本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及IPCEF1在診治骨肉瘤中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：骨肉瘤是一種起源于骨間葉細(xì)胞的原發(fā)性惡性骨腫瘤，發(fā)病年齡多為8-25歲，社會(huì)危害性極大，其血行轉(zhuǎn)移發(fā)生早且發(fā)生率高，進(jìn)展迅速，80％的患者在確診時(shí)己有微小轉(zhuǎn)移灶。隨著化學(xué)治療、手術(shù)技術(shù)、骨重建等治療方法的發(fā)展，5年總體生存率得到較大提高。但是，近年來(lái)骨肉瘤的治療遇到瓶頸，尤其是在骨肉瘤早期轉(zhuǎn)移上，即骨肉瘤的早期診斷成為臨床亟待解決的問(wèn)題。腫瘤標(biāo)志物的研究使得骨肉瘤的早期診斷成為可能。腫瘤標(biāo)志物的存在或量變可以提示腫瘤的性質(zhì)，借以了解腫瘤的組織發(fā)生、細(xì)胞分化、細(xì)胞功能，以幫助腫瘤的診斷、分類、預(yù)后判斷以及治療指導(dǎo)。不過(guò)由于骨肉瘤發(fā)病率低，約為0.3/萬(wàn)，導(dǎo)致樣本收集困難，沒(méi)有被深入研究，目前骨肉瘤的分子標(biāo)志物并不多。本發(fā)明對(duì)骨肉瘤病例樣本進(jìn)行高通量測(cè)序，采用生物信息學(xué)分析，挑選出與骨肉瘤密切相關(guān)的基因IPCEF1，現(xiàn)有研究表明IPCEF1可能參與膜受體轉(zhuǎn)運(yùn)，增強(qiáng)細(xì)胞粘附蛋白2的活性，進(jìn)一步，我們通過(guò)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)在大樣本中驗(yàn)證IPCEF1與骨肉瘤的相關(guān)性，表明其有望成為骨肉瘤診斷標(biāo)志物，為其臨床診斷提供參考，為骨肉瘤患者帶來(lái)希望。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供檢測(cè)IPCEF1基因或蛋白的制劑在制備骨肉瘤診斷試劑中的應(yīng)用。進(jìn)一步，骨肉瘤患病組中IPCEF1基因或蛋白的表達(dá)水平與正常對(duì)照組織或者癌旁組織相比，表達(dá)水平低。進(jìn)一步，檢測(cè)IPCEF1基因或蛋白在生物學(xué)樣品中的表達(dá)水平是通過(guò)檢測(cè)IPCEF1部分或全部mRNA和/或檢測(cè)編碼IPCEF1蛋白的部分或全部氨基酸序列進(jìn)行。優(yōu)選的，生物學(xué)樣品為來(lái)源于患者的生物樣品，包括細(xì)胞、組織等，可以是血液或者尿液等，優(yōu)選為外周血。進(jìn)一步，骨肉瘤診斷制劑通過(guò)基因檢測(cè)IPCEF1基因的表達(dá)水平或通過(guò)免疫檢測(cè)IPCEF1蛋白的表達(dá)水平。進(jìn)一步，骨肉瘤診斷制劑采用熒光定量PCR試劑盒、基因芯片方法、測(cè)序方法檢測(cè)骨肉瘤生物學(xué)樣品中IPCEF1基因的表達(dá)。優(yōu)選的，所述的熒光定量PCR試劑盒中含有一對(duì)特異性擴(kuò)增IPCEF1基因的引物；所述的基因芯片中包括與IPCEF1基因的核酸序列雜交的探針。更優(yōu)選的，熒光定量PCR試劑盒內(nèi)含有特異性檢測(cè)IPCEF1基因的上游引物和下游引物，上游引物序列為SEQIDNO.1，下游引物序列為SEQIDNO.2。熒光定量PCR法是通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度。基因芯片又稱為DNA微陣列(DNAmicroarray)，可分為三種主要類型：1)固定在聚合物基片(尼龍膜，硝酸纖維膜等)表面上的核酸探針或cDNA片段，通常用同位素標(biāo)記的靶基因與其雜交，通過(guò)放射顯影技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。2)用點(diǎn)樣法固定在玻璃板上的DNA探針陣列，通過(guò)與熒光標(biāo)記的靶基因雜交進(jìn)行檢測(cè)。3)在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成的寡核苷酸探針陣列，與熒光標(biāo)記的靶基因雜交進(jìn)行檢測(cè)。進(jìn)一步，骨肉瘤診斷制劑采用免疫方法檢測(cè)生物學(xué)樣品中IPCEF1蛋白的表達(dá)。優(yōu)選的，免疫方法為ELISA檢測(cè)和/或膠體金檢測(cè)。進(jìn)一步，檢測(cè)IPCEF1蛋白的ELISA法為使用ELISA檢測(cè)試劑盒。所述試劑盒中的抗體可采用市售的IPCEF1單克隆抗體或多克隆抗體。進(jìn)一步，ELISA檢測(cè)試劑盒包括：包被IPCEF1抗體的固相載體，酶標(biāo)抗體，酶的底物，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對(duì)照品，稀釋液，洗滌液，酶反應(yīng)終止液等。進(jìn)一步，膠體金檢測(cè)采用膠體金免疫層析技術(shù)或膠體金滲濾法。進(jìn)一步，所述的膠體金檢測(cè)試劑盒硝酸纖維素膜上的檢測(cè)區(qū)(T)噴點(diǎn)有抗IPCEF1抗體、質(zhì)控區(qū)(C)噴點(diǎn)有免疫球蛋白IgG。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行的技術(shù)。