技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及寄生蟲(chóng)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種弓形蟲(chóng)感染小鼠腦組織差異表達(dá)蛋白質(zhì)、與大腦發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白相互作用的蛋白質(zhì)及其應(yīng)用；具體涉及一種應(yīng)用iTRAQ技術(shù)研究弓形蟲(chóng)慢性感染小鼠腦組織差異表達(dá)蛋白質(zhì)組的方法、還涉及一種與大腦發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白相互作用的蛋白質(zhì)或多肽、及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：弓形蟲(chóng)(Toxoplasmagondii)是一種機(jī)會(huì)致病性原蟲(chóng)，可以引起世界性的人獸共患寄生蟲(chóng)病。據(jù)調(diào)查，約30％的世界人口有潛在的弓形蟲(chóng)感染，其中90％發(fā)生弓形蟲(chóng)腦炎的病人死亡，繼發(fā)性癱瘓的比例更高。近年來(lái)，弓形蟲(chóng)慢性感染導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem,CNS)損傷越發(fā)受到廣泛關(guān)注，這類(lèi)病患表現(xiàn)為局部或彌散性的神經(jīng)損傷，常伴隨精神癥狀和行為失常，如產(chǎn)生類(lèi)似阿茲海默癥的癥狀表現(xiàn)。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用到包括寄生蟲(chóng)在內(nèi)的許多生物體研究中，但目前寄生蟲(chóng)的基因圖譜極不完善，因此給蛋白質(zhì)組的研究帶來(lái)了一定困難。同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(IsobaricTagsForRelativeAndAbsoluteQuantitation，iTRAQ)技術(shù)是美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司2004年推出的一種體外同位素標(biāo)記技術(shù)。作為一種新型蛋白質(zhì)組學(xué)定量研究技術(shù)，iTRAQ技術(shù)可以在同一實(shí)驗(yàn)中對(duì)4種或8種不同樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)定量比較，對(duì)一個(gè)基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)或者一個(gè)復(fù)雜混合體系中的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行精確定量和分析鑒定。目前還未有報(bào)道應(yīng)用iTRAQ技術(shù)研究弓形蟲(chóng)慢性感染小鼠腦組織差異表達(dá)蛋白質(zhì)組的方法。此外，獲得弓形蟲(chóng)慢性感染小鼠腦組織差異表達(dá)蛋白質(zhì)組之后，需要對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分析以及功能驗(yàn)證，才能挖掘出檢測(cè)靶標(biāo)、防治藥物靶點(diǎn)；目前，由于有效獲取弓形蟲(chóng)慢性感染小鼠腦組織差異表達(dá)蛋白質(zhì)組的方法較為缺乏，導(dǎo)致關(guān)于弓形蟲(chóng)慢性感染小鼠腦組織差異表達(dá)蛋白質(zhì)相互作用蛋白的研究也難以推進(jìn)，不利于檢測(cè)靶標(biāo)、防治藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種應(yīng)用iTRAQ技術(shù)研究弓形蟲(chóng)慢性感染小鼠腦組織差異表達(dá)蛋白質(zhì)組的方法、與大腦發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白相互作用的蛋白質(zhì)或多肽、及其應(yīng)用。第一方面，本發(fā)明提供了一種應(yīng)用iTRAQ技術(shù)研究弓形蟲(chóng)慢性感染小鼠腦組織差異表達(dá)蛋白質(zhì)組的方法，包含以下步驟：(1)小鼠腦蛋白的提??；(2)對(duì)步驟(1)所得的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行FASP酶解、肽段標(biāo)記；(3)對(duì)步驟(2)標(biāo)記的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行HPLC分離肽段混合物及LC-MS質(zhì)譜分析；(3)對(duì)上步所得的質(zhì)譜鑒定結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析、定量分析，獲取弓形蟲(chóng)慢性感染小鼠腦組織過(guò)程中的差異表達(dá)蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，步驟(1)中，小鼠包括昆明鼠、Balb/c鼠、沙鼠中的一種或多種。優(yōu)選地，步驟(1)中所述小鼠腦蛋白的提取，具體步驟為：分別取感染弓形蟲(chóng)的小鼠腦及健康SPF小鼠腦，進(jìn)行RIPA裂解、超聲、離心處理，收集上清液。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述超聲處理的條件為：20W，工作0.8s，停0.8s，超聲10次后放于冰上冷卻，并重復(fù)6次。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述離心處理的條件為：4℃，12000rpm，離心20min，收集上清液。優(yōu)選地，步驟(2)中FASP酶切具體包括：a)在對(duì)步驟(1)所得的蛋白質(zhì)樣品定量后，每個(gè)樣本取200μg蛋白溶液置于離心管中，加入TCEP還原試劑，60℃反應(yīng)1h；然后加入MMTS半胱氨酸封閉試劑，室溫反應(yīng)30分鐘；獲得還原烷基化后的蛋白溶液；b)將還原烷基化后的蛋白溶液加入超濾管中，離心，棄掉收集管底部溶液；加入8M尿素(pH8.5)，離心，棄掉收集管底部溶液；加入0.25MTEAB(pH8.5)，離心，棄掉收集管底部溶液；更換新的收集管，在超濾管中加入0.5MTEAB，加入胰蛋白酶(胰蛋白酶與蛋白質(zhì)量比優(yōu)選為1:50)，37℃反應(yīng)過(guò)夜；次日加入胰蛋白酶(胰蛋白酶與蛋白質(zhì)量比優(yōu)選為1:100)，37℃反應(yīng)4h，離心獲得酶解消化后的肽段溶液。優(yōu)選地，步驟(2)肽段標(biāo)記具體包括：參照AB公司試劑盒iTRAQReagent-8plexMultiplexKit(ABSCIEX)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行FASP酶切后所得肽段的標(biāo)記。進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟(2)肽段標(biāo)記包括：a)取8標(biāo)iTRAQ試劑盒，平衡至室溫；向每管iTRAQ試劑中加入150μl異丙醇，渦旋振蕩，離心至管底，獲得異丙醇處理后的iTRAQ試劑；b)取50μl樣品(約100μg酶解產(chǎn)物)轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入步驟a)異丙醇處理后的的iTRAQ試劑到樣品中，渦旋振蕩，離心至管底，室溫反應(yīng)2h；加入水終止反應(yīng)，獲得標(biāo)記肽段。優(yōu)選地，步驟(3)具體包括：a)先(用95％的A相5％B相)平衡柱子，然后將步驟(2)標(biāo)記后多肽用A相復(fù)溶，進(jìn)樣后以0.2ml/min的速率進(jìn)行梯度洗脫：B相從5％到37％，最后在5min內(nèi)使B相的比例上升至95％并保持5min，共85min；收取肽段溶液，真空干燥后，進(jìn)行第二維LC-MS分析；其中，A相：水(NH3inH2O，pH10)；B相：80％乙腈(NH3inH2O，pH10)；；b)步驟(a)真空干燥后的肽段用樣品溶解液溶解，充分振蕩渦旋、離心，上清轉(zhuǎn)移到上樣管中，進(jìn)行質(zhì)譜鑒定；色譜柱信息：75umi.d.x150mm,裝填A(yù)cclaimPepMapRSLCC18,2μm,nanoViper；流動(dòng)相A：0.1％甲酸；流動(dòng)相B：0.1％甲酸，80％CAN(硝酸鈰銨)；流速：300nL/min；每個(gè)組分分析時(shí)間：65min；有效梯度：B相從5％上升至35％，40min。進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟(3)具體包括：a)先用95％的A相5％B相平衡柱子(Phenomenexcolumns；Gemini-NX3uC18110A；150*2.00mm)30min，然后將標(biāo)記后抽干的混合多肽用200μl的A相復(fù)溶，取100μl進(jìn)樣后以0.2ml/min的速率進(jìn)行梯度洗脫：B相從5％到37％，最后在5min內(nèi)使B相的比例上升至95％并保持5min，共85min；整個(gè)洗脫過(guò)程在214nm吸光度下進(jìn)行監(jiān)測(cè)，從線(xiàn)性梯度開(kāi)始根據(jù)峰型收取24個(gè)組分，每1管每50秒鐘接1次，梯度為85min，反復(fù)循環(huán)接樣；根據(jù)峰型和時(shí)間共收取24個(gè)組分(肽段)，真空干燥后，進(jìn)行第二維LC-MS分析；其中，A相：水(NH3inH2OpH10)；B相：80％乙腈(NH3inH2OpH10)b)肽段用樣品溶解液(0.1％甲酸、5％乙腈)溶解，充分振蕩渦旋，13500rpm，4℃離心20min，上清轉(zhuǎn)移到上樣管中，進(jìn)行質(zhì)譜鑒定；色譜柱信息：75umi.d.x150mm,裝填A(yù)cclaimPepMapRSLCC18,2μm,nanoViper；流動(dòng)相A：0.1％甲酸；流動(dòng)相B：0.1％甲酸，80％CAN(硝酸鈰銨)；流速：300nL/min；每個(gè)組分分析時(shí)間：65min；有效梯度：B相從5％上升至35％，40min；c)分離后的肽段直接進(jìn)入質(zhì)譜儀ThermoScientificQExactive進(jìn)行在線(xiàn)檢測(cè)，具體參數(shù)如下：一級(jí)質(zhì)譜參數(shù)：Resolution：70,000；AGCtarget：3e6；MaximumIT：100ms；Scanrange：350to1800m/z；二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)：Resolution：17,500；AGCtarget：5e4；MaximumIT：120ms；TopN：20；NCE/steppedNCE：30。