本發(fā)明涉及細(xì)胞學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種使用同一脂肪細(xì)胞聯(lián)合分析細(xì)胞增殖和沉脂能力的方法。

背景技術(shù)：

動物脂肪主要分布在內(nèi)臟周圍、皮下和肌肉等組織部位。對于人類而言，過多的脂肪沉積會引起一系列的疾病。對于畜禽而言，腹部脂肪蓄積過多會降低飼料的利用效率，也會額外增加加工費(fèi)用，并造成一定的環(huán)境污染；而在一定范圍內(nèi)的肌內(nèi)脂肪含量則會提高肉的品質(zhì)。因此，脂肪代謝是相關(guān)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。體外的細(xì)胞培養(yǎng)和研究，是生物科學(xué)領(lǐng)域的重要內(nèi)容之一。尤其是在一些不容易獲得組織材料或不方便直接開展活體實(shí)驗(yàn)的物種，體外細(xì)胞水平的研究更是在推進(jìn)科學(xué)進(jìn)展等方面起了不可或缺的重要作用。

一直以來，在前體脂肪細(xì)胞增殖和分化，以及脂肪細(xì)胞沉積脂肪等研究方向，為了測定細(xì)胞的脂肪沉積量，需要保證檢測的細(xì)胞數(shù)量相同。以往的做法是直接在細(xì)胞鋪板時(shí)調(diào)整細(xì)胞密度一致，由于技術(shù)的限制和培養(yǎng)過程中的其他因素影響，極易造成細(xì)胞數(shù)量不同。為了確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，研究者往往在現(xiàn)實(shí)操作中使用同批次的2板細(xì)胞分別測定細(xì)胞數(shù)目和脂肪含量兩個(gè)指標(biāo)，用以標(biāo)定和比較單位細(xì)胞數(shù)目的細(xì)胞中的脂肪含量。但是，基于上述研究技術(shù)的局限，檢測2板細(xì)胞的數(shù)目也無法保證完全相同。這樣，造成了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的不準(zhǔn)確或?qū)嶒?yàn)誤差大的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種使用同一脂肪細(xì)胞聯(lián)合分析細(xì)胞增殖和沉脂能力的方法，該發(fā)明方法解決了脂肪細(xì)胞體外研究中一直使用相同批次細(xì)胞分別檢測脂肪細(xì)胞增殖和沉脂能力導(dǎo)致的數(shù)據(jù)不夠精準(zhǔn)的問題?？蓱?yīng)用于體外研究不同物種、不同組織部位來源的前體脂肪細(xì)胞分化、脂肪細(xì)胞沉脂能力及相關(guān)的分子調(diào)控機(jī)理，以及相關(guān)營養(yǎng)素或藥物的篩選研發(fā)中應(yīng)用。

為了解決上述問題，本發(fā)明提出以下技術(shù)方案：一種使用同一脂肪細(xì)胞聯(lián)合分析細(xì)胞增殖和沉脂能力的方法，其特征在于，它采用同一脂肪細(xì)胞，先MTT法檢測細(xì)胞增殖，然后用油紅O染色檢測細(xì)胞沉脂能力。

該方法的具體步驟如下：

(1)棄去6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中前脂肪細(xì)胞或脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)基，PBS漂洗3遍，加入體積比10％的MTT工作液2mL，于二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育0.5-2h至細(xì)胞染色完全，完全棄去MTT工作液；

(2)加入0.5-1mL的DMSO于搖床輕微振蕩混勻10min，顯微鏡下觀察至細(xì)胞染色褪去，然后取96孔酶標(biāo)板，每孔加入150μL混勻后的液體，酶標(biāo)儀490nm波長讀取OD值；

(3)完全棄去6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中DMSO萃取的液體，PBS清洗細(xì)胞2-3次；1mL4％多聚甲醛固定細(xì)胞0.5h；PBS清洗細(xì)胞2-3次；加入0.5％油紅O染液0.5-1mL，室溫染色0.5-2h；