ELISA檢測(cè)試劑盒根據(jù)檢測(cè)目的和操作步驟可分為間接法、雙抗夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法、雙位點(diǎn)一步法、捕獲法測(cè)IgM抗體、應(yīng)用親和素和生物素的ELISA。ELISA檢測(cè)試劑盒中生色底物可選擇辣根過(guò)氧化物酶(HRP)或者堿性磷酸酶(AP)。免疫膠體金檢測(cè)技術(shù)：(1)免疫膠體金光鏡染色法細(xì)胞懸液涂片或組織切片，可用膠體金標(biāo)記的抗體進(jìn)行染色，也可在膠體金標(biāo)記的基礎(chǔ)上，以銀顯影液增強(qiáng)標(biāo)記，使被還原的銀原子沉積于已標(biāo)記的金顆粒表面，可明顯增強(qiáng)膠體金標(biāo)記的敏感性。(2)免疫膠體金電鏡染色法可用膠體金標(biāo)記的抗體或抗抗體與負(fù)染病毒樣本或組織超薄切片結(jié)合，然后進(jìn)行負(fù)染?？捎糜诓《拘螒B(tài)的觀察和病毒檢測(cè)。(3)斑點(diǎn)免疫金滲濾法應(yīng)用微孔濾膜作載體，先將抗原或抗體點(diǎn)于膜上，封閉后加待檢樣本，洗滌后用膠體金標(biāo)記的抗體檢測(cè)相應(yīng)的抗原或抗體。(4)膠體金免疫層析法將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠體金標(biāo)記試劑(抗體或單克隆抗體)吸附在結(jié)合墊上，當(dāng)待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后，通過(guò)毛細(xì)作用向前移動(dòng)，溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記試劑后相互反應(yīng)，當(dāng)移動(dòng)至固定的抗原或抗體的區(qū)域時(shí)，待檢物與金標(biāo)試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集在檢測(cè)帶上，可通過(guò)肉眼觀察到顯色結(jié)果。本發(fā)明的目的在于提供促進(jìn)IPCEF1基因或蛋白表達(dá)的試劑或化合物在制備骨肉瘤治療藥物或制劑中的應(yīng)用。進(jìn)一步，本領(lǐng)域人員熟知促進(jìn)基因或蛋白表達(dá)通常可以采用下述方法中的一種和/或幾種：激活基因的啟動(dòng)子、激活基因表達(dá)的蛋白或因子、導(dǎo)入促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的載體。優(yōu)選的，骨肉瘤治療藥物或制劑中含有促進(jìn)IPCEF1基因的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的載體和/或激活I(lǐng)PCEF1基因的啟動(dòng)子和/或激活I(lǐng)PCEF1基因表達(dá)的蛋白或因子。進(jìn)一步，骨肉瘤治療藥物或制劑中包含藥劑學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的藥劑學(xué)上可接受的載體為在制劑時(shí)通常利用的載體，該載體包含乳糖(lactose)、右旋糖(dextrose)、蔗糖(sucrose)、山梨醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、淀粉、阿拉伯橡膠、磷酸鈣、藻酸鹽(alginate)、凝膠(gelatin)、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、纖維素(cellulose)、水、糖漿、甲基纖維素(methylcellulose)、羥基苯甲酸甲酯(methylhydroxybenzoate)、丙基羥基苯甲酸丙酯(propylhydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸鎂(stearicacidmagnesium)及礦物油(mineraloil)等，但并非局限于此。本發(fā)明的藥劑學(xué)可接受的載體除了上述成分以外還可以包含潤(rùn)滑劑、濕潤(rùn)劑、甜味劑、香味劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑等。藥劑學(xué)上許可的適合的載體和制劑詳細(xì)記載于雷明登氏藥學(xué)全書。本發(fā)明的藥物或制劑能通過(guò)口服或非口服進(jìn)行給藥，作為非口服給藥時(shí)，能通過(guò)靜脈內(nèi)注射，鼻腔內(nèi)注射，局部注射，腦室內(nèi)注射，脊髓腔注射，皮下注射，腹腔注射，經(jīng)皮給藥等方式進(jìn)行給藥。本發(fā)明的藥物或制劑的適合給藥劑量根據(jù)制劑化方法、給藥方式、患者的年齡、體重、性別、病態(tài)、食物、給藥時(shí)間、給藥途徑、排泄速度及反應(yīng)靈敏性之類的因素而可以進(jìn)行多種處方，通常，熟練的醫(yī)生能夠容易地決定及處方對(duì)所希望的治療或預(yù)防有效的給藥劑量。本發(fā)明的藥物或制劑根據(jù)本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員可以容易實(shí)施的方法，利用藥劑學(xué)上能接受的載體和/或賦形劑來(lái)進(jìn)行制劑化，從而能夠以單位用量形態(tài)制備或者內(nèi)裝在多容量容器內(nèi)來(lái)制備。