉(zhuǎn)基因苜蓿應(yīng)能夠誘導(dǎo)表達和生產(chǎn)乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白重組抗原。就本發(fā)明而言，膠囊、沖劑或其它制劑中含有的乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白抗原應(yīng)該能夠精確定量，以避免人或其他哺乳類動物食用后產(chǎn)生免疫耐受性。
對本發(fā)明所使用的方法和其它相關(guān)事項極為重要的是一些質(zhì)粒載體的構(gòu)建，它們在獲得本發(fā)明所指的轉(zhuǎn)基因苜蓿以及轉(zhuǎn)基因苜蓿的加工應(yīng)用中起重要作用。用于轉(zhuǎn)化苜蓿的質(zhì)粒載體由編碼乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白基因或其衍生物的DNA序列和分別操縱這些DNA序列在苜蓿中進行誘導(dǎo)性表達的植物誘導(dǎo)型啟動子組成。在某些具體實施方案中，質(zhì)粒載體還包括一個選擇或標記基因，主要用于轉(zhuǎn)基因苜蓿的檢測。在某些具體實施方案中，本發(fā)明的植物誘導(dǎo)型啟動子是苜蓿亞硝酸鹽還原酶基因啟動子。正如上面所述，按照某些具體的實施方案，本發(fā)明的質(zhì)粒載體將用于轉(zhuǎn)化苜蓿，它編碼的抗原是乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白，更進一步說，質(zhì)粒載體所編碼的抗原能夠誘導(dǎo)人和其他哺乳類動物產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，特別是粘膜性免疫應(yīng)答反應(yīng)，就象天然蛋白和源自其它表達系統(tǒng)所產(chǎn)生的該抗原蛋白一樣，而植物誘導(dǎo)型啟動子主要是操縱這兩種抗原蛋白基因在苜蓿中進行誘導(dǎo)表達和生產(chǎn)。在一個類似的實施方案中，本發(fā)明提供的DNA片段可通過其他的遺傳轉(zhuǎn)化方法例如基因槍法轉(zhuǎn)化苜蓿。
本發(fā)明也提供了獲得轉(zhuǎn)基因苜蓿細胞的方法，它包括以下步驟1)構(gòu)建一個質(zhì)粒載體或者一段DNA序列，其中都含有編碼乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重組抗原的基因，而且這些基因被分別置于一個植物誘導(dǎo)型啟動子的操縱之下；2)用質(zhì)粒載體或上述DNA片段轉(zhuǎn)化苜蓿細胞。按照一個優(yōu)先的實施方案，還包括從轉(zhuǎn)化的苜蓿細胞再生出完整的轉(zhuǎn)基因苜蓿植株的方法。
本發(fā)明提供了各種苜蓿細胞或苜蓿植株的轉(zhuǎn)化方法。盡管在下面描述的某些優(yōu)先實施方案中僅利用了特定的轉(zhuǎn)化方法，但顯而易見的是，本領(lǐng)域?qū)＜宜缫咽熘钠渌参镛D(zhuǎn)化方法也應(yīng)包括在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)，這些方法包括微管注射、PEG融合和電融合等。按照某些優(yōu)先實施方案，使用的是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，特別指Ti質(zhì)粒參與的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。在其它一些優(yōu)先實施方案中，還可以使用基因槍法轉(zhuǎn)化苜蓿細胞或苜蓿植株。
就象下面實例中所要詳細描述的那樣，本發(fā)明苜蓿細胞或苜蓿轉(zhuǎn)化方法中所用的質(zhì)粒載體是一個雙元載體系統(tǒng)。按照一個實施方案，本發(fā)明使用的質(zhì)粒是一個整合性載體。按照一個更加優(yōu)先的實施方案，本發(fā)明所使用的質(zhì)粒是pBI121。
本發(fā)明提供了誘導(dǎo)表達乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白或其衍生物轉(zhuǎn)基因苜蓿的構(gòu)建方法，這種轉(zhuǎn)基因苜蓿作為食物或加工成膠囊、沖劑或其它制劑后被人們食用有可能引起人或其他哺乳動物的免疫應(yīng)答。這種免疫應(yīng)答的結(jié)果使人或其他哺乳動物對乙肝病毒的感染具有抵抗能力。這種免疫應(yīng)答是由于在轉(zhuǎn)基因苜蓿中表達乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重組抗原后而產(chǎn)生的結(jié)果，而乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白抗原的產(chǎn)生則是由于這些抗原蛋白基因整合入苜蓿的基因組中并在誘導(dǎo)型啟動子調(diào)控下能夠進行誘導(dǎo)性表達及生產(chǎn)的結(jié)果。
有許多種方法可以將外源基因?qū)胲俎?。將外源基因穩(wěn)定整合入苜蓿染色體基因組DNA的主要方法包括1)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法；2)DNA直接攝入法，包括PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)融合法、電激法、微管注射法以及使用基因槍將DNA直接送入植物細胞和組織等。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是利用質(zhì)粒載體將特定的DNA片段整合入苜蓿染色體基因組DNA。苜蓿的轉(zhuǎn)化方法因苜蓿外植體的不同及所使用的農(nóng)桿菌系統(tǒng)而異。最常用的方法是葉盤法，它適用于任何易于再生成完整植株的苜蓿外植體。
正如上面已提到的各種DNA直接攝入轉(zhuǎn)化方法，電激法是先將苜蓿原生質(zhì)體置于放在一個強電場中，在電流作用下將外源DNA送入原生質(zhì)體內(nèi)。微管注射法是用微管將DNA直接注射入細胞中?；驑尫ㄊ菍NA先吸附在硫酸鎂或鎢粒上，這些顆粒被加速射入苜蓿細胞或組織中。
按照本發(fā)明的一個優(yōu)先實施方案，農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒系統(tǒng)被選用。農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒中含有一段叫做轉(zhuǎn)移DNA(T-DNA)的，它可以進入苜蓿細胞中并整合入苜蓿的染色體中。轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建分為兩步，首先是構(gòu)建一個可以在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒，這個質(zhì)粒含有乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白抗原基因或其衍生物；抗原基因的兩端含有T-DNA邊界序列，它負責目的基因在苜?；蚪M中的插入位點。通常另外一個選擇標志基因(如抗卡那霉素抗性基因)也被包含在T-DNA的左右邊界序列中，該基因在苜蓿細胞中表達后可提供一個選擇標記證實苜?；蜍俎＜毎欠窈姓系腡-DNA序列。載體構(gòu)建的第二步是將質(zhì)粒從大腸桿菌轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌中。這可以通過三親交配的方式或DNA直接導(dǎo)入方式完成。為了T-DNA的轉(zhuǎn)移，所用的農(nóng)桿菌菌株中還要含有一套誘導(dǎo)基因，它們在T-DNA轉(zhuǎn)移到苜蓿細胞中起重要作用。
熟悉植物遺傳轉(zhuǎn)化的人應(yīng)該知道轉(zhuǎn)化用的農(nóng)桿菌菌株可以有多種選擇，質(zhì)粒構(gòu)建也有多種方式，其目的都是為了更有利于苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化。同樣，人們也應(yīng)該知道除了根癌農(nóng)桿菌外，在有些情況下，還有其它農(nóng)桿菌如發(fā)根型農(nóng)桿菌可供使用。
苜蓿的轉(zhuǎn)化方法因苜蓿的外植體不同和農(nóng)桿菌介導(dǎo)系統(tǒng)而異。最常用的是植物葉盤轉(zhuǎn)化法，它適于多種易于再生的苜蓿外植體。在某些情況下，還需要加入一些輔助細胞。其他的轉(zhuǎn)化方法包括原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，繼而由原生質(zhì)體再生出完整苜蓿細胞及完整植株。
本發(fā)明不僅僅限于使用農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，還應(yīng)包括使用其它物理性的手段將目標外源蛋白基因直接導(dǎo)入苜蓿細胞或原生質(zhì)體的方法。
