本發(fā)明屬于廢水吸附劑及其制備和應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種處理含鈾廢水的鈾酰離子結(jié)合十二肽和編碼該十二肽的核酸，含有該核酸的載體、細(xì)胞，以及鈾酰離子結(jié)合十二肽的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著核工業(yè)的發(fā)展，天然鈾的需求量不斷增加，在鈾礦冶工業(yè)的各主要生產(chǎn)環(huán)節(jié)以及鈾元素的應(yīng)用中，產(chǎn)生了大量的含鈾放射性廢水。這些含鈾廢水如不進(jìn)行排放前處理，將對地表水、地下水和土壤產(chǎn)生放射性污染，從而對環(huán)境及人類健康構(gòu)成極大危害。如何減少廢水中鈾的放射性危害，同時有效回收利用昂貴而且有限的鈾資源，已成為制約鈾工業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要問題之一。

生物吸附技術(shù)的出現(xiàn)給重金屬污染處理帶來了新的轉(zhuǎn)機(jī)。其中，微生物吸附成本低、效率高、在處理含鈾廢水和回收鈾資源方面有著廣闊的應(yīng)用前景。微生物細(xì)胞對廢水中重金屬離子的吸附一般可分為胞內(nèi)吸附、細(xì)胞表面吸附和胞外吸附。胞內(nèi)吸附主要是通過重金屬離子與細(xì)胞內(nèi)的金屬硫蛋白、金屬硫蛋白樣蛋白、植物螯合素等金屬結(jié)合蛋白相結(jié)合，在細(xì)胞內(nèi)沉淀固定。研究發(fā)現(xiàn)，在多種微生物、動物和植物細(xì)胞內(nèi)普遍存在對金屬離子具有親和能力的蛋白質(zhì)(肽)，稱為金屬結(jié)合蛋白(肽)，它們可與環(huán)境中的金屬離子通過化學(xué)結(jié)合作用形成復(fù)合物，進(jìn)而降低、富集或消除金屬離子對生物細(xì)胞的毒性。金屬結(jié)合肽的應(yīng)用范圍較廣，其中應(yīng)用領(lǐng)域之一是環(huán)境中重金屬污染的生物修復(fù)。目前研究的金屬結(jié)合肽主要為天然存在的結(jié)合肽，但是，天然結(jié)合肽種類有限，且未發(fā)現(xiàn)鈾酰離子特異性結(jié)合肽。

隨機(jī)肽庫技術(shù)的出現(xiàn)為研究并篩選鈾酰離子特異性結(jié)合肽提供了一條有效的途徑。隨機(jī)肽庫是由與細(xì)胞外殼蛋白融合表達(dá)的多肽所組成，庫中包含上億種多肽分子，分別呈現(xiàn)在不同的細(xì)胞表面，眾多重組細(xì)胞即組成了隨機(jī)肽庫。近年來，隨機(jī)肽庫技術(shù)已應(yīng)用于抗原表位篩選、新受體及天然配體結(jié)構(gòu)域的識別和鑒定、藥物篩選和設(shè)計等研究領(lǐng)域。利用隨機(jī)肽庫技術(shù)篩選鈾酰離子結(jié)合肽，并研究該結(jié)合肽對廢水中鈾酰離子的吸附作用，具有較好的應(yīng)用前景。

