本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種生物法綠色生產(chǎn)黃姜皂素的方法。
背景技術(shù)：
黃姜(Dioscorea zingiberensis C.H.Wright)學(xué)名盾葉薯蕷，又稱火頭根，多年生纏繞草本植物，為我國特有的野生植物資源，主要分布于湖南、陜西、四川、貴州及云南等省。黃姜的根狀莖含薯蕷皂苷等甾體皂苷類成分、40％左右的淀粉、50％的纖維素以及一些水溶性苷類、生物堿類、黃酮苷類、強(qiáng)心苷類、單寧、色素等化學(xué)成分。黃姜的主要有效成分是薯蕷皂苷元，也稱皂素(以下均稱皂素)。黃姜皂素是黃姜皂苷的配基，在黃姜中主要以皂苷的形式存在。以黃姜皂素合成的甾體激素中間體及皮質(zhì)激素、性激素、蛋白同化激素等產(chǎn)品為主的數(shù)百種國計(jì)民生特需的藥物，被譽(yù)為“藥用黃金”。甾體激素類藥物已迅速發(fā)展為僅次于抗生素的第二大類藥物。
盾葉薯蕷植物中的淀粉、蛋白質(zhì)、果膠等成分對甾體皂苷具有一定的包裹作用，而甾體皂苷又通過3位糖苷鍵與植物纖維相連。因而簡單的酸水解方法收率低，很難將植物中的薯蕷皂素提取完全，僅能提取其中的1/4。
黃姜皂素的生產(chǎn)目前仍采用基于Marker和Wall為代表的先萃取后水解及Rothrok提出的先水解后萃取的分離方法(直接酸解工藝)。傳統(tǒng)皂素生產(chǎn)工藝廢水廢渣排放量大，污染嚴(yán)重，廢水含酸高、色素濃，治理難度大成本高。黃姜加工企業(yè)多位于丹江口庫區(qū)周邊及南水北調(diào)中線的源頭，污染水的排放嚴(yán)重危及南水北調(diào)中線水源區(qū)水質(zhì)安全。然而，若全面禁止黃姜皂素生產(chǎn)行業(yè)，勢必造成百萬姜農(nóng)的民生利益受損，而且給下游甾體激素行業(yè)產(chǎn)生嚴(yán)重影響。我國在Rothrok法的基礎(chǔ)上，圍繞提高提取率，解決污染等問題，相繼出現(xiàn)了淀粉物理分離法、酶解糖液分離法和醇浸膏法等清潔生產(chǎn)工藝，即便如此，依然存在諸多不足。
專利CN1515585A公開了一種環(huán)保無污染生產(chǎn)薯蕷皂素的方法，但其中過篩分離40％的纖維素部分會帶走一些與纖維素結(jié)合的皂苷，從而降低了皂素的得率，且膜過濾在實(shí)際工業(yè)化過程中存在通量低、易堵塞等問題。專利CN1970785A公開了一種薯蕷皂素清潔生產(chǎn)及綜合利用的方法，將黃姜原料粉碎后直接進(jìn)行溶劑提取，與黃姜木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)共價(jià)偶聯(lián)的結(jié)合態(tài)皂苷無法獲得，皂素得率存在提升空間，且未能將黃姜其他組分高值化利用。專利CN1821380A公開了一種處理黃姜的高效復(fù)合微生物菌群，其使用的微生物菌群涵蓋細(xì)菌、霉菌、酵母菌等多種復(fù)合微生物，但存在問題是真菌生長時(shí)間較長，且細(xì)菌與真菌在生長過程中存在拮抗作用，大多數(shù)微生物在對黃姜木質(zhì)纖維素處理過程中，存在分階段生長的情況，與自然發(fā)酵過程一樣存在不可控性，且微生物對皂苷元母核可能會有降解與轉(zhuǎn)化作用，從而降低皂素得率。專利CN 103060416A公開了一種利用微生物技術(shù)清潔生產(chǎn)黃姜皂素的方法，其使用單一微生物結(jié)合蒸汽爆破處理黃姜干粉或鮮料的方法獲得了較好的收率，且大幅度降低了酸、水及有機(jī)溶劑的用量，但依然存在需要改進(jìn)的地方：單一微生物處理黃姜的能力有限，因而必須結(jié)合蒸汽爆破等物理化學(xué)手段對黃姜進(jìn)行預(yù)處理，而蒸汽爆破處理過程噪音大能耗高，不利于工業(yè)化放大，同時(shí)在生產(chǎn)皂素的過程中依然使用了酸，不能做到全過程的清潔生產(chǎn)。
最大限度提高黃姜皂素收率，同時(shí)摒棄傳統(tǒng)酸水解法，大幅減少有機(jī)溶劑用量，從而大幅降低黃姜皂素生產(chǎn)成本和污染程度成為核心問題，迫切需要通過科技創(chuàng)新，研發(fā)新的綠色生產(chǎn)工藝并進(jìn)行工業(yè)化放大應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術(shù)的以上缺陷或改進(jìn)需求，本發(fā)明提供了一種生物法綠色生產(chǎn)黃姜皂素的方法，其目的在于通過采用系列微生物菌群，包括能夠分泌木質(zhì)纖維素降解酶系、糖基轉(zhuǎn)移酶活力很高且能分泌表面活性物質(zhì)的高效微生物菌群A以及能夠分泌高活性糖苷酶的微生物菌群B分別進(jìn)行黃姜發(fā)酵、皂苷富集以及轉(zhuǎn)化皂苷為皂素，由此解決黃姜皂素生產(chǎn)過程中黃姜皂苷轉(zhuǎn)化率低、黃姜皂素收率低、能耗高、環(huán)境污染嚴(yán)重、淀粉利用不充分等突出問題，大幅降低了皂素生產(chǎn)成本，從而提高了皂素市場競爭力。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，按照本發(fā)明的一個方面，提供了一種黃姜皂素的制備方法，包括如下步驟：