在苜蓿外植體和轉(zhuǎn)化方法確定之后，一個誘導(dǎo)型表達的植物啟動子被選擇以便乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白基因能夠在苜蓿中進行誘導(dǎo)性表達。
所有已知能操縱外源基因在苜蓿細胞中進行誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)錄的啟動子都可以在應(yīng)用在本發(fā)明中。這些啟動子可從植物或病毒中獲得，如苜蓿亞硝酸還原酶基因的啟動子(包括經(jīng)過拼接、加倍和突變改造后的NIR啟動子)；光誘導(dǎo)基因啟動子如核糖二磷酸羧化酶小亞基(rbcS)啟動子或逆境誘導(dǎo)基因啟動子如乙醇脫氫酶(Adh1)啟動子等，但不僅限于此。
用于苜蓿轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒通常含有一個選擇標志基因。許多有此功能的基因已被開發(fā)出來。
本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因食物的生產(chǎn)方法。它包括以下步驟1)構(gòu)建一個質(zhì)粒載體或者一段DNA序列，其中都含有編碼乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重組抗原的基因或其衍生物，而且這些基因被分別置于一個植物誘導(dǎo)型啟動子操縱之下；2)用質(zhì)粒載體或上述DNA片段轉(zhuǎn)化苜蓿細胞；3)從轉(zhuǎn)基因苜蓿細胞中再生出完整的轉(zhuǎn)基因苜蓿植株；4)收獲轉(zhuǎn)基因苜蓿的可食用部分；5)食用一定量的這種轉(zhuǎn)基因苜蓿，盡量避免產(chǎn)生免疫耐受性，以達到預(yù)防疾病的效果。
本發(fā)明也提供了含確定劑量乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重組抗原蛋白膠囊、沖劑或其它制劑的生產(chǎn)方法，它包括以下步驟1)構(gòu)建一個質(zhì)粒載體或者一段DNA序列，其中都含有編碼乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白抗原的基因或其衍生物，而且這些基因被分別置于一個植物誘導(dǎo)型啟動子操縱之下；2)用質(zhì)粒載體或上述DNA片段轉(zhuǎn)化苜蓿細胞；3)從轉(zhuǎn)基因苜蓿細胞中再生出完整的轉(zhuǎn)基因苜蓿植株；4)自轉(zhuǎn)基因苜蓿細胞或完整植株中部分純化或完全純化出乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重組抗原，然后加工成膠囊、沖劑或其它制劑。按照一個優(yōu)先的實施方案，含有乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重組抗原的完整轉(zhuǎn)基因苜蓿食用部分可直接進行冷凍干燥和粉碎，然后加工成膠囊、沖劑或其它制劑，并確定其中含有的乙肝病毒重組抗原蛋白劑量。
為了詳細描述本發(fā)明的某些優(yōu)先實施方案，并以相應(yīng)的繪圖作參考

圖1A乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白基因的克隆。
圖1B乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白的結(jié)構(gòu)和組成。
圖2質(zhì)粒pSML的構(gòu)建過程，它含有乙型肝炎病毒包膜小蛋白和中蛋白抗原基因及苜蓿亞硝酸還原酶基因啟動子。其中GUS＝代表β-Glucuronidase(葡糖醛酸酶)基因；S代表乙肝病毒包膜小蛋白基因；M代表乙肝病毒包膜中蛋白基因；NIR代表苜蓿亞硝酸還原酶基因啟動子。
圖3質(zhì)粒pSML所含的3個結(jié)構(gòu)基因及其調(diào)控表達序列。其中Nos-Pro代表胭脂堿合成酶啟動子；NPT-II＝新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因；Nos-Ter代表胭脂堿合成酶終止子；NIR代表苜蓿亞硝酸鹽還原酶基因啟動子；RB代表T-DNA右邊界序列；LB代表T-DNA左邊界序列。
圖4PCR檢測乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白基因在不同苜蓿中的整合情況。其中1為標準分子量1kb DNA Ladder；2為包膜中蛋白陽性對照擴增產(chǎn)物；3為包膜小蛋白陽性對照擴增產(chǎn)物；4-5為陰性對照植物擴增結(jié)果；6-8為部分轉(zhuǎn)基因苜蓿中蛋白基因擴增產(chǎn)物；9-11相同轉(zhuǎn)基因苜蓿小蛋白基因擴增產(chǎn)物。
圖5轉(zhuǎn)基因苜蓿在誘導(dǎo)前后的乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重組抗原酶聯(lián)檢測結(jié)果。1為非轉(zhuǎn)基因苜蓿；2-3為轉(zhuǎn)基因苜蓿。
圖6乙肝病毒重組抗原蛋白(S&M)在苜蓿植物汁液中的穩(wěn)定性測定。其中含抗原蛋白的苜蓿莖葉(0.1g)在400ul磷酸緩沖液中磨碎后，室溫下(15-20℃)放置1-7天后，取100ul上清液酶聯(lián)反應(yīng)后測定OD405nm光吸收值。
圖7乙肝病毒重組抗原蛋白在高溫下的穩(wěn)定性測定。其中含抗原蛋白的苜蓿莖葉(0.1g)在400ul磷酸緩沖液中磨碎后，不同溫度下放置2小時后，取100ul上清液酶聯(lián)反應(yīng)后測定OD405nm光吸收值。
圖8經(jīng)親和層析純化出的苜蓿乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白的PAGE分析。
其中1為標準蛋白分子量(Pharmacia)；2為源自人血漿的乙肝病毒表面抗原(S蛋白，Chemicon公司)；3為非轉(zhuǎn)基因苜蓿莖葉的總蛋白提取物；4為轉(zhuǎn)基因苜蓿莖葉的總蛋白提取物；5為從轉(zhuǎn)基因苜蓿莖葉中純化出的乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重組抗原。
本發(fā)明包括以下幾個組成部分1)乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白基因的克隆。根據(jù)已公布的編碼乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白的DNA核苷酸序列，合成了兩對引物。乙肝患者的血清(adr亞型)經(jīng)酚和氯仿處理可抽提出含乙型肝炎病毒核酸的總DNA，以此為模板，利用上述的兩對引物，經(jīng)多聚酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增可分別獲得大小與期望值相符的兩個DNA片段，這兩個PCR擴增產(chǎn)物被分別定向插入到pGEM-T質(zhì)粒中的T位點內(nèi)(見Promega公司產(chǎn)品說明書)，經(jīng)藍白系統(tǒng)選擇，可獲得含有外源插入片段的細菌克隆(重組子)，序列分析所獲基因的正確性和完整性；2)苜蓿亞硝酸還原酶基因啟動子的克隆。根據(jù)已知的核苷酸序列，合成一對引物。利用CTAB法自苜蓿莖葉中提取出其總DNA，并以此為模板，經(jīng)PCR擴增可獲得大小與期望值相符的一個DNA片段，該PCR產(chǎn)物被定向插入到pGEM-T質(zhì)粒中的T位點內(nèi)(見Promega公司產(chǎn)品說明書)，經(jīng)藍白系統(tǒng)選擇，可獲得含有外源插入片段的細菌克隆(重組子)，序列分析所獲基因的正確性和完整性；3)利用DNA重組技木構(gòu)建質(zhì)粒表達載體，它同時含有乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白基因或其衍生物，這些抗原蛋白基因在誘導(dǎo)型啟動子的操縱下能夠分別在苜蓿體內(nèi)進行誘導(dǎo)性表達；4)在農(nóng)桿菌的介導(dǎo)下、或采用其他適宜的轉(zhuǎn)化方法，選擇適宜的苜蓿外植體進行遺傳轉(zhuǎn)化，使編碼上述乙肝病毒抗原蛋白的雙基因都能穩(wěn)定地整合入苜蓿染色體中并可穩(wěn)定地遺傳給后代；5)從轉(zhuǎn)化的苜蓿細胞中再生出完整的轉(zhuǎn)基因植株，而且該工程植株在誘導(dǎo)物的作用下，能夠穩(wěn)定和高效地表達及生產(chǎn)乙型肝炎病毒包膜小蛋白中蛋白重組抗原；6)人或其他哺乳動物直接食用這種轉(zhuǎn)基因苜?；蛞阅c道給藥的方式口服以該轉(zhuǎn)基因為主要活性成份加工而成的膠囊、沖劑或其它制劑后，有可能預(yù)防乙型肝炎病毒的侵染。
下面以苜蓿亞硝酸還原酶基因啟動子調(diào)控乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白在轉(zhuǎn)基因苜蓿中的誘導(dǎo)性表達為例，描述一個優(yōu)先的實施方案，但本發(fā)明的應(yīng)用不僅限于此。
