本發(fā)明屬于核苷酸和基因分子檢測領(lǐng)域，具體涉及一種人CYP2C19基因多態(tài)性包括CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17位點(diǎn)的檢測探針及其應(yīng)用。
技術(shù)背景
單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)主要是指在基因組水平上由單個(gè)核昔酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。在基因組DNA中，任何堿基均有可能發(fā)生變異，因此SNP既有可能在基因序列內(nèi)，也有可能在基因以外的非編碼序列上。位于編碼區(qū)內(nèi)的SNP(coding SNP,cSNP)比較少，從對生物的遺傳性狀的影響上來看，cSNP可分為2種：一種是同義cSNP，即SNP所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相同；另一種是非同義cSNP，指堿基序列的改變可使以其為模板翻譯的蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變，從而影響蛋白質(zhì)的功能，這種改變常是導(dǎo)致生物性狀改變的直接原因。SNP與許多疾病相關(guān)，決定了人類疾病的易感性和藥物反應(yīng)的差異性。因此，SNP在分析診斷、臨床檢驗(yàn)、法醫(yī)學(xué)、病原檢測、遺傳疾病和新藥研發(fā)等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
CYP2C19基因是人體內(nèi)一種重要的藥物代謝酶,其對藥物反應(yīng)起著關(guān)鍵性的作用,這是因?yàn)镃YP2C19基因的活性存在顯著的個(gè)體差異,表現(xiàn)為遺傳多態(tài)性,從而產(chǎn)生血藥濃度的個(gè)體差異,研究其遺傳多態(tài)性將為臨床確定最住治療劑量、制定合理用藥方案、發(fā)揮最大療效、避免和減少不良反應(yīng)提供指導(dǎo)依據(jù)。在CYP2C19基因中，CYP2C19基因的CYP2C19*2多態(tài)性和CYP2C19*3多態(tài)性在我國人群中的分布頻率分別為39.9％和6.1％，會(huì)使CYP2C19蛋白功能部分喪失，藥物在患者體內(nèi)代謝障礙蓄積性中毒。而CYP2C19基因的CYP2C19*17多態(tài)性在我國人群中的分布頻率為0.7％，其導(dǎo)致CYP2C19蛋白活性增加，藥物在患者體內(nèi)加速代謝，降低了藥物的治療效果。
目前研究發(fā)現(xiàn)，CYP2C19在人體內(nèi)參與氯吡格雷、S-美芬妥英、奧美拉唑、伏立康唑、安定、去甲安定等藥物的代謝。
氯吡格雷是一種抗血小板藥物，廣泛用于急性冠脈綜合征、缺血性腦血栓、閉塞性脈管炎和動(dòng)脈硬化及血栓栓塞引起的并發(fā)癥。心臟支架手術(shù)后的患者需長期服用氯目比格雷以防止支架內(nèi)再梗。氯吡格雷主要經(jīng)CYP2C19代謝活化后發(fā)揮抗血小板效應(yīng)。CYP2C19*2和CYP2C19*3突變個(gè)體應(yīng)用常規(guī)劑量的氯口比格雷后體內(nèi)活性代謝物生產(chǎn)減少，對血小板的抑制作用下降。臨床心臟病學(xué)會(huì)建議，對于CYP2C19代謝障礙患者需考慮改變治療方案。
伏立康唑是一種廣譜三哇類抗真菌藥，CYP2C19是其主要代謝酶之一。CYP2C19加速代謝與代謝障礙個(gè)體間伏立康唑的血液濃度存在顯著差異，代謝障礙個(gè)體(CYP2C19*2和CYP2C19*3突變)在應(yīng)用常規(guī)劑量藥物時(shí)可能出現(xiàn)毒副反應(yīng)，建議減少用藥劑量；加速代謝(CYP2C19*17突變)和正常代謝個(gè)體可給予常規(guī)劑量。在常規(guī)劑量治療時(shí)，若加速代謝個(gè)體出現(xiàn)毒副反應(yīng)或代謝障礙個(gè)體療效不佳，均應(yīng)考慮更換藥物。美國FDA指出個(gè)體應(yīng)用伏立康唑前需檢測CYP2C19基因型，以確保用藥安全。