(1)黃姜發(fā)酵：按照黃姜干重與水的質(zhì)量比為1:5～1:15配制成均勻漿液，在漿液中接種10％～40％微生物菌群A，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到相應(yīng)的發(fā)酵液；
(2)淀粉糖化：向步驟(1)得到的發(fā)酵液中加入淀粉酶酶解，再加入糖化酶糖化，經(jīng)板框過濾壓榨得到液相和固相，所述液相為黃姜含皂苷糖化液，所述固相為黃姜固形渣；
(3)皂苷富集：將步驟(2)所得的黃姜含皂苷糖化液經(jīng)膜過濾后獲得截留液和過濾液，所述截留液為皂苷濃縮液，所述過濾液為黃姜淀粉糖化液；將步驟(2)所得的黃姜固形渣使用乙醇水溶液進(jìn)行萃取，溶劑回收后獲得皂苷醇提浸膏；
(4)制備皂苷混合液：將步驟(3)獲得的皂苷濃縮液和皂苷醇提浸膏混合加水混勻后制成皂苷混合液；
(5)微生物轉(zhuǎn)化皂苷：向步驟(4)得到的皂苷混合液中接種10％～30％微生物菌群B，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到相應(yīng)的發(fā)酵液；
(6)皂素產(chǎn)品的制備：將步驟(5)所得到的發(fā)酵液進(jìn)行板框過濾壓榨，得到固相和液相，所述固相為皂素酶解物，所述皂素酶解物經(jīng)溶劑提取精制后獲得皂素產(chǎn)品。
優(yōu)選地，所述微生物菌群A包括Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonas flavigena；
優(yōu)選地，所述微生物菌群A的制備方法包括如下步驟：
(1)分別取菌株Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonas flavigena的單菌落接種于LB培養(yǎng)基中，在30℃～40℃，100～220r/min條件下培養(yǎng)8～16h，分別獲得Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonas flavigena的一級種子；
(2)分別將步驟(1)獲得的Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonas flavigena的一級種子按接種量1％～5％(體積百分?jǐn)?shù))接入LB培養(yǎng)基中，在30℃～40℃，100～300r/min，通氣量0.1～1vvm條件下培養(yǎng)2～8h，分別獲得Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonas flavigena的二級種子液；
(3)分別將步驟(2)獲得的Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonas flavigena的二級種子液接入廉價(jià)細(xì)菌培養(yǎng)基中，在通氣量0.1～1vvm，攪拌轉(zhuǎn)速100～300r/min，溫度30～40℃下，培養(yǎng)2～8h，分別獲得Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonas flavigena的三級種子；
(4)將步驟(3)獲得的Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonas flavigena的三級種子按照等體積比例混合制成微生物菌群A。
優(yōu)選地，所述廉價(jià)細(xì)菌培養(yǎng)基配方如下：黃豆餅粉5～15g/L，蛋白胨2～5g/L，酵母粉1～2.5g/L，氯化鈉5～12g/L，消泡劑0.05％～0.1％(v/v)。
優(yōu)選地，所述步驟(1)中的均勻漿液中還包括如下成分：大豆油體積百分比0.01％～0.05％，硫酸亞鐵0.006～0.01mmol/L，硫酸鎂0.005～0.015mmol/L，硝酸鉀5～15mmol/L，氯化鈣4～10μmol/L，硫酸鎂2～3mmol/L。
優(yōu)選地，所述步驟(1)中的表面活性物質(zhì)包括表面活性素或地衣素。
