本發(fā)明涉及一種利用小鼠腎細胞系統(tǒng)評價眼刺激性的方法，適用于化妝品原料刺激性的評價，尤其適用于表面活性劑的眼刺激性評價。
背景技術(shù)：
：表面活性劑是一種重要的精細化工產(chǎn)品，在國內(nèi)外被廣泛應(yīng)用，它被譽為“工業(yè)味精”，能使溶液表面張力顯著下降。表面活性劑廣泛應(yīng)用于化妝品調(diào)制、食品加工、農(nóng)藥和醫(yī)藥加工、紡織印染及洗滌劑生產(chǎn)等許多工業(yè)領(lǐng)域。表面活性劑用于生產(chǎn)化妝品或洗滌劑時，與消費者眼睛接觸的幾率大大增加，往往對消費者的眼睛存在一定刺激性甚至腐蝕性。家兔眼刺激試驗(Draizetest)是檢測化學(xué)物眼刺激性的經(jīng)典方法，近年來，隨著實驗動物使用3R原則的倡導(dǎo)與實施以及生物醫(yī)學(xué)研究模式的轉(zhuǎn)變，替代動物實驗的體外模型研究已經(jīng)成為毒理學(xué)評價的趨勢。根據(jù)體內(nèi)眼損傷發(fā)生的機理，目前尚在開發(fā)的眼刺激替代方法可分為細胞系統(tǒng)、雞胚、人工角膜和離體器官四類，與其它三類相比，細胞系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)化程度最高、成本最低而且快速。細胞系統(tǒng)替代內(nèi)動物實驗的原理是基于大多數(shù)具有眼刺激作用的物質(zhì)也具有細胞毒性，因此可根據(jù)化學(xué)物質(zhì)對細胞膜損傷和對細胞質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)大分子破壞的相關(guān)性建立體外方法。用于體外測試的細胞包括成纖維細胞、血細胞、犬腎細胞等，目前基于標(biāo)準(zhǔn)化實驗動物小鼠腎細胞系統(tǒng)建立的體外方法還未見相關(guān)專利和文獻報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種利用小鼠腎細胞系統(tǒng)評價眼刺激性的方法，該方法準(zhǔn)確性高、快速、簡便、成本低、對檢測儀器無特殊要求。本發(fā)明所提供的利用小鼠腎細胞系統(tǒng)評價眼刺激性的方法，是通過檢測暴露于受試物后熒光素鈉漏出單/多層小鼠腎細胞的熒光素量來評價受試物的刺激性。其中，用于定量評價受試物對小鼠腎細胞損傷的指標(biāo)為熒光素漏出量，其可用熒光分光光度計(激發(fā)光波長485nm，發(fā)射光波長530nm)定量測定。本發(fā)明的目的通過下述方案實現(xiàn)：一種利用小鼠腎細胞系統(tǒng)評價眼刺激性的方法，包括以下步驟：一、小鼠腎細胞的制備取小鼠腎臟上皮，剪碎，研磨后用培養(yǎng)液沖洗，收集液體，經(jīng)150目不銹鋼網(wǎng)篩沖洗并收集網(wǎng)上腎細胞，加1g/L膠原酶I消化培養(yǎng)，37℃消化，每隔5min振蕩1次，15min后加等體積含有10％牛胎血清的培養(yǎng)液終止消化，吹打分散細胞后靜置5min，1000r/min離心5min，去除上清液，加入含10％牛胎血清的培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)(37℃、5％CO2)至細胞長滿培養(yǎng)皿的85％以上，消化、凍存?zhèn)溆?；二、小鼠腎細胞生長培養(yǎng)膜的制備取步驟一中凍存?zhèn)溆玫膶?shù)生長期的小鼠腎細胞，調(diào)節(jié)細胞濃度為4×105～10×105個/mL，取0.5mL加入到插入式培養(yǎng)皿中的微孔濾膜表面上培養(yǎng)72～96h(37℃、5％CO2)，待細胞完全融合(細胞鋪滿整個微孔濾膜表面)后，得到小鼠腎細胞生長培養(yǎng)膜；三、熒光素滲漏試驗3.1檢測范圍確定實驗將0.4mL，0.01g/100mL、0.1g/100mL、1g/100mL、10g/100mL、20g/100mL、50g/100mL受試