本發(fā)明涉及一種花生焦斑病菌分子檢測引物及其快速檢測方法，屬于農(nóng)作物病害檢測和生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

花生是世界范圍內(nèi)廣泛栽培和種植的經(jīng)濟(jì)作物，是發(fā)展中國家重要的食用植物油脂的蛋白質(zhì)來源。我國花生種植面積居世界第2位，年總產(chǎn)一直穩(wěn)居世界第1位，花生油也是我國主要的食用植物油。近年來，隨著我國高產(chǎn)花生品種的推廣、農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和豐產(chǎn)栽培措施的應(yīng)用，花生病害日趨嚴(yán)重，已成為限制花生生產(chǎn)的重要影響因素之一。

花生焦斑?。↙eptosphaerulina crassiasca）是花生上廣泛純在的一種病害，在很多國家都有發(fā)生。該病主要為害花生葉片，也為害花生葉柄、莖、果柄和莢果，在葉片上通常產(chǎn)生焦斑和胡麻斑兩種類型的癥狀，其中焦斑癥狀最為常見，通常發(fā)生在葉尖和葉緣。病斑擴(kuò)展的邊緣有一明亮的黃帶，壞死組織變成暗褐色，病斑常呈現(xiàn)楔形、半圓形和不規(guī)則形，在葉片中部發(fā)病病斑多呈圓形或近圓形或不規(guī)則的褐色病斑?；ㄉl(fā)病后葉片早衰、早落，嚴(yán)重影響光合效能，造成莢果不飽滿，重者整株枯死，導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降。該病在田間的病株率一般在30%以上，嚴(yán)重可達(dá)100%，該病害的病還癥狀與花生褐斑病、花生炭疽病相似，沒有專業(yè)知識難以判斷區(qū)分。

以癥狀為基礎(chǔ)的病害常規(guī)診斷技術(shù)，需要采用柯赫氏法則經(jīng)過病原菌分離培養(yǎng)、病原菌鑒定、接菌、癥狀分析等步驟，耗時長、效率低、準(zhǔn)確性差，難以做到病害發(fā)生時及時檢測和有效控制病原菌的傳播和病害流行，難以滿足花生焦斑病診斷的實(shí)際需要，因此迫切需要建立一套方便快捷、結(jié)果可靠、靈敏度高的快速診斷技術(shù)。近年來，分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速，隨著分子生物學(xué)技術(shù)在植物病理學(xué)科不斷發(fā)展和應(yīng)用，一些分子標(biāo)記技術(shù)為植物病原菌的診斷檢測提供了新的途徑，其中PCR（polymerase chain reaction）技術(shù)以特異性強(qiáng)、靈敏度高、方便快捷等特點(diǎn)被用于植物病原菌的診斷。真菌核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer, ITS）序列種內(nèi)的保守性和科屬種間可變性的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR，對病原菌進(jìn)行快速檢測和鑒定的技術(shù)已受到廣泛的應(yīng)用，國內(nèi)外研究人員已成功開發(fā)出大豆疫霉、辣椒疫霉、柑橘潰瘍病菌、甘薯黑斑病菌和玉米南方銹病菌等多種病原菌的特異性引物和檢測方法，實(shí)現(xiàn)了快速、靈敏和準(zhǔn)確的鑒定。但目前有關(guān)花生焦斑病菌分子檢測的研究尚未見報道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中對花生焦斑病菌的檢測和鑒定主要基于病原形態(tài)學(xué)特征，程序繁瑣、耗死長、對鑒定經(jīng)驗(yàn)要求高、準(zhǔn)確度低，難以滿足花生焦斑病診斷的實(shí)際需要問題，提供了一種花生焦斑病菌分子檢測引物及其快速檢測方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：

