專利名稱：培育高含硫氨基酸的轉(zhuǎn)基因苜蓿的方法及其專用材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及培育高含硫氨基酸的轉(zhuǎn)基因苜蓿的方法及其專用材料。
背景技術(shù)：
苜蓿是苜蓿屬(Medicago)植物的通稱，是一種多年生開(kāi)花植物，其中最著名的是作為牧草的紫花苜蓿(Medicago sativa L.)。紫花苜蓿是苜蓿屬中很重要的多年生野生豆科牧草，主要分布在中國(guó)、蒙古、俄羅斯、巴基斯坦、印度、土耳其等國(guó)家。我國(guó)的紫花苜蓿品種資源豐富，主要分布在我國(guó)的東北、華北、西北地區(qū)。與其它種比較，紫花苜蓿具有抗逆性強(qiáng)、耐寒、耐旱、耐瘠薄和壽命長(zhǎng)等突出特點(diǎn)，適宜在干旱、寒冷的地區(qū)種植，是我國(guó)北方建設(shè)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)人工草地的首選。紫花苜蓿為優(yōu)質(zhì)豆科牧草，開(kāi)花期含粗蛋白22.75%、粗脂肪
1.78%、粗纖維22.84%。雖然紫花苜蓿的蛋白含量較高，但是其蛋白質(zhì)中含硫氨基酸的含量較低。實(shí)驗(yàn)證明含硫氨基酸含量的增加可提高羊毛產(chǎn)量22%以上，增產(chǎn)的幅度在22% 104%,同時(shí)還可增加牲畜的重量。創(chuàng)制高含硫氨基酸的苜蓿品種將促進(jìn)畜牧業(yè)的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種培育氨基酸含量改變的轉(zhuǎn)基因苜蓿的方法及其專用材料。本發(fā)明所提供的培育氨基酸含量改變的轉(zhuǎn)基因苜蓿的方法，包括向受體苜蓿中導(dǎo)入天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因，得到氨基酸含量改變的轉(zhuǎn)基因苜蓿；所述轉(zhuǎn)基因苜蓿具 有下述I) -4)中的全部特性或至少一種特性:I)所述轉(zhuǎn)基因苜蓿與所述受體苜蓿相比，甲硫氨酸含量提高；2)所述轉(zhuǎn)基因苜蓿與所述受體苜蓿相比，半胱氨酸含量提高；3)所述轉(zhuǎn)基因苜蓿與所述受體苜蓿相比，天冬氨酸含量提高；4)所述轉(zhuǎn)基因苜蓿與所述受體苜蓿相比，賴氨酸含量提高；所述天冬氨酸激酶是如下a)或b)的蛋白質(zhì):a)氨基酸序列如SEQ ID N0.2第65-512位所示的蛋白質(zhì)；b)將SEQ ID N0.2第65-512位經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基得到的具有天冬氨酸激酶活性的由a)衍生的蛋白質(zhì)；所述腺苷硫酸還原酶是如下c)或d)的蛋白質(zhì):c)氨基酸序列如SEQ ID N0.4第65-330位所示的蛋白質(zhì)；d)將SEQ ID N0.4第65-330位經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基得到的具有腺苷硫酸還原酶活性的由c)衍生的蛋白質(zhì)。其中，SEQ ID N0.2由512個(gè)氨基酸殘基組成，為葉綠體引導(dǎo)肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白TP-AK的氨基酸序列，SEQ ID N0.2的第1_62位為葉綠體引導(dǎo)肽TP的氨基酸序列，SEQ ID N0.2的第65-512位為天冬氨酸激酶AK的氨基酸序列。SEQ ID N0.4由330個(gè)氨基酸殘基組成，為葉綠體引導(dǎo)肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白TP-APR的氨基酸序列，SEQ ID N0.4的第1-62位為葉綠體引導(dǎo)肽TP的氨基酸序列，SEQ ID N0.4的第65-330位為腺苷硫酸還原酶APR的氨基酸序列。上述方法中，所述氨基酸含量是指葉片中的氨基酸含量。所述轉(zhuǎn)基因苜蓿與所述受體苜蓿相比，總氨基酸含量沒(méi)有差異。上述方法中，所述天冬氨酸激酶編碼基因可為如下I)或2)或3)或4)所示的基因，和/或所述腺苷硫酸還原酶為如下5)或6)或7)或8)所示的基因:I)編碼所述天冬氨酸激酶的DNA分子；2)其編碼序列是SEQ ID N0.1的第1196-2542位核苷酸的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA分子雜交且編碼所述天冬氨酸激酶的DNA分子；4)與I)限 定的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼所述天冬氨酸激酶的DNA分子;5)編碼所述腺苷硫酸還原酶的DNA分子；6)其編碼序列是SEQ ID N0.3的第1196-1996位核苷酸的DNA分子；7)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA分子雜交且編碼所述腺苷硫酸還原酶的DNA分子;8)與I)限定的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼所述腺苷硫酸還原酶的DNA分子。