此時(shí)，劑型是油性或者水性介質(zhì)中的溶液、懸浮液或乳化液形態(tài)，或者也可以是浸膏劑、粉末劑、顆粒劑、片劑或者膠囊劑形態(tài)，還可以包括分散劑或者穩(wěn)定劑。本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)骨肉瘤的基因檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒檢測(cè)基因IPCEF1，采用特異的上游引物和下游引物，上游引物序列為SEQIDNO.1，下游引物序列為SEQIDNO.2。進(jìn)一步，該P(yáng)CR試劑盒適合于目前存在市場(chǎng)上的所有類型熒光定量基因擴(kuò)增儀，靈敏度高，定量快速準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好，具有良好的應(yīng)用前景。進(jìn)一步，上述熒光定量PCR試劑盒組分包括：特異性引物、內(nèi)參引物、熒光定量PCR反應(yīng)液。所述內(nèi)參為GAPDH。所述的試劑盒還包含RNA抽提試劑。本發(fā)明目的是提供了一種骨肉瘤蛋白檢測(cè)試劑盒，所述的檢測(cè)試劑盒檢測(cè)IPCEF1蛋白。進(jìn)一步的，所述的試劑盒還包括其他檢測(cè)試劑。本發(fā)明目的是提供了一種檢測(cè)骨肉瘤的基因芯片，所述的基因芯片包括與IPCEF1基因的核酸序列雜交的探針。附圖說(shuō)明圖1是RT-PCR擴(kuò)增曲線圖圖2是RT-PCR溶解曲線圖圖3是在組織樣本中IPCEF1相對(duì)表達(dá)量圖圖4是在血液樣本中IPCEF1相對(duì)表達(dá)量圖具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照廠商所建議的條件實(shí)施檢測(cè)。實(shí)施例1高通量測(cè)序及分析分別收集10例骨肉瘤病例樣本及5例正常對(duì)照組織，其中10例骨肉瘤病例樣本中5例原發(fā)樣本、5例轉(zhuǎn)移樣本。進(jìn)行RNA提取，RNA提取后瓊脂糖凝膠電泳，從電泳結(jié)果可以初步判定提取的RNA樣品質(zhì)量合格與否，是否可以用于進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄組分析。進(jìn)而通過(guò)NanoDrop1000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA樣品的提取情況，RNA-seq測(cè)序的樣品要求：OD260/OD280為1.8-2.2。測(cè)序平臺(tái)為Illumina公司的HiSeq2500高通量測(cè)序平臺(tái)，進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序，測(cè)序后我們運(yùn)用Fast-QC軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行整體評(píng)估，包括堿基的質(zhì)量值分布，質(zhì)量值的位置分布，GC含量，PCRduplication含量，kmer的frequency等。在差異基因表達(dá)分析時(shí)，根據(jù)得到的FPKM值，采用國(guó)際公認(rèn)算法EBSeq進(jìn)行差異篩選。其中，篩選時(shí)，LOG2FC>1或<-1,FDR<0.05。為了更好的理解差異表達(dá)基因的功能，我們對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行了GeneOnlogy和信號(hào)通路分析，并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)分析，鑒于以上數(shù)據(jù)分析的結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)我們篩選了在骨肉瘤組下調(diào)表達(dá)明顯基因IPCEF1。實(shí)施例2骨肉瘤組及正常組IPCEF1基因表達(dá)情況一材料和方法1、材料收集17例骨肉瘤組織樣本、28例骨肉瘤血液樣本，6例正常骨組織對(duì)照、20例正常血液樣本對(duì)照，對(duì)其進(jìn)行分組及編號(hào)。組織提?。夯颊叱醮问中g(shù)時(shí)，在無(wú)菌操作下術(shù)中提取組織樣本，每塊切成黃豆大小，取出后迅速放入凍存管中，并盡快置于液氮中。血液提?。夯颊叽_認(rèn)后及時(shí)采集病例的外周血標(biāo)本3-5毫升，迅速放入EDTA抗凝管中，盡快置于-80℃冰箱。2、方法2.1骨肉瘤及正常對(duì)照總RNA的提取采用Reagent(invitrogen，貨號(hào)15596-018)進(jìn)行樣本RNA提取，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。提取后，用Nanodrop2000紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA純度及濃度,凍存于-70℃。RNA質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)：RNA樣本的OD260/OD280值為1.7-2.2之間；總RNA電泳圖譜有清晰的28S、18S條帶；70℃水浴保溫1小時(shí)后的電泳圖譜與水浴保溫前的圖譜無(wú)明顯差異。