優(yōu)選地，步驟(4)生物信息學(xué)分析具體包括：用ProteomeDiscoverer1.4(ThermoFisherScientific)的默認(rèn)設(shè)置進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析；用ProteinPilot5.0(AppliedBiosystemsSciex)進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析和蛋白定量分析；差異表達(dá)倍數(shù)>2倍和<0.5倍(兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)“P≤0.05和|FC|≥2”)，分別選出作為蛋白表達(dá)量上調(diào)和下調(diào)的研究對(duì)象。本發(fā)明所述的P值為ProteinPilot5.0軟件分析時(shí)進(jìn)行的假設(shè)檢驗(yàn)，F(xiàn)C為Foldchange的縮寫(xiě)。優(yōu)選地，步驟(4)生物信息學(xué)分析進(jìn)一步具體包括：通過(guò)QuickGO，從生物學(xué)進(jìn)程、分子功能以及細(xì)胞組分，對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行分析。優(yōu)選地，步驟(4)生物信息學(xué)分析進(jìn)一步具體包括：通過(guò)KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)進(jìn)行生物學(xué)通路分析，在Uniprot上可找到該蛋白的序列和功能信息。優(yōu)選地，如第一方面提供的方法，獲取弓形蟲(chóng)慢性感染小鼠腦組織過(guò)程中的差異表達(dá)蛋白質(zhì)不低于4983個(gè)蛋白。優(yōu)選地，如第一方面提供的方法，通過(guò)用兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)“P≤0.05和|FC|≥2”進(jìn)行顯著性差異分析，被弓形蟲(chóng)感染的昆明鼠腦部與對(duì)照組相比，可獲得上調(diào)蛋白有不低于215個(gè)。進(jìn)一步優(yōu)選地，可獲得不低于215個(gè)的上調(diào)蛋白優(yōu)選包括表2中所例高表達(dá)蛋白。優(yōu)選地，如第一方面提供的方法，通過(guò)用兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)“P≤0.05和|FC|≥2”進(jìn)行顯著性差異分析，被弓形蟲(chóng)感染的昆明鼠腦部與對(duì)照組相比，可獲得下調(diào)蛋白有不低于246個(gè)。進(jìn)一步優(yōu)選地，可獲得不低于246個(gè)的下調(diào)蛋白優(yōu)選包括表2中所例低表達(dá)蛋白。優(yōu)選地，如第一方面提供的方法，通過(guò)用兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)“P≤0.05和|FC|≥2”進(jìn)行顯著性差異分析，被弓形蟲(chóng)感染的Balb/c鼠腦部與對(duì)照組相比，可獲得上調(diào)蛋白有不低于159個(gè)。優(yōu)選地，如第一方面提供的方法，通過(guò)用兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)“P≤0.05和|FC|≥2”進(jìn)行顯著性差異分析，被弓形蟲(chóng)感染的Balb/c鼠腦部與對(duì)照組相比，可獲得下調(diào)蛋白有不低于353個(gè)。進(jìn)一步優(yōu)選地，可獲得不低于246個(gè)的下調(diào)蛋白優(yōu)選包括表2中所例低表達(dá)蛋白。優(yōu)選地，如第一方面提供的方法，通過(guò)用兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)“P≤0.05和|FC|≥2”進(jìn)行顯著性差異分析，被弓形蟲(chóng)感染的沙鼠腦部與對(duì)照組相比，可獲得上調(diào)蛋白有不低于48個(gè)(優(yōu)選包括表3中所例48種高表達(dá)蛋白)。優(yōu)選地，如第一方面提供的方法，通過(guò)用兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)“P≤0.05和|FC|≥2”進(jìn)行顯著性差異分析，被弓形蟲(chóng)感染的沙鼠腦腦部與對(duì)照組相比，可獲得下調(diào)蛋白有不低于63個(gè)(優(yōu)選包括表3中所例63種低表達(dá)蛋白)。優(yōu)選地，如第一方面提供的方法獲得的差異表達(dá)蛋白質(zhì)涉及的通路包括代謝信號(hào)通路、氧化磷酸化信號(hào)通路、谷氨酸能突觸信號(hào)通路、鈣信號(hào)信號(hào)通路、cGMP-PKG信號(hào)通路、突觸囊泡循環(huán)信號(hào)通路，以及Mdh2、Pdhx、Pvalb、Atp5a1、Cox4i1、Me1、Dbn1、Impdh2、Syt7、Hadha、Actb蛋白相關(guān)信號(hào)通路中的一種或多種。優(yōu)選地，如第一方面提供的方法中，步驟(4)獲取弓形蟲(chóng)慢性感染小鼠腦組織過(guò)程中的差異表達(dá)蛋白質(zhì)包括大腦發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述與大腦發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白相互作用的蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸序列包括：1)表12所示蛋白質(zhì)中的任一種，或2)氨基酸編碼序列與表12所示蛋白質(zhì)同源性不低于80％、85％、90％、95％、98％或99.9％的蛋白質(zhì)或多肽中的任一種。第三方面，本發(fā)明提供了一種與大腦發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白相互作用的蛋白質(zhì)或多肽，所述與大腦發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白相互作用的蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸序列包括：1)表12所示蛋白質(zhì)中的任一種，或2)氨基酸編碼序列與表12所示蛋白質(zhì)同源性不低于80％、85％、90％、95％、98％或99.9％的蛋白質(zhì)或多肽中的任一種。第四方面，本發(fā)明提供了一種核酸序列，所述核酸序列編碼第三方面所述的與大腦發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白相互作用的蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸序列中的任一種。第五方面，本發(fā)明提供了一種如第一方面提供的方法、與大腦發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白相互作用的蛋白質(zhì)或多肽、如第三方面提供的與大腦發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白相互作用的蛋白質(zhì)或多肽、如第四方面提供的核酸序列在制備弓形蟲(chóng)慢性感染關(guān)聯(lián)信號(hào)通路生物標(biāo)志物或診斷試劑中的應(yīng)用，其中，所述信號(hào)通路包括代謝信號(hào)通路、氧化磷酸化信號(hào)通路、谷氨酸能突觸信號(hào)通路、鈣信號(hào)信號(hào)通路、cGMP-PKG信號(hào)通路、突觸囊泡循環(huán)信號(hào)通路，以及Mdh2、Pdhx、Pvalb、Atp5a1、Cox4i1、Me1、Dbn1、Impdh2、Syt7、Hadha、Actb蛋白相關(guān)信號(hào)通路中的一種或多種。第六方面，本發(fā)明提供了一種如第一方面提供的方法、與大腦發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白相互作用的蛋白質(zhì)或多肽、如第三方面提供的與大腦發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白相互作用的蛋白質(zhì)或多肽、如第四方面提供的核酸序列在制備弓形蟲(chóng)慢性感染關(guān)聯(lián)疾病生物標(biāo)志物、診斷試劑或靶向藥物中的應(yīng)用，其中，所述弓形蟲(chóng)慢性感染關(guān)聯(lián)疾病包括亨廷氏舞蹈癥、阿茲海默癥、帕金森氏癥中的一種或多種。本發(fā)明通過(guò)比較弓形蟲(chóng)慢性感染小鼠與健康小鼠的腦組織，篩選差異表達(dá)的鼠腦蛋白質(zhì)，以期從蛋白質(zhì)組學(xué)角度挖掘其導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem,CNS)損傷的機(jī)制，并為尋找生物標(biāo)志物提供靶標(biāo)。