物溶液(受試物用PBS緩沖液稀釋，w/v)到步驟二中的插入式培養(yǎng)皿中的小鼠腎細胞生長培養(yǎng)膜上，每個受試物濃度設(shè)置3孔平行對照，作用5～20min后，用Hank’s液輕輕沖洗細胞生長培養(yǎng)膜至其表面沒有受試物；然后再將清洗之后的帶有小鼠腎細胞生長培養(yǎng)膜的插入式培養(yǎng)皿放入另一含新鮮的10％牛胎血清的培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，加入5～20μg/mL的等體積的熒光素鈉溶液到插入式培養(yǎng)皿中的小鼠腎細胞生長培養(yǎng)膜上，37℃繼續(xù)培養(yǎng)10～30min，然后用Hank’s液輕輕清洗細胞生長膜至其表面沒有受試物，用熒光分光光度計檢測含10％牛胎血清的培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中每孔培養(yǎng)基中的熒光素量(激發(fā)光波長485nm、發(fā)射光波長530nm)；3.2熒光素滲漏試驗從范圍確定實驗的結(jié)果得到使熒光素滲漏的效應(yīng)發(fā)生的大概濃度范圍，根據(jù)上述范圍進行合理的間隔，按照幾何對數(shù)或者最少設(shè)置六個濃度梯度，從而得到精確的評估熒光素漏出量的受試物初濃度，并依次確定以下指標(biāo)：(1)受試物各濃度對應(yīng)的3個平行孔熒光素漏出量的確定；(2)不加受試物的溶劑對照組的熒光素漏出量的確定；(3)無細胞生長培養(yǎng)膜的最大滲透組的熒光素漏出量的確定；(4)受試物濃度-熒光素漏出率標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定；(5)使熒光素漏出率為20％時的受試物濃度的確定；(6)接觸受試物溶液后使熒光素漏出率為20％時的腎細胞生長培養(yǎng)膜繼續(xù)培養(yǎng)4h、24h、36h、72h后的熒光素漏出率的確定；3.3熒光素滲漏試驗結(jié)果分析實驗獲得反應(yīng)小鼠腎細胞受損情況相關(guān)的三個參數(shù)：(1)FL(％)；代表不同受試物濃度下的熒光素漏出百分比，按以下公式計算不同受試物濃度下的熒光素漏出百分比：FL(％)＝(m-y)/(z-y)×100m表示受試物各濃度對應(yīng)的3個平行孔熒光素漏出量的平均值，y表示同一塊插入式培養(yǎng)皿不加受試物的溶劑對照組的熒光素鈉漏出量的平均值，z表示同一塊插入式培養(yǎng)皿無細胞生長培養(yǎng)膜的最大滲透組的熒光素漏出量的平均值；(2)D值[mg/100mL]：表示使不同百分比的熒光素漏出的受試物濃度，根據(jù)不同受試物濃度值和其相對應(yīng)的熒光素漏出百分比，統(tǒng)計得出受試物濃度-熒光素漏出百分比標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后得出使20％的熒光素漏出的受試物實際濃度，即D20值[mg/100mL]；(3)FL20HY：表示接觸受試物后引起20％熒光素漏出的腎細胞生長培養(yǎng)膜在含10％牛胎血清的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)Y小時(4h或24h或36h或72h)后的熒光素漏出百分比在標(biāo)準(zhǔn)曲線上所對應(yīng)的受試物濃度(mg/100mL)，根據(jù)3.2得到的熒光素漏出率為20％時的腎細胞生長培養(yǎng)膜繼續(xù)培養(yǎng)Y小時后的熒光素漏出率，將其代入受試物濃度-熒光素漏出百分比標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出此時對應(yīng)的受試物濃度，即FL20HY；四、分類和判斷根據(jù)上述預(yù)測模型對受試物眼刺激性及程度做出判斷：根據(jù)預(yù)測模型實驗得到的上述3個參數(shù)，根據(jù)以下分類標(biāo)準(zhǔn)，直接判斷受試物的眼刺激性及其程度，(1)當(dāng)FL(％)＝20時，F(xiàn)L20HY＞15g/100mL，無眼刺激性，相當(dāng)于動物實驗MMAS＜25；(2)當(dāng)FL(％)＝20時，3g/100mL＜FL20HY≤15g/100mL，中度刺激性，相當(dāng)于25＜MMAS＜55，(3)當(dāng)FL(％)＝20時，F(xiàn)L20HY≤3g/100mL，重度刺激性，相當(dāng)于動物實驗MMAS＞55。