其中，SEQ ID N0.1由3132個(gè)核苷酸組成，為天冬氨酸激酶編碼基因表達(dá)盒的核苷酸序列，第1-1003位為35S啟動(dòng)子序列，第1004-1189位為葉綠體引導(dǎo)肽基因序列，第1196-2542位為天冬氨酸激酶AK基因序列，第1004-2542位為葉綠體引導(dǎo)肽天冬氨酸激酶融合蛋白TP-AK的基因序列，第2543-3132位為ocs終止子序列。SEQ ID N0.3由2586個(gè)核苷酸組成，為腺苷硫酸還原酶編碼基因表達(dá)盒的核苷酸序列，第1-1003位為35S啟動(dòng)子序列，第1004-1189位為葉綠體弓I導(dǎo)肽基因序列，第1196-1996位為腺苷硫酸還原酶APR基因序列，第1004-1996位為葉綠體引導(dǎo)肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白TP-APR的基因序列，第1997-2586位為ocs終止子序列。上述方法中，所述天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因通過(guò)天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因表達(dá)載體導(dǎo)入所述受體苜蓿；所述天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因表達(dá)載體含有天冬氨酸激酶編碼基因表達(dá)盒和腺苷硫酸還原酶編碼基因表達(dá)盒；所述天冬氨酸激酶編碼基因表達(dá)盒包括啟動(dòng)子I和由所述啟動(dòng)子I啟動(dòng)的葉綠體引導(dǎo)肽天冬氨酸激酶融合蛋白基因和終止所述葉綠體引導(dǎo)肽天冬氨酸激酶融合蛋白基因轉(zhuǎn)錄的終止子I;所述葉綠體引導(dǎo)肽天冬氨酸激酶融合蛋白基因是所述天冬氨酸激酶編碼基因與所述葉綠體引導(dǎo)肽基因相連接形成的融合基因，所述葉綠體引導(dǎo)肽基因位于所述天冬氨酸激酶編碼基因的上游；所述腺苷硫酸還原酶編碼基因表達(dá)盒包括啟動(dòng)子2和由所述啟動(dòng)子2啟動(dòng)的葉綠體引導(dǎo)肽腺苷硫酸還原酶融合基因和終止所述葉綠體引導(dǎo)肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白基因轉(zhuǎn)錄的終止子2 ;所述葉綠體引導(dǎo)肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白基因是所述腺苷硫酸還原酶編碼基因與所述葉綠體引導(dǎo)肽基因相連接形成的融合基因，所述葉綠體引導(dǎo)肽基因位于所述腺苷硫酸還原酶編碼基因的上游。
上述方法中，所述葉綠體引導(dǎo)肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白可為TP-AK，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示；所述葉綠體引導(dǎo)肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白可為TP-APR，其氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。上述方法中，所述葉綠體引導(dǎo)肽天冬氨酸激酶融合基因序列如SEQ ID N0.1的第1004-2542位所示；所述葉綠體引導(dǎo)肽腺苷硫酸還原酶融合基因序列如SEQ ID N0.3的第1004-1996 位所示。上述方法中，所述葉綠體引導(dǎo)肽基因的核苷酸序列可如SEQ ID N0.1的第1004-1189位所示；所述啟動(dòng)子I和啟動(dòng)子2均是35s(核苷酸序列如SEQ ID N0.1的第1-1003位)，所述終止子I和所述終止子2均是ocs (核苷酸序列如SEQ ID N0.1的第2543-3132 位)。上述方法中，所述天冬氨酸激酶編碼基因表達(dá)盒的核苷酸序列具體如SEQ IDN0.1所示；腺苷硫酸還原酶編碼基因表達(dá)盒的核苷酸序列具體如SEQ ID N0.3所示。上述方法中，所述天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因表達(dá)載體具體可為在PCAMBIA2300的多克隆位點(diǎn)插入所述天冬氨酸激酶編碼基因表達(dá)盒和腺苷硫酸還原酶編碼基因表達(dá)盒得到的重組表達(dá)載體PCAMBIAK-APR。上述方法中，所述受體苜蓿具體可為紫花苜蓿，如保定苜蓿。