本發(fā)明首先提供了一種花生焦斑病菌分子檢測引物，其核苷酸序列為：

上游引物L(fēng)CSF：5’-GAGATGTACTGCGCTCCGAA-3’；

下游引物L(fēng)CSR：5’-ACTTACGTTTCCTCGGCGG-3’。

所述引物L(fēng)CSF和LCSR對花生焦斑病菌特異性擴(kuò)增出355bp的產(chǎn)物。

本發(fā)明還提供了一種花生焦斑病菌的快速檢測方法，包括以下步驟：

(1)從花生植株中提取DNA；

用于檢測病原菌純培養(yǎng)物時，采用 CTAB 法提取供試菌株基因組 DNA；用于檢測花生植株組織是否存在花生焦斑病菌時，采用NaOH 快速裂解法提取花生植株組織基因組DNA。

(2) 以提取花生植株DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的LCSF和LCSR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達(dá)25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45sec，57℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35個循環(huán)；72℃延伸10min；

(3)上步所得的PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上用0.5×TBE緩沖液電泳分析，電壓為4-5V/cm；根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定檢測結(jié)果，如果能特異性擴(kuò)增出355bp的產(chǎn)物，則可判定所述病菌為花生焦斑病菌或所述花生植株中存在花生焦斑病菌，否則所述病菌非花生焦斑病菌或所述的花生植株中不存在花生焦斑病菌。

本發(fā)明的積極有益效果在于：

（1）準(zhǔn)確性高：本發(fā)明是根據(jù)真菌核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）序列在真菌種內(nèi)的高度保守性和科屬種間可變性的特點(diǎn)設(shè)計(jì)對花生焦斑病菌具有特異擴(kuò)增作用的PCR 引物。已經(jīng)對不同地理來源的花生焦斑病菌、攜帶花生焦斑病菌的植物組織和健康的花生組織進(jìn)行了檢測驗(yàn)證，只有花生焦斑病菌和攜帶該病菌的花生組織中能特異性地擴(kuò)增出一條355 bp 的電泳條帶，說明本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物用于檢測花生焦斑病菌準(zhǔn)確可靠；

（2）特異性強(qiáng)：本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物對花生焦斑病菌具有很強(qiáng)的特異性，能夠用于區(qū)別花生焦斑病菌、花生褐斑病菌、花生網(wǎng)斑病菌及花生炭疽病菌等花生上常見的病原菌，從而能有效區(qū)分發(fā)生在花生上癥狀特征相似的病害；

（3）靈敏度高：本發(fā)明將設(shè)計(jì)的特異引物與ITS 基因通用引物（ITS1/ITS4）聯(lián)合起來進(jìn)行巢式PCR 擴(kuò)增后，對花生焦斑病菌的檢測靈敏度在DNA 水平上可達(dá)到10 fg；

（4）適用性廣、實(shí)用性好：本發(fā)明的花生焦斑病菌的檢測方法，不僅能對病菌菌絲體進(jìn)行檢測，也能對感病的花生組織進(jìn)行檢測，可實(shí)現(xiàn)花生焦斑病菌的早期檢測，即在病害顯癥前進(jìn)行檢測，防治病害的爆發(fā)流行。

（5）、操作簡便快速：本發(fā)明只需進(jìn)行DNA 提取、PCR 擴(kuò)增和瓊脂糖電泳后即可判定結(jié)果，一般整個檢測過程可在數(shù)小時內(nèi)完成，操作簡便快捷。

附圖說明

圖1為本發(fā)明引物對花生焦斑病菌特異性擴(kuò)增電泳圖：其中泳道M為2000bp DNA Marker，泳道2、泳道3為花生焦斑病菌，泳道4-10分別為：花生褐斑病菌、花生黑斑病菌、花生炭疽病菌、花生網(wǎng)斑病菌、花生根腐病菌、花生菌核病菌、陰性對照。

圖2為本發(fā)明引物花生焦斑病菌的靈敏性檢測擴(kuò)增電泳圖：A：普通PCR靈敏度檢測，其中泳道M為2000bp DNA Marker，泳道2-12分別為：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、陰性對照、陽性對照；B為巢式PCR靈敏度檢測，其中泳道M為2000bp DNA Marker，泳道2-13分別為：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、100ag、陰性對照、陽性對照；

圖3為本發(fā)明花生發(fā)病組織DNA擴(kuò)增電泳圖，其中泳道M為2000bp DNA Marker，泳道2-10分別為自然發(fā)病的花生葉片組織、自然發(fā)病花生葉柄組織、人工接種發(fā)病的花生葉片組織、人工接種發(fā)病花生葉柄組織、健康花生葉片組織、健康花生葉柄組織、健康花生莖稈組織、陰性對照、陽性對照。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明所述的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明。