由上述可見，CYP2C19的活性在在臨床指導(dǎo)用藥上具有非常廣泛的作用，而CYP2C19多態(tài)性的檢測凸顯其重要性。目前用于檢測一般采用直接測序或定性PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))檢測技術(shù)檢測CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性、CYP2C19*3多態(tài)性和CYP2C 19*17多態(tài)性。直接測序和定性PCR電泳鑒定檢測的靈敏度和特異性均不高，不能準(zhǔn)確檢測出CYP2C19基因多態(tài)性，不利于預(yù)測藥物療效及指導(dǎo)藥物選擇性用藥。另外，直接測序目前大多采用外包實(shí)驗(yàn)，檢測時(shí)間過長，一般需要48小時(shí)以上，為快速檢測CYP2C19基因多態(tài)性帶來不便。因此臨床治療中，迫切需要一種能夠快速檢測CYP2C19多個(gè)SNP位點(diǎn)的類型，且不需要測序，特異性高的檢測探針，快速得到準(zhǔn)確的SNP結(jié)果，知道后續(xù)臨床治療。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種人CYP2C19基因SNP的檢測探針，其中，所述檢測探針由特異性上、下游引物、特異性野生型Taqman熒光探針和特異性突變型Taqman熒光探針組成，所述CYP2C19基因SNP位點(diǎn)由CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17三個(gè)位點(diǎn)構(gòu)成，所述檢測探針至少檢測所述SNP位點(diǎn)中的一組SNP；所述檢測探針的特異性上、下游引物、特異性野生型Taqman熒光探針和特異性突變型Taqman熒光探針至少為以下一組：
組1：所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特異性上游引物的序列為序列表中SEQ ID NO:1；
所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特異性下游引物的序列為序列表中SEQ ID NO:2；
所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特異性野生型Taqman熒光探針的序列為序列表中SEQ ID NO:3；
所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特異性突變型Taqman熒光探針的序列為序列表中SEQ ID NO:4；
組2：所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特異性上游引物序列為序列表中SEQ ID NO:5；
所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特異性下游引物序列為序列表中SEQ ID NO:6；
所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特異性野生型Taqman熒光探針的序列為序列表中SEQ ID NO:7；
所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特異性突變型Taqman熒光探針的序列為序列表中SEQ ID NO:8；
組3：所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特異性上游引物序列為序列表中SEQ ID NO:9；
所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特異性下游引物序列為序列表中SEQ ID NO:10；
所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特異性野生型Taqman熒光探針的序列為序列表中SEQ ID NO:11；
所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特異性突變型Taqman熒光探針的序列為序列表中SEQ ID NO:12；
優(yōu)選任意兩組，更優(yōu)選三組。
所述特異性野生型Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)I,3’端連接有熒光淬滅基團(tuán)III；
所述特異性突變型Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)II,3’端連接有熒光淬滅基團(tuán)III，所述I和II為不相同的熒光報(bào)告基團(tuán)。
熒光報(bào)告基團(tuán)I和II可以選自CY5、JOE、ROX、HEX、VIC等商用探針熒光報(bào)告基團(tuán)，熒光萃滅基團(tuán)選自MGB、TAMRA和BHQ等常見商用熒光萃滅基團(tuán)；所屬I和II不能為相同的熒光基團(tuán)。(可參見Lakowicz,JR(2006).Principles of fluorescence spectroscopy(3rd ed.).Springer.)