上述方法中，所述天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒，植物病毒栽體，直接DNA轉(zhuǎn)化，微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞(Weissbach, 1998, Method for Plant Molecular Biology VIII, AcademyPress, New York, pp.411-463;Geiserson and Corey, 1998, Plant Molecular Biology(2ndEdition)。所述方法還包括從導(dǎo)入所述天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因的植株中篩選表達(dá)所述天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因的植株，得到所述氨基酸含量改變的轉(zhuǎn)基因苜蓿的步驟。所述轉(zhuǎn)基因苜蓿理解為不僅包含將所述天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因轉(zhuǎn)化受體苜蓿得到的第一代轉(zhuǎn)基因苜蓿，也包括其子代。對(duì)于轉(zhuǎn)基因苜蓿，可以在該物種中繁殖所述天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將所述天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因苜蓿包括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。下述任一種生物材料也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍:A、在pDES200的1xp位點(diǎn)插入SEQ ID N0.1所示的天冬氨酸激酶編碼基因表達(dá)盒和SEQ ID N0.3所示的腺苷硫酸還原酶編碼基因表達(dá)盒得到的重組表達(dá)載體；B、含有SEQ ID N0.1所示的天冬氨酸激酶編碼基因表達(dá)盒和SEQ ID N0.3所示的腺苷硫酸還原酶編碼基因表達(dá)盒的表達(dá)載體；C、SEQ ID N0.1所示的天冬氨酸激酶編碼基因表達(dá)盒和SEQ ID N0.3所示的腺苷硫酸還原酶編碼基因表達(dá)盒；D、SEQ ID N0.2所示的融合蛋白的編碼基因和SEQ ID N0.4所示的融合蛋白的編碼基因；E、SEQ ID N0.1的 第1004-2542位所示的葉綠體引導(dǎo)肽天冬氨酸激酶融合基因；SEQ ID N0.3的第1004-1996位所示的葉綠體引導(dǎo)肽腺苷硫酸還原酶融合基因。本發(fā)明還要求保護(hù)SEQ ID N0.2所示的葉綠體引導(dǎo)肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白和SEQ ID N0.4所示的葉綠體引導(dǎo)肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明培育的氨基酸含量改變的轉(zhuǎn)基因苜蓿的甲硫氨酸含量顯著高于受體苜?！崔D(zhuǎn)化保定苜蓿(野生型)，是野生型的1.5倍；轉(zhuǎn)pCAMBIAK-APR株系的半胱氨酸含量顯著高于野生型，是野生型的1.2倍，轉(zhuǎn)pCAMBIAK-APR株系的天冬氨酸含量顯著高于野生型，是野生型的1.4倍；RpCAMBIAK-APR株系的賴氨酸含量顯著高于野生型，是野生型的1.5倍。


圖1為共表達(dá)載體pCAMBIAK-APR的物理圖譜。圖2為共表達(dá)載體pCAMBIAK-APR酶切鑒定圖。圖中，I是 AscI 內(nèi)切酶，2 是 1-scel 內(nèi)切酶，M 為 Ikb DNA ladder (Fermentas),由下到上分別為 2500bp, 3000bp, 3500bp, 4000bp, 5000bp, 6000bp, 8000bp, IOOOObp 圖3為轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)圖，WT為野生型植株(陰性對(duì)照)，1-6為轉(zhuǎn)pCAMBIAK-APR苜蓿的PCR產(chǎn)物，7為未加樣品PCR產(chǎn)物(空白對(duì)照)，8為質(zhì)粒 pCAMBIAK-APR 的 PCR 產(chǎn)物(陽(yáng)性對(duì)照)，M 為 GeneRuler TMlkb DNA ladder (MBIFermentas, Maryland, USA)。圖4為轉(zhuǎn)基因植株的RT-PCR檢測(cè)圖，WT為野生型植株(陰性對(duì)照)，1_8為轉(zhuǎn)pCAMBIAK-APR苜蓿的RT-PCR產(chǎn)物，Actin是內(nèi)參基因。
具體實(shí)施例方式