步驟一中所述的小鼠可為AKR/J小鼠或BALB/c小鼠；步驟一、二、三中所述的培養(yǎng)液均為無酚紅低糖含谷氨酰胺DMEM培養(yǎng)液，購自于Gibco公司，胎牛血清購自于Gibco公司；步驟一中所述的膠原酶I用于上皮細胞的分離，來源于市售，如Gibco公司I型膠原酶，Sigma公司的I型膠原酶；步驟二中所述的插入式培養(yǎng)皿孔徑為0.4μm，微孔濾膜直徑為6.4mm，如美國康寧公司的Millicell插入式細胞培養(yǎng)皿；步驟二中小鼠腎細胞生長培養(yǎng)膜為小鼠腎細胞完全融合得到的無間隙的細胞膜，細胞長滿微孔濾膜，培養(yǎng)小鼠腎細胞的培養(yǎng)基不能污染，細胞不能變色，否者不能使用。步驟三中所述的PBS緩沖液含有以下組分：以1L緩沖液計算，氯化鈉8.0g、氯化鉀0.2g、無水磷酸氫鉀0.2g、無水磷酸氫二鈉1.15g、葡萄糖1.8g、剩余為去離子水，該PBS緩沖液pH為7.2～7.4。步驟三中所述的Hank′s液為無酚紅含鈣鎂Hank’s平衡鹽溶液，如Gibco公司的Hank′s液；本發(fā)明步驟三中所述的檢測熒光素量采用熒光分光光度計檢測，檢測條件為激發(fā)光波長485nm，發(fā)射光波長530nm；本發(fā)明步驟三的3.1中所述受試物作用時間優(yōu)選為10～15min；本發(fā)明步驟三中3.2中繼續(xù)培養(yǎng)Y小時后的熒光素漏出率的確定是為了判斷受試物作用于細胞后，細胞經(jīng)一定時間的恢復(fù)程度或繼續(xù)損傷程度，優(yōu)選為繼續(xù)培養(yǎng)4h。本發(fā)明的機理：完全融合緊密連接的小鼠腎細胞膜在熒光素鈉作用時，熒光素不會滲漏過細胞。若受試物對細胞無刺激性，細胞膜的整體形態(tài)不會改變，細胞與細胞之間緊密連接，熒光素作用時熒光素漏出量很低甚至無熒光素漏出；若受試物對細胞產(chǎn)生刺激作用，細胞受到刺激，細胞收縮，完全融合的細胞膜受到破壞，熒光素作用于受損的細胞膜時根據(jù)漏出的熒光素量間接反映細胞膜的破壞程度，從而表征受試物的刺激性大小。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點及有益效果：(1)本發(fā)明所用受試材料來源于標(biāo)準(zhǔn)化實驗動物小鼠，遺傳背景清楚、種群穩(wěn)定、來源可靠；經(jīng)小鼠腎上皮消化得到的小鼠腎上皮細胞傳代培養(yǎng)穩(wěn)定，不易分化，為實驗的穩(wěn)定性提供保證；(2)本發(fā)明使用的小鼠腎上皮細胞與其他細胞相比融合速度快，容易形成細胞生長培養(yǎng)膜，為試驗的穩(wěn)定性提供保證；(3)本發(fā)明建立的實驗方法適用于表面活性劑眼刺激性損傷評價，與兔眼動物實驗的結(jié)果相關(guān)性好。附圖說明圖1為受試物濃度-熒光素漏出百分比的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實施方式下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例中所用試劑如無特殊說明均可從市場常規(guī)購得。