優(yōu)選地，所述步驟(4)中制備皂苷混合液時(shí)皂苷濃縮液和皂苷醇提浸膏的總體積與水的體積比為1:4～7。
優(yōu)選地，所述微生物菌群B包括Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger。
優(yōu)選地，所述微生物菌群B的制備方法包括如下步驟：
(1)取斜面保藏菌株Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger的孢子液分別接種于YPD培養(yǎng)基中，分別在25～35℃，100～220r/min條件下培養(yǎng)10～18h，分別獲得Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger的一級種子；
(2)將步驟(1)獲得的Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger的一級種子分別按接種量1％～5％(體積百分?jǐn)?shù))接入YPD培養(yǎng)基中，在25℃～35℃，100～300r/min，通氣量0.2～1vvm條件下培養(yǎng)16～32h，分別獲得Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger的二級種子；
(3)將步驟(2)獲得的Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger的二級種子液分別接入真菌培養(yǎng)基中，分別在通氣量0.2～1vvm，攪拌轉(zhuǎn)速100～300r/min，25～35℃，培養(yǎng)12～24h，分別獲得Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger的三級種子；
(4)將步驟(3)獲得的Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger的三級種子按照等體積比例混合制成微生物菌群B。
優(yōu)選地，所述的真菌培養(yǎng)基配方如下：蛋白胨5～10g/L，酵母粉2～5g/L，葡萄糖5～10g/L。
優(yōu)選地，所述步驟(1)的發(fā)酵條件為在30～40℃轉(zhuǎn)速為100～300r/min通氣量為0.1～1vvm條件下培養(yǎng)4～24h。
優(yōu)選地，所述步驟(5)的發(fā)酵條件為在28～39℃轉(zhuǎn)速為100～300r/min通氣量為0.2～1vvm條件下培養(yǎng)24～168h。
總體而言，通過本發(fā)明的上述技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，能夠取得下列有益效果：
1、采用能夠分泌木質(zhì)纖維素降解酶系、糖基轉(zhuǎn)移酶以及表面活性物質(zhì)的微生物菌群A預(yù)處理黃姜原料，使木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)松散，有效斷開糖苷鍵，使得束縛的皂苷釋放，使存在于黃姜組織細(xì)胞中被木質(zhì)纖維素、果膠、淀粉等包裹的皂苷充分游離；再通過轉(zhuǎn)糖基作用及表面活性物質(zhì)使得游離皂苷在水中的溶解性增加，使得固形物中皂苷含量減少，大幅降低有機(jī)溶劑用量。
2、采用能夠分泌系列高活性糖苷酶的微生物菌群B轉(zhuǎn)化總皂苷生產(chǎn)皂素，所得的皂素產(chǎn)品得率高，純度好。本發(fā)明的方法與直接酸解法相比，完全不用酸，且皂素得率能夠提高43％。
3、本發(fā)明的一種生物法綠色生產(chǎn)黃姜皂素的方法，整個工藝綠色環(huán)保，無污染，成本低，產(chǎn)業(yè)化前景廣闊。
附圖說明
圖1是本發(fā)明一種生物法綠色生產(chǎn)黃姜皂素的方法的工藝流程圖。
具體實(shí)施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。此外，下面所描述的本發(fā)明各個實(shí)施方式中所涉及到的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。
一種生物法綠色生產(chǎn)黃姜皂素的方法,包括如下步驟：
(1)黃姜材料的預(yù)處理
取新鮮黃姜適量，洗去泥土去須，按照黃姜干重：水＝1：5～15(w/w)粉碎勻漿配制成黃姜漿液，然后加入少量營養(yǎng)成分，使得黃姜漿液中含有：大豆油0.01％～0.05％(v/v)，硫酸亞鐵0.006～0.01mmol/L，硫酸鎂0.005～0.015mmol/L，硝酸鉀5～15mmol/L，氯化鈣4～10μmol/L，硫酸鎂2～3mmol/L。