優(yōu)選地，本發(fā)明還提供一種人CYP2C19基因SNP的檢測探針，其中，所述熒光報(bào)告基團(tuán)I為CY5,熒光報(bào)告基團(tuán)II為JOE，所述熒光淬滅基團(tuán)III為MGB。
即所述特異性野生型Taquman熒光探針的5’端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)CY5,3’端連接有熒光淬滅基團(tuán)MGB；
所述特異性突變型Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)JOE,3’端連接有熒光淬滅基團(tuán)MGB。
CY5
Cyanine dyes 5，菁類染料5，波長670nm
JOE
Carboxy-4',5'-dichloro-2'，7'-dimethoxyfluorescein，羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基熒光素，波長548nm
MGB
Minor groove binder oligo deoxynucleotide conjugate，低聚糖脫氧核苷酸共軛小溝粘合劑，不發(fā)光。
ROX
ROX Roxithromycin，羅丹明熒光染料，波長602nm。
HEX
Hexachloro fluorescein，六氯－6－甲基熒光素，波長556nm。
TAMRA
Carboxytetramethylrhodamine，6-羧基四甲基羅丹明，波長576nm
CYP指人細(xì)胞色素酶家族，2C19指基因名稱，*2等位基因上的核苷酸位點(diǎn)，CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17分別代表細(xì)胞色素酶家族2C19等位基因3個(gè)SNP位點(diǎn)
這種檢測引物可以同時(shí)對CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17的SNP情況進(jìn)行檢測，快速得到所需的結(jié)果。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種人CYP2C19基因SNP的檢測探針，其中，所述檢測探針檢測所述SNP位點(diǎn)中的兩組SNP；所述特異性上、下游引物、特異性野生型Taqman熒光探針和特異性突變型Taqman熒光探針為以下任意兩組：
組1：所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特異性上游引物的序列為序列表中SEQ ID NO:1；所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特異性下游引物的序列為序列表中SEQ ID NO:2；
所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特異性野生型Taqman熒光探針的序列為序列表中SEQ ID NO:3；
所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特異性突變型Taqman熒光探針的序列為序列表中SEQ ID NO:4；
組2：所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特異性上游引物序列為序列表中SEQ ID NO:5；
所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特異性下游引物序列為序列表中SEQ ID NO:6；
所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特異性野生型Taqman熒光探針的序列為序列表中SEQ ID NO:7；
所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特異性突變型Taqman熒光探針的序列為序列表中SEQ ID NO:8；
組3：所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特異性上游引物序列為序列表中SEQ ID NO:9；
所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特異性下游引物序列為序列表中SEQ ID NO:10；
所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特異性野生型Taqman熒光探針的序列為序列表中SEQ ID NO:11；
所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特異性突變型Taqman熒光探針的序列為序列表中SEQ ID NO:12；
所述特異性野生型Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)I,3’端連接有熒光淬滅基團(tuán)III；
所述特異性突變型Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)II,3’端連接有熒光淬滅基團(tuán)III，所述I和II為不相同的熒光報(bào)告基團(tuán)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種人CYP2C19基因SNP的檢測探針，其中，所述檢測探針檢測所述SNP位點(diǎn)中的三組SNP；所述檢測探針的特異性上、下游引物、特異性野生型Taqman熒光探針和特異性突變型Taqman熒光探針為以下三組：
組1：所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特異性上游引物的序列為序列表中SEQ ID NO:1；所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特異性下游引物的序列為序列表中SEQ ID NO:2；
所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特異性野生型Taqman熒光探針的序列為序列表中SEQ ID NO:3；
所述CYP2C19基因CYP2C19*2的特異性突變型Taqman熒光探針的序列為序列表中SEQ ID NO:4；