(4)棄去油紅O染液，PBS清洗細(xì)胞3次，倒置顯微鏡拍照；加入1mL異丙醇，搖床輕微振蕩混勻10min；取96孔酶標(biāo)板，每孔加入150μL混勻后的液體，酶標(biāo)儀510nm波長讀取OD值。

優(yōu)選的，步驟(1)中將MTT染色的細(xì)胞于二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育時(shí)間為1h。

優(yōu)選的，步驟(2)中加入的DMSO為1mL。

進(jìn)一步的，步驟(2)中加入DMSO完全萃取MTT染料，至細(xì)胞變?yōu)闊o色。

優(yōu)選的，步驟(3)中加入的0.5％油紅O染液為0.5mL。

優(yōu)選的，步驟(3)中加入0.5％油紅O染液后室溫染色時(shí)間為1h。

進(jìn)一步的，步驟(1)中檢測的前脂肪細(xì)胞或脂肪細(xì)胞，可以是不同物種、不同組織來源、不同生長時(shí)期的前體脂肪細(xì)胞或脂肪細(xì)胞。

本發(fā)明還提出了將上述方法在針對體外研究不同物種、不同組織部位來源的前體脂肪細(xì)胞分化、脂肪細(xì)胞沉脂能力及相關(guān)的分子調(diào)控機(jī)理，以及相關(guān)營養(yǎng)素或藥物的篩選研發(fā)中應(yīng)用。

為了驗(yàn)證本方法的有效性和在脫離本方法實(shí)驗(yàn)步驟下其他實(shí)驗(yàn)步驟的不可行性，申請人做了如下實(shí)驗(yàn)對比，并得出結(jié)論：

利用MTT染色、油紅O染色方法和顯微鏡觀察，分析本方法的有效性，以及先做MTT染色，再做油紅O染色獲得的細(xì)胞脂肪含量數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。以僅做油紅O染色的同批次雞腹脂來源的分化誘導(dǎo)后的脂肪細(xì)胞為對照。細(xì)胞經(jīng)過分化誘導(dǎo)處理96h，MTT染色后顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞及其中的脂滴狀態(tài)未發(fā)生明顯變化；油紅O染色檢測結(jié)果表明聯(lián)合分析測得的細(xì)胞的沉脂含量數(shù)據(jù)與對照組數(shù)據(jù)無顯著差異。因此，可以認(rèn)定本方法的有效性和可行性，即細(xì)胞先經(jīng)過MTT染色后，不影響再使用油紅O染色技術(shù)檢測細(xì)胞脂肪含量的數(shù)據(jù)。

利用油紅O染色、MTT染色方法和顯微鏡觀察，通過先做甲醛固定并油紅O染色測定細(xì)胞脂肪含量，再做MTT染色測定細(xì)胞數(shù)目量，分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性以及本發(fā)明中方法的有效性。以僅做MTT染色的同批次雞腹脂來源的分化誘導(dǎo)后的脂肪細(xì)胞為對照。細(xì)胞經(jīng)過分化誘導(dǎo)處理96h，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞經(jīng)過甲醛固定并油紅O染色后，MTT染色1h。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過1h染色后，未經(jīng)過油紅O染色的對照組細(xì)胞著色完全，而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞則完全不能著色。因此，可以認(rèn)定本方法的檢測順序調(diào)換后的不可行性。

為了深入驗(yàn)證本發(fā)明中檢測順序挑換后的是否可行。利用油紅O染色、MTT染色方法和顯微鏡觀察，通過不做甲醛固定，先直接油紅O染色測定細(xì)胞脂肪含量，再做MTT染色測定細(xì)胞數(shù)目量，分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性以及本發(fā)明中方法的有效性。以僅做MTT染色的同批次雞腹脂來源的分化誘導(dǎo)后的脂肪細(xì)胞為對照。細(xì)胞經(jīng)過分化誘導(dǎo)處理96h。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)未經(jīng)過甲醛固定的細(xì)胞，在油紅O染色和異丙醇萃取后，PBS漂洗或后繼的MTT染色過程細(xì)胞貼壁不牢，部分細(xì)胞飄起，無法繼續(xù)MTT檢測。因此，可以認(rèn)定本方法的檢測順序調(diào)換后的不可行性。