(2)微生物菌群制備
微生物菌群A的制備方法包括如下步驟：
(1)取菌株Bacillus sp.的單菌落接種于100mL LB培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，在30℃～40℃，100～220r/min條件下培養(yǎng)8～16h，獲得Bacillus sp.的一級種子；
(2)將Bacillus sp.的一級種子接入裝有50L LB培養(yǎng)基的種子罐中，接種量1％(v/v)，罐溫30℃～40℃，100～300r/min，通氣量0.1～1vvm條件下培養(yǎng)2～8h，獲得Bacillus sp.的二級種子；
(3)將Bacillus sp.的二級種子接入裝有1500L廉價(jià)細(xì)菌培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，通氣量0.1～1vvm，攪拌轉(zhuǎn)速100～300r/min，罐溫30～40℃，培養(yǎng)2～8h，獲得Bacillus sp.的三級種子；
采用如上同樣的方法分別獲得Pectobacterium carotovorum和Cellulomonas flavigena的三級種子。
(4)將Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonas flavigena的三級種子按照等體積比例混合制成微生物菌群A。
所述廉價(jià)細(xì)菌培養(yǎng)基配方如下：黃豆餅粉5～15g/L，蛋白胨2～5g/L，酵母粉1～2.5g/L，氯化鈉5～12g/L，消泡劑0.05％～0.1％(v/v)；
微生物菌群B的制備方法包括如下步驟：
(1)取斜面保藏菌株Aspergillus tubingensis的孢子液接種于100mL YPD培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，在25℃～35℃，100～220r/min條件下培養(yǎng)10～18h，獲得Aspergillus tubingensis的一級種子；
(2)將Aspergillus tubingensis的一級種子接入裝有50L YPD培養(yǎng)基的種子罐中，接種量1％(v/v)，罐溫25℃～35℃，100～300r/min，通氣量0.2～1vvm條件下培養(yǎng)16～32h，獲得Aspergillus tubingensis的二級種子；
(3)將Aspergillus tubingensis的二級種子接入裝有1000L真菌培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，通氣量0.2～1vvm，攪拌轉(zhuǎn)速100～300r/min，罐溫25～35℃，培養(yǎng)12～24h，獲得Aspergillus tubingensis的三級種子。
采用如上相同的方法獲得Aspergillus niger的三級種子。
(4)將Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger的三級種子按照等體積比例混合制成微生物菌群B。
所述真菌培養(yǎng)基配方如下：蛋白胨5～10g/L，酵母粉2～5g/L，葡萄糖5～10g/L。
(3)微生物發(fā)酵促進(jìn)皂苷游離
在步驟(1)所得到的黃姜漿液中接種10～40％(v/v)的微生物菌群A，在30～40℃轉(zhuǎn)速為100～300r/min通氣量為0.1～1vvm條件下發(fā)酵培養(yǎng)4～24h，得到相應(yīng)的發(fā)酵液。
(4)淀粉糖化
向步驟(3)所得到的發(fā)酵液中按黃姜干重每千克加入5萬單位(U)α-淀粉酶，在pH 6.2、95℃條件下液化20min，冷卻至60℃以下；再按黃姜干重每千克加入5萬單位(U)糖化酶，在pH 4.2、溫度60℃條件下糖化6h，板框過濾壓榨得到液相和固相，液相為黃姜含皂苷糖化液，固相為黃姜固形渣。
(5)皂苷富集
將步驟(4)所得的黃姜含皂苷糖化液先通過微濾得到清液，所述清液再通過孔徑為1.5nm的納濾裝置，獲得截留液和過濾液，截留液為皂苷濃縮液，過濾液為黃姜淀粉糖化液；使用40～90％(v/v)的乙醇水溶液對步驟(4)所得的黃姜固形渣進(jìn)行萃取，溶劑回收回用后獲得皂苷醇提浸膏。
(6)制備皂苷混合液
將步驟(5)獲得的皂苷濃縮液和皂苷醇提浸膏混合物加水制成皂苷混合液，其中混合物的體積與所加水體積的比例為1:4～7。
(7)微生物轉(zhuǎn)化皂苷