組2：所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特異性上游引物序列為序列表中SEQ ID NO:5；
所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特異性下游引物序列為序列表中SEQ ID NO:6；
所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特異性野生型Taqman熒光探針的序列為序列表中SEQ ID NO:7；
所述CYP2C19基因CYP2C19*3的特異性突變型Taqman熒光探針的序列為序列表中SEQ ID NO:8；
組3：所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特異性上游引物序列為序列表中SEQ IDNO:9；
所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特異性下游引物序列為序列表中SEQ ID NO:10；
所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特異性野生型Taqman熒光探針的序列為序列表中SEQ ID NO:11；
所述CYP2C19基因CYP2C19*17的特異性突變型Taqman熒光探針的序列為序列表中SEQ ID NO:12；
所述特異性野生型Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)I,3’端連接有熒光淬滅基團(tuán)III；
所述特異性突變型Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)II,3’端連接有熒光淬滅基團(tuán)III，所述I和II為不相同的熒光報(bào)告基團(tuán)。
雖然臨床上常用了只有CYP2C19*2、CYP2C19*3的SNP檢測，但CYP2C19*17在中國人群SNP突變率不高，但三種SNP同時(shí)檢測，可以減小漏檢率，且使本發(fā)明的應(yīng)用更具有國際化視野。
本發(fā)明還提供一種檢測探針在CYP2C19基因SNP檢測中的應(yīng)用，其中，所述應(yīng)用包含以下步驟：
1)使用基因組提取方法提取受檢者的基因組DNA；
2)使用熒光定量PCR反應(yīng)試劑或者熒光定量PCR反應(yīng)試劑的混合物配置熒光定量PCR反應(yīng)體系，所述熒光定量PCR反應(yīng)體系含有：PCR預(yù)混合液、Mg2+、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、DNA聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)和水；
3)合成所述CYP2C19相關(guān)的所述特異性上、下游引物、特異性野生型Taqman熒光探針和特異性突變型Taqman熒光探針，向步驟2中的一個(gè)熒光定量PCR反應(yīng)體系加入步驟1所述的基因組DNA和所述特異性上、下游引物、特異性野生型Taqman熒光探針和特異性突變型Taqman熒光探針的一組；
4)啟動(dòng)PCR擴(kuò)增程序，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得擴(kuò)增數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，即可獲得SNP檢測結(jié)果。
其中基因組提取方法優(yōu)選實(shí)驗(yàn)室經(jīng)典基因組提取方法或商用試劑盒提取法。
DNA聚合酶優(yōu)選Hot-Start Taq酶。其中dATP、dCTP、dGTP、dTTP可以混合為dNTP混合液進(jìn)行使用。
步驟三中每一組PCR反應(yīng)體系分別加入一組所述特異性上、下游引物、特異性野生型Taqman熒光探針和特異性突變型Taqman熒光探針。即以步驟1得到的基因組DNA為模板，采用如序列表中SEQ ID NO:1所示的上游引物、如序列表中SEQ ID NO:2所示的下游引物和如序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的Taqman熒光探針，或?qū)YP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增；以步驟1得到的基因組DNA為模板，采用如序列表中SEQ ID NO:5所示的上游引物、如序列表中SEQ ID NO:6所示的下游引物和如序列表中SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的Taqman熒光探針，或?qū)YP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增；以步驟1得到的基因組DNA為模板，采用如序列表中SEQ ID NO:9所示的上游引物、如序列表中SEQ ID NO:10所示的下游引物和如序列表中SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的Taqman熒光探針，對CYP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增；其中所述步驟二中的熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件相同。
所述熒光定量PCR反應(yīng)體系中組分及終濃度進(jìn)一步優(yōu)選如下：PCR反應(yīng)預(yù)混合液、2.5-4.0mM的Mg2+、0.2-0.4mM的dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)的混合物、0.3-0.6mM的dUTP、0.1-0.2U/μL Hot-Start Taq酶、和0.01-0.05U/μL的尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)。