實施例11.乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白基因的克隆根據(jù)已公布的乙肝病毒基因組DNA核苷酸序列(4)，合成了一對特定的引物以便用于擴增乙肝病毒包膜小蛋白基因，其中上游引物(5’端引物)為5’-AACCCGGGAACAATGGAGAACACAGCATCAGGATTCC-3’，下游引物(3’端引物)為5’-AAGAGCTCTCAAATGTATACCCAAAGACAAAAG-3’。乙肝患者的血清(adr亞型)購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部微生物教研室，經(jīng)用等體積酚和氯仿處理以后，可從中抽提出含乙型肝炎病毒核酸的總DNA，以此作為模版，利用上述引物并經(jīng)多聚酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增，可獲得一個大小約為700bp的DNA片段。該DNA片段被直接插入到pGEM-T質(zhì)粒中的T位點內(nèi)(見Promega公司產(chǎn)品說明書)，按照該公司提供的方法，通過藍白系統(tǒng)篩選，得到含有乙肝病毒包膜小蛋白基因的細菌克隆pGEMS(見圖1)，然后，通過核苷酸序列分析，確定乙肝病毒包膜小蛋白編碼序列是正確和完整的(測序工作由上海生工生物工程公司完成)(見序列表中的1)。
為擴增乙肝病毒包膜中蛋白基因，又合成了另外一個上游引物(5’端引物)，其序列為5’-AACCCGGGAACAATGGCGTGGAACTCCACAACATTCCACC-3’，而下游引物(3’端引物)與擴增乙肝病毒包膜小蛋白所使用的引物完全相同。同樣以乙肝病毒基因組DNA為模板，利用上述引物并經(jīng)多聚酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增，可獲得一個大小約為850bp的DNA片段。該DNA片段被直接插入到pGEM-T質(zhì)粒中的T位點內(nèi)(見Promega公司產(chǎn)品說明書)，按照該公司提供的方法，通過藍白系統(tǒng)篩選，得到含有乙肝病毒包膜中蛋白基因的細菌克隆pGEMM(見圖1)，然后，通過核苷酸序列分析，確定乙肝病毒包膜中蛋白編碼序列是正確和完整的(測序工作由上海生工生物工程公司完成)(見序列表中的3)。
2.苜蓿亞硝酸還原酶基因啟動子(NIR)的克隆根據(jù)已公布的苜蓿亞硝酸還原酶基因啟動子DNA核苷酸序列(5)，合成了一對特定的引物以便用于擴增該啟動子，其中上游引物(5’端引物)為5’-AAAGCTTCCGGGCTGGTCTGTACATTCATCTTGCCGCC-3’，下游引物(3’端引物)為5’-ACCCGGGTTTTGGAGAAGAGAGTGTGTTTGGAATGAG-3’。苜?；蚪MDNA的提取方法基本依據(jù)Chee的方法(6)。取0.3g苜蓿(苜蓿品種為保定苜蓿，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所)新鮮葉片，放入研缽中用液氮研磨，磨碎后的粉末移置10ml離心管中，然后加入0.9ml CTAB提取液(100mM Tris-HCl，pH7.5含5M NaCl，10mM EDTA，10ml/L β-巰基乙醇，10g/L CTAB)，劇烈振蕩1分鐘，使之充分混勻。在60℃水浴中溫浴90分鐘，期間每30分鐘振蕩一次。從水浴中取出離心管，室溫下放置4-5分鐘，使之冷卻，然后加入0.45ml氯仿，輕輕搖動，使之充分混勻。室溫下5000g離心10分鐘。收集上清液于另一10ml離心管中，加入0.45ml氯仿，重復(fù)上述步驟。收集上清液，加入1ml冰冷的異丙醇，輕搖10-15分鐘，5000g離心5分鐘，收集沉淀，用1ml 76％乙醇含0.2MNaOAc和1ml 76％乙醇含10mM NH4OAc各洗沉淀一次，最后加入TE(pH8.0)緩沖液溶解DNA，將DNA濃度調(diào)至1ug/ul。取上述苜?；蚪MDNA作為模版，利用上述合成的特異性引物經(jīng)多聚酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增，可獲得一個大小約為3kb的DNA片段。該DNA片段被直接插入到pGEM-T質(zhì)粒中的T位點內(nèi)(見Promega公司產(chǎn)品說明書)，按照該公司提供的方法，通過藍白系統(tǒng)篩選，得到含有苜蓿亞硝酸還原酶基因啟動子核苷酸序列的細菌克隆pGEMNIR，通過核苷酸序列分析，確定苜蓿亞硝酸還原酶基因啟動子核苷酸序列是正確和完整的(測序工作由上海生工生物工程公司完成)(見序列表中的5)。
3.植物表達載體pSML質(zhì)粒的構(gòu)建質(zhì)粒pGEMS中含有乙肝病毒包膜小蛋白基因，在合成引物時，因為在5’端和3’端引物中分別引入了SmaI和SacI位點，所以用限制性內(nèi)切酶SmaI和SacI雙酶切質(zhì)粒pGEMS便可將包膜小蛋白基因切下來，通過瓊脂糖凝膠電泳可分離獲得該DNA片段，隨后將其定向插入到質(zhì)粒pBI121中的原GUS基因位點上(SmaI和SacI雙酶切)便構(gòu)建成中間質(zhì)粒載體pS(見圖2)。
質(zhì)粒pGEMM中含有乙肝病毒包膜中蛋白基因，在合成引物時，因為在5’端和3’端引物中分別引入了SmaI和SacI位點，所以用限制性內(nèi)切酶SmaI和SacI雙酶切質(zhì)粒pGEMM同樣可將包膜中蛋白基因切下來，通過瓊脂糖凝膠電泳可分離獲得該DNA片段。隨后將其定向插入到質(zhì)粒pBI121中的原GUS基因位點上(SmaI和SacI雙酶切)便構(gòu)建成中間質(zhì)粒載體pM(見圖2)。
質(zhì)粒pGEMNIR中含有苜蓿亞硝酸還原酶基因啟動子核苷酸序列，在合成引物時，因為在5’端和3’端引物中分別引入了HindIII和SmaI位點，用限制性內(nèi)切酶HindIII和SmaI雙酶切質(zhì)粒pGEMNIR便可將該啟動子序列切下來，通過瓊脂糖凝膠電泳可分離獲得該DNA片段，隨后將其分別定向插入到中間質(zhì)粒載體pS和pM中的原35S啟動子位點上(HindIII和SmaI雙酶切)便又構(gòu)建成兩個新的中間質(zhì)粒載體pSN和pMN(見圖2)。
質(zhì)粒pSN DNA先用限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切，然后用Klenow酶將粘性末端補平，在T4 DNA連接酶的作用下，再與磷酸化的HindIII接頭(購自大連寶生物工程有限公司，貨號為D4860P)相連，最后，用限制性內(nèi)切酶HindIII單酶切并通過瓊脂糖凝膠電泳可分離獲得攜帶苜蓿亞硝酸還原酶基因啟動子-乙肝病毒包膜小蛋白基因-Nos終止子序列的DNA片段，隨后將其插入到質(zhì)粒pMN的HindIII位點內(nèi)，便構(gòu)建成植物表達載體pSML(見圖2)。
質(zhì)粒pBI121購自美國Clonetech公司，它的SmaI限制性酶切位點位于花椰菜花葉病毒35S啟動子和GUS基因起始密碼之間，SacI限制性酶切位點位于GUS基因終止序列和NOS終止子之間。選用質(zhì)粒pBI121是因為用SmaI和SacI雙酶切可將GUS基因刪除，而隨后可插入另外一個蛋白基因。用HindIII和SmaI雙酶切可將原35S啟動子刪除，而隨后可插入一個新的植物誘導(dǎo)型啟動子。新基因?qū)⒛軌蛟谥参锛毎麅?nèi)進行誘導(dǎo)性表達。質(zhì)粒pBI121還含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II基因(NPT II)，它編碼的酶可為植物細胞提供卡那霉素抗性，從而可將含有T-DNA的細胞和組織篩選出來。NPT II基因有自己的啟動子和多聚腺酸信號序列，它們源自胭脂堿(Nopaline)合成酶(NOS)基因。
植物表達載體pSML含有1)新霉素合成酶基因II(NPT II)，它提供給植物細胞卡那霉素抗性；2)乙肝病毒包膜小蛋白抗原基因及操縱該基因在苜蓿中進行誘導(dǎo)性表達的苜蓿亞硝酸還原酶啟動子；3)乙肝病毒包膜中蛋白抗原基因及操縱該基因在苜蓿中進行誘導(dǎo)性表達的苜蓿亞硝酸還原酶啟動子；4)T-DNA左右邊界序列，它可將NPT II基因、乙肝病毒包膜小蛋白和中蛋白抗原基因轉(zhuǎn)移到苜蓿體內(nèi)并整合到苜蓿的染色體中。pSML的結(jié)構(gòu)如圖3所示。
4.將表達載體pSML導(dǎo)入農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)含有乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白抗原基因的質(zhì)粒pSML被通過三親交配的方式轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌LBA4404菌株中，該菌株購自美國Clonetech公司(見產(chǎn)品說明書)。菌株LBA4404現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用是因為它是一改造后的農(nóng)桿菌，它含有完整Vir基因，但其野生型的T-DNA已經(jīng)被刪除。Vir基因可反式調(diào)節(jié)T-DNA自質(zhì)粒載體pSML向苜蓿細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移。