向步驟(6)所得到的皂苷混合液或黃姜固形渣重懸液中接種10％～30％(v/v)的微生物菌群B，在28～39℃轉(zhuǎn)速為100～300r/min通氣量為0.2～1 vvm條件下發(fā)酵培養(yǎng)24～168h，將皂苷轉(zhuǎn)化為皂素，并獲得相應(yīng)的發(fā)酵液。
(8)皂素產(chǎn)品的制備
將步驟(7)所得到的發(fā)酵液板框過濾壓榨后得到皂素酶解物，干燥后再以120#汽油索氏提取4h，回收有機(jī)溶劑循環(huán)利用，提取物結(jié)晶干燥后得到白色黃姜皂素產(chǎn)品。
步驟(1)中加入大豆油、硫酸亞鐵、硫酸鎂等營養(yǎng)成分的目的是為了促進(jìn)微生物菌群A在發(fā)酵黃姜漿液時(shí)除了能夠分泌木質(zhì)纖維素降解酶系、糖基轉(zhuǎn)移酶，還可以促進(jìn)分泌表面活性素或地衣素等表面活性物質(zhì)。
步驟(3)中微生物菌群A的接種量優(yōu)選范圍為15％～25％，微生物菌群A逐漸增加有助于提高其單位時(shí)間的工作能力，菌群A分泌的酶在一定反應(yīng)時(shí)間內(nèi)使得皂苷游離溶解于水相，但微生物菌群A的加入量過大時(shí)會導(dǎo)致游離的皂苷上面的糖基進(jìn)一步降解從而使得皂苷溶解性下降而沉淀，影響了皂苷的溶解性。
步驟(7)中微生物菌群B的加入量優(yōu)選為10％～18％，菌群B的加入量在較低水平內(nèi)逐漸增加能極大的提高菌群B對皂苷的轉(zhuǎn)化效率，但進(jìn)一步提高其加入量則對皂苷的轉(zhuǎn)化效率沒有什么影響，相反還會因?yàn)榧尤脒^多微生物菌絲體阻礙轉(zhuǎn)化結(jié)束后皂素的提取效率。
單一菌株的纖維素酶的酶活很低，由于半纖維素、木質(zhì)素的包裹，導(dǎo)致微生物未能接觸到纖維素結(jié)構(gòu)，從而幾乎不分泌纖維素酶；單一菌株分泌的木聚糖酶、甘露聚糖酶和果膠酶酶活水平很低，影響整體降解效率，發(fā)酵促進(jìn)黃姜皂苷游離的效果很有限。而本發(fā)明的微生物菌群A為能夠分泌木質(zhì)纖維素降解酶系、糖基轉(zhuǎn)移酶以及表面活性物質(zhì)的混合微生物菌群，能夠分工合作，既避免了不同種微生物對有限底物的競爭作用，也提高了不同底物的降解效率，同時(shí)分泌高酶活性的各種酶，各種酶之間的協(xié)同作用更明顯，快速釋放被包裹及共價(jià)結(jié)合的黃姜皂苷。本發(fā)明的微生物菌群B為能夠分泌高活性糖苷酶的混合微生物菌群，其菌株的豐富的糖苷酶酶系相互協(xié)同配合，保證了菌株對皂苷的高效轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明通過分階段投入不同微生物單菌株或菌群處理黃姜材料，使木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)松散，有效斷開糖苷鍵，使得結(jié)合態(tài)黃姜皂苷釋放，再通過轉(zhuǎn)糖基作用將游離的還原糖重新連接到皂苷上使其在水中的溶解性增加，同時(shí)由菌株分泌的適量表面活性物質(zhì)使得游離的水不溶皂苷溶解于水相；固形物中的皂苷游離程度高，含量低，有機(jī)溶劑用量少，提取效率高；獲得的皂苷采用糖苷酶活性強(qiáng)的微生物菌株將其全部轉(zhuǎn)化為皂素，完全替代酸解。本發(fā)明黃姜皂素收率高，整個生產(chǎn)過程完全不用酸，溶劑用量少，廢水量低，污染小，廢渣量少，黃姜資源可利用度高。
本發(fā)明所述微生物菌群A包括Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonas flavigena；所述微生物菌群B包括Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger。
所述Pectobacterium carotovorum沒有特定的菌株限定。
所述Bacillus sp.其于2016年12月30日保藏于中國武漢，中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NO: M 2016791。
所述Cellulomonas flavigena沒有特定的菌株限定。
所述Aspergillus tubingensis，其于2016年7月11日保藏于中國武漢，中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NO: M 2016389。
所述Aspergillus niger沒有特定的菌株限定。
圖1是本發(fā)明一種生物法綠色生產(chǎn)黃姜皂素的方法的工藝流程圖。
以下為實(shí)施例：
實(shí)施例1
一種生物法綠色生產(chǎn)黃姜皂素的方法,包括如下步驟：
(1)黃姜材料的預(yù)處理