酵母菌被認(rèn)為是富集金屬離子的良好微生物，對鈾離子有較強(qiáng)的吸附作用，具有安全、培養(yǎng)簡單、生長迅速等優(yōu)良特性，同時，酵母細(xì)胞易于固定化處理，方便機(jī)械化和自動化應(yīng)用。通過細(xì)胞表面展示技術(shù)將鈾酰離子結(jié)合肽展示在酵母細(xì)胞表面，使結(jié)合肽與環(huán)境中的鈾酰離子直接作用，可以有效提高吸附速率及吸附量。同時，結(jié)合肽螯合鈾酰離子并將其堆積在細(xì)胞表面，不需要破碎菌體細(xì)胞就可以將鈾酰離子洗脫下來，既方便金屬離子的回收利用，也可使細(xì)胞循環(huán)用于金屬除污，降低生產(chǎn)成本。由于吸附作用主要取決于細(xì)胞表面結(jié)合肽的螯合作用，而不依賴于細(xì)胞的生命活動，因此，即使制備的細(xì)胞失去了生命活力，只要保證結(jié)合肽的正確折疊結(jié)構(gòu)，就不會降低細(xì)胞對鈾酰離子的吸附量，這無疑將簡化細(xì)胞吸附劑的使用條件及操作程序。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種處理含鈾廢水的鈾酰離子結(jié)合十二肽，其對水溶液中的鈾酰離子具有高親和力，同時還提供了鈾酰離子結(jié)合十二肽的編碼核酸，含有該核酸的載體、細(xì)胞，以及鈾酰離子結(jié)合十二肽的應(yīng)用。本發(fā)明通過篩選鈾酰離子結(jié)合十二肽，并在酵母細(xì)胞表面進(jìn)行展示制備吸附劑，具有潛在的提高細(xì)胞吸附量的能力，是一條極具前途的開發(fā)新型鈾酰離子吸附材料的有效途徑。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種處理含鈾廢水的鈾酰離子結(jié)合十二肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2所示。

編碼鈾酰離子結(jié)合十二肽的核酸，其編碼SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，編碼SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

一種載體，其為含有如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示多核苷酸序列的載體。

一種細(xì)胞，其為含有上述載體，或者轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染有上述核酸的釀酒酵母細(xì)胞，細(xì)胞表面展示了鈾酰離子結(jié)合十二肽。

一種鈾酰離子特異性結(jié)合十二肽在制備處理含鈾酰離子廢水的吸附材料中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明通過篩選噬菌體隨機(jī)十二肽庫，得到了兩種鈾酰離子結(jié)合十二肽。試驗證明，鈾酰離子結(jié)合十二肽對水溶液中的鈾酰離子具有高親和力，能與鈾酰離子特異性結(jié)合，將鈾酰離子結(jié)合十二肽展示在酵母細(xì)胞表面制備吸附材料，可有效提高酵母細(xì)胞對廢水中鈾酰離子的吸附作用，具有較好的應(yīng)用前景。同時本發(fā)明所述的結(jié)合肽的篩選方法，也為篩選其它金屬離子結(jié)合肽提供了切實可行的技術(shù)方案。

附圖說明

圖1為鈾酰離子結(jié)合十二肽對鈾酰離子的親和性測定；

圖2為鈾酰離子結(jié)合十二肽對其它金屬離子的反篩實驗；

圖3為本發(fā)明實施例2中的重組表達(dá)載體pYD-12-2、pYD-12-7示意圖；

圖4為釀酒酵母細(xì)胞EBY100-12-2、EBY100-12-7的免疫熒光檢測；

圖5為溶液初始pH值對酵母工程菌EBY100-12-2吸附鈾酰離子的影響；

圖6為吸附時間對酵母工程菌EBY100-12-2吸附鈾酰離子的影響；

圖7為初始濃度對酵母工程菌EBY100-12-2吸附鈾酰離子的影響；

圖8為溫度對酵母工程菌EBY100-12-2吸附鈾酰離子的影響；

圖9為初始pH對酵母工程菌EBY100-12-7吸附鈾酰離子的影響；

圖10為吸附時間對酵母工程菌EBY100-12-7吸附鈾酰離子的影響；

圖11為初始濃度對酵母工程菌EBY100-12-7吸附鈾酰離子的影響；

圖12為溫度對酵母工程菌EBY100-12-7吸附鈾酰離子的影響。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此，凡是對本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。