農(nóng)桿菌在含有25mg/L鏈霉素50ml YEP(蛋白胨10克，酵母提取物10克，NaCl 5克，加蒸餾水至1升，pH7.0)培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，在OD600nm值達到0.4-0.7時，4000g離心收集細菌細胞，將農(nóng)桿菌細胞重新懸浮在1ml不含任何抗生素的YEP培養(yǎng)基中待用。含有表達載體pSML的DH5α(購自美國GIBCO公司)和含有輔助質(zhì)粒pRK2013(購自美國Clonetech公司)的HB101(購自美國Clonetech公司)分別接種在含有50mg/L卡那霉素50ml LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，在OD600nm值達到0.4-0.7時，4000g離心收集細菌細胞，然后將細胞分別懸浮在1ml不含任何抗生素的LB培養(yǎng)基(10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化鈉，加蒸餾水至1升，pH7.0)中待用。取上述三種細胞懸浮液各200ul，置于同一1.5ml離心管中(三親交配)，28℃靜置培養(yǎng)過夜，取該培養(yǎng)物5-10ul，均勻涂抹在YEP固體培養(yǎng)基平板上，該培養(yǎng)基中同時含有25mg/L鏈霉素和50mg/L卡那霉素，28℃培養(yǎng)2天后，含有pSML質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌落開始產(chǎn)生。
用堿裂解法從農(nóng)桿菌中提取質(zhì)粒DNA，并用限制性內(nèi)切酶酶切可檢測pSML質(zhì)粒DNA是否存在。
實施例21.苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化主要依據(jù)Horsch等人的葉盤轉(zhuǎn)化方法(7)。苜蓿種子(品種為保定苜蓿，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所)被浸入10％次氯酸鈉溶液中，室溫下消毒處理10分鐘，然后用無菌蒸餾水漂洗三次。漂洗后的苜蓿種子被置于無菌水浸濕的濾紙上進行萌發(fā)，輔之以中等光照強度下，7日后切取子葉(帶子葉柄)作為外植體進行遺傳轉(zhuǎn)化。
含有表達載體pSML的農(nóng)桿菌LBA4404接種在50ml YEP培養(yǎng)基(含50mg/ml卡那霉素和25mg/ml鏈霉素)中28℃培養(yǎng)2天，4000g離心5分鐘收集菌體，用25ml MS培養(yǎng)液(不含抗抗生素)洗滌一次，再用MS培養(yǎng)液重新懸浮至OD600nm＝0.2-0.4。將有傷口的子片浸入稀釋后的農(nóng)桿菌菌液中5-8分鐘，用無菌濾紙吸干子葉上多余的菌液，然后將子葉移置不含任何激素和抗生素的TM-1固體平板培養(yǎng)基(8)上23-25℃避光共培養(yǎng)5天；將葉片移置新鮮的再生固體平板培養(yǎng)基(TM-1中含有11mg/L 2，4-D、0.5mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA；25mg/L卡那霉素、250mg/L羧芐青霉素，7g/L瓊脂)上培養(yǎng)，溫度26℃，16小時光照，中等光照強度(GXZ智能型光照培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠)，以后每兩周更換一次培養(yǎng)基。當葉片傷口處愈傷有幼芽形成并長至足夠大時，將幼芽切下(通常在轉(zhuǎn)化后3個月)轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上(TM-1中含有25mg/L卡那霉素、250mg/L羧芐青霉素，不含任何激素)生長。當根出現(xiàn)后(約需20天)，待植株長至一定高度，然后轉(zhuǎn)移到滅菌土壤或蛭石中，給予適宜的條件培養(yǎng)生長。
2.PCR檢測乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白基因在苜蓿中的整合情況苜?；蚪MDNA的提取方法見實施例1。取3g苜蓿葉片，放入研缽中用液氮研磨，磨碎后的粉末移置20ml離心管中，然后加入9ml CTAB提取液(100mMTris-HCl，pH7.5含5M NaCl，10mM EDTA，10ml/L β-巰基乙醇，10g/L CTAB)，劇烈振蕩1分鐘，使之充分混勻。在60℃水浴中溫浴90分鐘，期間每30分鐘振蕩一次。從水浴中取出離心管，室溫下放置4-5分鐘，使之冷卻，然后加入4.5ml氯仿，輕輕搖動，使之充分混勻。室溫下5000g離心10分鐘。收集上清液于另一20ml離心管中，加入4.5ml氯仿，重復(fù)上述步驟。收集上清液，加入10ml冰冷的異丙醇，輕搖10-15分鐘，5000g離心5分鐘，收集沉淀，用3ml 76％乙醇含0.2M NaOAc和2ml 76％乙醇含10mM NH4OAc各洗沉淀一次，最后加入TE(pH8.0)緩沖液溶解DNA，將DNA濃度調(diào)至1ug/ul。
取上述苜?；蚪MDNA 1ug約1ul作為模版，加入乙肝病毒包膜小蛋白或中蛋白基因特異性引物各1ul，10XPCR緩沖液3ul，dNTP(各2.5mM)3ul，Taq酶0.5ul約1.5U，加水至總體積30ul。94℃30秒，50℃45秒，72℃1.5分鐘，共進行35個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，取5ul擴增樣品進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。如圖4所示，陰性對照苜蓿中(泳道4-5)沒有發(fā)現(xiàn)特異性的條帶，而在轉(zhuǎn)基因苜蓿植株中則可擴增出1個約700bp或850bp的特異性條帶(泳道6-11)，該結(jié)果表明乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白基因已整合進入苜蓿基因組DNA中。
3.乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白抗原在轉(zhuǎn)基因苜蓿中的誘導(dǎo)性表達及檢測乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白在轉(zhuǎn)基因苜蓿中的誘導(dǎo)性表達基本上參照Vezina等人的方法(5)。轉(zhuǎn)基因苜蓿以盆栽的方式、單株定植在蛭石中，在定植后前4周，每隔5天澆灌一次Hoagland營養(yǎng)液(2mM KH2PO4，2mM MgSO4·7H2O，0.55mMK2SO4，15mM KCl，10mM NH4Cl，2.8mM CaCl2·2H2O，0.05mM NaFe EDTA)，每升Hoagland營養(yǎng)液中還添加有1毫升微量元素(1g/L H3BO3，1g/L MnCl2·4H2O，0.58g/LZnSO4·7H2O，0.13g/L CuSO4·5H2O，0.1g/L Na2MoO4·2H2O)。在第4周后，開始澆灌新的營養(yǎng)液，新營養(yǎng)液的營養(yǎng)成分與上述營養(yǎng)液大致相同，只是以40mM KNO3替換掉原來的10mM NH4Cl，因為KNO3是苜蓿亞硝酸還原酶啟動子的誘導(dǎo)物，它可以激活該啟動子并操縱乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白基因在苜蓿中開始表達。在更換澆灌營養(yǎng)液兩周后，取苜蓿頂端已完全伸展開的葉片進行乙肝病毒抗原蛋白的檢測。
取不同轉(zhuǎn)基因苜蓿頂端伸展開葉片各0.1g，分別加入1.5ml去離子水，在4℃下用玻璃勻漿器磨碎。勻漿液10000g 4℃離心5分鐘，利用Lowry法(蛋白測定試劑盒購自Sigma公司，貨號為P5656)，取部分上清液測定可溶性蛋白含量。依據(jù)Hepanostika HBsAg Uni-Form II Microelisa System試劑盒(購自荷蘭Organon Teknika公司)中提供的方法，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗測定上清液中乙肝病毒包膜小蛋白和中蛋白的含量(該試劑盒無法區(qū)分包膜小蛋白和中蛋白各自的含量)。以CHO細胞提取的標準含量的重組HBsAg蛋白(中國衛(wèi)生部生物制品鑒定所提供，因為無法獲得標準含量的乙肝病毒包膜中蛋白，以下所測定的苜蓿乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白表達量為近似值)為陽性對照。陽性對照被稀釋成不同蛋白水平(0.2-32ng)，在顏色反應(yīng)后，讀取405nm光吸收值，制備一條標準吸收曲線。如圖5中所示，通過比較發(fā)現(xiàn)，陰性對照苜蓿誘導(dǎo)前后(1)及轉(zhuǎn)基因苜蓿(誘導(dǎo)前)其OD405nm吸光值均處于較低的水平，意味著體內(nèi)乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白基因處于沉默狀態(tài)，沒有表達；或者說是在這種條件下，因乙肝病毒重組抗原蛋白含量非常低，該酶聯(lián)試劑盒無法檢測到這些重組抗原蛋白(2和3)。但在誘導(dǎo)后，苜蓿亞硝酸還原酶基因啟動子被激活，它開始操控乙肝病毒包膜小蛋白和中蛋白基因在轉(zhuǎn)基因苜蓿中同時進行高效表達。通過與陽性對照相比，可知在轉(zhuǎn)基因苜蓿中，乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重組抗原的表達量約占到植物可溶性蛋白的0.01-0.02％，即每克鮮重莖葉約含有1-2ug克乙肝病毒重組抗原蛋白。不同轉(zhuǎn)基因苜蓿之間有一定的差異，這可能是由于基因插入的拷貝數(shù)和插入位點不同引起的。