實施例1一、實驗材料1、實驗試劑級儀器牛胎血清(Gibco公司)，實施例中所用培養(yǎng)液均指無酚紅低糖含谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司)，熒光素鈉(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，插入式細胞培養(yǎng)皿(康寧公司的Millicell插入式細胞培養(yǎng)皿，24孔)，膠原酶I(Gibco公司)，氯化鈉，氯化鉀，無水磷酸氫鉀，無水磷酸氫二鈉，葡萄糖，去離子水，熒光分光光度計(上海儀電-分析儀器總廠，970CRT)；2、受試物根據(jù)OECD的數(shù)據(jù)庫(參考文獻：Eyeirritation.Referencechemicalsdatabank(Secondedition)[1998])，選擇5類已知眼刺激性分級的表面活性劑，詳見表1。表1受試物列表編號名稱1吐溫202聚乙烯二醇單月桂酸鹽315％SDS4月桂酸鉀510％苯扎氯銨二、熒光素漏出實驗1、小鼠腎細胞的制備取小鼠腎臟上皮，剪碎，研磨后用培養(yǎng)液充分沖洗，收集液體，經(jīng)150目不銹鋼網(wǎng)篩沖洗并收集網(wǎng)上腎細胞，加1g/L膠原酶I消化培養(yǎng)，37℃消化，每隔5min振蕩1次，15min后加等體積含有10％牛胎血清的培養(yǎng)液終止消化，吹打分散細胞，后靜置5min，1000r/min離心5min，去除上清液，加入含10％牛胎血清的培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)(37℃、5％CO2)至細胞長滿培養(yǎng)皿的85％以上，消化、凍存細胞，備用；2、小鼠腎細胞生長培養(yǎng)膜的制備取步驟一種凍存?zhèn)溆玫膶?shù)生長期的小鼠腎細胞，調(diào)節(jié)細胞濃度為4×105個/mL，取0.5mL加入到插入式培養(yǎng)皿中的微孔濾膜表面上培養(yǎng)96h(37℃、5％CO2)，待細胞完全融合(細胞鋪滿整個微孔濾膜表面)后，得到小鼠腎細胞生長培養(yǎng)膜。3、熒光素滲漏試驗(1)根據(jù)使熒光素滲漏的效應(yīng)發(fā)生的濃度范圍，取0.4mL，濃度分別為20g/100mL、10g/100mL、5g/100mL、1g/100mL、0.1g/100mL受試物溶液(受試物用PBS緩沖液稀釋，w/v)，加入到步驟2中的小鼠腎細胞生長培養(yǎng)膜中，每個受試物濃度設(shè)置3孔平行對照，作用15min后，用Hank’s液輕輕沖洗細胞生長培養(yǎng)膜至其表面無受試物；(2)將清洗干凈的帶有小鼠腎細胞生長培養(yǎng)膜的插入式培養(yǎng)皿放入另一含新鮮10％牛胎血清的培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，加入0.4mL、10μg/mL的熒光素鈉溶液到微孔濾膜表面，37℃繼續(xù)培養(yǎng)30min，用Hank’s液輕輕清洗細胞生長培養(yǎng)膜，至其表面沒有受試物，然后用熒光分光光度計檢測含新鮮10％牛胎血清的培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中每孔培養(yǎng)基中的熒光素量(激發(fā)光波長485nm、發(fā)射光波長530nm)；同時，每塊插入式培養(yǎng)皿另外設(shè)不加受試物的溶劑對照組和無細胞生長培養(yǎng)膜對照組各3孔，以了解受試物對細胞緊密連接的影響；根據(jù)所測的培養(yǎng)皿中每孔培養(yǎng)基中的熒光素量，按以下公式計算不同濃度下的熒光素漏出百分比FL(％)值：FL(％)＝(m-y)/(z-y)×100m表示受試物各濃度對應(yīng)的3個平行孔熒光素漏出量的平均值，y表示同一塊插入式培養(yǎng)皿不加受試物的溶劑對照組的熒光素鈉漏出量的平均值，z表示同一塊插入式培養(yǎng)皿無細胞生長培養(yǎng)膜的最大滲透組的熒光素漏出量的平均值；根據(jù)不同的受試物濃度D值與其相對應(yīng)的熒光素漏出百分比，統(tǒng)計得出受試物濃度-熒光素漏出百分比標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得曲線圖如圖1所示；(3)根