以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中的生物材料如下:大腸桿菌K12(趙倩等.大腸桿菌天冬氨酸激酶IysC基因的克隆及定點(diǎn)突變.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào).1999，7 (4))，公眾可從商業(yè)途徑獲得，也可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，以重復(fù)本申請(qǐng)實(shí)驗(yàn)。pOSBlO8、pOSB2。8、pDES200、大腸桿菌 SW106 (Lei Ma, Jiangli Dong, YongshengJin，Mingliang Chen, Xiaoye Shenj Tao Wang.RMDAP:A Versatile, Ready-To-Use Toolboxfor Multigene Genetic Transformation.PLoS ONE|www.plosone.0rg.May2011.Volume6.1ssue5.el9883)，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，以重復(fù)本申請(qǐng)實(shí)驗(yàn)。銅綠假單抱桿菌(GeorgeTsakraklideslet al.Sulfate reduction isincreased in transgenic Arabidopsis thaliana expressing50-adenylyIsulfatereductase from Pseudomonas aeruginosa.The Plant Journal (2002) 32，879 - 889)，公眾可從商業(yè)途徑獲得，也可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，以重復(fù)本申請(qǐng)實(shí)驗(yàn)。根癌農(nóng)桿菌EHA105記載在下述文獻(xiàn)中:抗生素抑制農(nóng)桿菌的效果及對(duì)條斑紫菜生長(zhǎng)發(fā)育的影響，王萍等，水產(chǎn)科學(xué)，2009，28 (7)，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，以重復(fù)本申請(qǐng)實(shí)驗(yàn)。保定苜蓿(張萬(wàn)軍王濤.紫花苜蓿愈傷成苗高頻再生體系的建立及其影響因子的研究.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)2002，35 (12):1579-1583)，公眾可從商業(yè)途徑獲得，也可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，以重復(fù)本申請(qǐng)實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例1、利用天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因培育氨基酸含量改變的轉(zhuǎn)基因苜蓿一、構(gòu)建天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因表達(dá)載體pCAMBIAK-APR1、構(gòu)建含有天冬氨酸激酶編碼基因表達(dá)盒的中間載體p0SB108-AK用正向引物為5’ -CTCGAGTCTGAAATTGTTGTCTCCAA-3’和反向引物 5’ -TCTAGATTACTCAAACAAATTACTAT-3’，正向引物自5，端第I到6位是XhoI酶切位點(diǎn)，反向引物從5，端起第1-6位是XbaI酶切位點(diǎn)，從大腸桿菌K12中擴(kuò)增出天冬氨酸激酶編碼基因(AK基因)，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果為，該P(yáng)CR產(chǎn)物中的AK基因的編碼序列是SEQ ID N0.1的第1196-2542位，編碼SEQ ID N0.2的第65-512位所示的天冬氨酸激酶AK。將AK基因的PCR產(chǎn)物用XhoI和XbaI雙酶切后插入載體p0SB108的XhoI和XbaI位點(diǎn)，得到載體P0SB108-AK。p0SB108-AK中含有天冬氨酸激酶編碼基因表達(dá)盒，該天冬氨酸激酶編碼基因表達(dá)盒的核苷酸序列是SEQ ID N0.1。SEQ ID N0.1由3132個(gè)核苷酸組成，為天冬氨酸激酶編碼基因表達(dá)盒的核苷酸序列，第1-1003位為35S啟動(dòng)子序列，第1004-1189位為葉綠體引導(dǎo)肽基因序列，第1196-2542位為天冬氨酸激酶AK基因序列，第1004-2542位為葉綠體引導(dǎo)肽天冬氨酸激酶融合蛋白TP-AK的基因序列，第2543-3132位為ocs終止子序列。SEQ ID N0.1的第1004-2542位所示的葉綠體引導(dǎo)肽天冬氨酸激酶融合蛋白TP-AK的基因編碼SEQ ID N0.2所示的葉綠體引導(dǎo)肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白TP-AK。