本發(fā)明提供的iTRAQ結(jié)合LCMS/MS技術(shù)能快速有效地進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，為研究弓形蟲(chóng)慢性感染致宿主CNS損傷機(jī)制以及發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物提供參考。本發(fā)明還提供了弓形蟲(chóng)慢性感染小鼠腦組織差異表達(dá)蛋白質(zhì)組、與大腦發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白相互作用的蛋白質(zhì)或多肽，并進(jìn)行了生物功能分析和生物功能驗(yàn)證。附圖說(shuō)明圖1為差異表達(dá)蛋白的通路富集分析結(jié)果；圖2為部分差異表達(dá)蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果；圖3為部分差異表達(dá)蛋白mRNA表達(dá)水平的熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果。具體實(shí)施方式以下所述是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。在本發(fā)明第一實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種應(yīng)用iTRAQ技術(shù)研究弓形蟲(chóng)慢性感染小鼠腦組織差異表達(dá)蛋白質(zhì)組的方法。本發(fā)明實(shí)施例中若無(wú)特別說(shuō)明，所用試劑及耗材均為市售商品。6～8周齡的SPF級(jí)昆明小鼠，購(gòu)于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；弓形蟲(chóng)PRU株，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院寄生蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室保存。1材料與方法1.1樣品制備弓形蟲(chóng)慢性感染小鼠模型建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明小鼠40只，體重約22g，隨機(jī)均分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。將一只弓形蟲(chóng)慢性感染小鼠用頸椎脫白法處死，取小鼠的腦組織，加入適量PBS，用研缽充分研磨至不見(jiàn)任何組織，取腦勻漿平鋪在玻片上，于顯微鏡下計(jì)數(shù)包囊個(gè)數(shù)，重復(fù)3次，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果將腦組織勻漿用PBS稀釋成20個(gè)包囊/mL。釆取經(jīng)口感染的方式，實(shí)驗(yàn)組接種10個(gè)包囊/只，即0.5mL腦勻漿液。對(duì)照組每只灌胃0.5mLPBS。分別分籠飼養(yǎng)，每籠5只，正常取食及飲水。感染弓形蟲(chóng)30天的成年昆明小鼠18只，雌雄各半，隨機(jī)均分為3組。無(wú)菌環(huán)境下解剖取腦，每組鼠腦混合后將其分為2等份，一半用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究，另一半用于做熒光定量PCR和Westernblot驗(yàn)證。另取相同年齡、相同性別的18只健康SPF小鼠腦，相同處理，作為空白對(duì)照。1.2主要儀器及試劑冷凍離心機(jī)(湘儀H2050R)；超聲儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；PMSF(-20℃保存，使用前需搖勻使結(jié)晶溶解)(上海生工)；旋渦混合器VORTEX-5；RIPA裂解液(50mMTris-Hcl，AMRESCO)；BCA定量試劑盒(Sigma)；分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)；8-plexiTRAQ試劑盒(ABSciex)；胰酶(Promega)；10K超濾管(Pall)；三乙基碳酸氫銨緩沖液TEAB(Sigma)；液相色譜ShimadzuHPLC(ThermoDionexUltimate3000RSLCnano)；質(zhì)譜儀(ThermoScientificQExactive)。PBS(pH7.4)：NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO41.42g，KH2PO40.27g，加入約800mL蒸餾水充分溶解，將pH調(diào)至7.4后再加蒸餾水定容至1L，高壓滅菌后使用。RIPA裂解液(使用前加入1×的PMSF)：50mMTris-Hcl，150mMNacl，1％SDS，0.1％Trionx-100，1％SDCpH8.0。1.3蛋白質(zhì)的提取及純化在EP管中加入100μlRIPA，充分溶解組織后超聲處理(20W，工作0.8s，停0.8s，超聲10下后放于冰上冷卻，重復(fù)6次)，破碎核酸，4℃，12000rpm，離心20min，收集上清液。BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，取1、2、4、6、8、10、12、14μg的BSA制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，樣品取2μL，雙復(fù)管測(cè)定。每支管加入100μL去離子水，100μLBCA染液，渦旋振蕩20s，60℃反應(yīng)1h，575nm處測(cè)定吸光值。1.4蛋白酶解及iTRAQ試劑標(biāo)記使用FASP方法酶解樣品，蛋白定量后每個(gè)樣本取200μg蛋白溶液置于離心管中；加入4μLTCEPReducingReagent，60℃反應(yīng)1h；加入2μlMMTSCysteine-BlockingReagent，室溫30分鐘；將還原烷基化后的蛋白溶液加入10K的超濾管中，12,000rpm離心20min，棄掉收集管底部溶液；加入8M尿素(pH8.5)100μl，12000rpm離心20分鐘，棄掉收集管底部溶液，重復(fù)2次；加入0.25MTEAB(pH8.5)100μl，12000rpm離心20min，棄掉收集管底部溶液，重復(fù)3次；更換新的收集管，在超濾管中加入0.5MTEAB使終體積為50μl，加入胰蛋白酶(胰蛋白酶與蛋白質(zhì)量比1:50)，37℃反應(yīng)過(guò)夜；次日加入胰蛋白酶(胰蛋白酶與蛋白質(zhì)量比1:100)，37℃反應(yīng)4h，反應(yīng)后12000rpm離心20min，酶解消化后的肽段溶液離心于收集管底部；在超濾管中加入50μl0.5MTEAB，12000rpm再次離心20min，與上步合并，收集管底部共得到100μl酶解后的樣品；iTRAQ試劑標(biāo)記，從冰箱中取出8標(biāo)的iTRAQ試劑盒，平衡到室溫，將iTRAQ試劑離心至管底；向每管iTRAQ試劑中加入150μl異丙醇，渦旋振蕩，離心至管底；取50μl樣品(100μg酶解產(chǎn)物)轉(zhuǎn)移到新的離心管中；將iTRAQ試劑添加到樣品中，渦旋振蕩，離心至管底，室溫反應(yīng)2h；加入100μl水終止反應(yīng)；混合標(biāo)記后的樣品，渦旋振蕩，離心至管底；真空冷凍離心干燥；抽干后的樣品冷凍保存待用。1.5HPLC分離肽段混合物以及質(zhì)譜檢測(cè)第一維高pH-RP液相分離先用95％的A相5％B相平衡柱子(柱子信息：Phenomenexcolumns；Gemini-NX3uC18110A；150*2.00mm)30min，然后將標(biāo)記后抽干的混合多肽用200μl的A相(H2O)復(fù)溶，取100μl進(jìn)樣后以0.2ml/min的速率進(jìn)行梯度洗脫：B相(80％ACN)從5％到37％，最后在5min內(nèi)使B相的比例上升至95％并保持5min，共85min。整個(gè)洗脫過(guò)程在214nm吸光度下進(jìn)行監(jiān)測(cè)，從線(xiàn)性梯度開(kāi)始根據(jù)峰型收取24個(gè)組分，每1管每50秒鐘接1次，梯度為85min，反復(fù)循環(huán)接樣；根據(jù)峰型和時(shí)間共收取24個(gè)組分，真空干燥后，進(jìn)行第二維LC-MS分析。A相：水(NH3inH2OpH10)；B相：80％乙腈(NH3inH2OpH10)。具體梯度洗脫程序如表1所示。表1梯度洗脫程序第二維反相液質(zhì)聯(lián)用RPLC-MS肽段用樣品溶解液(0.1％甲酸、5％乙腈)溶解，充分振蕩渦旋，13500rpm，4℃離心20min，上清轉(zhuǎn)移到上樣管中，進(jìn)行質(zhì)譜鑒定；色譜柱信息：75umi.d.x150mm,packedwithAcclaimPepMapRSLCC18,2μm,nanoViper；流動(dòng)相A：0.1％甲酸；流動(dòng)相B：0.1％甲酸，80％CAN；流速：300nL/min；每個(gè)組分分析時(shí)間：65min；有效梯度：B相從5％上升至35％，40min。具體梯度洗脫程序如表2所示。表2梯度洗脫程序分離后的肽段直接進(jìn)入質(zhì)譜儀ThermoScientificQExactive進(jìn)行在線(xiàn)檢測(cè)，具體參數(shù)如下：一級(jí)質(zhì)譜參數(shù)：Resolution：70,000；AGCtarget：3e6；MaximumIT：100ms；Scanrange：350to1800m/z。二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)：Resolution：17,500；AGCtarget：5e4；MaximumIT：120ms；TopN：20；NCE/steppedNCE：30。1.6蛋白質(zhì)鑒定與數(shù)據(jù)分析將原文件轉(zhuǎn)換為MASCOT軟件的通用格式(.mgf)，用ProteomeDiscoverer1.4(ThermoFisherScientific)的默認(rèn)設(shè)置進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析。