據(jù)受試物濃度-熒光素漏出百分比的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出使熒光素鈉漏出百分比為20％時的受試物濃度，然后在此濃度附近繼續(xù)重復(fù)步驟(1)和步驟(2)，直至得到實際熒光素鈉漏出百分比為20％，此時對應(yīng)的受試物濃度即D20，然后將此時的腎細胞生長培養(yǎng)膜連同插入式培養(yǎng)皿置于10％牛胎血清的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，再用Hank’s液輕輕清洗細胞生長膜至其表面沒有受試物，用熒光分光光度計檢測含10％牛胎血清的培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中每孔培養(yǎng)基中的熒光素量(激發(fā)光波長485nm、發(fā)射光波長530nm)，計算出此時的熒光素鈉漏出百分比(FL(％)值)，將其代入濃度-熒光素漏出百分比的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，所得的受試物濃度值即FL20H4[mg/100mL]值。4、結(jié)果分析使20％熒光素鈉漏出的各受試物的實際濃度D值和繼續(xù)培養(yǎng)4h后的受試物濃度FL20H4值詳見表2；表2小鼠腎細胞系統(tǒng)評價方法D值和FL20H4值結(jié)果編號名稱D20值(mg/100mL)FL20H4(mg/100mL)1吐溫2026.825.122聚乙烯二醇單月桂酸鹽16.518.21315％SDS0.640.854月桂酸鉀2.591.63510％苯扎氯銨0.120.06備注：表2中D值和FL20H4值為3次平均值，D值為接觸受試物溶液后使20％熒光素鈉漏出的受試物溶液的實際濃度值，F(xiàn)L20H4值為在D20情況下繼續(xù)培養(yǎng)4h后的熒光素漏出率在標(biāo)準(zhǔn)曲線上相對應(yīng)的受試物濃度。5、分類和判斷根據(jù)上述模型對受試物眼刺激性及程度做出判斷：根據(jù)預(yù)測模型實驗得到的上述D值(mg/100mL)和FL20H4值(mg/100mL)兩個參數(shù)，按以下分類標(biāo)準(zhǔn)判斷受試物的眼刺激性，將得到的刺激性結(jié)果再與參考物質(zhì)Draizetest已知的等級分類做比較，可得到本發(fā)明利用小鼠腎細胞系統(tǒng)評價眼刺激性的方法與Draizetest的方法相關(guān)性。分類標(biāo)準(zhǔn)：①當(dāng)FL(％)＝20時，F(xiàn)L20HY＞15g/100mL，無眼刺激性，相當(dāng)于動物實驗MMAS＜25；②當(dāng)FL(％)＝20時，3g/100mL＜FL20HY≤15g/100mL，中度刺激性，相當(dāng)于25＜MMAS＜55，③當(dāng)FL(％)＝20時，F(xiàn)L20HY≤3g/100mL，重度刺激性，相當(dāng)于動物實驗MMAS＞55；5個已知刺激性分類的參考物質(zhì)經(jīng)小鼠腎細胞系統(tǒng)評價試驗得出的結(jié)果如表3所示：表3已知參考物受試物用小鼠腎細胞系統(tǒng)評價試驗刺激分級結(jié)果與Draizetest結(jié)果比較表編號名稱D20值FL20H4MMAS值1吐溫20＞10＞1002聚乙烯二醇單月桂酸鹽＞10＞103.3315％SDS＜2＜2594月桂酸鉀＜2＜238510％苯扎氯銨＜2＜2108從表3中可以看出吐溫20、聚乙烯二醇單月桂酸鹽為輕或無刺激性，15％SDS、月桂酸鉀、10％苯扎氯銨為重度刺激性，與Draizetest結(jié)果吐溫20、聚乙烯二醇單月桂酸鹽為輕或無刺激性，15％SDS、10％苯扎氯銨為重度刺激性，月桂酸鉀為中度刺激性比較，結(jié)果相關(guān)性為80％以上。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3