SEQ ID N0.2的第1-62位為葉綠體引導(dǎo)肽TP的氨基酸序列，SEQ ID N0.2的第65-512位為天冬氨酸激酶AK的氨基酸序列。2、構(gòu)建含有腺苷硫酸還原酶編碼基因表達(dá)盒的中間載體p0SB208-APR用正向引物為5’ -CCGCTCGAGCTGCCCTTTGCTACCATTCC-3’和反向引物 5’ -GCTCTAGATCAGGCCTTGCTGATCAGGT-3’，正向引物自5’端第4到9位是XhoI酶切位點(diǎn)，反向引物從5’端起第3到8位是XbaI酶切位點(diǎn)，從銅綠假單孢桿菌中擴(kuò)增出腺苷硫酸還原酶編碼基因(APR基因)，該P(yáng)CR產(chǎn)物中的APR基因的編碼序列是SEQ ID N0.3的第1196-1996位，編碼SEQ ID N0.4的第65-330位所示的腺苷硫酸還原酶APR。 將APR基因的PCR產(chǎn)物用XhoI和XbaI雙酶切后插入載體p0SB208的XhoI和XbaI位點(diǎn)，得到載體p0SB208-APR。p0SB208-APR中含有腺苷硫酸還原酶編碼基因表達(dá)盒，該腺苷硫酸還原酶編碼基因表達(dá)盒的核苷酸序列是SEQ ID N0.3。SEQ ID N0.3由2586個(gè)核苷酸組成，為腺苷硫酸還原酶編碼基因表達(dá)盒的核苷酸序列，第1-1003位為35S啟動(dòng)子序列，第1004-1189位為葉綠體弓I導(dǎo)肽基因序列，第1196-1996位為腺苷硫酸還原酶APR基因序列，第1004-1996位為葉綠體引導(dǎo)肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白TP-APR的基因序列，第1997-2586位為ocs終止子序列。SEQ ID N0.3的第1004-1996位所示的葉綠體引導(dǎo)肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白TP-APR的基因編碼SEQ ID N0.4所示的葉綠體引導(dǎo)肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白TP-APR。SEQ ID N0.4的第1_62位為葉綠體引導(dǎo)肽TP的氨基酸序列，SEQ IDN0.4的第65-330位為腺苷硫酸還原酶APR的氨基酸序列。3、pCAMBIAK_APR 的構(gòu)建通過(guò)電轉(zhuǎn)化將載體p0SB108-AK和目的載體pDES200共轉(zhuǎn)化到帶有Cre蛋白的大腸桿菌SW106中，通過(guò)Cre/loxP同源重組整合，經(jīng)過(guò)氨芐青霉素和卡那霉素的雙重篩選，得到抗性菌種，提質(zhì)粒，用1-scel內(nèi)切酶切掉T載體骨架，再用T4DNA連接酶進(jìn)行自連后得到重組載體PDES200-AK，然后pDES200-AK再和質(zhì)粒p0SB208_APR進(jìn)行第二輪的Cre/1xP同源重組，共轉(zhuǎn)化大腸桿菌SW106，經(jīng)過(guò)氨芐青霉素和卡那霉素的雙重篩選，用AscI內(nèi)切酶切掉T載體骨架，自連得到共表達(dá)載體pDESAK-APR。分別用EcoRI和Hind III雙酶切 pDESAK-APR 及 pCAMBIA2300 (pCAMBIA-2300，其全序列見(jiàn) GenBank:AF234315.1，updatedate是2010年11月16日))，回收雙酶切pDESAK-APR得到的小片段(含有SEQ ID N0.3所示的腺苷硫酸還原酶編碼基因表達(dá)盒和SEQ ID N0.1所示的天冬氨酸激酶編碼基因表達(dá)盒)和雙酶切PCAMBIA2300得到的大片段，然后再用T4DNA連接酶連接，獲得含有SEQ IDN0.3所示的腺苷硫酸還原酶編碼基因表達(dá)盒和SEQ ID N0.1所示的天冬氨酸激酶編碼基因表達(dá)盒的重組植物表達(dá)載體pCAMBIAK-APR (圖1)。pCAMBIAK-APR的AscI酶切鑒定結(jié)果和pCAMBIAK-APR的1-scel酶切鑒定結(jié)果如圖2所示。 二、pCAMBIAK-APR轉(zhuǎn)化苜蓿培育氨基酸含量改變的轉(zhuǎn)基因苜蓿1.農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備挑取根癌農(nóng)桿菌EHA105單菌落接種于5ml YEP (含75mg/L利福平)液體培養(yǎng)基，280C，250rpm,振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；將菌液按1:100轉(zhuǎn)移至200mlYEP (含75mg/L利福平)培養(yǎng)液中，28°C，250rpm，振蕩培養(yǎng)至0D600=0.4(約4_5h);轉(zhuǎn)入250ml的無(wú)菌離心瓶，4°C，4000rpm離心IOmin,棄上清；加入IOml預(yù)冷的0.15M的CaCl2溶液,輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置20min ;4°C，5000rpm離心5min，去上清，加入4ml預(yù)冷的含有10%甘油的0.15M的CaCl2溶液，輕輕懸??