有益效果：

本發(fā)明使用常規(guī)的技術(shù)和試劑，整合現(xiàn)有技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了這一技術(shù)難題的突破，可以對同一份細(xì)胞直接測定其數(shù)量和脂肪含量，獲得完全精準(zhǔn)和真實(shí)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。較之以前的研究，本方法的技術(shù)方法對原有檢測技術(shù)進(jìn)行整合，沒有額外的操作，具備結(jié)果精準(zhǔn)、節(jié)省人力和實(shí)驗(yàn)費(fèi)用等優(yōu)點(diǎn)。

本方法構(gòu)建的聯(lián)合檢測體系中，可應(yīng)用于體外研究不同物種、不同組織部位來源的前體脂肪細(xì)胞分化、脂肪細(xì)胞沉脂能力及相關(guān)的分子調(diào)控機(jī)理，以及相關(guān)營養(yǎng)素或藥物的篩選研發(fā)等。

附圖說明

圖1A為實(shí)施例1中，倒置顯微鏡下(200×)，比較雞腹脂脂肪細(xì)胞MTT染色前后，細(xì)胞和脂滴的形態(tài)無明顯變化。

圖1B為實(shí)施例1中，與僅做油紅O染色處理的對照組細(xì)胞相比，經(jīng)過MTT和油紅O染色聯(lián)合處理的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中的脂肪含量無顯著差異(P>0.05)，Means±SD，n＝3。

圖2為實(shí)施例2中，MTT染色1h后，倒置顯微鏡下(200×)發(fā)現(xiàn)未經(jīng)過油紅O染色的對照組細(xì)胞著色，而經(jīng)過甲醛固定并油紅O染色的細(xì)胞完全不能著色，導(dǎo)致MTT染色失敗。

圖3為實(shí)施例3中，倒置顯微鏡下(200×)，未經(jīng)過甲醛固定而直接油紅O染色的雞腹脂脂肪細(xì)胞，在油紅O染色和異丙醇萃取后，PBS漂洗或后繼的MTT染色過程中出現(xiàn)不貼壁浮起的現(xiàn)象，并不斷加劇，導(dǎo)致MTT染色無法進(jìn)行。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料和試劑，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑，購自試劑公司。以下所述雙抗指青霉素和鏈霉素。

本發(fā)明所述方法采用同一脂肪細(xì)胞，先MTT法檢測細(xì)胞增殖，然后用油紅O染色檢測細(xì)胞沉脂能力。它包括培養(yǎng)的前脂肪細(xì)胞或脂肪細(xì)胞使用MTT工作液染色0.5-2h，棄去MTT工作液后DMSO萃取；酶標(biāo)儀490nm波長讀取OD值；完全棄去DMSO萃取的液體，PBS清洗后加入4％多聚甲醛固定細(xì)胞0.5-1h，PBS清洗后加入0.5％油紅O染液染色0.5-1h；棄去油紅O染液，PBS清洗后加入異丙醇萃取，酶標(biāo)儀510nm波長讀取OD值。最終使用同一脂肪細(xì)胞完成細(xì)胞增殖和沉脂能力的聯(lián)合分析。

具體地，本發(fā)明上述方法包括以下步驟：

(1)棄去6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中前脂肪細(xì)胞或脂肪細(xì)胞(不同生長時(shí)期)的培養(yǎng)基，PBS漂洗3遍，加入體積比10％MTT工作液2mL，于二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育0.5-2h至細(xì)胞染色完全，完全棄去MTT工作液。其中，步驟(1)中加入MTT工作液的體積為2mL,可以更快的將細(xì)胞染色完全。本步驟中加入MTT工作液染色細(xì)胞，并二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育的時(shí)間為0.5-2h，進(jìn)一步優(yōu)選為1h。這樣既保證了細(xì)胞被完全染色，又避免了染色時(shí)間過久導(dǎo)致細(xì)胞貼壁不牢。本發(fā)明所述MTT工作液(體積比10％)為本領(lǐng)域通用術(shù)語，一般是指10mL的細(xì)胞培養(yǎng)基中含有1mLMTT溶液(5mg/mL，即5mgMTT溶解于1mLPBS中配制而成)。MTT可購自試劑公司。