所述PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃，5分鐘預(yù)變性，然后95℃，15秒,62℃，35秒擴(kuò)增，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束采集I和II熒光訊號，優(yōu)選CY5和JOE熒光。
本發(fā)明的創(chuàng)造點(diǎn)為：
(1)敏感性高：由于人基因組DNA整體差異較小，引物匹配率較高，通過PCR反應(yīng)放大后再用較靈敏的熒光采集系統(tǒng)，能夠在極微量基因組DNA存在情況下檢測出CYP2C19基因中CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17多態(tài)性。
(2)特異性強(qiáng)：使用特異性雙探針對SNP變異進(jìn)行識別，同時(shí)Taqman探針用MGB修飾后大大提高探針的Tm值，增加了其信噪比，MGB信噪比為6～10，普通修飾的探針信噪比只有1.5左右，所以MGB修飾的探針具有更低的熒光背景，更高的退火Tm值。
(3)PCR反應(yīng)試劑中加入dUTP和UNG酶，可以防止PCR擴(kuò)增模板氣溶膠的污染。同時(shí)擴(kuò)增和檢測在同一管中進(jìn)行，只需加開蓋加一次模板DNA，大大降低了污染的可能性；擴(kuò)增和檢測一步完成，不需后期特殊處理，不必?fù)?dān)心放射性污染。
(4)結(jié)果分析簡單：該方法中只有檢測基因SNP的兩條特異性Taqman探針，不需要內(nèi)參，降低了PCR反應(yīng)體系中引物和探針的復(fù)雜程度，進(jìn)一步提高定性判斷SNP突變的準(zhǔn)確性。
(5)檢測快速：PCR反應(yīng)時(shí)間短，同時(shí)檢測通量較高，可在3小時(shí)內(nèi)完成檢測。
綜上所述，本發(fā)明所提供的檢測探針具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和限制的進(jìn)步，具有專利法所規(guī)定的創(chuàng)造性。
具體實(shí)施方式
為進(jìn)一步闡明本技術(shù)方法，以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說明。未注明具體條件的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法，請參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊》(第三版)(科學(xué)出版社，2002)軟件或試劑盒請按照廠家提供的建議或說明書。
實(shí)施例1
CYP2C19基因來源于NCBI GenBank，參考序列號為NG 008384.2。
因SNP檢測是其基因組上的序列，但基因組上的CYP2C19基因有內(nèi)含子，序列分布較廣，約有90000bp長度，下面只列出CYP2C19基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄加工后的mRNA序列，1709bp，序列如下：
GTCTTAACAAGAGGAGAAGGCTTCAATGGATCCTTTTGTGGTCCTTGTGCTCTGTCTCTCATGTTTGCTTCTCCTTTCAATCTGGAGACAGAGCTCTGGGAGAGGAAAACTCCCTCCTGGCCCCACTCCTCTCCCAGTGATTGGAAATATCCTACAGATAGATATTAAGGATGTCAGCAAATCCTTAACCAATCTCTCAAAAATCTATGGCCCTGTGTTCACTCTGTATTTTGGCCTGGAACGCATGGTGGTGCTGCATGGATATGAAGTGGTGAAGGAAGCCCTGATTGATCTTGGAGAGGAGTTTTCTGGAAGAGGCCATTTCCCACTGGCTGAAAGAGCTAACAGAGGATTTGGAATCGTTTTCAGCAATGGAAAGAGATGGAAGGAGATCCGGCGTTTCTCCCTCATGACGCTGCGGAATTTTGGGATGGGGAAGAGGAGCATTGAGGACCGTGTTCAAGAGGAAGCCCGCTGCCTTGTGGAGGAGTTGAGAAAAACCAAGGCTTCACCCTGTGATCCCACTTTCATCCTGGGCTGTGCTCCCTGCAATGTGATCTGCTCCATTATTTTCCAGAAACGTTTCGATTATAAAGATCAGCAATTTCTTAACTTGATGGAAAAATTGAATGAAAACATCAGGATTGTAAGCACCCCCTGGATCCAGATATGCAATAATTTTCCCACTATCATTGATTATTTCCCGGGAACCCATAACAAATTACTTAAAAACCTTGCTTTTATGGAAAGTGATATTTTGGAGAAAGTAAAAGAACACCAAGAATCGATGGACATCAACAACCCTCGGGACTTTATTGATTGCTTCCTGATCAAAATGGAGAAGGAAAAGCAAAACCAACAGTCTGAATTCACTATTGAAAACTTGGTAATCACTGCAGCTGACTTACTTGGAGCTGGGACAGAGACAACAAGCACAACCCTGAGATATGCTCTCCTTCTCCTGCTGAAGCACCCAGAGGTCACAGCTAAAGTCCAGGAAGAGATTGAACGTGTCATTGGCAGAAACCGGAGCCCCTGCATGCAGGACAGGGGCCACATGCCCTACACAGATGCTGTGGTGCACGAGGTCCAGAGATACATCGACCTCATCCCCACCAGCCTGCCCCATGCAGTGACCTGTGACGTTAAATTCAGAAACTACCTCATTCCCAAGGGCACAACCATATTAACTTCCCTCACTTCTGTGCTACATGACAACAAAGAATTTCCCAACCCAGAGATGTTTGACCCTCGTCACTTTCTGGATGAAGGTGGAAATTTTAAGAAAAGTAACTACTTCATGCCTTTCTCAGCAGGAAAACGGATTTGTGTGGGAGAGGGCCTGGCCCGCATGGAGCTGTTTTTATTCCTGACCTTCATTTTACAGAACTTTAACCTGAAATCTCTGATTGACCCAAAGGACCTTGACACAACTCCTGTTGTCAATGGATTTGCTTCTGTCCCGCCCTTCTATCAGCTGTGCTTCATTCCTGTCTGAAGAAGCACAGATGGTCTGGCTGCTCCTGTGCTGTCCCTGCAGCTCTCTTTCCTCTGGTCCAAATTTCACTATCTGTGATGCTTCTTCTGACCCGTCATCTCACATTTTCCCTTCCCCCAAGATCTAGTGAACATTCAGCCTCCATTAAAAAAGTTTCACTGTGCAAATATATCTGCTATTCCCCATACTCTATAATAGTTACATTGAGTGCCACATAATGCTGATACTTGTCTAATGTTGAGTTATTAACATATTATTATTAAATAGAGAAAGATGATTTGTGTATTATAAAAAAAAAAAA