4.表達乙型肝炎病毒包膜中蛋白轉(zhuǎn)基因苜蓿的繁殖和培育在篩選出高效和穩(wěn)定表達乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白重組抗原的轉(zhuǎn)基因苜蓿后，為商品化生產(chǎn)上述抗原蛋白必須大量繁殖該轉(zhuǎn)基因植株。苜蓿既可以通過種子繁殖，也可以通過營養(yǎng)繁殖(扦插)。通過種子繁殖，轉(zhuǎn)基因苜蓿必須要經(jīng)過連續(xù)幾代的篩選，在得到純系后，外源基因才有可能穩(wěn)定地遺傳給后代，這就需要比較長的時間。因此，可通過扦插的方法，在短時間內(nèi)便可獲得大量苜蓿幼苗，且不必擔心由于有性生殖而引起后代的遺傳重組問題。
實施例31.重組乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重組抗原在苜蓿莖葉中的穩(wěn)定性測定重組乙肝病毒包膜蛋白重組抗原[包括小蛋白(S)及中蛋白(M)]在完整的苜蓿細胞中，可長時間保存。例如，苜蓿地上綠色部分在收割后可迅速脫水干燥并在4℃下低溫保存，保存期長達一年，抗原蛋白也不會有任何損失。但當苜蓿細胞結(jié)構(gòu)完全破壞以后，細胞器中的各種蛋白酶就會被釋放出來，它們能降解苜蓿植物汁液中所含的乙肝病毒重組抗原蛋白。因此，檢測乙肝病毒重組抗原蛋白在苜蓿植物汁液中的穩(wěn)定性，對于今后在加工過程中盡可能保證抗原蛋白不受損失至關(guān)重要。從圖6中可以看出，重組的乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白抗原在苜蓿植物汁液中放置的時間越長，蛋白的損失就會越大。在室溫下放置1天后與新研磨的汁液中相比，抗原蛋白含量差別不大，但從第2天起，抗原蛋白的量會急劇減少，到第七天后，基本上就檢測不到乙肝重組抗原蛋白了。該結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因苜蓿莖葉加工過程中，應(yīng)盡快使其脫水干燥并保存在低溫條件下，才可以有效防止乙肝病毒重組抗原蛋白不會被細胞中釋放出的蛋白酶降解破壞。
盡管高溫可加速轉(zhuǎn)基因苜蓿莖葉脫水干燥，但重組乙肝病毒包膜中蛋白抗原對高溫的忍受能力是有限的。從圖7可以看出，當溫度超過50℃時，處理時間達長2小時，則苜蓿植物汁液中能夠檢測到的乙肝病毒重組抗原蛋白的數(shù)量就會急劇下降，這表明乙肝病毒抗原蛋白在苜蓿植物汁液中可忍受的極限高溫是50℃，超過此溫度，抗原蛋白會被蛋白酶所降解，或者是由于乙肝病毒抗原蛋白變性，從而失去了與特異性抗體的反應(yīng)能力。
綜合上述，可以得出如下結(jié)論，苜蓿地上部分的干燥應(yīng)以低溫、快速最為適宜，在此條件下可有效保護乙肝病毒重組抗原蛋白不受損失。
2.含乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重組抗原膠囊的制備苜蓿地上綠色部分不便于人類食用，可考慮加工成膠囊。1000g鮮重苜蓿莖葉在低溫條件下徹底干燥后可獲得干物質(zhì)約230g，該干物質(zhì)進而在低溫下被磨成150-200目的干粉，經(jīng)測定，每100mg這種轉(zhuǎn)基因苜蓿莖葉制成的干粉中約含有0.4ug乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白抗原。該干粉可直接灌入腸溶性或胃溶性的膠囊外殼內(nèi)。根據(jù)具體情況，每個膠囊可灌入100-500mg由轉(zhuǎn)基因苜蓿莖葉制成的干粉，例如，一個300mg的膠囊約含有1.2ug乙肝病毒抗原蛋白。成人一次需服用至少10粒這樣的膠囊，才有可能獲得足夠的免疫劑量。
為了提高每個膠囊內(nèi)乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白抗原的含量，可預(yù)先進行一個粗提純過程。新鮮的苜蓿莖葉在加入等重量PBS緩沖液(0.2g KH2PO4，2.9gNa2HPO4·12H2O，8.0gNaCl，0.2g KCl，加水至1升，pH7.4)后，在4℃低溫條件下被徹底粉碎，以便將乙肝病毒抗原蛋白自苜蓿細胞中完全釋放出來，低速離心后收集上清液，經(jīng)迅速冷凍干燥后，每100mg這種粗提取物中約含有30-50ug乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白抗原，而成年人每次只需服用1粒100mg的膠囊，就有可能達到足夠的免疫劑量。
3.含乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重組抗原沖劑的制備膠囊的容積比較小，如果直接灌入轉(zhuǎn)基因苜蓿莖葉制成的干粉，則每粒膠囊所含有的乙肝病毒重組抗原蛋白較少，成人每次需服用多粒膠囊才能夠達到足夠的免疫劑量。而若經(jīng)過一個粗提純過程，雖然可提高每粒膠囊中所含的有效成分，但這必然會增加生產(chǎn)成本。為此，為增加一次性服用的劑量，可采用沖劑包裝形式，每袋內(nèi)裝入10-20g由轉(zhuǎn)基因苜蓿莖葉制成的干粉。以10g包裝為例，含有乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重組抗原約40ug。成人每次只需服用1袋，便可獲得足夠的免疫劑量。在服用時，為避免高溫導(dǎo)致蛋白變性，可伴以溫開水稀釋后服下。
4.含乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重組抗原的其它制劑苜蓿莖葉也可以加工成飲料的方式便于服用，其前提是必須保證在液體情況下其中的乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重組抗原不會被蛋白酶所降解，并能在室溫條件下長期儲存。
苜蓿來源的乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重組抗原還可以有其它應(yīng)用方式，例如，抗原蛋白在經(jīng)過完全純化或部分純化后，可作為食品添加劑，摻入奶粉、豆粉、果汁和酸奶等食物以及飲料中制備成各種特殊功能性食品。
實施例4
1.利用親和層析法從轉(zhuǎn)基因苜蓿中提純乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重組抗原乙肝病毒表面抗原山羊多克隆抗體(產(chǎn)品貨號MAB8161)購自美國Chemicon公司，該抗體的免疫抗原蛋白(HBsAg)來自人血漿，它與乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白均能發(fā)生特異性血清學(xué)反應(yīng)(因為乙肝病毒包膜中蛋白分子中同樣含有完整的包膜小蛋白多肽)。首先通過酶聯(lián)免疫吸附試驗證實轉(zhuǎn)基因苜蓿莖葉提取物中含有能夠與該抗體產(chǎn)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)，然后通過SDS-PAGE電泳和Western blot檢測苜蓿莖葉中重組蛋白的大小和糖基化情況。
按照產(chǎn)品說明書中提供的方法，上述的山羊抗體被固定在經(jīng)CNBr活化的Sepharose 4B上(Pharmacia Biotech公司產(chǎn)品)。取100克經(jīng)硝酸鉀誘導(dǎo)表達后的轉(zhuǎn)基因苜蓿幼嫩莖葉，加入等量PBS緩沖液(含有0.1％Triton X-100；0.5mMPMSF)，在4℃下勻漿。勻漿液經(jīng)40,000g離心后收集上清液。上清液經(jīng)冷凍干燥后，重新溶解在2ml TSA緩沖液(20mM Tris-HCl，pH8.0，140mM NaCl，0.025％NaN3)中，然后與上述活化的抗體-凝膠復(fù)合物在4℃下充分混合16小時。反應(yīng)物上柱后，用5倍柱體積pH8.0和pH9.0的Tris緩沖液(50mM Tris-HCl，0.1％Triton X-100，500mM NaCl)分別洗柱，接著用5ml三乙醇胺緩沖液(50mM三乙醇胺，pH11.5，0.1％Triton X-100，150mM NaCl)進行洗脫，洗脫液分別收集在10個1.5ml(每管0.5ml)離心管中。通過酶聯(lián)吸附反應(yīng)檢測每個離心管中抗原蛋白的有無。將有免疫反應(yīng)的洗脫液匯集在一起，裝入透析袋中，4℃透析過夜，透析緩沖液為2升PBS。透析完成后從透析袋中吸出透析物，經(jīng)冷凍干燥后，重新溶解在1ml PBS緩沖液中，然后從中取出20ul進行SDS-PAGE電泳。SDS-PAGE電泳檢測發(fā)現(xiàn)植物重組包膜小蛋白及中蛋白的分子量分別約為27KD和33KD，與人血漿中的乙肝病毒包膜小蛋白GP27(分子量27KD)及中蛋白GP33(分子量33KD)相類似(1)，即各蛋白至少含有一個糖基化位點(見圖8)。