(2)加入0.5-1mL的DMSO于搖床輕微振蕩混勻10min，顯微鏡下觀察至細(xì)胞染色褪去(變?yōu)闊o色)。取96孔酶標(biāo)板，每孔加入150μL混勻后的液體，酶標(biāo)儀490nm波長讀取OD值。本步驟中加入DMSO0.5-1mL萃取，進(jìn)一步優(yōu)選為1mL。既可以縮短萃取時(shí)間，又保證細(xì)胞吸附的MTT染料更快更充分地被萃取，提高后繼地油紅O染色的成功率。本步驟中加入DMSO后于搖床輕微振蕩混勻10min，以完全萃取MTT染料，此步實(shí)驗(yàn)可輔助倒置顯微鏡觀察，MTT完全被DMSO萃取后鏡下細(xì)胞變?yōu)闊o色。本發(fā)明所述DMSO為常規(guī)試劑，可購自試劑公司。

(3)完全棄去6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中DMSO萃取的液體，PBS清洗細(xì)胞2-3次。1mL4％多聚甲醛固定細(xì)胞0.5h。PBS清洗細(xì)胞2-3次。加入0.5％油紅O染液0.5-1mL，室溫染色0.5-2h。步驟(3)中加入0.5％油紅O工作液體積為0.5-1mL，進(jìn)一步優(yōu)選為0.5mL，0.5mL的0.5％油紅O可以保證細(xì)胞充分染色的同時(shí)，最大程度的減少培養(yǎng)板孔壁上染料附著造成的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)誤差。步驟(3)中加入0.5％油紅O工作液于室溫下染色時(shí)間為0.5-2h，進(jìn)一步優(yōu)選為1h，1h染色可以保證細(xì)胞充分染色的同時(shí)，又可減少染色時(shí)間，避免因?yàn)槿旧珪r(shí)間過久導(dǎo)致的細(xì)胞貼壁不牢固。本發(fā)明所述0.5％油紅O工作液(質(zhì)量體積比)為本領(lǐng)域通用術(shù)語，一般是指0.5g油紅O溶解于體積為60mL異丙醇中，完全溶解并過濾后再加入40mL超純水。油紅O可購自試劑公司。

(4)棄去油紅O染液，PBS清洗細(xì)胞3次，倒置顯微鏡拍照；加入1mL異丙醇，搖床輕微振蕩混勻10min。取96孔酶標(biāo)板，每孔加入150μL混勻后的液體，酶標(biāo)儀510nm波長讀取OD值。

本發(fā)明中的前體脂肪細(xì)胞或脂肪細(xì)胞，范圍廣泛，既包括不同物種、不同組織部位來源的體外培養(yǎng)前體脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，也包括培養(yǎng)至不同生長時(shí)期或生理狀態(tài)的原代前體脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì)胞或細(xì)胞系。

本發(fā)明中的細(xì)胞培養(yǎng)基，指的是符合具體實(shí)驗(yàn)要求的任何一種細(xì)胞培養(yǎng)基?？少徸栽噭┕尽?/p>

本發(fā)明還提供了上述方法在針對雞腹脂前體脂肪細(xì)胞增殖和分化能力研究等方面的應(yīng)用。

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的方法做詳細(xì)描述：

實(shí)施例1：對比分析MTT染色對脂肪細(xì)胞的脂肪含量測定的影響。

利用MTT染色、油紅O染色方法和顯微鏡觀察，雞腹脂來源的分化誘導(dǎo)后的脂肪細(xì)胞，分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每個(gè)組3個(gè)細(xì)胞孔作為重復(fù)。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞先進(jìn)性MTT染色，再進(jìn)行油紅O染色；對照組細(xì)胞僅做油紅O染色處理。按照以下操作進(jìn)行檢測。