輸入.mgf格式文件，用ProteinPilot5.0(AppliedBiosystemsSciex)進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析和蛋白定量分析。ProteinPilot5.0中的ParagonAlgorithm用于數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，利用該軟件，iTRAQ系統(tǒng)得到的肽段數(shù)據(jù)得以轉(zhuǎn)換成蛋白水平上的差異分析數(shù)據(jù)。參數(shù)設(shè)置如下：Cysalkylation:MMTS；IDfocus:biologicalmodifications；Digestion:typsin；Database:Uniprot_MOUSE；Searcheffort:thoroughID。差異表達(dá)倍數(shù)>2倍和<0.5倍，分別選出作為蛋白表達(dá)量上調(diào)和下調(diào)的研究對(duì)象。為了找到生物學(xué)功能顯著變化的蛋白，我們通過(guò)QuickGO，利用生物信息研究最權(quán)威的數(shù)據(jù)庫(kù)，從生物學(xué)進(jìn)程、分子功能以及細(xì)胞組分，對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行分析。QuickGO是通過(guò)BLAST和Uniprot找到差異表達(dá)蛋白的ID并對(duì)其進(jìn)行注釋。選取的蛋白通過(guò)KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)進(jìn)行生物學(xué)通路分析，在Uniprot上可找到該蛋白的序列和功能信息。另外，可以借助STRING10.0(http://string-db.org)探索互作關(guān)系網(wǎng)中的功能與蛋白質(zhì)差異表達(dá)的關(guān)系。統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差為標(biāo)準(zhǔn)，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)用來(lái)評(píng)估組間的顯著性差異。應(yīng)用SPSS18進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05時(shí)表明差異顯著。1.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析驗(yàn)證mRNA的表達(dá)水平qRT-PCR分析是用于驗(yàn)證iTRAQ結(jié)果得到的驗(yàn)證基因表達(dá)差異。根據(jù)操作說(shuō)明書(shū)通過(guò)RNAisoPlus方法(Takara,大連,中國(guó))對(duì)感染鼠腦進(jìn)行總RNA的提取，最后用無(wú)酶水重懸所得RNA。提取的RNA濃度以及純度由紫外分光光度計(jì)(ThermoScientificNanodrop2000,Waltham,MA,USA)測(cè)量所得。通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒SYBRPrimeScriptTMRTMasterMix(PerfectRealTime)試劑盒(TaKaRa,大連,中國(guó))轉(zhuǎn)錄成cDNA。參照UniGene上的基因序列用Premier5.0軟件(PremierBiosoftInternational,PaloAlto,CA,USA)設(shè)計(jì)特異性qPCR引物。引物序列見(jiàn)表3。qPCR使用儀器Rotor-GeneQ(Qiagen)的實(shí)時(shí)系統(tǒng)，采用SYBRGreenmastermix(SYBRPremixExTagTMII；TaKaRaBio；http://www.TaKaRa-bio.com),qRT-PCR反應(yīng)條件是95℃5min；95℃30s，60℃1min，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品三次生物學(xué)重復(fù)，mRNA的表達(dá)水平通過(guò)公式2–△△Ct得出。為了標(biāo)準(zhǔn)化，我們采用β-actin基因的表達(dá)作為內(nèi)參，空白對(duì)照作為一個(gè)參照樣品設(shè)為1。表3熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)1.8Westernblot實(shí)驗(yàn)分別選取實(shí)驗(yàn)組中差異表達(dá)下調(diào)蛋白Dbn1和上調(diào)蛋白Pvalb進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。處理好的樣品進(jìn)行SDS-PAGE，120V。然后轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Roche,Indianapolis,USA)上，45min，120mA。然后把膜放在含有0.1％的吐溫20以及5％的脫脂牛奶的PBS中過(guò)夜孵育鼠抗β-actin單抗(NEOBIOSCIENCE,中國(guó).1:500稀釋)，特異性兔抗Syt7(1:250,Abcam，ab106618)和兔抗Pvalbalb(1:300,Abcam，ab11427)抗體。孵育抗體之后洗膜三次再分別用羊抗兔的二抗1：2500稀釋。膜是用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物溶液(天根生化科技(北京)有限公司，中國(guó))顯像，圖像是由ECL-plusWesternblotting檢測(cè)分析系統(tǒng)進(jìn)行成像分析(Tiannon，上海，中國(guó))。2結(jié)果2.1原始數(shù)據(jù)分析及差異表達(dá)蛋白的檢測(cè)通過(guò)ProteinPilot5.0搜索軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析，檢測(cè)到4983個(gè)蛋白，通過(guò)用兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)“P≤0.05和|FC|≥2”進(jìn)行顯著性差異分析，發(fā)現(xiàn)被弓形蟲(chóng)包囊感染的小鼠腦部與對(duì)照組相比有215個(gè)蛋白上調(diào)(46.63％)和246個(gè)下調(diào)蛋白(53.37％)。部分上調(diào)和下調(diào)蛋白已分別列出(表4)。表4部分差異表達(dá)蛋白信息2.2差異表達(dá)蛋白的生物信息學(xué)分析通過(guò)GO分析鑒定各個(gè)功能相關(guān)的差異表達(dá)蛋白，主要涉及生物學(xué)進(jìn)程(BP)有解剖結(jié)構(gòu)的發(fā)展、信號(hào)傳導(dǎo)、運(yùn)輸、細(xì)胞分化、應(yīng)激反應(yīng)等。分子功能(MF)分類(lèi)揭示差異蛋白主要與體內(nèi)分子的結(jié)合與捆綁相關(guān)。細(xì)胞組分(CC)分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)蛋白主要參與細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器、胞外結(jié)構(gòu)和質(zhì)膜形成。同時(shí)，KEGGPATHWAY分析可見(jiàn)差異表達(dá)蛋白一共涉及了227個(gè)通路，圖1為差異表達(dá)蛋白的通路富集分析結(jié)果，包含差異蛋白最多的前10個(gè)通路，包括代謝通路、氧化磷酸化、谷氨酸能突觸、鈣信號(hào)通路、cGMPPKG信號(hào)通路、亨廷氏舞蹈癥、突觸囊泡循環(huán)、和阿茲海默癥、多巴胺能神經(jīng)突觸、帕金森氏癥等。根據(jù)STRING10.0數(shù)據(jù)庫(kù)(http://string-db.org)探索差異表達(dá)蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，這些差異表達(dá)蛋白至少與其中另一個(gè)蛋白存在相互作用，結(jié)果如圖2所示，圖2為部分差異表達(dá)蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果。不同顏色的線(xiàn)表明蛋白質(zhì)不同種類(lèi)的互作證據(jù)(由于專(zhuān)利申請(qǐng)文件為灰度圖，顯示不出色彩效果，若需要，申請(qǐng)人可提供帶顏色的原圖)。Mdh2、Pdhx、Pvalb、Atp5a1、Cox4i1、Me1、Dbn1、Impdh2、Syt7、Hadha、Actb等是處在關(guān)系互作網(wǎng)的重要節(jié)點(diǎn)，散在的蛋白目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。具體地，差異表達(dá)鼠腦蛋白質(zhì)大腦發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白(Drebrin)在調(diào)節(jié)樹(shù)突棘與神經(jīng)突觸的形態(tài)結(jié)構(gòu)上有重要作用。在大腦的學(xué)習(xí)和記憶機(jī)制中，樹(shù)突棘是一個(gè)關(guān)鍵角色，并且影響神經(jīng)突觸的生長(zhǎng)發(fā)育。阿茲海默癥早期的認(rèn)知功能障礙就與突觸退化有關(guān)，樹(shù)突棘形態(tài)退化、數(shù)量和密度同時(shí)下降，Drebrin的表達(dá)水平在大腦顳葉也發(fā)生顯著下調(diào)。Kojima等在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)DrebrinA在成年鼠腦中對(duì)突觸的可塑性和海馬依賴(lài)性的恐懼記憶是至關(guān)重要的。