2.2逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA采用PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser(PerfectRealTime)(貨號(hào)：RR047B)進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，首先去除基因組DNA反應(yīng)，在試管中加入5×gDNAEraserBuffer2.0uL，gDNAEraser1.0uL，TotalRNA1ug，加RnaseFreeH20使總體積至10ul，水浴鍋中加熱2min，再將PrimeScriptRTEnzymeMixI1.0uL，RTPrimerMix1.0uL，5×PrimeScriptBuffer2(forRealTime)4.0uL，RNaseFreedH204.0uL，混合后加入上述試管中一起混合共20uL，水浴鍋中37℃加熱15min，85℃加熱5sec，合成的cDNA需要長(zhǎng)期保存時(shí)，請(qǐng)于-20℃或更低溫度保存。2.3Real-TimePCR2.3.1儀器及分析方法用ABI7300型熒光定量PCR儀，采用法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。2.3.2引物設(shè)計(jì)采用在線引物設(shè)計(jì)軟件，引物設(shè)計(jì)后由invitrogen公司合成。具體引物序列如下：表1操作過(guò)程如下：(一)反應(yīng)體系：表2試劑使用量2×SuperRealPreMixPlus10μl上游引物(10uM)0.6μl下游引物(10uM)0.6μl50×ROXReferenceDye△2μlDNA模板2ul滅菌蒸餾水4.8ul擴(kuò)增程序?yàn)椋?5°15min，(95℃10sec，55℃30sec，72℃32sec)×40個(gè)循環(huán)，95℃15sec，60℃60sec，95℃15sec)。(二)引物篩選將各樣本cDNA混合后，以此為模板進(jìn)行3倍梯度稀釋，稀釋后樣品各取2μl作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增(見(jiàn)表3)，同時(shí)在60-95℃進(jìn)行融解曲線分析，根據(jù)擴(kuò)增效率高和溶解曲線單峰原則進(jìn)行引物篩選。表3(三)樣品RealTimePCR檢測(cè)將各樣品cDNA3倍稀釋后取2μl作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增。同時(shí)在60-95℃進(jìn)行溶解曲線分析。二實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線拐點(diǎn)清楚，擴(kuò)增曲線整體平行性好，表明各反應(yīng)管的擴(kuò)增效率相近，極限平而無(wú)上揚(yáng)現(xiàn)在，曲線指數(shù)期斜率較大，說(shuō)明擴(kuò)增效率較高(見(jiàn)圖1)；樣本擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線都是單峰，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條，為特異性擴(kuò)增(見(jiàn)圖2)；根據(jù)qRT-PCR的相對(duì)定量公式：2-ΔΔCt，比較IPCEF1基因在骨肉瘤組織和正常組織、骨肉瘤血液樣本和正常對(duì)照血液樣本中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：qRT-PCR擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定，在組織樣本中，IPCEF1在骨肉瘤組的表達(dá)水平是正常對(duì)照組的0.35倍(具體見(jiàn)圖3)，在血液樣本中，IPCEF1在骨肉瘤組的表達(dá)水平是正常對(duì)照組的0.69倍(具體見(jiàn)圖4)，以上結(jié)果驗(yàn)證了高通量轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)的整合分析IPCEF1在骨肉瘤組中低表達(dá)的結(jié)果。本發(fā)明采用高通量測(cè)序篩選出骨肉瘤相關(guān)基因IPCEF1，結(jié)合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了IPCEF1是骨肉瘤診治標(biāo)志物。SEQUENCELISTING<110>北京泱深生物信息技術(shù)有限公司<120>IPCEF1在診治骨肉瘤中的應(yīng)用<160>4<170>PatentInversion3.3<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1ttgtcaacctgcctgatttcac22<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2aggtcttgatctgtggatggc21<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>3ggagcgagatccctccaaaat21<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>4ggctgttgtcatacttctcatgg23當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3