本發(fā)明涉及一種用于提高肝炎患者免疫力的小分子β-1,3-葡聚糖制備方法，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

肝炎是肝臟炎癥的統(tǒng)稱，通常是指由多種致病因素如病毒、細(xì)菌、寄生蟲、化學(xué)毒物、藥物、酒精、自身免疫等因素使肝臟細(xì)胞受到破壞，肝臟的功能受到損害，表現(xiàn)為肝功能指標(biāo)的異常，并引起身體一系列不適癥狀。提高自身免疫力可以減緩肝炎病情的進(jìn)展，從而有效減免病情惡化為肝硬化甚至肝癌。

目前提高肝炎患者免疫力的藥物主要有胸腺肽、胸腺五肽等。胸腺肽有效成分不明確，含量低、含致敏大分子蛋白，不符合WHO對(duì)免疫調(diào)節(jié)劑的五項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)，因而療效低、安全性差，不良反應(yīng)尤其是嚴(yán)重過敏反應(yīng)頻繁發(fā)生。雖然胸腺五肽的效果比較優(yōu)異，但是其合成的方法相對(duì)復(fù)雜，價(jià)格昂貴。

β-1,3葡聚糖是一類以β-1,3糖苷鍵連接的具有多種生物活性的葡萄糖聚合物。大量研究表明，β-1,3-葡聚糖具有特殊的生物活性：其能夠活化巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等，能夠提高白細(xì)胞介素、干擾素及腫瘤壞死因子α的含量，全面刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)，從而提高機(jī)體的免疫力。β-1,3-葡聚糖能使受傷機(jī)體的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-1的能力迅速恢復(fù)正常，有效調(diào)節(jié)機(jī)體免疫機(jī)能，還能夠促進(jìn)體內(nèi)IgM抗體的產(chǎn)生，提高體液免疫能力。β-1,3-葡聚糖能夠有效激活機(jī)體非特異性防御機(jī)制，故應(yīng)用在腫瘤、感染病和治療創(chuàng)傷方面深受矚目，近幾年研究發(fā)現(xiàn)，β-1,3-葡聚糖在治療腫瘤、心血管、糖尿病等病癥以及降血脂、抗衰老方面效果顯著。

目前市場(chǎng)上的β-1,3-葡聚糖產(chǎn)品幾乎都是從酵母細(xì)胞中提取，而酵母細(xì)胞中葡聚糖含量低，且主要集中在細(xì)胞壁中，提取過程相當(dāng)繁瑣，產(chǎn)品純度又低，生產(chǎn)成本極高。因此，醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟需一種高活性、高純度、低成本的可溶性小分子β-1,3-葡聚糖，以期能夠顯著提高患者的自身免疫力。利用微生物代謝生產(chǎn)的可得然膠是一種水不溶性大分子β-1,3-葡聚糖，已被衛(wèi)生部公告為一種可以在食品中添加的添加劑。天然的大分子可得然膠雖然由β-1,3-葡聚糖組成，但由于其不溶于水，導(dǎo)致其不具有顯著的生物活性，但其水溶性衍生物(如硫酸酯化物等)、小分子量可得然膠或可得然膠寡糖則具有非常顯著的生物活性，能夠顯著提高機(jī)體免疫力，特別是對(duì)于提高肝炎患者的免疫力具有較好的效果。因此通過降解可得然膠獲得小分子β-1,3-葡聚糖，并將其用于提高患者特別是肝炎患者的免疫力具有重要的意義。

專利《一種用于提高肝炎患者免疫力的可溶性小分子β-1,3-葡聚糖》采用了一系列的物理方法對(duì)可得然膠進(jìn)行處理，但所采用的高壓均質(zhì)技術(shù)效率低、能耗高，得到的目標(biāo)產(chǎn)品小分子β-1,3-葡聚糖的產(chǎn)品收率較低，僅為60～70％，并且得到的目標(biāo)產(chǎn)物分子量均一性也較低。

綜上所述，利用現(xiàn)有技術(shù)制備小分子β-1,3-葡聚糖存在純度低、收率低，以及產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定的問題，需要一種高效的小分子β-1,3-葡聚糖純化方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的β-1,3-葡聚糖純度低和提取收率低的不足，本發(fā)明提供了一種小分子β-1,3-葡聚糖的制備方法，通過該方法不僅能夠獲得質(zhì)量穩(wěn)定的小分子β-1,3-葡聚糖，還能顯著提高其收率。

一種高純度小分子β-1,3-葡聚糖產(chǎn)品的制備方法，包括以下步驟：

(1)以不溶性大分子β-1,3-葡聚糖可得然膠為原料，將其堿溶后進(jìn)行微波加熱，然后利用超聲波降解β-1,3-葡聚糖溶液；

其中，所述微波加熱的工藝參數(shù)為：微波頻率900～2000MHz，處理2～5次，間隔3～5min，每次25～45s；超聲波降解的工藝參數(shù)為：超聲波工作頻率范圍45～200KHz，處理時(shí)間為15～30min。

(2)將上述步驟(1)中β-1,3-葡聚糖溶液中和后進(jìn)行凝膠色譜分級(jí)純化，獲得水溶性小分子β-1,3-葡聚糖溶液，分離得到的大分子β-1,3-葡聚糖溶液回到步驟(1)再次降解；