慢性感染弓形蟲(chóng)的小鼠精神沉郁很可能與鼠腦中Drebrin表達(dá)水平顯著下調(diào)有關(guān)。樹(shù)突棘和突觸的病變與通路富集分析結(jié)果一致。為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的有益效果，本發(fā)明第二實(shí)施例還采用沙鼠替換本發(fā)明上述第一實(shí)施例中的昆明鼠，其他步驟不變，獲得部分差異表達(dá)蛋白信息如表5所示：表5部分差異表達(dá)蛋白信息在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的有益效果，本發(fā)明第三實(shí)施例還采用Balb/c鼠替換本發(fā)明上述第一實(shí)施例中的昆明鼠，其他步驟不變，獲得差異表達(dá)蛋白情況為：上調(diào)蛋白159種；下調(diào)蛋白有353種，部分差異表達(dá)蛋白情信息如表6所示：表6部分差異表達(dá)蛋白信息在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的有益效果，本發(fā)明第四實(shí)施例選用表4中差異表達(dá)鼠腦蛋白質(zhì)大腦發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白(Drebrin)為研究對(duì)象，提供了一種篩選與小鼠Drebrin蛋白互作的弓形蟲(chóng)蛋白的方法。3.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器3.1.1蟲(chóng)株、菌株與細(xì)胞弓形蟲(chóng)PRU株，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院寄生蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室保存；Trans5α、TransBL21(DE3)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)于北京全式金生物科技有限公司；人包皮成纖維細(xì)胞(HFF)，由暨南大學(xué)饋贈(zèng)，保存于本實(shí)驗(yàn)室液氮中；小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞(N2a)，保存于本實(shí)驗(yàn)室液氮中。3.1.2載體和引物克隆載體pMD18-T(全式金)；原核表達(dá)載體pGEX-6P-1，由本實(shí)驗(yàn)室保存；Drebrin(UniprotAccession：Q9QXS6)擴(kuò)增引物通過(guò)PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)，由上海生工合成，序列如下：Drebrin-F：5'-ggatccATGGCCGGCGTCAGCTTCAGC-3'，劃線(xiàn)酶切位點(diǎn)為BamHI，Drebrin-R：5'-ctcgagCTAATCACCACCCTCGAAGCCCTC-3'，劃線(xiàn)酶切位點(diǎn)為XhoI。使用前，先將引物12000rpm離心1～3min，加入相應(yīng)量的滅菌去離子水進(jìn)行稀釋?zhuān)K濃度為50pmol/μL，分裝后于-20℃保存?zhèn)溆谩?.1.3主要試劑及溶液配制Pierce經(jīng)典磁珠式免疫共沉淀試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit(ThermoScientific)；RIPA裂解液；Milli-Qwater；乙腈、甲醇(Fisher)；硫代硫酸鈉、碘乙酰胺、鐵氰化鉀、碳酸氫銨、FA甲酸、溴化乙錠(EB)、瓊脂糖(Sigma)；二硫蘇糖醇(PlusOne)；胰酶、胰酶重溶液、十二烷基硫酸鈉SDS(Promega)；NC膜(LifeSciencePureNitrocelluloseBlottingMembrane)；T4DNA連接酶，Ex-TaqDNA聚合酶(5U/μL)，dNTPs(2.5mMeach)，10×PCRbuffer，6×LoadingBuffer，10×LoadingBuffer，pMD18-TVectorKit，RNA提取試劑RNAisoPlus，TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKit(TAKARA)；TIANprepMiniPlasmidKit質(zhì)粒小提試劑盒(TIANGEN)；兔抗Drebrin多抗(proteintech)；ANTI-GST(TRANS)；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(碧云天，A0208)；HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG(康為世紀(jì)cw0102A)；5×TBE貯存液(pH8.3)：Tris54g，硼酸27.5g，EDTA(0.5mol/L)20mL，加去離子水至1L；1.0％瓊脂糖凝膠：瓊脂糖2g，0.5×TBE電泳緩沖液200mL，將以上組分溶于三角燒瓶中，然后放入微波爐中加熱3min是瓊脂糖完全融化，加入10μLE.B.(10mg/mL)備用；銀染脫色液配制：K3Fe(CN)625mg，NaS2O340mg，溶于5mL超純水。3.1.4主要儀器蛋白電泳儀、電泳槽(Bio-RAD)；旋轉(zhuǎn)儀(TR-02U(HYQ-2231)，CrystalTechnology&Industries)；質(zhì)譜儀QExactivemassspectrometer(Thermofisher)；真空干燥儀；旋轉(zhuǎn)混合儀；愛(ài)普生掃描儀；PCR擴(kuò)增儀(TaKaRa)；Thermo精密pH計(jì)；Bio-RAD核酸電泳系統(tǒng)3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1免疫共沉淀CoIP1、弓形蟲(chóng)速殖子感染N2a細(xì)胞全蛋白提?。?1)加入850μLRIPA裂解液，在冰上孵育5min；(2)漩渦振蕩5s，12,000g，4℃離心5min；(3)將上清液轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管中，置于冰上備用，或-80℃保存；(4)分別取40μL蛋白裂解液用于input組，400μL蛋白用于NC組，400μL蛋白用于IP組。2、蛋白免疫復(fù)合物制備：取1μg抗體原液(分別為Drebrin抗體和IgG蛋白)、400μL細(xì)胞裂解液上清混合，在4℃緩慢顛倒混勻過(guò)夜，使目的蛋白從細(xì)胞裂解液中被特異性抗體免疫沉淀下來(lái)。3、proteinA/G瓊脂糖珠準(zhǔn)備按總需量，取100μlproteinA/G瓊脂糖珠，加200μL裂解緩沖液洗滌3次，4℃，3000g離心30s留瓊脂糖珠，加100μL裂解緩沖液重懸。4、捕獲免疫復(fù)合物：(1)在EP管中分別加入50μLProteinA/GAgarose，低速1000g離心1min除去儲(chǔ)存液，并用100μLPBS洗滌兩次，低速離心棄洗滌液；(2)加入第2步中免疫復(fù)合物，體系用裂解緩沖液補(bǔ)齊至1mL，4℃混合室溫孵育2h；(3)1000g離心1min，加入200μLIPwashbuffer，洗滌2-3次；(4)再用100μL1×Conditoningbuffer洗滌1次。5、洗脫免疫復(fù)合物：加入50μlElutionBuffer，室溫下孵育10min，沸水煮10min，3000g離心30s，取上清存于-80℃，或直接用于SDS-PAGE電泳分析。6、SDS-PAGE檢測(cè)電泳操作同3.2.5，電泳結(jié)束后斷開(kāi)電源，取下凝膠，將凝膠邊緣多余部分切掉，放在有考馬斯亮藍(lán)染色液的染色池中染色40min。然后將膠從染色液中取出，用清水將多余的染液沖掉，放入脫色液中脫色。期間，及時(shí)更換脫色液，待條帶清楚時(shí)，停止脫色，觀察拍照。3.2.2GST-Pulldown3.2.2.1Drebrin基因克隆和帶GST標(biāo)簽的原核表達(dá)1、從鼠腦組織中擴(kuò)增Drebrin鼠腦TotalRNA提取及反轉(zhuǎn)錄操作同3.2.4描述。以鼠腦cDNA為模板，利用Drebrin特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳分析后，與DL2000、DL5000DNAMarker進(jìn)行比較。PCR擴(kuò)增體系見(jiàn)表7。表7鼠腦Drebrin基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系特異PCR擴(kuò)增的條件為：94℃預(yù)變性4min；94℃變性1min、65℃退火1min、72℃延伸2min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。2、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收和純化采用切膠純化法進(jìn)行純化，按照寶生物工程(大連)有限公司的DNA凝膠回收試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。3、Drebrin基因片段與pMD18-T載體連接將回收的Drebrin片段DNA與pMD18-T于4℃連接過(guò)夜。連接體系見(jiàn)表8：表8連接反應(yīng)體系根據(jù)pMD18-TVectorKit說(shuō)明書(shū)，將上述各組分加入到一個(gè)新鮮干凈的0.2mL離心管中，整個(gè)操作過(guò)程在冰浴上進(jìn)行。4、將所得pMD18-Drebrin重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(DH5α)，培養(yǎng)12-14h。5、提取pMD18-Drebrin重組質(zhì)粒，-20℃保存。6、pMD18-Drebrin重組質(zhì)粒的酶切及測(cè)序鑒定提取的質(zhì)粒用BamHI和XhoI進(jìn)行雙酶切鑒定，將酶切鑒定正確的陽(yáng)性質(zhì)粒送到上海生工公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與Genebank中的序列進(jìn)行比對(duì)，核苷酸序列正確的陽(yáng)性質(zhì)粒命名為PMD18-Drebrin。