2.小鼠的注射免疫接種試驗供試小白鼠(BALB/c)購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部，兩種性別，但每批實驗各處理組的小鼠均為雄性或雌性，體重在15-20克左右。乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg源自人血漿)購自美國Chemicon公司，酵母基因工程重組乙肝疫苗(S蛋白)購自衛(wèi)生部北京生物制品研究所。不同來源乙肝病毒抗原各取100ng，分別加入PBS緩沖液至終體積200ul，不加入任何佐劑，以腹腔注射方式免疫每只小鼠，每組接種5只小鼠。每隔10天注射接種1次，在第5次接種后10天通過眼部取血方式收集小鼠抗血清。
抗血清的效價通過酶聯(lián)吸附反應(yīng)進行測定，乙肝病毒表面抗原(Chemicon公司產(chǎn)品)經(jīng)包被緩沖液稀釋(1.59g Na2CO3，2.93g NaHCO3，加蒸餾水至1升)后，每個小孔內(nèi)加入100ul(含抗原100ng)，4℃下包被過夜。次日，用PBST緩沖液(8.0gNaCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12H2O，0.2g kCl，0.5ml Tween20，加蒸餾水至1升，pH7.4)洗四次，每次2分鐘，甩干后，加入經(jīng)PBST(含0.2％BSA)稀釋成不同濃度的小鼠抗血清100ul，37℃反應(yīng)2小時。用PBST洗4次，甩干后加入經(jīng)PBST(含0.2％BSA)1/5000倍稀釋的堿性磷酸酶標記的兔抗鼠酶標抗體(Sigma公司產(chǎn)品)100ul，37℃反應(yīng)2小時，用PBST洗5次，甩干后加入100ul底物緩沖液[9.7ml二乙醇胺，60mg p-nitrophenyl(Sigma公司)，加蒸餾水至100毫升，pH9.8]，室溫下反應(yīng)30分鐘，然后加入50ul 3M NaOH終止反應(yīng)，讀取各小孔405nm光吸收值。
如表1所示，在注射接種同樣劑量抗原蛋白的情況下，植物來源的乙肝病毒重組抗原蛋白的免疫原性是最強的，在稀釋倍數(shù)達1/10,000時，檢測100ng乙肝病毒表面抗原時，OD405nm的吸光值比陰性對照的高4倍之多，同時，在相同稀釋度的情況下，其吸光值也比另外兩種抗原抗血清的吸光值要高，如在1/5000倍稀釋時，其OD405nm的吸光值比酵母重組乙肝疫苗(S蛋白)高約3倍，比血源乙肝表面抗原(HBsAg)高約1.1倍。
表1不同免疫原小鼠抗血清效價的比較
(1)表中數(shù)字為3次實驗的平均值(OD405nm吸光值)3.小鼠的口服免疫接種實驗供試的小鼠與上面注射接種實驗相同。因自然取食無法規(guī)范確定每個小鼠的免疫劑量(各小鼠吃的量不一致)，故口服免疫接種采取一次性口腔注入的方法。取0.5g或1g轉(zhuǎn)基因苜蓿新鮮莖葉與等量PBS緩沖液混合后，利用玻璃勻漿器充分研磨，然后利用針尖為圓球形的注射器(購自北京化學(xué)試劑商店)將苜蓿粗勻漿液通過小鼠口腔小心注入小鼠食道內(nèi)(在操作過程中避免對小鼠消化道造成任何傷害)。小鼠在口服接種前先饑餓2 4小時，接種后2小時之內(nèi)不予進水。
每隔10天口服接種1次，共接種8次。在每次口服接種后的第7天，從小鼠尾靜脈取血3滴，將每組(5只小鼠)小鼠的血匯集在一起，然后與100ul PBS緩沖液混合后，室溫下放置1小時，離心收集上部血清，-20℃下保存待測。小鼠抗體的產(chǎn)生情況通過乙肝抗抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒(Hepanostika anti-HBs試劑盒購自荷蘭Organon Teknika公司)進行檢測，操作方法完全按照試劑盒中提供的方法進行。
檢測結(jié)果如表2所示，用含有乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白的轉(zhuǎn)基因苜蓿莖葉口服接種小鼠是可以誘導(dǎo)特異性抗體產(chǎn)生的，而且口服接種1g轉(zhuǎn)基因苜蓿莖葉的效果要好于口服接種0,5g的。盡管口服接種抗體滴度比注射接種要弱很多，而且首次免疫應(yīng)答反應(yīng)出現(xiàn)的時間也比較晚，但與試劑盒中提供的人弱陽性抗體血清(＞10mIU/ml)相比，第8次口服接種后的小鼠抗血清其OD405nm吸光值要高于后者，而這一滴度在人體上足以起到抵御乙肝病毒侵染的作用。
表2口服接種后小鼠體內(nèi)抗體產(chǎn)生情況
(1)表中數(shù)字為3次實驗的平均值(OD405nm吸光值)參考文獻1.成軍和楊守純主編，現(xiàn)代肝炎病毒分子生物學(xué)，人民軍醫(yī)出版社，1997年2.de Aizpurua and Russell-Jones，J. Exp. Med.，1988，167440-4513.Man-kit，L. D.，Arntzen，C.J.and Mason，H.S.，WO94/200135，19944.琦組和等，中國科學(xué)B輯，1988，121300-13045.Vezina，L.P.and D’Aoust M.A.，patent application，WO02/36786A2，20026.Chee，P.P.，Drong，R.F.and Slightom，J.L.，Plant Molecular Biology Manual，1991，C31-287.Horsch，R.B.，et al.，Science，1985，2271229-12318.Shahin，E.A.，Theor.Appl.Genet.，1985，69235-240本發(fā)明的進一步描述只是一些特別的優(yōu)先實施方案，是按照專利申請要求和為了解釋和說明本專利的內(nèi)容。很顯然，在不背離本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)，可在此基礎(chǔ)上，做進一步的改進和變化。
序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所<120>乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白基因在苜蓿中的誘導(dǎo)性表達<160>5<210>1<211>681<212>DNA<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)<220>
<221>CDS<222>(1)...(678)<400>1atg gag aac aca gca tca gga ttc cta gga ccc ctg ctc gtg tta cag gcg ggg ttt 57Met Glu His Thr Ala Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe1 5 10 15ttc ttg ttg aca aga atc ctc aca ata cca cag agt cta gac tcg tgg tgg act tct 114Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser20 25 30 35ctc aat ttt cta ggg gga gca ccc acg tgt cct ggc caa aat tcg cag tcc cca acc 171Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr40 45 50 55tcc aat cac tca cca acc ttc tgt cct cca att tgt cct ggc tat cgc tgg atg tgt 228Ser Asn His Ser Pro Thr Phe Cys Pro Pro Ile Cys Pro Arg Tyr Arg Trp Met Cys60 65 70 75ctg cgg cgt ttt atc ata ttc ctc ttc atc ctg ctg cta tgc ctc atc ttc ttg ttg 285Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu80 85 90 95gtt ctt ctg gac tac caa ggt atg ttg ccc gtt tgt cct cta ctt cca gga aca tca 342Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser100 105 110act acc agc acg gga cca tgc aag acc tgc acg att cct gct caa gga acc tct atg 399Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys lys Thr Cys Cys Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met115 120 125 130ttt ccc tct tgt tgc tgt aca aaa cct tcg gac gga aac tgc act tgt att ccc atc 456Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile135 140 145 150cca tca tca tgg gct ttc gca aga ttc cta tgg gag tgg gcc tca gtc cgt ttc tcc 513Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser155 160 165 170