實施例1

本實施例中提供了一種鈾酰離子結(jié)合十二肽的篩選方法，包括以下步驟：

(1)鈾酰離子螯合樹脂的制備

在無菌條件下，移取100μl樹脂于1.5mL離心管中，13000rpm，5min離心，去上清。用1mL無菌水重懸樹脂，13000rpm，5min離心，重復(fù)4次。將處理過的樹脂加入150mL，濃度為20μg/mL的無菌鈾標(biāo)溶液中，150rpm振蕩過夜。13000rpm，10min離心，去上清，獲得了鈾酰離子螯合樹脂(M^U+)。實驗中設(shè)置滅菌超純水處理的樹脂作為對照(M^-)。

(2)隨機(jī)十二肽庫的第一輪篩選

取100μl M^U+、M^-樹脂各一支，各加入1000μl 0.1％TBST(pH7.4)，清洗2遍。在M^U+、M^-樹脂中分別加入10μl噬菌體十二肽庫(購于美國New England Biolabs，NEB公司)。25℃，100rpm室溫溫和混勻1h，4℃條件下2000rpm離心30s。分別加入1000μl 0.1％TBST，100rpm震蕩1min后，4℃條件下2000rpm離心30s，棄上清，清洗2次。加入500μl20mmolID，4℃2000rpm離心30s，棄上清，清洗2次。加入1000μl0.1％TBST，4℃2000rpm離心30s，清洗5次。加入300μl 200mmol ID，100rpm，25℃搖床20min；4℃2000rpm離心30s，取上清，重復(fù)2次。合并2次的上清液，即為第一輪篩選后的噬菌體洗脫物。根據(jù)常規(guī)M13方法，測定少量(1μl)洗脫物的滴度。

(3)噬菌體洗脫液的擴(kuò)增

將10μl洗脫物加入到20ml ER2738培養(yǎng)物中(該菌體應(yīng)處于對數(shù)前期)，37℃劇烈搖動(150rpm)培養(yǎng)4.5h。轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物至一新離心管中，4℃10000rpm離心10min，然后將上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中，再離心。轉(zhuǎn)移80％上清到一新管中，加入1/6體積的PEG/NaCl，4℃沉淀至少60min。4℃，12000rpm離心15min，去上清液。4℃，12000rpm離心30s，去除殘留上清液。加入1mL TBS重懸沉淀物，轉(zhuǎn)移懸液到微量離心管中，4℃14000rpm離心5min，沉淀殘余細(xì)胞。轉(zhuǎn)移上清到另一新鮮微量離心管中，加入1/6體積的PEG/NaCl沉淀上清液，冰上孵育30min。沉淀物重懸于200μl TBS，4℃10000rpm離心1min，沉淀任何殘余的不溶物。上清轉(zhuǎn)入新的離心管中，即為第一輪噬菌體洗脫物的擴(kuò)增物。

(4)第二輪篩選

將擴(kuò)增后的噬菌體液用TBS稀釋為1×10¹²cfu/mL，取100μl分別加入到M^U+、M^-樹脂中。第二輪篩中選用1000μl 0.1％TBST，清洗2次，棄上清。加入500μl 20mmolID清洗2次，棄上清。加入1000μl 0.1％TBST清洗5次，棄上清。加入300μl 200mmolID，100rpm，25℃搖床20min。2000rpm，4℃離心30s，取上清，重復(fù)2次，合并2次的上清液，即為第二輪篩選后的噬菌體洗脫物。測洗脫物的滴度。

(5)第三輪篩選

擴(kuò)增第二輪篩選后的噬菌體洗脫物。將擴(kuò)增后的噬菌體液用TBS稀釋為1×10¹²cfu/mL，取100μl分別加入到M^U+、M^-樹脂中。第二輪篩中選用1000μl 0.3％TBST，清洗4次，棄上清。加入500μl 20mmolID清洗4次，棄上清。加入1000μl 0.3％TBST清洗8次，棄上清。加入300μl200mmolID，100rpm，25℃搖床20min。2000rpm，4℃離心30s，取上清，重復(fù)2次，合并2次的上清液，即為第三輪篩選后的噬菌體洗脫物。測洗脫物的滴度。