7、表達(dá)載體pGEX-6p-1的線(xiàn)性化提取pGEX-6p-1載體質(zhì)粒，并用BamHI和XhoI對(duì)pGEX-6p-1載體進(jìn)行雙酶切；用1％瓊脂糖凝膠電泳，切下目的條帶后用膠回收試劑盒進(jìn)行回收線(xiàn)性化的pGEX-6p-1載體。8、帶粘性末端Drebrin基因片段的制備提取質(zhì)粒pMD18-Drebrin，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒pMD18-Drebrin用BamHI和XhoI雙酶切，1％瓊脂糖凝膠電泳，切下目的條帶后用膠回收試劑盒說(shuō)回收帶粘性末端的Drebrin目的片段。9、Drebrin與線(xiàn)性化表達(dá)載體pGEX-6p-1的連接及轉(zhuǎn)化將帶有粘性末端的Drebrin基因片段連接至線(xiàn)性化的pGEX-6p-1載體，連接體系如下：表9目的基因與線(xiàn)性化表達(dá)載體pGEX-6p-1的連接體系混勻后短暫離心，于4℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)12～14h。10、重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定提取重組質(zhì)粒，用BamHI和XhoI雙酶切，1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將鑒定為陽(yáng)性的重組表達(dá)質(zhì)粒送往送到上海生工公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與Genebank中的序列進(jìn)行比較分析，核苷酸序列正確的陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pGEX-6p-1-Drebrin。鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒放在-20℃保存，對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性菌液可于4℃短暫保存，長(zhǎng)期保存需加入甘油置于-80℃保存。11、GST融合蛋白的表達(dá)及純化(1)將重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-Drebrin轉(zhuǎn)入BL21大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑單克隆于5mLLB培養(yǎng)基中(含100μg/mLAmp+)，37℃180rpm過(guò)夜，第二天吸取1mL加入100mL培養(yǎng)基中擴(kuò)培至OD值為0.6左右；(2)加IPTG至終濃度0.4mmoL/L誘導(dǎo)，20℃培養(yǎng)3h收菌，離心8500rpm棄上清后，用PBS洗滌沉淀3次；(3)加入細(xì)胞裂解液，超聲破碎后4℃12000rpm離心10min，取上清；(4)取50μL上清加10μL6×Loadingbuffer，沸水中煮10min，-20℃放置5min后10000rpm離心5min，取上清做WB檢測(cè)表達(dá)情況；(5)取150ulGST瓊脂糖均分為3管，用PBST洗滌3次，再用PBS洗滌一次，備用；(6)WB驗(yàn)證正確的陽(yáng)性菌株制備新鮮細(xì)菌裂解液，上清加入GST瓊脂糖中(留一部分細(xì)菌裂解液作為Input)，混合儀上4℃孵育1h，離心棄上清，用細(xì)胞裂解液洗滌瓊脂糖3次。12、弓形蟲(chóng)全蛋白提取(1)用HFF細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)PRU株速殖子，待細(xì)胞破裂釋放出大量蟲(chóng)體時(shí)進(jìn)行收集，用細(xì)胞刮刀將貼壁細(xì)胞刮下，然后用27g針頭的注射器反復(fù)吹吸破碎全部細(xì)胞，讓蟲(chóng)體釋放更加完全，混合液轉(zhuǎn)入15mL離心管，先低速離心(800rpm，5min)去除大的細(xì)胞碎片，取上清繼續(xù)4000rpm離心10min收集蟲(chóng)體，計(jì)數(shù)約為109個(gè)；(2)將蟲(chóng)體置于預(yù)冷的研缽中，加入液氮研磨至粉末；(3)加入900μL裂解液，將裂解的蛋白移入1.5mLEp管中超聲破碎10min，4℃12000rpm離心10min取上清，即為弓形蟲(chóng)全蛋白。13、體外蛋白質(zhì)結(jié)合分析(1)將弓形蟲(chóng)蛋白平均分成兩份，一份加入上一步的GST空載-瓊脂糖中，另一份加入GST-Drebrin-瓊脂糖中，加入等量的裂解液于另一份GST-Drebrin-瓊脂糖中，混合儀上4℃孵育過(guò)夜；(2)離心將瓊脂糖與蛋白裂解液分離，棄裂解液，用細(xì)胞裂解液洗磁洗滌3次，再用PBS洗滌1次，用20mM還原型谷胱甘肽洗脫10min；(4)再次離心將瓊脂糖與蛋白裂解液分離，將還原型谷胱甘肽吸入新的1.5mlEp管中，加入Loadingbuffer混勻后沸水煮10min，離心后吸取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳、銀染和WB；(5)WB：一抗稀釋比例為兔抗Drebrin多抗1:1000，GST抗體1:6000；二抗稀釋比例為1:8000；(6)銀染：SDS-PAGE電泳結(jié)束后將凝膠取下，放入干凈的銀染盒中，加入固定液(40％乙醇，10％乙酸，50％去離子水)室溫水平搖床上固定30min；小心倒掉固定液，加入敏化液(乙酸鈉10.2g,硫代硫酸鈉0.471g，乙醇45mL，去離子水補(bǔ)足到150mL)室溫水平搖床上敏化30min；倒掉敏化液，用去離子水漂洗4次，每次5min；倒掉漂洗液，加入染色液(硝酸銀0.375g溶解于150ml去離子水中)室溫水平搖床上染色30min；倒掉染色液，用去離子水漂洗2次，每次40s；倒入顯色液(碳酸鈉4.5g，甲醛72μL，溶解于180mL去離子水中)，水平搖床上染色25s，倒掉顯色液，再加入顯色液顯色直至條帶清晰；倒掉顯色液，加入終止液(Na2EDTA2.19g溶解于150mL去離子水中)終止顯色反應(yīng)；愛(ài)普生掃描儀掃描成像，并保存。3.2.3質(zhì)譜鑒定銀染條帶酶解：1、切膠：將需要進(jìn)行質(zhì)譜鑒定的蛋白條帶切出后放入EP管中。2、水洗：每管加入120-150μLMilli-Q水，置于震蕩器震蕩1min，吸出液體。每管再加入120-150μLMilli-Q水，置于震蕩器震蕩1min，吸出液體的同時(shí)用槍頭把膠粒切成1mm3大小。3、脫色：加脫色液50μL于EP管中，置于白色濾紙上觀察，顏色完全脫去后馬上吸出液體，然后加150μLddH2O沖洗停止反應(yīng)，吹打洗滌膠粒，吸出液體后再加入150μLddH2O洗膠粒兩次。4、脫水：每管加入150μL100％ACN，震蕩30s等膠粒變白后吸出液體。5、還原：往干燥膠粒中加入120μL25mMDTT，放55℃孵育50min。6、水洗：吸出DTT，加入150μLddH2O吹打洗滌膠粒3次。7、脫水：加入150μL100％CAN脫水至膠粒變白。8、烷基化：每管加入100μL55mMIAA，室溫暗處孵育40min。9、水洗：將IAA吸出，加入150μLddH2O吹打水洗膠粒3次。10、脫水：加入150μL100％ACN脫水至膠粒變白。11、酶解：用覆蓋液(25mMNH4HCO3，10％ACN)稀釋胰酶至10ng/μL；每管膠粒加入胰酶10μL，冰浴30min后吸掉多余的胰酶；再加入15μL左右25mMNH4HCO3至覆蓋膠粒，小心將EP管倒轉(zhuǎn)，將整個(gè)EP管架放入塑料盒中，放入37℃恒溫箱酶切12-16h。12、肽段提?。簩P管盒直接放入超聲儀中超聲破碎15-20min，吸出肽段，真空抽干，用6μL30％ACN重溶。蛋白產(chǎn)物溶液酶解由于CoIP電泳結(jié)果條帶不明顯，所以對(duì)獲得的蛋白溶液進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，Pulldown實(shí)驗(yàn)的蛋白溶液也進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，作為對(duì)條帶質(zhì)譜的補(bǔ)充，蛋白溶液酶解操作如下：1、向蛋白溶液中加入0.05MTCEP溶液充分混勻，60℃反應(yīng)1h；加入55mMMMTS溶液，室溫避光孵育45min。2、處理10KD超濾管：加入70％乙醇潤(rùn)洗，12000g離心20min，棄掉濾液；加入純水潤(rùn)洗，12000g離心20min，棄掉濾液。3、將蛋白液加入10KD超濾管，12000g離心20min，棄掉濾液；加入100μLUA溶液(8M尿素，0.1MTris/HCL，pH8.5)，12000g離心20min，離心2次。4、加入100μL0.25MTEAB，12000g離心20min，重復(fù)3次。5、加入50μL0.5MTEAB，加入胰酶(胰酶儲(chǔ)存于50mM乙酸中，儲(chǔ)存濃度為1μg/μL)，胰酶與蛋白質(zhì)量比為1:50，37℃過(guò)夜。第二天早上補(bǔ)加胰酶，胰酶與蛋白質(zhì)量比為1:100，繼續(xù)反應(yīng)4h。6、更換新的收集管，離心收集濾液，再向超濾管中加入50μL0.5MTEAB，離心并和之前的濾液合并，低溫真空抽干，用6μL30％ACN重溶。質(zhì)譜檢測(cè)：1、肽段用樣品溶解液(0.1％甲酸、2％乙腈)溶解，充分振蕩渦旋，13200rpm，4℃離心10min，上清轉(zhuǎn)移到上樣管中，進(jìn)行質(zhì)譜鑒定；2、樣品通過(guò)FinniganSurveyor高效液相系統(tǒng)讓多肽經(jīng)過(guò)C18反向柱(300μmi.d.x5mm,packedwithAcclaimPepMapRSLCC18,5μm,nanoViper)進(jìn)行分離；分離參數(shù)：流動(dòng)相A：0.1％甲酸；流動(dòng)相B：0.1％甲酸，80％ACN；流速：300nL/min；分析時(shí)間：65min；有效梯度：B相從5％上升至90％，5％5min，50％45min，90％50min，90％55min，5％65min。