見序列表SEQ ID NO：13
采用Vector NTI 10.0核酸比對軟件和Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件分別設(shè)計(jì)引物和探針：CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性的特異性上下游引物及所述CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性的特異性野生和突變Taqman熒光探針、CYP2C19基因CYP2C19*3多態(tài)性的特異性上下游引物及所述CYP2C19基因CYP2C19*3多態(tài)性的特異性野生和突變Taqman熒光探針、CYP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性的特異性上下游引物及所述CYP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性的特異性野生和突變Taqman熒光探針。
按照軟件設(shè)計(jì)后得到引物如下：
CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性的特異性上游引物序列：
5’-CAACCAGAGCTTGGCATATTG-3’(序列表中SEQ ID N0:1所示)。
CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性的特異性下游引物序列：
5’-GTCCATCGATTCTTGGTGTTC-3’(序列表中SEQ ID N0:2所示)。
CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性的特異性野生型Taqman熒光探針序列：
5’-GATTATTTCCCGGGAACCC-3’(序列表中SEQ ID N0:3所示，其中5’端連有CY5,3’端連有MGB)。
CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性的特異性突變型Taqman熒光探針序列：
5’-GATTATTTCCCAGGAACCC-3’(序列表中SEQ ID N0:4所示，其中5’端連有JOE,3’端連有MGB)。
CYP2C19基因CYP2C19*3多態(tài)性的特異性上游引物序列：
5’-CCCTGCAATGTGATCTGCTCC-3’(序列表中SEQ ID N0:5所示)。
CYP2C19基因CYP2C19*3多態(tài)性的特異性下游引物序列：
5’-GCTGTCTAGGCAAGACTGTAG-3’(序列表中SEQ ID N0:6所示)。
CYP2C19基因CYP2C19*3多態(tài)性的特異性野生型Taqman熒光探針序列：
5’-GCACCCCCTGGATCCAGG-3’(序列表中SEQ ID N0:7所示，其中5’端連有CY5,3’端連有MGB)。
CYP2C19基因CYP2C19*3多態(tài)性的特異性突變型Taqman熒光探針序列：
5’-GCACCCCCTGAATCCAGG-3’(序列表中SEQ ID N0:8所示，其中5’端連有JOE,3’端連有MGB)。
CYP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性的特異性上游引物序列：
5’-GCTGCATGGATATGAAGTGGTG-3’(序列表中SEQ ID N0:9所示)。
CYP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性的特異性下游引物序列：
5’-CGAGAAGCTCTGCTAGTCTGTT-3’(序列表中SEQ ID N0:10所示)。
CYP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性的特異性野生型Taqman熒光探針序列：
5’-TTGGAGAGGAGTTTTCTG-3’(序列表中SEQ ID N0:11所示，其中5’端連有CY5,3’端連有MGB)。
CYP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性的特異性突變型Taqman熒光探針序列：
5’-TTGGAGAAGAGTTTTCTG-MGB-3’(序列表中SEQ ID N0:12所示，其中5’端連有JOE,3’端連有MGB)。
所有核酸序列均由上海生工合成，引物經(jīng)PAGE純化，熒光標(biāo)記探針經(jīng)HPLC純化并提供質(zhì)譜報(bào)告。
實(shí)施例2
PCR產(chǎn)物熔解曲線的單一程度可以反應(yīng)其產(chǎn)物的單一程度，產(chǎn)物單一說明引物特異性好。利用熔解曲線法來確定設(shè)計(jì)引物的特異性。
①基因組DNA提?。毫羧∈茉囌逧DTA抗凝全血0.5ml，采用Qiagen Genemic BloodKit提取全血DNA，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，提取DNA樣本-20℃保存，使用時(shí)室溫溶解并充分混勻、離心。
②實(shí)驗(yàn)所述特異性引物為CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性的特異性上游引物和下游引物(SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2)；CYP2C19基因CYP2C19*3多態(tài)性的特異性上游引物和下游引物(SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6)；CYP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性的特異性上游引物和下游引物(SEQ ID N0:9和SEQ ID N0:10)。