；每管100 μ L分裝于1.5mL無(wú)菌的EP管中，_80°C保存。2.表達(dá)載體pCAMBIAK-APR轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105:取I μ g的表達(dá)載體質(zhì)粒pCAMBIAK-APR的DNA加入到200 μ I ΕΗΑ105感受態(tài)細(xì)胞中，混勻；液氮中速凍lmin，37°C水浴5min，加入Iml YEP液體培養(yǎng)基，28°C 150rpm振蕩培養(yǎng)4h ; IOOOOrpm離心30sec，棄上清，加入0.1ml YEP液體培養(yǎng)基，重新懸浮細(xì)胞；涂布于含50 μ g/ml Kan(卡那霉素)和125 μ g/ml利福平的YEP固體平板上，28°C培養(yǎng)大約48h ;挑取平板上長(zhǎng)出的單菌落，接種于YEP液體培養(yǎng)液(含50 μ g/ml Kan和125 μ g/ml利福平)中，28°C 220rpm振蕩過(guò)夜培養(yǎng)。長(zhǎng)出的單菌落用PCR鑒定，鑒定用的引物是上述步驟一的AK和APR基因的擴(kuò)增引物，結(jié)果顯示載體pCAMBIAK-APR已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。3.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化苜蓿:I)植物受體材料的準(zhǔn)備:選取紫花苜蓿品種保定苜蓿的飽滿種子在75%的酒精中浸泡2min,然后在0.1%的氯化萊溶液中消毒IOmin,再用無(wú)菌水沖洗3 — 5次,接種在1/2MS培養(yǎng)基上發(fā)芽。5天后取長(zhǎng)出的子葉和下胚軸，子葉以橫向切成2 — 3_寬的小條，下胚軸切成2 — 4mm長(zhǎng)的小段,用于轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。2)農(nóng)桿菌菌液的制備:將含有植物表達(dá)載體pCAMBIAK-APR的農(nóng)桿菌EHA105接種于YEB培養(yǎng)液(加入卡那霉素)中，加入乙酰丁香酮(AS)至終濃度50-200 μ m。28°C振蕩培養(yǎng)至0D600為0.6-0.8，4000rpm離心5分鐘，去上清，沉淀用SH液體培養(yǎng)基將菌液稀釋5倍，加入乙酰丁香酮(AS)至終濃度50-200 μ m。3)切好的苜蓿子葉和下胚軸在稀釋的農(nóng)桿菌菌液中浸泡10 - 30分鐘。4)用無(wú)菌濾紙吸干植物材料表面的菌液，轉(zhuǎn)入上鋪一層濾紙的SH基本培養(yǎng)基(力口入AS至終濃度50-200 μ m)，置25°C暗培養(yǎng)。5)三天后，將材料轉(zhuǎn)到含有相應(yīng)抗生素的SH愈傷組織保持培養(yǎng)基(SH培養(yǎng)基+
0.025mg/L KT + 2mg/L2, 4_D + 20_25mg/L卡那霉素+ 500mg/L羧芐青霉素)中培養(yǎng)兩周。6)兩周后，將生長(zhǎng)良好的愈傷組織夾成小塊，轉(zhuǎn)到新的含有抗生素的SH愈傷保持培養(yǎng)基(SH 培養(yǎng)基 + 0.05mg/L KT + 2mg/L2, 4_D + 20_25mg/L 卡那霉素+ 500mg/L 羧芐
青霉素)中繼續(xù)培養(yǎng)兩周。7)兩周后，將生長(zhǎng)良好的愈傷組織夾成小塊，轉(zhuǎn)到新的含有抗生素的SH愈傷保持培養(yǎng)基(SH培養(yǎng)基+ 0.lmg/L KT + 2mg/L2, 4_D + 20mg/L卡那霉素+ 200mg/L羧芐青霉素)中繼續(xù)培養(yǎng)兩周。8)兩周后，將生長(zhǎng)良好的 愈傷組織夾成小塊，轉(zhuǎn)到新的含有抗生素的SH分化培養(yǎng)(SH培養(yǎng)基+ 0.4mg/L KT + 20mg/L卡那霉素+ 200mg/L羧芐青霉素)中繼續(xù)培養(yǎng)兩周，繼代一次。9)待抗性芽生長(zhǎng)至2 - 3cm高時(shí)，切下小芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(1/2MS基本培養(yǎng)基)中誘導(dǎo)生根；10)待根長(zhǎng)至足夠10 - 20cm長(zhǎng)(約3周)，且具有一定數(shù)量即可去掉封口膜。