在篩選過程中，計算每輪M^U+樹脂的洗脫物滴度與M^-樹脂的洗脫物滴度的比值(P/N值)，來反映特異性結(jié)合噬菌體的富集程度。結(jié)果顯示(如表1)，經(jīng)過三輪篩選，噬菌體富集度逐漸升高，表明得到了與鈾酰離子特異結(jié)合的噬菌體克隆。

表1兩輪親和篩選對噬菌體的富集

(6)單克隆噬菌體的擴(kuò)增

將ER2738過夜培養(yǎng)物按1：100的比例稀釋至20ml LB液體培養(yǎng)基中。用滅菌吸頭隨機(jī)挑取20個藍(lán)色噬菌斑，分別加入到ER2738培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)4.5-5h。將培養(yǎng)物于4℃12000rpm離心30s。取上清轉(zhuǎn)入新管中，離心。取80％的上清轉(zhuǎn)入新離心管中，此即為擴(kuò)增的單克隆噬菌體。

(7)噬菌體展示短肽對鈾酰離子的親和性測定

為了檢測篩選到的噬菌體與鈾酰離子的親和性，隨機(jī)挑選15個噬菌體單克隆并進(jìn)行擴(kuò)增，分別將噬菌體擴(kuò)增液與M^U+、M^-兩種樹脂混合，通過洗脫反應(yīng)，測得各處理洗脫液的噬菌體滴度，計算M ^U+樹脂的洗脫物滴度與M^-樹脂的洗脫物滴度比值(P/N值)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，15個噬菌體展示的十二肽對鈾酰離子均具有一定的親和力，但是，不同的結(jié)合肽親和力不同，其中12-2、12-4、12-7、12-18、12-20這4條結(jié)合肽對鈾酰離子的親和性較高，結(jié)果如圖1。

(8)反篩實驗

制備鈰、銫、鍶、釓、釤5種混合金屬離子的螯合樹脂(M^H+)及鈾酰離子螯合樹脂(M^U+)，設(shè)置滅菌超純水處理的樹脂作為對照(M^-)。取100μl M^H+、M^U+、M^-樹脂各一支，分別加入1000μl0.1％TBST(pH7.4)清洗2次。擴(kuò)增含有上述7條結(jié)合肽的噬菌體克隆，將M^H+、M^U+、M^-三種樹脂分別與噬菌體擴(kuò)增液混合，25℃，130rpm搖床室溫1h。加入1000μl 0.1％TBST，2000rpm，4℃離心15s，棄上清，清洗10次。加入500μl 20mmol ID，2000rpm，4℃離心15s，棄上清，清洗8次。加入0.1％的TBST，2000rpm，4℃離心15s，棄上清，清洗10次。加入300μl 200mmol的ID，200rpm，25℃洗脫20min，2000rpm，4℃離心20s，取上清，重復(fù)2次。合并2次的洗脫液，測滴度，計算P/N值，結(jié)果如圖2。

結(jié)果表明，12-2、12-7噬菌體對鈾酰離子的親和力遠(yuǎn)高于對混合金屬離子的親和力。說明，噬菌體12-2、12-7中插入的十二肽為鈾酰離子特異性結(jié)合肽。

(9)噬菌體DNA序列測定

挑取12-2和12-7的噬菌體克隆，用-28gIII(如SEQ ID NO：5所示)和-96gIII測序引物(如SEQ ID NO：6所示)交由蘇州金唯智生物科技有限公司測序。得到的兩條鈾酰離子結(jié)合十二肽的核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。推測其相應(yīng)的氨基酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

實施例2

本實施例中提供了一種鈾酰離子結(jié)合十二肽在釀酒酵母細(xì)胞表面的展示方法，包括以下步驟：

(1)表面展示載體的構(gòu)建

由蘇州金唯智生物科技有限公司合成兩條鈾酰離子結(jié)合十二肽的編碼DNA序列，并連接到表面展示載體pYD1上，形成表達(dá)載體pYD-12-2和pYD-12-7(如圖3所示)。