取新鮮黃姜若干(干重2950kg)，洗去泥土去須，按照黃姜干重：水＝1：5(w/w)粉碎勻漿配制成黃姜漿液，加入少量營養(yǎng)成分，使得漿液中相應(yīng)組分的終濃度如下：大豆油0.01％(v/v)，硫酸亞鐵0.006mmol/L，硫酸鎂0.005mmol/L，硝酸鉀5mmol/L，氯化鈣4μmol/L，硫酸鎂2mmol/L。
(2)微生物菌群制備
微生物菌群A的制備方法為：
取菌株Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonas flavigena的單菌落分別接種于裝有100mL LB培養(yǎng)基的250mL搖瓶，每個菌株各5瓶，在30℃，100r/min條件下培養(yǎng)16h，獲得一級種子。
將一級種子分別接入裝有50L LB培養(yǎng)基的種子罐中，罐溫30℃，100r/min，通氣量0.1vvm條件下培養(yǎng)8h，獲得二級種子。
將二級種子分別接入裝有1500L廉價(jià)細(xì)菌培養(yǎng)基的3m3發(fā)酵罐中，罐溫30℃，100r/min，通氣量0.1vvm條件下培養(yǎng)8h，獲得三級種子。
將上述獲得的Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonas flavigena的三級種子按照等體積比例混合菌液制成微生物菌群A。
所述廉價(jià)細(xì)菌培養(yǎng)基配方如下：黃豆餅粉15g/L，蛋白胨2g/L，酵母粉1g/L，氯化鈉5g/L，消泡劑0.1％(v/v)。
微生物菌群B的制備方法為：
取斜面保藏菌株Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger孢子液分別接種于裝有100mL LB培養(yǎng)基的250mL搖瓶，每個菌株各5瓶，在25℃，100r/min條件下培養(yǎng)18h，獲得一級種子。
將一級種子分別接入裝有50L YPD培養(yǎng)基的種子罐中，罐溫25℃，100r/min，通氣量0.2vvm條件下培養(yǎng)32h，獲得二級種子。
將二級種子分別接入裝有1000L真菌培養(yǎng)基的2m3發(fā)酵罐中，罐溫25℃，100r/min，通氣量0.2vvm條件下培養(yǎng)24h，獲得三級種子。
將上述獲得的Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger的三級種子按照等體積比例混合菌液制成微生物菌群B。
所述真菌培養(yǎng)基配方如下：蛋白胨5g/L，酵母粉2g/L，葡萄糖10g/L。
(3)微生物發(fā)酵促進(jìn)皂苷游離
在步驟(1)所得到的黃姜漿液中微生物菌群A，在30℃轉(zhuǎn)速為100r/min通氣為0.1vvm條件下發(fā)酵培養(yǎng)24h，得到相應(yīng)的發(fā)酵液。
(4)淀粉糖化
向步驟(3)所得到的發(fā)酵液中按黃姜干重每千克加入5萬單位(U)α-淀粉酶，在pH 6.2、95℃條件下液化20min，冷卻至60℃以下；再按黃姜干重每千克加入5萬單位(U)糖化酶，在pH 4.2、溫度60℃條件下糖化6h，板框過濾壓榨得到液相和固相，液相為黃姜含皂苷糖化液，固相為黃姜固形渣。
(5)皂苷富集
將步驟(4)所得的黃姜含皂苷糖化液先通過微濾得到清液，所述清液再通過孔徑為1.5nm的納濾裝置，獲得截留液和過濾液，截留液為皂苷濃縮液，過濾液為黃姜淀粉糖化液；使用40％(v/v)的乙醇水溶液對步驟(4)所得的黃姜固形渣進(jìn)行萃取，溶劑回收回用后獲得皂苷醇提浸膏。
(6)制備皂苷混合液
將步驟(5)獲得的皂苷濃縮液和皂苷醇提浸膏混合加水制成皂苷混合液，總體積為11m3，其中皂苷濃縮液和皂苷醇提浸膏混合物與所加水的體積比例為1:4。
(7)微生物轉(zhuǎn)化皂苷
向步驟(6)所得到的皂苷混合液中接入微生物菌群B，在28℃轉(zhuǎn)速為100r/min通氣為0.2vvm條件下發(fā)酵培養(yǎng)168h，將皂苷轉(zhuǎn)化為皂素，并獲得相應(yīng)的發(fā)酵液。
(8)皂素產(chǎn)品的制備
將步驟(7)所得到的發(fā)酵液板框過濾壓榨除去上清后得到皂素酶解物，干燥后再以120#汽油索氏提取4h，回收有機(jī)溶劑循環(huán)利用，提取物結(jié)晶干燥后得到白色黃姜皂素產(chǎn)品。
與直接酸解法相比，本發(fā)明的方法完全不用酸，且獲得的皂素得率提高了20％。
實(shí)施例2
一種生物法綠色生產(chǎn)黃姜皂素的方法,包括如下步驟：
(1)黃姜材料的預(yù)處理