4、轉(zhuǎn)基因苜蓿的篩選和檢測(cè)經(jīng)過(guò)抗生素篩選的再生苗進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè):a、DNA水平檢測(cè)以Ttl代轉(zhuǎn)pCAMBIAK-APR各卡那霉素抗性株系的基因組DNA為模板，質(zhì)粒pCAMBIAK-APR為陽(yáng)性對(duì)照，未轉(zhuǎn)化的保定苜蓿(野生型，WT)為陰性對(duì)照，以正向引物5，-GACGCACAATCCCACTATCC-3’(對(duì)應(yīng)于 35S 啟動(dòng)子)和反向引物 5’ -TCTAGATTACTCAAACAAATTACTAT-3’，PCR擴(kuò)增 35S 啟動(dòng)子-AK 基因片段，以正向引物 5’-GACGCACAATCCCACTATCC-3’(對(duì)應(yīng)于 35S 啟動(dòng)子)和反向引物 5’ -GCTCTAGATCAGGCCTTGCTGATCAGGT-3’ PCR 擴(kuò)增 35S 啟動(dòng)子-APR基因片段。這兩個(gè)PCR的反應(yīng)體系均為:
權(quán)利要求
1.培育氨基酸含量改變的轉(zhuǎn)基因苜蓿的方法，包括向受體苜蓿中導(dǎo)入天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因，得到氨基酸含量改變的轉(zhuǎn)基因苜蓿； 所述轉(zhuǎn)基因苜蓿具有下述I)-4)中的全部特性或至少一種特性: 1)所述轉(zhuǎn)基因苜蓿與所述受體苜蓿相比，甲硫氨酸含量提高； 2)所述轉(zhuǎn)基因苜蓿與所述受體苜蓿相比，半胱氨酸含量提高； 3)所述轉(zhuǎn)基因苜蓿與所述受體苜蓿相比，天冬氨酸含量提高； 4)所述轉(zhuǎn)基因苜蓿與所述受體苜蓿相比，賴氨酸含量提高； 所述天冬氨酸激酶是如下a)或b)的蛋白質(zhì): a)氨基酸序列如SEQ ID N0.2第65-512位所示的蛋白質(zhì)； b)將SEQ ID N0.2第65-512位經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基得到的具有天冬氨酸激酶活性的由a)衍生的蛋白質(zhì)； 所述腺苷硫酸還原酶是如下c)或d)的蛋白質(zhì): c)氨基酸序列如SEQ ID N0.4第65-330位所示的蛋白質(zhì)； d)將SEQ ID N0.4第65-330位經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基得到的具有腺苷硫酸還原酶活性的由c)衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述天冬氨酸激酶編碼基因?yàn)槿缦翴)或2)或3)或4)所示的基因,和/或所述腺苷硫酸還原酶為如下5)或6)或7)或8)所示的基因: 1)編碼所述天冬氨酸激酶的DNA分子； 2)其編碼序列是SEQID N0.1的第1196-2542位核苷酸的DNA分子； 3)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA分子雜交且編碼所述天冬氨酸激酶的DNA分子； 4)與I)限定的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼所述天冬氨酸激酶的DNA分子; 5)編碼所述腺苷硫酸還原酶的DNA分子； 6)其編碼序列是SEQID N0.3的第1196-1996位核苷酸的DNA分子； 7)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA分子雜交且編碼所述腺苷硫酸還原酶的DNA分子； 8)與I)限定的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼所述腺苷硫酸還原酶的DNA分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因通過(guò)天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因表達(dá)載體導(dǎo)入所述受體苜蓿；所述天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因表達(dá)載體含有天冬氨酸激酶編碼基因表達(dá)盒和腺苷硫酸還原酶編碼基因表達(dá)盒；所述天冬氨酸激酶編碼基因表達(dá)盒包括啟動(dòng)子I和由所述啟動(dòng)子I啟動(dòng)的葉綠體引導(dǎo)肽天冬氨酸激酶融合蛋白基因和終止所述葉綠體引導(dǎo)肽天冬氨酸激酶融合蛋白基因轉(zhuǎn)錄的終止子I;所述葉綠體引導(dǎo)肽天冬氨酸激酶融合蛋白基因是所述天冬氨酸激酶編碼基因與所述葉綠體引導(dǎo)肽基因相連接形成的融合基因，所述葉綠體引導(dǎo)肽基因位于所述天冬氨酸激酶編碼基因的上游； 所述腺苷硫酸還原酶編碼基因表達(dá)盒包括啟動(dòng)子2和由所述啟動(dòng)子2啟動(dòng)的葉綠體引導(dǎo)肽腺苷硫酸還原酶融合基因和終止所述葉綠體引導(dǎo)肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白基因轉(zhuǎn)錄的終止子2 ;所述葉綠體引導(dǎo)肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白基因是所述腺苷硫酸還原酶編碼基因與所述葉綠體引導(dǎo)肽基因相連接形成的融合基因，所述葉綠體引導(dǎo)肽基因位于所述腺苷硫酸還原酶編碼基因的上游。