(2)釀酒酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

活化釀酒酵母EBY100菌株，挑取5個單菌落至50mL YPD液體培養(yǎng)基中，30℃，170rpm過夜培養(yǎng)至OD600至1.0。將過夜培養(yǎng)的菌液稀釋于新的50mL YPD液體培養(yǎng)基中，使OD600為0.6，30℃，170rpm培養(yǎng)3h，測OD600達(dá)1.0。用50mL離心管收集菌體，2500rpm離心5min，棄上清，用40mL 1×TE重懸菌體。2500rpm繼續(xù)離心5min，棄上清，菌體用2mL 1×LiAc/0.5×TE重懸。30℃，80rpm溫育1h；分裝，每管100μl。在管中加入表達(dá)載體(pYD-12-2、pYD-12-7、pYD1)、SS-DNA及700μl 1×LiAc/40％PEG-3350/1×TE，混合均勻；30℃溫育30min，后加入88μl DMSO，混合均勻。42℃熱激7min；4000rpm離心1min，除去上清，收集菌體。用1mL 1×TE重懸菌體，4000rpm繼續(xù)離心1min，去上清，菌體用100μl 1×TE重懸。涂布于MD選擇性平板，30℃倒置培養(yǎng)。培養(yǎng)36h后，在MD選擇性平板上，有酵母菌落出現(xiàn)。

(3)釀酒酵母轉(zhuǎn)化子的誘導(dǎo)表達(dá)及免疫熒光檢測

挑單菌落至10ml含有2％葡萄糖的YNB-CAA培養(yǎng)基中，30℃震蕩培養(yǎng)過夜，至OD600于2～5之間，3000～5000rpm，室溫離心5-10min。雙蒸水洗滌沉淀，離心5min，重復(fù)2次。用含有2％半乳糖的YNB-CAA培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，至OD600為0.5～1。20℃，180rpm震蕩培養(yǎng)24h，即為表達(dá)了結(jié)合十二肽的酵母細(xì)胞。

取誘導(dǎo)后的細(xì)胞培養(yǎng)液，3000～5000rpm，4℃離心5-10min。1×PBS洗滌細(xì)胞，3000～5000rpm，4℃離心5-10min，重復(fù)三次。用250μl的1×PBS，1mg/ml BSA重懸細(xì)胞，加入1μg抗6×His標(biāo)簽的免疫球蛋白(IgG)。冰浴30min，不時混勻，3000-5000rpm，4℃離心5～10min。1×PBS清洗細(xì)胞2次。250μl 1×PBS，1mg/ml BSA重懸細(xì)胞，加入1μg的抗鼠IgG-FITC。黑暗條件下冰浴30min，不時顛倒離心管。1ml1×PBS清洗細(xì)胞2次。40μl 1×PBS重懸細(xì)胞，熒光顯微觀察(如圖4)。結(jié)果表明結(jié)合肽12-2、12-7在酵母細(xì)胞表面成功表達(dá)。將成功表達(dá)結(jié)合肽12-2、12-7的酵母工程菌分別命名為EBY100-12-2、EBY100-12-7，將表達(dá)了載體pYD1的酵母細(xì)胞命名為EBY100-pYD。

實施例3

本實施例中提供了一種鈾酰離子結(jié)合十二肽在制備處理含鈾廢水的吸附材料中的應(yīng)用，包括以下步驟：分別挑取酵母工程菌EBY100-12-2、EBY100-12-7單菌落至10ml含有2％葡萄糖的YNB-CAA培養(yǎng)基中，30℃震蕩培養(yǎng)過夜，至OD600于2～5之間，3000～5000rpm，室溫離心5-10min。雙蒸水洗滌沉淀，離心5min，重復(fù)2次。用含有2％半乳糖的YNB-CAA培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，至OD600為0.5～1。20℃，180rpm震蕩培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞，雙蒸水洗滌，冷凍干燥后，即可用于含鈾廢水的處理。試驗設(shè)酵母細(xì)胞EBY100-pYD、EBY100處理為對照。