3、質(zhì)譜參數(shù)：分離后的肽段直接進(jìn)入質(zhì)譜儀ThermoScientificQExactive進(jìn)行在線(xiàn)檢測(cè)，具體參數(shù)如下：表10質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置4、數(shù)據(jù)庫(kù)檢索：質(zhì)譜原始文件經(jīng)過(guò)MMFileConversion軟件處理轉(zhuǎn)換，得到MGF格式文件，然后用Proteinpilot(5.0.1版本)檢索Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索參數(shù)如下：表11蛋白質(zhì)檢索參數(shù)設(shè)置實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論Q9QXS6的CoIP和Pulldown兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的交集是6個(gè)弓形蟲(chóng)蛋白，分別如表12所示：表126個(gè)弓形蟲(chóng)蛋白在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)的登錄號(hào)為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的有益效果，本發(fā)明第四實(shí)施例針對(duì)TgRPS14、TgH4基因進(jìn)行基因敲除實(shí)驗(yàn)和神經(jīng)行為學(xué)驗(yàn)證。具體地，包括：4.1基于CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)構(gòu)建TgRPS14、TgH4基因缺失的蟲(chóng)株4.1.1用CRISPR/CAS9敲除弓形蟲(chóng)的基因4.1.1.1特定基因的CRISPR質(zhì)粒構(gòu)建在web-serverE-CRISP(http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html)上獲取靶定GOI的gRNA序列，長(zhǎng)度為20bp，其后緊挨著PAM序列(NGG)。選擇好gRNA序列之后，通過(guò)PCR突變用所選基因特異的gRNA去置換CRISPR原始質(zhì)粒(pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT)上的UPRT，使用Q5突變?cè)噭┖校０鍨閜SAG1::CAS9-U6::sgUPRT質(zhì)粒，引物是GOI-gRNA-Fw/GOI-gRNA-Rv，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)置反應(yīng)體系，反應(yīng)條件如下：PCR擴(kuò)增后，取出5μL產(chǎn)物用0.8％瓊脂糖凝膠電泳鑒定是否擴(kuò)增成功(片段大小9674bp)。若鑒定PCR反應(yīng)有效，將剩余的PCR產(chǎn)物按照Q5試劑盒操作進(jìn)行KLD反應(yīng)和轉(zhuǎn)化?？蛇x步驟(推薦)：在KLD反應(yīng)前用DpnI消化PCR產(chǎn)物可以提高突變的效率。每12.5μLPCR產(chǎn)物中加入1μLDpnI酶，37℃孵育15-30min后用DpnI消化產(chǎn)物(不要求純化時(shí))，然后繼續(xù)KLD反應(yīng)和其他步驟。挑選正確的目的基因靶定gRNA克隆。從平板上挑選4-6個(gè)單克隆，接種到5mlLB培養(yǎng)基(Amp100μg/ml)，37℃搖床培養(yǎng)12-16h。提取質(zhì)粒并用0.8％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。要確定已經(jīng)成功用目的基因靶定的gRNA置換的原本的UPRTgRNA，需要用M13-rev(5'-CAGGAAACAGCTATGAC)或M13R(-48)(5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA)作為引物對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。鑒定正確的克隆保留待用。4.1.1.2同源模板質(zhì)粒構(gòu)建以下步驟是如何構(gòu)建一個(gè)包含目的基因序列同源片段的質(zhì)粒并用其敲除部分或全部的目的基因。同源模板質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)商品化的試劑盒(如Gibsonassemblykit或NEBuilderHiFiDNAassemblykit)一步克隆組裝多個(gè)片段。以下步驟是根據(jù)Gibson試劑盒列出，說(shuō)明書(shū)內(nèi)有更詳盡的步驟。設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增克隆載體(如PUC19)，同源臂(左臂和右臂)，以及選擇性標(biāo)簽。因?yàn)橥幢鄣奈恢脹Q定了基因編輯的位置，設(shè)計(jì)時(shí)必須與實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊恢?。引物的設(shè)計(jì)還需保證PCR產(chǎn)物末端能夠進(jìn)行后面的重組(參照說(shuō)明書(shū))。用高保真酶擴(kuò)增克隆載體、同源臂和選擇性標(biāo)簽，基因組DNA作為擴(kuò)增同源臂的模板。如果使用質(zhì)粒DNA作為模板，則在PCR擴(kuò)增后，克隆載體和選擇性標(biāo)簽的PCR產(chǎn)物需要用DpnI進(jìn)行消化。每10μLPCR產(chǎn)物中加入1μLDpnI，37℃孵育30min。為了提高成功率，PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳后需要進(jìn)行切膠回收純化，以去除非特異性條帶和引物二聚體，純化后用分光光度計(jì)測(cè)定產(chǎn)物濃度。重組反應(yīng)體系為10μL，包含0.01-0.05pmol等摩爾比值的目的片段和Gibsonassemblymastermix(2×)。在PCR儀中50℃反應(yīng)60min后，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，或直接-20℃凍存待用。需要設(shè)置陰性對(duì)照。重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(如DH5α)。2-3μL重組產(chǎn)物或陰性對(duì)照加入50μL感受態(tài)細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作和培養(yǎng)篩選。鑒定陽(yáng)性克隆。從平板上挑選4–6個(gè)菌落，分別用5mLLB肉湯培養(yǎng)基(加入對(duì)應(yīng)抗生素)培養(yǎng)12–16h。小提質(zhì)粒后用酶切和測(cè)序鑒定。陽(yáng)性克隆鑒定正確后，用酶切的方式或PCR擴(kuò)增來(lái)大量獲取同源模板，以進(jìn)行接下來(lái)的蟲(chóng)體轉(zhuǎn)染。這一步的目的是排除載體序列的干擾，提高轉(zhuǎn)染時(shí)同源重組的效率。4.1.2蟲(chóng)體轉(zhuǎn)染1.培養(yǎng)HFF細(xì)胞(T25培養(yǎng)瓶)：略2.準(zhǔn)備蟲(chóng)體：用適宜劑量的蟲(chóng)體感染HFF細(xì)胞，待感染后細(xì)胞裂解并自然釋放蟲(chóng)體達(dá)到50-80％時(shí)，刮取細(xì)胞并用22G注射器反復(fù)抽吸3–5次，使宿主細(xì)胞破碎釋放蟲(chóng)體。用3μm濾膜過(guò)濾除去細(xì)胞碎片，400g18℃離心10min，棄上清，沉淀用10mLHank’s平衡鹽緩沖液洗滌并重懸，相同條件再次離心后用適量cytomixbuffer重懸(蟲(chóng)體密度4×107/ml)。3.在電轉(zhuǎn)杯中配制轉(zhuǎn)染體系(300μL)蟲(chóng)體懸液250μl同源模板(PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物)1.5μg目的基因CRISPR質(zhì)粒7.5μgATP(0.2M，100×)3μl谷胱甘肽(0.5M，100×)3μlCytomix加至300μl陰性對(duì)照不加同源模板和目的基因的CRISPR質(zhì)粒。4.在電轉(zhuǎn)杯中混合以上組分后進(jìn)行電穿孔。對(duì)于BTXECM-830電轉(zhuǎn)儀(4mm間隙電轉(zhuǎn)杯)，我們使用1700V，脈沖持續(xù)時(shí)間176μsec，2次脈沖間隔100msec。陰性對(duì)照也要進(jìn)行電轉(zhuǎn)。電轉(zhuǎn)后立即將蟲(chóng)體轉(zhuǎn)入HFF細(xì)胞(T25培養(yǎng)瓶)，放入CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。4.1.3藥物篩選和蟲(chóng)體增殖1.電轉(zhuǎn)后的蟲(chóng)體從HFF細(xì)胞中自然釋放后，將1/5-1/3的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至包含篩選藥物的培養(yǎng)基中，重復(fù)此過(guò)程直至孔中耐藥蟲(chóng)株穩(wěn)定，即陰性對(duì)照組的蟲(chóng)體全部死亡，而實(shí)驗(yàn)組則能耐受每2–4天的藥物篩選。2.提取耐藥組一個(gè)孔的基因組，按照Fig1(PCR1和PCR2)進(jìn)行PCR鑒定是否包含陽(yáng)性克隆(基因敲除)。3.如果PCR1和PCR2鑒定為陽(yáng)性，則將對(duì)應(yīng)的孔用有限稀釋法進(jìn)行克隆。