tgg ctc agt tta cta gtg cca ttt gtt cag tgg ttc gta ggg ctt tcc ccc act gtt 570Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val175 180 185 190tgg ctt tca gtt gta tgg atg atg tgg tat tgg ggg cca agt ctg tac aac atc ttg 627Trp Leu Ser Val Val Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile Leu195 200 205agt ccc ttt tta cct cta tta cca att ttc ttt tgt ctt tgg gta tac att tga 681Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile *210 215 220 225<210>2<211>226<212>PRT<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)<400>2Met Glu His Thr Ala Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln1 5 10 15Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu20 25 30Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys35 40 45Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Phe50 55 60Cys Pro Pro Ile Cys Pro Arg Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe65 70 75 80Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val85 90 95Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly100 105 110Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys lys Thr Cys Cys Ile Pro Ala115 120 125Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp130 135 140Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg145 150 155 160Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu165 170 175Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu180 185 190
Ser Val Val Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile195 200 205Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val210 215 220Tyr Ile225<210>3<211>846<212>DNA<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)<220>
<221>CDS<222>(1)...(843)<400>3atg gcg tgg aac tcc aca aca ttc cac caa gct ctg cta gat ccc aga gtg agg ggc 57Met Ala Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly1 5 10 15cta tat ttt cct gct ggt ggc tcc agt tcc gga aca gta aac cct gtt ccg act act 114Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr20 25 30 35gtc tca ccc ata tcg tca atc ttc tcg agg act ggg gac cct gca ccg aac atg gag 171Val Ser Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn Met Glu40 45 50 55aac aca gca tca gga ttc cta gga ccc ctg ctc gtg tta cag gcg ggg ttt ttc ttg 228His Thr Ala Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu60 65 70 75ttg aca aga atc ctc aca ata cca cag agt cta gac tcg tgg tgg act tct ctc aat 285Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn80 85 90 95ttt cta ggg gga gca ccc acg tgt cct ggc caa aat tcg cag tcc cca acc tcc aat 342Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn100 105 110cac tca cca acc ttc tgt cct cca att tgt cct ggc tat cgc tgg atg tgt ctg cgg 399His Ser Pro Thr Phe Cys Pro Pro Ile Cys Pro Arg Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg115 120 125 130cgt ttt atc ata ttc ctc ttc atc ctg ctg cta tgc ctc atc ttc ttg ttg gtt ctt 456Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu135 140 145 150ctg gac tac caa ggt atg ttg ccc gtt tgt cct cta ctt cca gga aca tca act acc 513Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr
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115 120 125Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu130 135 140Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro145 150 155 160Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys165 170 175lys Thr Cys Cys Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys180 185 190Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro195 200 205Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg210 215 220Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly225 230 235 240Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Val Trp Met Met Trp Tyr Trp245 250 255Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro260 265 270Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile275 280<210>5<211>