PCR反應(yīng)體系采用2×Takara SYBR PreMix，0.2uM正向和反向引物，0.2U Taq DNA聚合酶，直接加入1～2ul模板DNA樣本，用水補(bǔ)足50ul。
反應(yīng)條件：95℃5分鐘；95℃20秒，60℃40秒×5循環(huán)；95℃15秒，60℃35秒(采光)×35循環(huán)；70℃～95℃熔解曲線。
③實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
1.CYP2C19*2引物擴(kuò)增曲線及熔解曲線
擴(kuò)增曲線良好，熔解曲線單一平滑，說明擴(kuò)增產(chǎn)物單一，引物特異性良好。
2.CYP2C19*3引物擴(kuò)增曲線及熔解曲線
擴(kuò)增曲線良好，熔解曲線單一平滑，說明擴(kuò)增產(chǎn)物單一，引物特異性良好。
3.CYP2C19*17引物擴(kuò)增曲線及熔解曲線
擴(kuò)增曲線良好，熔解曲線單一平滑，說明擴(kuò)增產(chǎn)物單一，引物特異性良好。
實(shí)施例3
以隨機(jī)選取8份受試者外周全血樣本為例。
用本發(fā)明方法檢測某一受檢者的CYP2C19*2基因多態(tài)性、CYP2C19*3基因多態(tài)性和CYP2C 19*17基因多態(tài)性的檢測流程為：首先獲取臨床受檢者外周血樣本,快速提取基因組DNA；接下來再配制CYP2C19*2基因多態(tài)性、CYP2C19*3基因多態(tài)性和CYP2C19*17基因多態(tài)性的熒光定量PCR反應(yīng)液，進(jìn)行熒光定量PCR檢測樣品，在熒光定量PCR儀采集CY5和JOE的熒光信號，僅有CY5標(biāo)記的Taqman探針擴(kuò)增是野生型，僅有JOE標(biāo)記的Taqman探針擴(kuò)增是突變型，既有CY5標(biāo)記的Taqman探針擴(kuò)增又有JOE標(biāo)記的Taqman探針擴(kuò)增是雜合型，所以樣本總會(huì)有陽性探針擴(kuò)增，不需要再單加內(nèi)參。
具體步驟：
步驟1：提取受檢者外周血樣本基因組DNA；
步驟2：以步驟1得到的基因組DNA為模板，采用如序列表中SEQ ID NO:1所示的上游引物、如序列表中SEQ ID NO:2所示的下游引物和如序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的Taqman熒光探針，或?qū)YP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增；以步驟1得到的基因組DNA為模板，采用如序列表中SEQ ID NO:5所示的上游引物、如序列表中SEQ ID NO:6所示的下游引物和如序列表中SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的Taqman熒光探針，或?qū)YP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增；以步驟1得到的基因組DNA為模板，采用如序列表中SEQ IDNO:9所示的上游引物、如序列表中SEQ ID NO:10所示的下游引物和如序列表中SEQID NO:11和SEQ ID NO:12所示的Taqman熒光探針，對CYP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增；
PCR反應(yīng)體系首選為：4.0mM的Mg2+、0.2mM的dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)的混合物、0.3mM的dUTP、0.1U/μL Hot-Start Taq酶、和0.05U/μL的尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)加入1～2ul模板DNA樣本，加入一組CYP2C19的SNP檢測探針，用水補(bǔ)足50ul。(所加入的基因組模板的具體含量和引物的具體含量，可根據(jù)基因組抽提試劑盒要求和引物制備廠家要求進(jìn)行添加。屬于本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)。)
PCR反應(yīng)條件首選為：95℃，5分鐘預(yù)變性，然后95℃，15秒,62℃，35秒擴(kuò)增，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束采集熒光訊號，優(yōu)選CY5和JOE熒光。
根據(jù)所示CYP2C19*2基因多態(tài)性Taqman雙探針檢測擴(kuò)增曲線、CYP2C19*3基因多態(tài)性Taqman雙探針檢測擴(kuò)增曲線和CYP2C19*17基因多態(tài)性Taqman雙探針檢測擴(kuò)增曲線分析結(jié)果與測序比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用本發(fā)明提供的檢測探針，檢測SNP結(jié)果的正確率為100％。
表1 8份全血樣本CYP2C19基因多態(tài)性檢測結(jié)果分析
*1/*1表示野生型純合子，*1/*2表示雜合子，*2/*2為完全突變型。
以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制，應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改造，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京一立科技發(fā)展有限公司
<120> 一種人CYP2C19基因SNP的檢測探針及其應(yīng)用
<130> 0
<160> 13