首先對實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞進(jìn)行MTT染色處理。選擇經(jīng)過分化誘導(dǎo)處理96h的脂肪細(xì)胞，棄去6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中細(xì)胞培養(yǎng)基。用37℃預(yù)熱的PBS漂洗3遍，加入MTT工作液2mL,放置于二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育1h，顯微鏡下觀察細(xì)胞中脂肪細(xì)胞被完全染色后，使用移液槍小心吸棄MTT工作液，傾斜靜止3min，再次完全吸棄殘余液體。每孔加入DMSO1mL，搖床輕微振蕩混勻10min。顯微鏡下觀察至細(xì)胞變?yōu)闊o色時(shí)，混勻DMSO萃取液，并轉(zhuǎn)移150μL至96孔酶標(biāo)板，每孔3個(gè)重復(fù)，于酶標(biāo)儀上490nm波長檢測讀取OD值。

同時(shí)，吸棄6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中DMSO萃取液，PBS輕柔清洗細(xì)胞3次。從此步驟開始，實(shí)驗(yàn)組和對照組(未經(jīng)過MTT染色處理)細(xì)胞同步操作。再加入1mL4％多聚甲醛固定細(xì)胞0.5h，隨后用PBS輕柔清洗細(xì)胞3次。最后加入0.5％油紅O染液0.5mL，室溫染色1h至顯微鏡下觀察細(xì)胞中脂肪被完全染色。移液槍吸棄油紅O染液，PBS輕柔清洗細(xì)胞3次，每次靜置3min，倒置顯微鏡拍照；最后加入1mL異丙醇，于搖床輕微振蕩混勻10min?；靹虍惐驾腿∫?，并轉(zhuǎn)移150μL至96孔酶標(biāo)板，每孔3個(gè)重復(fù)，于酶標(biāo)儀上510nm波長檢測讀取OD值。

倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，MTT染色后細(xì)胞形態(tài)及其中脂滴狀態(tài)發(fā)生變化：較之MTT染色前，細(xì)胞MTT染色并DMSO萃取后細(xì)胞形態(tài)沒有明顯變化(圖1A)；油紅O染色檢測結(jié)果顯示聯(lián)合分析測得的細(xì)胞的沉脂含量數(shù)據(jù)與對照組數(shù)據(jù)無顯著差異(P>0.05)(圖1B)。結(jié)果表明，MTT染色對細(xì)胞無顯著影響，也不會影響后繼的脂肪細(xì)胞中脂肪含量測定。說明了本方法的有效性和可行性。

實(shí)施例2：甲醛固定并油紅O染色對脂肪細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目測定影響的分析。

利用MTT染色、油紅O染色方法和顯微鏡觀察，使用實(shí)施例1中相同的細(xì)胞分組和處理，每組3孔細(xì)胞重復(fù)。按照以下操作進(jìn)行檢測。

首先對驗(yàn)組細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色處理。棄去6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中實(shí)培養(yǎng)基，每孔加入1mL4％多聚甲醛固定細(xì)胞0.5h，用37℃預(yù)熱的PBS輕柔清洗細(xì)胞3次。再加入0.5％油紅O染液0.5mL，室溫染色1h至顯微鏡下觀察細(xì)胞中脂肪被完全染色。移液槍吸棄油紅O染液，PBS輕柔清洗細(xì)胞3次，每次靜置3min，倒置顯微鏡拍照；最后加入1mL異丙醇，于搖床輕微振蕩混勻10min?；靹虍惐驾腿∫?，并轉(zhuǎn)移150μL至96孔酶標(biāo)板，每孔3個(gè)重復(fù)，于酶標(biāo)儀上510nm波長檢測讀取OD值。吸棄6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中剩余油紅O萃取液，PBS漂洗3遍。