<212>DNA<213>苜蓿(Medicago sativa)<400>5ccgggctggt ctgtacattc atcttgccgc ctttgcattc acttggccac aaagagtaga 60gagaaggaag agaagagccc agacttcaag aagcgacctt gcaagtgcac tcgagggtca 120gaaactgtat atcatatcta tgtgagagaa aggggaacat ttgagatgga gtccatttac 180ttgaggtata cttattattt tgatcaataa atttgtatac ttcttattta gatcaataaa 240tttgtcatta agctataatc caaaataaat tacgatcaaa tatgcaaatg ttagccagta 300cttgtgttaa acttgatggc atctcttggt ttctttggca atcacatgcc taagaaataa 360atagtatcat atgattgtgt ttggtcagac ttcagagtca gatgactctg tttggataaa 420cagcttaatt aagcgcttat agaatatcat atgattgtgt ttggtcagac ttcagagcat 480ctcttggttt ctctggcaat catatgccta agaaataaat agtatcatat gattgtgttt 540ggtcagactt cagagtcaga tgaccctgtt tgggtaaaca gcttaattaa gtgcttatag 600aataagcgct tatcatataa gtgcttttgt acagttattt ctatgaaagt agaagaaata 660gtcatattgt tttaatataa gctatcctgg agagcttgtg gaaataacca gaaaagaact 720tatggacacg tcatgagctg tttacataag atctccctaa cagtctcaaa agtgtttatg 780
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1.一種通過轉(zhuǎn)基因苜蓿同時誘導(dǎo)表達和生產(chǎn)乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白重組抗原或者是它們的衍生物的方法。
2.一種引起人或其他哺乳動物對乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白重組抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，該方法包括使用有效和確定免疫劑量的、來源于能產(chǎn)生這些重組抗原蛋白或其衍生物的轉(zhuǎn)基因苜?？墒秤貌糠秩绺?、莖和葉或其加工提取物對人或其他哺乳動物進行口服或腸道給藥。
3.一種食物至少是由轉(zhuǎn)基因苜蓿的某一部分所組成，它被食用是因為它具有一定的營養(yǎng)價值，其中所說的轉(zhuǎn)基因苜蓿是一種能夠誘導(dǎo)表達乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白重組抗原的苜蓿，而這些抗原蛋白已知在天然狀態(tài)下具有免疫原性，且可以作為一種藥物的主要或有效組成部分。
4.如權(quán)利要求3中的任何食物，其中所說的苜蓿食用部分包括葉子、莖、根或所說的苜蓿種子。
5.一個用于轉(zhuǎn)化苜蓿的質(zhì)粒載體包括一段編碼乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白重組抗原或者是它們的衍生物的DNA序列，這些蛋白在已知天然狀態(tài)下具有免疫原性。另外還包括與所說的基因分別連接的植物誘導(dǎo)型啟動子，例如苜蓿亞硝酸還原酶基因啟動子，該啟動子在誘導(dǎo)物的作用下，可操縱所說的基因能夠在苜蓿中同時進行誘導(dǎo)性表達。
6.如權(quán)利要求5中的質(zhì)粒載體，它含有一個選擇或標記基因。
7.一段用于基因槍法轉(zhuǎn)化苜蓿的DNA序列包括一段編碼乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白重組抗原或者是它們的衍生物的DNA序列，這些蛋白已知在天然狀態(tài)下具有免疫原性。另外還包括與所說的基因分別連接的植物誘導(dǎo)型啟動子，例如苜蓿亞硝酸還原酶基因啟動子，該啟動子在誘導(dǎo)物的作用下，可操縱所說的基因能夠在苜蓿中同時進行誘導(dǎo)性表達。
8.如權(quán)利要求7中的DNA序列，它含有一個選擇或標記基因。
9.一種構(gòu)建轉(zhuǎn)基因苜蓿細胞的方法包括構(gòu)建一個質(zhì)粒載體或一段DNA序列，其中都含有編碼乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白的基因或者是它們的衍生物，另外還包括與所說的基因分別連接的植物誘導(dǎo)型啟動子，例如苜蓿亞硝酸還原酶基因啟動子，該啟動子在誘導(dǎo)物的作用下，可操縱所說的基因能夠在苜蓿中同時進行誘導(dǎo)性表達。用該質(zhì)粒載體或該DNA序列轉(zhuǎn)化苜蓿細胞。
10.如權(quán)利要求9中的方法，它包括從所說的轉(zhuǎn)基因苜蓿細胞中再生出完整的轉(zhuǎn)基因植株。
11.生產(chǎn)一種膠囊、沖劑或其它制劑的方法包括構(gòu)建一個質(zhì)粒載體或一段DNA序列，其中都含有編碼乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白的基因或者是它們的衍生物，另外還包括與所說的基因分別連接的植物誘導(dǎo)型啟動子，例如苜蓿亞硝酸還原酶基因啟動子，該啟動子在誘導(dǎo)物的作用下，可操縱所說的基因能夠在苜蓿中同時進行誘導(dǎo)性表達，已知這些蛋白已知在天然狀態(tài)下具有免疫原性。用該質(zhì)粒載體或該DNA序列轉(zhuǎn)化苜蓿細胞。將轉(zhuǎn)基因苜蓿的食用部分冷凍、干燥和磨碎后制作成膠囊、沖劑或其它制劑。
12.如權(quán)利要求11的方法，其中還包括在利用轉(zhuǎn)基因苜蓿作為食物以及加工成膠囊、沖劑或其它制劑之前，應(yīng)從所說的轉(zhuǎn)基因苜蓿細胞中再生出完整的轉(zhuǎn)基因植株。
13.如權(quán)利要求11中的方法，其中還包括從所說的苜蓿細胞中部分純化或完全純化出所說的乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重組抗原作為膠囊、沖劑或其它制劑的活性組成部分。
14.如權(quán)利要求11中的方法，其中所說的苜蓿細胞是通過農(nóng)桿菌系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的。
15.如權(quán)利要求14中的方法，其中所說的農(nóng)桿菌系統(tǒng)是農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒系統(tǒng)。
16.如權(quán)利要求11中的方法，其中所說的苜蓿細胞是通過除農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)以外的其它轉(zhuǎn)化方法如基因槍法、微管注射法、PEG吸收法以及電融合法等方法轉(zhuǎn)化的。
全文摘要
本發(fā)明涉及乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白基因在轉(zhuǎn)基因苜蓿中同時進行誘導(dǎo)性表達的方法及其應(yīng)用。上述兩個抗原蛋白基因被分別置于苜蓿亞硝酸還原酶基因啟動子操控之下，在正常生長條件下，這兩個外源蛋白基因處于沉默狀態(tài)，無任何目標蛋白產(chǎn)生。但在硝酸鹽的誘導(dǎo)下，亞硝酸還原酶基因啟動子被激活，并隨后調(diào)控乙肝病毒包膜小蛋白和中蛋白基因在苜蓿體內(nèi)同時進行高效表達和積累。人或其他哺乳動物通過直接食用含有這兩種重組抗原蛋白的轉(zhuǎn)基因苜蓿、或通過腸道給藥的方式利用自這些轉(zhuǎn)基因苜蓿中部分或完全純化出乙型肝炎病毒膜小蛋白及中蛋白作為膠囊、沖劑或其它制劑的主要活性成分從而可能引起人或其他哺乳動物對乙肝病毒包膜抗原蛋白的免疫應(yīng)答反應(yīng)。
文檔編號A23L1/212GK101070536SQ20061007876
公開日2007年11月14日 申請日期2006年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月11日
發(fā)明者劉德虎, 李剛強, 徐妙云, 魏昭榮, 王躍駒 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所