下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例1 分子檢測引物設(shè)計(jì)及花生焦斑病菌特異分子檢測方法的建立

1.花生焦斑病菌基因組DNA的提?。?/p>

采用 CTAB 法提取本實(shí)驗(yàn)室保存的5株花生焦斑病菌的基因組 DNA，具體步驟如下：

(1)取0.1 g菌絲粉于1.5 mL 離心管中，加入900 μL2%CTAB提取液，使用振蕩器振蕩混勻，60℃水浴60min，室溫條件下，12000r/min離心15 min；

(2)取上清液700 μL，加等體積酚、氯仿、異戊醇混合液（各體積比為25:24:1），溫和搖動，室溫條件下，8000 r/min離心10min ；

(3)取上清液500 μL，加入等體積氯仿再抽提一次，室溫條件下，8000 r/min離心10min；

(4)取上清液350 μL，加入1/10 體積3 mol/L NaAc 和2倍體積無水乙醇，-20℃沉淀60 min，4℃條件下，8000 r/min離心5 min ；

(5)棄去上清液，加入700μL 體積濃度為70%冰乙醇，輕搖10sec，4℃條件下，8000 r/min離心10sec，晾干，加入50 μL TE緩沖液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.花生焦斑病菌ITS序列測定：

以真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS） 通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' 為引物對提取花生焦斑病菌的DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系和反應(yīng)程序?yàn)椋篜CR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶（Takara 大連寶生物工程有限公司），10μmol/L的TIS1和ITS4各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達(dá)25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1 min，55℃退火45sec，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃延伸10min；所得PCR產(chǎn)物送大連寶生物工程有限公司測序。

3.花生焦斑病菌特異分子檢測引物的設(shè)計(jì)：

根據(jù)花生焦斑病菌核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）序列在真菌種間高度變異和種內(nèi)穩(wěn)定性，用Clustal X軟件將測序得到的5株花生焦斑病菌的ITS 序列與GenBank 中Leptosphaerulina屬不同種的ITS序列、花生褐斑病菌ITS 序列、花生炭疽病菌ITS 序列進(jìn)行同源性分析和差異位點(diǎn)比較，用Primer Primer5軟件設(shè)計(jì)了對花生焦斑病菌具有特異性擴(kuò)增作用的一對PCR引物(由上海生工生物工程有限公司合成)，即特異分子檢測引物的序列為：

上游引物L(fēng)CSF：5’-GAGATGTACTGCGCTCCGAA-3’；

下游引物L(fēng)CSR：5’-ACTTACGTTTCCTCGGCGG-3’

4.花生焦斑病菌快速分子檢測方法的建立：

(1)從花生植株中提取DNA:

①用于檢測病原菌純培養(yǎng)物時，采用 CTAB 法提取供試菌株基因組 DNA；

②用于檢測花生植株組織是否存在花生焦斑病菌時，采用NaOH 快速裂解法提取花生植株組織基因組DNA，具體步驟如下：

a.稱取待檢測的植物組織0.1 g，加入0.5 mol/L NaOH 30 μL，將組織充分磨碎成糊；

b.將糊狀組織轉(zhuǎn)入1.5 mL 離心管中，12000r/min 離心6 min，取上清液5 μl

c.上清液中加入495μL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0），混合均勻，取1.0 μL 作為PCR 模板進(jìn)行擴(kuò)增；

(2) 以提取花生植株DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的LCSF和LCSR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達(dá)25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45sec，57℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35個循環(huán)；72℃延伸10min；

(3)上步所得的PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上用0.5×TBE緩沖液電泳分析，電壓為4-5V/cm；根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定檢測結(jié)果，如果能特異性擴(kuò)增出355bp的產(chǎn)物，則可判定所述的病菌是花生焦斑病菌或花生植株中存在花生焦斑病菌，否則所述的病菌非花生焦斑病菌或花生植株中不存在花生焦斑病菌。