宿主細(xì)胞自然釋放出蟲(chóng)體后，刮取細(xì)胞并用22G注射器破碎細(xì)胞，用3μm濾膜過(guò)濾除去細(xì)胞碎片后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)蟲(chóng)體，以估算培養(yǎng)基中總的蟲(chóng)體密度。將培養(yǎng)基用新鮮的D10培養(yǎng)基(不含藥物)稀釋至每150μl2–3個(gè)蟲(chóng)體(Ⅰ型蟲(chóng)株)，或每150μl3–5個(gè)蟲(chóng)體(其他蟲(chóng)株)。按150μl/孔將稀釋好的培養(yǎng)基加入已有HFF細(xì)胞的96孔板，培養(yǎng)7–10天，過(guò)程中不可移動(dòng)，以形成HFF單層細(xì)胞噬斑。4.1.4陽(yáng)性克隆鑒定1.噬斑形成后，在倒置顯微鏡下檢查96孔板的每個(gè)孔，并找到只有一個(gè)噬斑的孔。將此孔中的蟲(chóng)體轉(zhuǎn)移至已有單層HFF細(xì)胞的24孔板中培養(yǎng)，直至宿主細(xì)胞自然釋放出蟲(chóng)體。2.24孔板每一孔中釋放出的蟲(chóng)體取一小份轉(zhuǎn)入新的板中，剩余用來(lái)進(jìn)行PCR鑒定(Fig1中的PCR1，PCR2和PCR3)。PCR1和PCR2檢測(cè)陽(yáng)性，PCR3檢測(cè)陰性的即為成功敲除目的基因的克隆，可以進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)(如WB)。3.鑒定出的陽(yáng)性克隆要轉(zhuǎn)入T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，并及時(shí)凍存保種。4.2建立弓形蟲(chóng)PRU株野生型與TgRPS14、TgH4基因缺失型小鼠感染模型與神經(jīng)行為測(cè)驗(yàn)120只KM小鼠(18-22g，雌性)隨機(jī)均分為4組，其中3組分別感染PRU株野生型、TgRPS14基因缺失株、TgH4基因缺失株，另一組作為正常對(duì)照。每只小鼠腹腔注射100個(gè)弓形蟲(chóng)速殖子記錄動(dòng)物存活時(shí)間、發(fā)病情況，出現(xiàn)死亡者，生理鹽水腹腔灌洗法、解剖頭部，取腦組織直接涂片，查找弓形蟲(chóng)，若未發(fā)現(xiàn)弓形蟲(chóng)，將腦組織用0.25％胰酶消化1小時(shí)，涂片，吉姆薩染色，查找弓形蟲(chóng)，或?qū)⒛X組織搗碎，直接盲傳小白鼠。感染后60d進(jìn)行小鼠神經(jīng)行為測(cè)驗(yàn)，內(nèi)容包括對(duì)貓氣味的反應(yīng)、游泳試驗(yàn)、迷宮試驗(yàn)等，并用Lab-maze動(dòng)物行為學(xué)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。A.一般行為學(xué)與震顫麻痹評(píng)分觀察：給藥后立即觀察行為變化，無(wú)任何癥狀0分；間斷性細(xì)小震顫，但活動(dòng)自如1分；頻繁性震顫，后肢僵直，顫尾，活動(dòng)逐漸受限2分；連續(xù)性震顫，四肢僵硬，吞咽活動(dòng)頻繁，活動(dòng)受限3分；全身麻痹而死亡4分。B.自主活動(dòng)計(jì)數(shù)(openfield)：開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)同樣可以檢測(cè)動(dòng)物的焦慮程度和自主活動(dòng)能力。實(shí)驗(yàn)裝置主要為一60cm×60cm×40cm大小的頂部開(kāi)口的箱體。在安靜、光線(xiàn)較暗的環(huán)境中檢測(cè)。小鼠適應(yīng)環(huán)境10min后,計(jì)數(shù)5min內(nèi)小鼠移動(dòng)(ambulation)的格子數(shù)和站立(rearing)的次數(shù),連續(xù)測(cè)5次取平均值。C.游泳實(shí)驗(yàn)(swimtest)：將受試小鼠放入一個(gè)20cm×30cm×20cm規(guī)格的有機(jī)玻璃水箱中,水深10cm,水溫為22℃-25℃。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：在1min內(nèi)能連續(xù)不斷游泳者記310分；大部分時(shí)間游泳僅偶爾漂浮者記215分；漂浮時(shí)間占整個(gè)受試時(shí)間50％以上者記210分；偶爾游泳者記115分；偶爾用后肢游動(dòng)并漂浮在水箱一邊者記110分。每次檢測(cè)間隔1min,共檢測(cè)5次取平均值。D.爬桿實(shí)驗(yàn)(poletest)：直徑018cm,高60cm的直木桿頂部有一小木球,外面覆蓋紗布以防止小鼠打滑。小鼠被頭向上放于桿頂端,計(jì)錄兩個(gè)時(shí)間：動(dòng)物從開(kāi)始運(yùn)動(dòng)到完全轉(zhuǎn)為頭向下的時(shí)間和它們下到桿底的時(shí)間。每次檢測(cè)間隔1min,共檢測(cè)5次取平均值。E.懸掛實(shí)驗(yàn)(gridtest)：有機(jī)玻璃懸掛實(shí)驗(yàn)箱,水平放置的金屬桿直徑115mm,距地面30cm,金屬桿上方1cm加蓋,以避免小鼠翻坐于金屬上,實(shí)驗(yàn)中小鼠懸掛于金屬桿上,記錄落地前的時(shí)間,按下述標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分：0～4s評(píng)0分,5～9s評(píng)1分,10～14s評(píng)2分,15～19s評(píng)3分,20～24s評(píng)4分,25～29s評(píng)5分,超過(guò)30s評(píng)6分。每次檢測(cè)間隔1min,共檢測(cè)5次取平均值。變異系數(shù)(co-efficientofvariation,CV)：幾種行為學(xué)檢測(cè)方法采用單位不同,因此通過(guò)計(jì)算每只小鼠5次檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù),求出每種檢測(cè)方法10只小鼠所得變異系數(shù)的x和s,進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)方法間的比較,對(duì)比不同方法測(cè)得結(jié)果的穩(wěn)定性。在每種檢測(cè)方法中按順序計(jì)算10只小鼠從第1到第5次檢測(cè)結(jié)果的x和s,求出每次結(jié)果的CV，反映從第1到第5次檢測(cè)結(jié)果的變化趨勢(shì)。F.Y型迷宮實(shí)驗(yàn)：基本原理是利用老鼠喜陰暗的天性，給予電擊刺激，使其逃離陰暗區(qū)，即此處是傷害源(電擊)，從而避開(kāi)，趨向一個(gè)安全的正性刺激(光亮區(qū))。Y型迷宮的電擊程度和時(shí)間是可控的，但對(duì)于老鼠來(lái)說(shuō)電擊畢竟是一種傷害管，使動(dòng)物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而影響學(xué)習(xí)記憶活動(dòng)。在筆者近期做的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中曾出現(xiàn)有小鼠低電壓下沒(méi)反應(yīng)，而電壓稍高就疼痛呻吟的情況。在目前Y迷宮多用于藥物篩選。G.八臂迷宮：一種用于研究動(dòng)物空間記憶的迷宮模型。它由一個(gè)中心區(qū)和其周?chē)B接的八條臂組成，在其中一些臂的末端放入食餌或?qū)⒁恍┍凼┮噪姄?，根?jù)動(dòng)物的取食或逃避策略(進(jìn)入每個(gè)臂的次數(shù)、時(shí)間、錯(cuò)誤次數(shù)、路線(xiàn)等)，可反應(yīng)其空間記憶能力；強(qiáng)大、靈活的GSN軟件系統(tǒng)具備八臂迷宮所有的功能(如動(dòng)物活動(dòng)路徑、各種時(shí)間、次數(shù)及參數(shù))，還能通過(guò)聲、光、電等刺激-應(yīng)答模塊建立完整的各種條件、非條件刺激環(huán)境，具有超強(qiáng)的運(yùn)行學(xué)習(xí)記憶實(shí)驗(yàn)的能力。對(duì)于八臂迷宮，它所記錄的數(shù)據(jù)資料，如時(shí)間、動(dòng)物位置、進(jìn)入某個(gè)區(qū)域的次數(shù)等，根據(jù)不同的模型其意義都不一樣，不同的模型也要在軟件系統(tǒng)中設(shè)計(jì)不同的實(shí)驗(yàn)方案，選擇不同的參數(shù)，可記錄的指標(biāo)是靈活多變的。為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的有益效果，本發(fā)明第五實(shí)施例針對(duì)TgRPS14、TgH4基因分別克隆到慢病毒載體，并進(jìn)行小鼠神經(jīng)行為學(xué)功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。具體地，包括：根據(jù)Rab2和HSP60基因編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR以蟲(chóng)體cDNA為模板擴(kuò)增克隆至pCDH-CMV-EF1-GFP-Puro慢病毒載體中。制備慢病毒穿梭質(zhì)粒及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒，三種質(zhì)粒載體分別進(jìn)行高純度無(wú)內(nèi)毒素抽提，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6h更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48和72h后，分別收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，病毒上清液通過(guò)超速離心濃縮病毒。檢測(cè)病毒滴度后，根據(jù)待感染細(xì)胞的MOI值，取適量病毒液侵染N2a細(xì)胞或感染小鼠，觀察細(xì)胞形態(tài)狀態(tài)和小鼠癥狀，進(jìn)行小鼠神經(jīng)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3