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述葉綠體引導(dǎo)肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，所述葉綠體引導(dǎo)肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于:所述葉綠體引導(dǎo)肽天冬氨酸激酶融合基因序列如SEQ ID N0.1的第1004-2542位所示；所述葉綠體引導(dǎo)肽腺苷硫酸還原酶融合基因序列如SEQ ID N0.3的第1004-1996位所示；所述啟動(dòng)子I和啟動(dòng)子2均是35s，所述終止子I和所述終止子2均是ocs。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于:所述天冬氨酸激酶編碼基因表達(dá)盒的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；腺苷硫酸還原酶編碼基因表達(dá)盒的核苷酸序列如SEQ ID N0.3 所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于:所述天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因表達(dá)載體是在PDES200的1xp位點(diǎn)插入所述天冬氨酸激酶編碼基因表達(dá)盒和腺苷硫酸還原酶編碼基因表達(dá)盒得到的重組表達(dá)載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于:所述受體苜蓿為紫花苜蓿。
9.SEQ ID N0.2所示的葉綠體引導(dǎo)肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白和SEQ ID N0.4所示的葉綠體引導(dǎo)肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白。
10.A-E中的任一種生物材料: A、在pCAMBIA2300的多克隆位點(diǎn)插入SEQID N0.1所示的天冬氨酸激酶編碼基因表達(dá)盒和SEQ ID N0.3所示的腺苷硫酸還原酶編碼基因表達(dá)盒得到的重組表達(dá)載體； B、含有SEQID N0.1所示的天冬氨酸激酶編碼基因表達(dá)盒和SEQ ID N0.3所示的腺苷硫酸還原酶編碼基因表達(dá)盒的表達(dá)載體； C、SEQID N0.1所示的天冬氨酸激酶編碼基因表達(dá)盒和SEQ ID N0.3所示的腺苷硫酸還原酶編碼基因表達(dá)盒； D、SEQID N0.2所示的融合蛋白的編碼基因和SEQ ID N0.4所示的融合蛋白的編碼基因； E、SEQID N0.1的第1004-2542位所示的葉綠體引導(dǎo)肽天冬氨酸激酶融合基因；SEQ IDN0.3的第1004-1996位所示的葉綠體引導(dǎo)肽腺苷硫酸還原酶融合基因。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了培育高含硫氨基酸的轉(zhuǎn)基因苜蓿的方法及其專用材料。本發(fā)明的培育氨基酸含量改變的轉(zhuǎn)基因苜蓿的方法，包括向受體苜蓿中導(dǎo)入天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因，得到氨基酸含量改變的轉(zhuǎn)基因苜蓿；所述天冬氨酸激酶是氨基酸序列如SEQ ID No.2第65-512位所示的蛋白質(zhì)；所述腺苷硫酸還原酶是氨基酸序列如SEQ ID No.4第65-330位所示的蛋白質(zhì)。本發(fā)明培育的氨基酸含量改變的轉(zhuǎn)基因苜蓿的甲硫氨酸含量顯著高于受體苜?！崔D(zhuǎn)化保定苜蓿(野生型)，是野生型的1.5倍；轉(zhuǎn)pCAMBIAK-APR株系的半胱氨酸含量顯著高于野生型，是野生型的1.2倍，轉(zhuǎn)pCAMBIAK-APR株系的天冬氨酸含量顯著高于野生型，是野生型的1.4倍；轉(zhuǎn)pCAMBIAK-APR株系的賴氨酸含量顯著高于野生型，是野生型的1.5倍。
文檔編號(hào)C12N15/62GK103215305SQ20131008627
公開(kāi)日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月18日
發(fā)明者王濤, 仝宗永, 董江麗 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)