取新鮮黃姜若干(干重1750kg)，洗去泥土去須，按照黃姜干重：水＝1:15(w/w)粉碎勻漿配制成黃姜漿液，加入少量營養(yǎng)成分，使得漿液中相應(yīng)組分的終濃度如下：大豆油0.05％(v/v)，硫酸亞鐵0.01mmol/L，硫酸鎂0.015mmol/L，硝酸鉀15mmol/L，氯化鈣10μmol/L，硫酸鎂3mmol/L。
(2)微生物菌群制備
微生物菌群A的制備方法為：
取菌株Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonas flavigena的單菌落分別接種于裝有100mL LB培養(yǎng)基的250mL搖瓶，每個菌株各5瓶，在40℃，220r/min條件下培養(yǎng)8h，獲得一級種子。
將一級種子分別接入裝有50L LB培養(yǎng)基的種子罐中，罐溫40℃，300r/min，通氣量1vvm條件下培養(yǎng)2h，獲得二級種子。
將二級種子分別接入裝有1500L廉價(jià)細(xì)菌培養(yǎng)基的3m3發(fā)酵罐中，罐溫40℃，300r/min，通氣量1vvm條件下培養(yǎng)2h，獲得三級種子，
將上述獲得的Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonas flavigena的三級種子按照等體積比例混合菌液制成微生物菌群A。
所述廉價(jià)細(xì)菌培養(yǎng)基配方如下：黃豆餅粉5g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2.5g/L，氯化鈉12g/L消泡劑0.05％(v/v)。
微生物菌群B的制備方法為：
取斜面保藏菌株Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger孢子液分別接種于裝有100mL LB培養(yǎng)基的250mL搖瓶，每個菌株各5瓶，在35℃，220r/min條件下培養(yǎng)10h，獲得一級種子。
將一級種子分別接入裝有50L YPD培養(yǎng)基的種子罐中，罐溫35℃，300r/min，通氣量1vvm條件下培養(yǎng)16h，獲得二級種子。
將二級種子分別接入裝有1000L真菌培養(yǎng)基的2m3發(fā)酵罐中，罐溫35℃，300r/min，通氣量1vvm條件下培養(yǎng)12h，獲得三級種子。
將上述獲得的Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger的三級種子按照等體積比例混合菌液制成微生物菌群B。
所述真菌培養(yǎng)基配方如下：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖5g/L。
(3)微生物發(fā)酵促進(jìn)皂苷游離
在步驟(1)所得到的黃姜漿液中接入微生物菌群A，在40℃轉(zhuǎn)速為300r/min通氣為1vvm條件下發(fā)酵培養(yǎng)4h，得到相應(yīng)的發(fā)酵液。
(4)淀粉糖化
向步驟(3)所得到的發(fā)酵液中按黃姜干重每千克加入5萬單位(U)α-淀粉酶，在pH 6.2、95℃條件下液化20min，冷卻至60℃以下；再按黃姜干重每千克加入5萬單位(U)糖化酶，在pH 4.2、溫度60℃條件下糖化6h，板框過濾壓榨得到液相和固相，液相為黃姜含皂苷糖化液，固相為黃姜固形渣。
(5)皂苷富集
將步驟(4)所得的黃姜含皂苷糖化液先通過微濾得到清液，所述清液再通過孔徑為1.5nm的納濾裝置，獲得截留液和過濾液，截留液為皂苷濃縮液，過濾液為黃姜淀粉糖化液；使用90％(v/v)的乙醇水溶液對步驟(4)所得的黃姜固形渣進(jìn)行萃取，溶劑回收回用后獲得皂苷醇提浸膏。
(6)制備皂苷混合液
將步驟(5)獲得的皂苷濃縮液和皂苷醇提浸膏混合加水制成皂苷混合液，總體積為7m3，其中皂苷濃縮液和皂苷醇提浸膏混合物與所加水的體積比例為1:7。
(7)微生物轉(zhuǎn)化皂苷
向步驟(6)所得到的皂苷混合液中接入微生物菌群B，在39℃轉(zhuǎn)速為300r/min通氣為1vvm條件下發(fā)酵培養(yǎng)24h，將皂苷轉(zhuǎn)化為皂素，并獲得相應(yīng)的發(fā)酵液。
(8)皂素產(chǎn)品的制備
將步驟(7)所得到的發(fā)酵液板框過濾壓榨除去上清后得到皂素酶解物，干燥后再以120#汽油索氏提取4h，回收有機(jī)溶劑循環(huán)利用，提取物結(jié)晶干燥后得到白色黃姜皂素產(chǎn)品。
與直接酸解法相比，本發(fā)明的方法完全不用酸，且獲得的皂素得率提高了24％。
實(shí)施例3
一種生物法綠色生產(chǎn)黃姜皂素的方法,包括如下步驟：
(1)黃姜材料的預(yù)處理