試驗例1

(1)溶液初始pH值對酵母工程菌EBY100-12-2吸附鈾酰離子的影響

準(zhǔn)確量取50mL，50μg/ml的鈾標(biāo)溶液于150ml的錐形瓶中，用0.1mol/L的HCl、NaOH調(diào)節(jié)pH值至值3.26、3.89、4.43、4.88、5.38、6.13、6.78和7.24。加入0.03g酵母工程菌EBY100-12-2，在28℃，145rpm的恒溫振蕩器上吸附12h。13000rpm室溫離心5min，取上清，用偶氮胂Ⅲ光度法測定溶液中鈾酰離子的濃度。試驗設(shè)置酵母細(xì)胞EBY100-pYD和EBY100處理為對照。

鈾酰離子的吸附量按照以下公式計算(下同)：

式中：q_e為吸附量，mg/g；V為溶液的體積，L；C_e為鈾酰離子溶液平衡濃度，mg/L；C₀為鈾酰離子溶液初始濃度，mg/L；m為吸附劑質(zhì)量，g。

結(jié)果表明(圖5)，對于酵母工程菌EBY100-12-2，pH值為3.26～4.43時，隨著pH值的升高EBY100-12-2對鈾酰離子的吸附量不斷增加，且增幅較大；當(dāng)pH＝4.43時，吸附量達(dá)到最大，為104.53mg/g，明顯大于EBY100和pYD的最大吸附量；當(dāng)4.43<pH<7.24時，吸附量隨著pH值的增大而減小，因此pH＝4.43為EBY100-12-2吸附鈾酰離子的最佳pH，并且從圖中可以看出，BY100-12-2在pH＝3.26時具有較大的吸附量，為72.270mg/g，而EBY100和pYD的吸附量則相對較小，表明鈾離子結(jié)合肽酵母菌EBY100-12-2在低pH值時仍對鈾酰離子有較好的吸附性能。

(2)吸附時間對酵母工程菌EBY100-12-2吸附鈾酰離子的影響

準(zhǔn)確量取50mL，50μg/ml的鈾標(biāo)溶液于150ml的錐形瓶中，用0.1mol/L的HCl、NaOH調(diào)節(jié)pH值為4.43。分別加入0.03g酵母工程菌EBY100-12-2，在28℃，145rpm的恒溫振蕩器上分別吸附0min、15min、30min、45min、60min、120min、180min、240min和300min。13000rpm室溫離心5min，取上清，測定溶液中鈾酰離子的濃度。試驗設(shè)置酵母細(xì)胞EBY100-pYD和EBY100處理為對照。

結(jié)果表明(圖6)，三種吸附劑在起始階段對鈾酰離子吸附速率均較快，酵母工程菌EBY100-12-2對鈾酰離子的吸附速率明顯快于EBY100和pYD，且具有較大的吸附量；三種吸附劑對鈾酰離子的吸附均在120min左右達(dá)到平衡，即達(dá)到最大吸附量，但酵母工程菌EBY100-12-2的吸附量顯著大于EBY100和pYD。由此可見，結(jié)合肽12-2顯著提高了酵母菌對鈾酰離子的吸附量。通過計算吸附速率常數(shù)得知，相同條件下，酵母工程菌EBY100-12-2比EBY100和pYD具有較快的吸附速率。

(3)初始濃度對酵母工程菌吸附鈾離子的影響

鈾酰離子的初始濃度是影響吸附的重要因素。設(shè)置鈾酰離子初始濃度分別為10、20、30、40、50、60、80、100mg/L。加入0.03g酵母工程菌EBY100-12-2，在28℃，145rpm的恒溫振蕩器上吸附3h。13000rpm室溫離心5min，取上清，測定溶液中鈾酰離子的濃度。試驗設(shè)置酵母細(xì)胞EBY100-pYD和EBY100處理為對照。