實(shí)施例2 花生焦斑病菌特異性擴(kuò)增

1.采用CTAB 法提取2株花生焦斑病菌、花生褐斑病菌、花生黑斑病菌、花生炭疽病菌、花生網(wǎng)斑病菌、花生根腐病菌、花生菌核病菌的基因組DNA。

2. 以提取供試菌的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的LCSF和LCSR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達(dá)25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45sec，57℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35個循環(huán)；72℃延伸10min；電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。

3.特異性擴(kuò)增結(jié)果

如圖1所示，2株花生焦斑病菌可以特異性擴(kuò)增出355bp的條帶，而花生褐斑病菌、花生黑斑病菌、花生炭疽病菌、花生網(wǎng)斑病菌、花生根腐病菌、花生菌核病菌和陰性對照均無擴(kuò)增條帶，表明本發(fā)明的分子檢測引物可以將花生焦斑病菌與其他病原菌區(qū)分開來，具有很強(qiáng)的特異性，本發(fā)明的檢測方法可用于花生焦斑病菌的特異性擴(kuò)增。

實(shí)施例3本發(fā)明引物對花生焦斑病菌的靈敏性檢測

1.采用CTAB 法提取花生焦斑病菌的基因組DNA；

2.將提取的花生焦斑病菌的基因組DNA，經(jīng)分光光度計(jì)測定濃度后，用無菌超純水稀釋，配制成系列濃度，備用；

3. 以配制的成系列濃度DNA為模板進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的LCSF和LCSR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達(dá)25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45sec，57℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35個循環(huán)；72℃延伸10min；電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。

4. 以配制的成系列濃度DNA為模板進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增：

（1）第一輪PCR 擴(kuò)增：以真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS） 通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3' 為外引物對配制的成系列濃度DNA 進(jìn)行第一輪PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系和反應(yīng)程序?yàn)椋篜CR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶（Takara 大連寶生物工程有限公司），10μmol/L的TIS1和ITS4各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達(dá)25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1 min，55℃退火45sec，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃延伸10min；

（2）第二輪PCR擴(kuò)增：以第一輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板，以LCSF/LCSR為引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的LCSF和LCSR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達(dá)25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45sec，57℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35個循環(huán)；72℃延伸10min；電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。

5.檢測結(jié)果

如圖2所示，以本發(fā)明引物L(fēng)CSF/LCSR為引物進(jìn)行常規(guī)PCR時，在25μL反應(yīng)體系中，10pg的花生焦斑病菌DNA可以獲得可視條帶，其檢測靈敏度可達(dá)到10pg（圖2-A）；而進(jìn)一步以真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）的通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' 為外引物擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板，以本發(fā)明引物L(fēng)CSF/LCSR為引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增時，在25μL反應(yīng)體系中，10fg的花生焦斑病菌DNA可以獲得可視條帶，其檢測靈敏度可達(dá)到10fg(圖2-B)。

實(shí)施例4發(fā)病花生植株中花生焦斑病菌的檢測

1.采用NaOH 快速裂解法提取花生植株組織基因組DNA。

2. 以配制的成系列濃度DNA為模板進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的LCSF和LCSR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達(dá)25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45sec，57℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35個循環(huán)；72℃延伸10min；電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。

3. 檢測結(jié)果

如圖3所示，自然發(fā)病的花生葉片組織、自然發(fā)病花生葉柄組織、人工接種發(fā)病的花生葉片組織、人工接種發(fā)病花生葉柄、陽性對照中均可產(chǎn)生355bp左右的可視條帶，而健康花生葉片組織、健康的花生葉柄組織、健康花生莖稈組織、陰性對照均無任何條帶出現(xiàn)，表明本發(fā)明引物和檢測方法還可用于田間花生焦斑病發(fā)病植株的檢測。

SEQUENCE LISTING

<110>福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所

<120>一種花生焦斑病菌分子檢測引物及其快速檢測方法

<160>4

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>1

tccgtagggaacctgcgg 18

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>2

tcctccgcttattgatatgc 20

<210>3

<211> 20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>3

gagatgtactgcgctccgaa 20

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>4

acttacgtttcctcggcgg 19