取新鮮黃姜若干(干重2250kg)，洗去泥土去須，按照黃姜干重：水＝1:10(w/w)粉碎勻漿配制成黃姜漿液，加入少量營養(yǎng)成分，使得漿液中相應(yīng)組分的終濃度如下：大豆油0.03％(v/v)，硫酸亞鐵0.008mmol/L，硫酸鎂0.01mmol/L，硝酸鉀10mmol/L，氯化鈣6μmol/L，硫酸鎂2.3mmol/L。
(2)微生物菌群制備
微生物菌群A的制備方法為：
取菌株Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonas flavigena的單菌落分別接種于裝有100mL LB培養(yǎng)基的250mL搖瓶，每個菌株各5瓶，在37℃，200r/min條件下培養(yǎng)12h，獲得一級種子。
將一級種子分別接入裝有50L LB培養(yǎng)基的種子罐中，罐溫37℃，250r/min，通氣量0.3vvm條件下培養(yǎng)6h，獲得二級種子。
將二級種子分別接入裝有1500L廉價(jià)細(xì)菌培養(yǎng)基的3m3發(fā)酵罐中，罐溫37℃，250r/min，通氣量0.3vvm條件下培養(yǎng)6h，獲得三級種子。
將上述獲得的Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonas flavigena的三級種子按照等體積比例混合菌液制成微生物菌群A。
所述廉價(jià)細(xì)菌培養(yǎng)基配方如下：黃豆餅粉10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2.5g/L，氯化鈉10g/L，消泡劑0.08％(v/v)。
微生物菌群B的制備方法為：
取斜面保藏菌株Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger孢子液分別接種于裝有100mL LB培養(yǎng)基的250mL搖瓶，每個菌株各5瓶，在28℃，200r/min條件下培養(yǎng)12h，獲得一級種子。
將一級種子分別接入裝有50L YPD培養(yǎng)基的種子罐中，罐溫28℃，280r/min，通氣量0.5vvm條件下培養(yǎng)24h，獲得二級種子。
將二級種子分別接入裝有1000L真菌培養(yǎng)基的2m3發(fā)酵罐中，罐溫28℃，280r/min，通氣量0.5vvm條件下培養(yǎng)16h，獲得三級種子。
將Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger的三級種子按照等體積比例混合菌液制成微生物菌群B。
所述真菌培養(yǎng)基配方如下：蛋白胨6g/L，酵母粉3g/L，葡萄糖6g/L。
(3)微生物發(fā)酵促進(jìn)皂苷游離
在步驟(1)所得到的黃姜漿液中接種微生物菌群A，在37℃轉(zhuǎn)速為300r/min通氣為0.5vvm條件下發(fā)酵培養(yǎng)8h，得到相應(yīng)的發(fā)酵液。
(4)淀粉糖化
向步驟(3)所得到的發(fā)酵液中按黃姜干重每千克加入5萬單位(U)α-淀粉酶，在pH 6.2、95℃條件下液化20min，冷卻至60℃以下；再按黃姜干重每千克加入5萬單位(U)糖化酶，在pH 4.2、溫度60℃條件下糖化6h，板框過濾壓榨得到液相和固相，液相為黃姜含皂苷糖化液，固相為黃姜固形渣。
(5)皂苷富集
將步驟(4)所得的黃姜含皂苷糖化液先通過微濾得到清液，所述清液再通過孔徑為1.5nm的納濾裝置，獲得截留液和過濾液，截留液為皂苷濃縮液，過濾液為黃姜淀粉糖化液；使用70％(v/v)的乙醇水溶液對步驟(4)所得的黃姜固形渣進(jìn)行萃取，溶劑回收回用后獲得皂苷醇提浸膏。
(6)制備皂苷混合液
將步驟(5)獲得的皂苷濃縮液和皂苷醇提浸膏混合加水制成皂苷混合液，總體積為17m3，其中皂苷濃縮液和皂苷醇提浸膏混合物與所加水的體積比例為1:5。
(7)微生物轉(zhuǎn)化皂苷
向步驟(6)所得到的皂苷混合液中接入微生物菌群B，在30℃轉(zhuǎn)速為300r/min通氣為0.5vvm條件下發(fā)酵培養(yǎng)72h，將皂苷轉(zhuǎn)化為皂素，并獲得相應(yīng)的發(fā)酵液。
(8)皂素產(chǎn)品的制備
將步驟(7)所得到的發(fā)酵液板框過濾壓榨除去上清后得到皂素酶解物，干燥后再以120#汽油索氏提取4h，回收有機(jī)溶劑循環(huán)利用，提取物結(jié)晶干燥后得到白色黃姜皂素產(chǎn)品。
與直接酸解法相比，本發(fā)明的方法完全不用酸，且獲得的皂素得率提高了43％。
以上所述為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，但本發(fā)明不應(yīng)該局限于該實(shí)施例所公開的內(nèi)容。所以凡是不脫離本發(fā)明所公開的精神下完成的等效或修改，都落入本發(fā)明保護(hù)的范圍。