由圖7可知，隨著鈾酰離子初始濃度的增大，酵母工程菌EBY100-12-2、EBY100-pYD和EBY100對鈾酰離子的吸附量均不斷增加。當(dāng)鈾酰離子初始濃度小于40mg/L時，三種吸附劑對鈾酰離子的吸附量無顯著差別，當(dāng)初始濃度逐漸增大到大于40mg/L時，酵母工程菌EBY100-12-2對鈾酰離子的吸附量顯著高于EBY100-pYD和EBY100，表明結(jié)合肽12-2提高了酵母工程菌EBY100-12-2對鈾酰離子的吸附作用。

(4)吸附溫度對酵母工程菌吸附鈾酰離子的影響

準(zhǔn)確量取50mL，50μg/ml的鈾標(biāo)溶液于150ml的錐形瓶中，用0.1mol/L的HCl、NaOH調(diào)節(jié)pH值為4.43。加入0.03g酵母工程菌EBY100-12-2，在不同溫度(295.15K、298.15K、301.15K和304.15K)下，145rpm的恒溫振蕩器上吸附3h。13000rpm室溫離心5min，取上清，測定溶液中鈾酰離子的濃度。試驗設(shè)置酵母細(xì)胞EBY100-pYD和EBY100處理為對照。

由圖8可知，隨著溶液溫度的升高，酵母工程菌EBY100-12-2、EBY100-pYD和EBY100三種吸附劑對鈾酰離子的吸附量均逐漸增加，表明三種吸附劑對鈾酰離子的吸附均為吸熱過程。溫度升高有助于吸附自發(fā)進(jìn)行。在相同的溫度條件下，酵母工程菌EBY100-12-2對鈾酰離子的吸附量顯著高于EBY100-pYD和EBY100，表明結(jié)合肽12-2可以有效的提高酵母工程菌EBY100-12-2對鈾酰離子的吸附作用。

試驗例2

(1)溶液初始pH值對酵母工程菌EBY100-12-7吸附鈾酰離子的影響

準(zhǔn)確量取50mL，50μg/ml的鈾標(biāo)溶液于150ml的錐形瓶中，用0.1mol/L的HCl、NaOH調(diào)節(jié)pH值至值3.26、3.89、4.43、4.88、5.38、6.13、6.78和7.24。加入0.03g酵母工程菌EBY100-12-7，在28℃，145rpm的恒溫振蕩器上吸附12h。13000rpm室溫離心5min，取上清，測定溶液中鈾酰離子的濃度。試驗設(shè)置酵母細(xì)胞EBY100-pYD和EBY100處理為對照。鈾酰離子的吸附量計算公式同上。

結(jié)果表明(圖9)，在pH值為3.26至4.43之間時，酵母工程菌EBY100-12-7對鈾酰離子的吸附量逐漸增加，且增幅較大；當(dāng)pH為4.43時酵母工程菌EBY100-12-7對鈾酰離子的吸附量達(dá)到最大，為108.25mg/g，顯著高于EBY100-PYD和EBY100對鈾酰離子的最大吸附量；表明結(jié)合肽酵母菌EBY100-12-7在低pH值時仍對鈾酰離子有較好的吸附性能。

(2)吸附時間對酵母工程菌EBY100-12-7吸附鈾酰離子的影響

準(zhǔn)確量取50mL，50μg/ml的鈾標(biāo)溶液于150ml的錐形瓶中，用0.1mol/L的HCl、NaOH調(diào)節(jié)pH值為4.43。分別加入0.03g酵母工程菌EBY100-12-7，在28℃，145rpm的恒溫振蕩器上分別吸附0min、15min、30min、45min、60min、120min、180min、240min和300min。13000rpm室溫離心5min，取上清，測定溶液中鈾酰離子的濃度。試驗設(shè)置酵母細(xì)胞EBY100-pYD和EBY100處理為對照。