其次，對實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞進(jìn)行MTT染色處理。加入MTT工作液2mL,放置于二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育1h，顯微鏡下觀察拍照。使用移液槍小心吸棄MTT工作液，傾斜靜止3min，再次完全吸棄殘余液體。每孔加入DMSO1mL，搖床輕微振蕩混勻10min。顯微鏡下觀察至細(xì)胞變?yōu)闊o色時(shí)，混勻DMSO萃取液，并轉(zhuǎn)移150μL至96孔酶標(biāo)板，每孔3個(gè)重復(fù)，于酶標(biāo)儀上490nm波長檢測讀取OD值。

倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞經(jīng)過甲醛固定并油紅O染色1h后，未經(jīng)過油紅O染色的對照組細(xì)胞著色，而經(jīng)過甲醛固定并油紅O染色的細(xì)胞完全不能著色(圖2)，導(dǎo)致無法繼續(xù)后面的操作，MTT染色失敗。分析失敗原因，可能是用于油紅O染色前的甲醛固定處理影響了MTT染料著色。結(jié)果表明，油紅O染色時(shí)甲醛固定處理會干擾MTT染料在細(xì)胞的著色，導(dǎo)致MTT染色無法進(jìn)行。說明了調(diào)換本方法中的檢測順序是不可行的。

實(shí)施例3：未甲醛固定直接油紅O染色對脂肪細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目測定影響的分析。

利用MTT染色、油紅O染色方法和顯微鏡觀察，使用實(shí)施例2中相同的細(xì)胞分組處理，每組3孔細(xì)胞重復(fù)。按照以下操作進(jìn)行檢測。

首先對實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞直接進(jìn)行油紅O染色。棄去6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中細(xì)胞培養(yǎng)基，用37℃預(yù)熱的PBS輕柔清洗細(xì)胞3次；加入0.5％油紅O染液0.5mL，室溫染色1h至顯微鏡下觀察細(xì)胞中脂肪被完全染色。移液槍吸棄油紅O染液，PBS輕柔清洗細(xì)胞3次，每次靜置3min，倒置顯微鏡拍照；最后加入1mL異丙醇，于搖床輕微振蕩混勻10min?；靹虍惐驾腿∫?，并轉(zhuǎn)移150μL至96孔酶標(biāo)板，每孔3個(gè)重復(fù)，于酶標(biāo)儀上510nm波長檢測讀取OD值。吸棄6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中剩余油紅O萃取液，PBS漂洗3遍。

其次對實(shí)驗(yàn)組和對照祖細(xì)胞進(jìn)行MTT染色處理。加入MTT工作液2mL,放置于二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育1h，顯微鏡下觀察細(xì)胞中脂肪細(xì)胞被完全染色后，使用移液槍小心吸棄MTT工作液，傾斜靜止3min，再次完全吸棄殘余液體。每孔加入DMSO1mL，搖床輕微振蕩混勻10min。顯微鏡下觀察至細(xì)胞變?yōu)闊o色時(shí)，混勻DMSO萃取液，并轉(zhuǎn)移150μL至96孔酶標(biāo)板，每孔3個(gè)重復(fù)，于酶標(biāo)儀上490nm波長檢測讀取OD值。

倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞經(jīng)過油紅O染色和異丙醇萃取后，在PBS漂洗或MTT染色過程中細(xì)胞開始出現(xiàn)不貼壁浮起現(xiàn)象，并且越來越多的細(xì)胞浮起，導(dǎo)致無法進(jìn)行MTT染色(圖2)。結(jié)果表明，如果細(xì)胞不進(jìn)行甲醛固定，油紅O染色和異丙醇萃取會嚴(yán)重降低脂肪細(xì)胞的活性和貼壁能力，并導(dǎo)致隨后的MTT染色無法進(jìn)行。說明了調(diào)換本方法中的檢測順序是不可行的。