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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caaccagagc ttggcatatt g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gtccatcgat tcttggtgtt c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gattatttcc cgggaaccc 19
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<211> 19
<212> DNA
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gattatttcc caggaaccc 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gctgtctagg caagactgta g 21
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gcaccccctg aatccagg 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gctgcatgga tatgaagtgg tg 22
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<211> 22
<212> DNA
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<400> 10
cgagaagctc tgctagtctg tt 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ttggagagga gttttctg 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ttggagaaga gttttctg 18
<210> 13
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
gtcttaacaa gaggagaagg cttcaatgga tccttttgtg gtccttgtgc tctgtctctc 60
atgtttgctt ctcctttcaa tctggagaca gagctctggg agaggaaaac tccctcctgg 120
ccccactcct ctcccagtga ttggaaatat cctacagata gatattaagg atgtcagcaa 180
atccttaacc aatctctcaa aaatctatgg ccctgtgttc actctgtatt ttggcctgga 240
acgcatggtg gtgctgcatg gatatgaagt ggtgaaggaa gccctgattg atcttggaga 300
ggagttttct ggaagaggcc atttcccact ggctgaaaga gctaacagag gatttggaat 360
cgttttcagc aatggaaaga gatggaagga gatccggcgt ttctccctca tgacgctgcg 420
gaattttggg atggggaaga ggagcattga ggaccgtgtt caagaggaag cccgctgcct 480
tgtggaggag ttgagaaaaa ccaaggcttc accctgtgat cccactttca tcctgggctg 540
tgctccctgc aatgtgatct gctccattat tttccagaaa cgtttcgatt ataaagatca 600
gcaatttctt aacttgatgg aaaaattgaa tgaaaacatc aggattgtaa gcaccccctg 660
gatccagata tgcaataatt ttcccactat cattgattat ttcccgggaa cccataacaa 720
attacttaaa aaccttgctt ttatggaaag tgatattttg gagaaagtaa aagaacacca 780
agaatcgatg gacatcaaca accctcggga ctttattgat tgcttcctga tcaaaatgga 840
gaaggaaaag caaaaccaac agtctgaatt cactattgaa aacttggtaa tcactgcagc 900
tgacttactt ggagctggga cagagacaac aagcacaacc ctgagatatg ctctccttct 960
cctgctgaag cacccagagg tcacagctaa agtccaggaa gagattgaac gtgtcattgg 1020
cagaaaccgg agcccctgca tgcaggacag gggccacatg ccctacacag atgctgtggt 1080
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tgacgttaaa ttcagaaact acctcattcc caagggcaca accatattaa cttccctcac 1200
ttctgtgcta catgacaaca aagaatttcc caacccagag atgtttgacc ctcgtcactt 1260
tctggatgaa ggtggaaatt ttaagaaaag taactacttc atgcctttct cagcaggaaa 1320
acggatttgt gtgggagagg gcctggcccg catggagctg tttttattcc tgaccttcat 1380
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aagcacagat ggtctggctg ctcctgtgct gtccctgcag ctctctttcc tctggtccaa 1560
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ttattaacat attattatta aatagagaaa gatgatttgt gtattataaa aaaaaaaaa 1799