結(jié)果表明(圖10)，在吸附開始的15min內(nèi)，酵母工程菌EBY100-12-7即表現(xiàn)為對鈾酰離子較高的吸附速率，且在15min時吸附量顯著高于EBY100-PYD和EBY100。隨著吸附時間的延長，三種吸附劑的吸附量均逐漸升高，當(dāng)吸附時間達(dá)到120min時達(dá)到吸附平衡。酵母工程菌EBY100-12-7對鈾酰離子的最大吸附量顯著高于兩對照處理。

(3)初始濃度對酵母工程菌EBY100-12-7吸附鈾酰離子的影響

鈾酰離子的初始濃度是影響吸附的重要因素。設(shè)置鈾酰離子初始濃度分別為10、20、30、40、50、60、80、100mg/L。加入0.03g酵母工程菌EBY100-12-7，在28℃，145rpm的恒溫振蕩器上吸附3h。13000rpm室溫離心5min，取上清，測定溶液中鈾酰離子的濃度。試驗設(shè)置酵母細(xì)胞EBY100-pYD和EBY100處理為對照。

由圖11可知，隨著鈾酰離子初始濃度的增大，酵母工程菌EBY100-12-7、EBY100-pYD和EBY100對鈾酰離子的吸附量均不斷增加。當(dāng)鈾酰離子初始濃度小于30mg/L時，三種吸附劑對鈾酰離子的吸附量無顯著差別，當(dāng)初始濃度逐漸增大到大于30mg/L時，酵母工程菌EBY100-12-7對鈾酰離子的吸附量顯著高于EBY100-pYD和EBY100，表明結(jié)合肽12-7提高了酵母工程菌EBY100-12-7對鈾酰離子的吸附作用。

(4)吸附溫度對酵母工程菌EBY100-12-7吸附鈾酰離子的影響

準(zhǔn)確量取50mL，50μg/ml的鈾標(biāo)溶液于150ml的錐形瓶中，用0.1mol/L的HCl、NaOH調(diào)節(jié)pH值為4.43。加入0.03g酵母工程菌EBY100-12-7，在不同溫度(295.15K、298.15K、301.15K和304.15K)下，145rpm的恒溫振蕩器上吸附3h。13000rpm室溫離心5min，取上清，測定溶液中鈾酰離子的濃度。試驗設(shè)置酵母細(xì)胞EBY100-pYD和EBY100處理為對照。

由圖12可知，隨著溶液溫度的升高，酵母工程菌EBY100-12-7、EBY100-pYD和EBY100三種吸附劑對鈾酰離子的吸附量均逐漸增加，表明三種吸附劑對鈾酰離子的吸附均為吸熱過程。溫度升高有助于吸附自發(fā)進(jìn)行。在相同的溫度條件下，酵母工程菌EBY100-12-7對鈾酰離子的吸附量顯著高于EBY100-pYD和EBY100，表明結(jié)合肽12-7可以有效的提高酵母工程菌EBY100-12-7對鈾酰離子的吸附作用。

<110> 東華理工大學(xué)

<120> 鈾酰離子結(jié)合十二肽

<160> 6

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<220>

<221> 短肽1

<222> (1)...(12)

<223>

<400> 1

Met Gln Ile Gln Ile Ser Ser Arg Ser Met Gln Thr

1 5 10

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<220>

<221> 短肽2

<222> (1)...(12)

<223>

<400> 2

Gln His Leu Pro Thr Arg Ile Ser Ile Asn Arg His

1 5 10

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<222> (1)...(36)

<223>

<400> 3

ATGCAAATAC AGATTAGTAG CCGAAGTATG CAAACC 36

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<222> (1)...(36)

<223>

<400> 4

CAGCATCTCC CCACGAGAAT TAGTATTAAC CGGCAT 36

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<221> -28 gIII測序上游引物

<222> (1)...(22)

<223>

<400> 5

GTATGGGATT TTGCTAAACA AC 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<221> -96 gIII測序下游引物

<222> (1)...(20)

<223>

<400> 6

CCCTCATAGT TAGCGTAACG 20