(3)利用納濾膜過濾步驟(2)所得目的小分子β-1,3-葡聚糖溶液，濃縮脫鹽；

(4)乙醇沉淀，向步驟(3)中所得濃縮液中加入1～3倍體積的乙醇，沉淀可溶性小分子β-1,3-葡聚糖，過濾或離心得沉淀后再用1～3倍體積的乙醇洗滌兩次，再次通過過濾或離心得到的沉淀即為目標(biāo)產(chǎn)物；

(5)將步驟(4)中所得沉淀干燥，干燥條件為60～80℃，時(shí)間2～4h，干燥后所得固體即為高純度可溶性小分子β-1,3-葡聚糖。

本發(fā)明中，所述高純度是指小分子β-1,3-葡聚糖的純度大于等于90％，優(yōu)選的為等于95.0％。

本發(fā)明中，所述高收率是指所述產(chǎn)品中的小分子量β-1,3-葡聚糖的收率大于等于90％。

步驟(1)中，為了能夠高效的獲取小分子β-1,3-葡聚糖，本發(fā)明所選原料的純度為85％以上。

所述堿溶的具體步驟為：向β-1,3-葡聚糖可得然膠原料中加入堿溶液，使可得然膠終濃度為1.0～1.5％(w/v)，OH^-終濃度為0.1～0.5mol/L。優(yōu)選的堿是NaOH或KOH。

加入堿對(duì)β-1,3-葡聚糖可得然膠原料進(jìn)行物理稀釋和溶解，使可得然膠溶解于堿溶液中，原理是在一定pH范圍下，破壞了可得然膠大分子之間的氫鍵，破壞可得然膠分子所形成的三螺旋穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，從而使可得然膠溶解，而選擇OH^-濃度的原則是：在溶解良好且溶液粘度不高的同時(shí)保證所得產(chǎn)品具有較好的質(zhì)量。經(jīng)過試驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明選擇OH^-濃度為0.1～0.5mol/L，可得然膠濃度為1.0～1.5％(w/v)，確保了產(chǎn)品的高純度和高收率。

優(yōu)選的，所述微波加熱的工藝參數(shù)為：微波頻率為950～1800MHz，處理2～3次，間隔3～5min，每次15～30s。

在提高產(chǎn)品純度和收率上，同時(shí)便于β-1,3-葡聚糖降解，本發(fā)明采用了微波加熱溶解，一方面，微波輻射能穿透稀釋堿溶后的可得然膠溶液，達(dá)到物料內(nèi)部，使其內(nèi)部溫度迅速上升，快速提高物質(zhì)在介質(zhì)中的溶解度，從而有利于提純可得然膠；另一方面，微波能夠透射到生物組織內(nèi)部使偶極分子和蛋白質(zhì)的極性側(cè)鏈以極高的頻率振蕩，引起分子的電磁振蕩等作用，加之在堿溶液的作用下，能夠降解破壞溶液中的雜蛋白，使其降解為小分子多肽，以便有利于后續(xù)醇沉的操作，在醇沉過程中，小分子多肽不會(huì)被絮凝沉淀。從產(chǎn)品純度和收率的效果來講，本發(fā)明選取了合適的微波加熱參數(shù)：微波頻率為900～2000MHz，處理2～5次，間隔3～5min，每次15～30s。優(yōu)選的，微波頻率為950～1800MHz，處理2～3次，間隔3～5min，每次15～30s。

本發(fā)明中，在采用堿溶微波加熱后，為了使大分子β-1,3-葡聚糖降解為較為均一的小分子量目標(biāo)產(chǎn)物，采用了超聲波作用降解的處理方法，超聲波的空化作用會(huì)產(chǎn)生局部高溫、高壓或強(qiáng)沖擊波和微射流，當(dāng)超聲波在液體中傳播時(shí)，由于液體微粒的劇烈震動(dòng)，會(huì)在液體內(nèi)部產(chǎn)生小空洞，這些小空洞迅速脹大和閉合，會(huì)使液體微粒之間發(fā)生猛烈的撞擊作用，微粒間的這種劇烈的相互作用，會(huì)弱化高分子量的β-1,3-葡聚糖內(nèi)部之間的化學(xué)鍵，進(jìn)一步使化學(xué)鍵斷裂，從而降低了大分子β-1,3-葡聚糖分子量。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)可得然膠堿溶液經(jīng)過超聲波作用，能夠有效的降解β-1,3-葡聚糖的分子量，并且分子量的分布較為均一，分子量變化范圍在500Da以內(nèi)。

為有效降低β-1,3-葡聚糖的分子量并使其目標(biāo)產(chǎn)物的分子量較為均一，本發(fā)明優(yōu)化了超聲波降解的條件，超聲波頻率范圍是45～200KHz，處理時(shí)間為15～30min。

步驟(2)中，將β-1,3-葡聚糖降解液中和后便于凝膠色譜分級(jí)純化，在不降解可得然膠之前，若是中和可得然膠的堿溶液，會(huì)形成中和凝膠，但是降解之后，并不形成凝膠，便于后續(xù)的分級(jí)純化。根據(jù)β-1,3-葡聚糖的理化性質(zhì)，優(yōu)選的，分級(jí)純化體系為葡聚糖凝膠色譜分級(jí)體系；優(yōu)選的，采用水作為流動(dòng)相，進(jìn)行洗脫，獲得不同的分子量的β-1,3-葡聚糖溶液，收集目的分子量的β-1,3-葡聚糖溶液，并將大分子量的β-1,3-葡聚糖溶液返回超聲波降解步驟重復(fù)降解3～5次；進(jìn)一步優(yōu)選的，流動(dòng)相流速范圍是0.025-0.200m/h。

步驟(3)中，將步驟(2)中獲得的目的分子量的β-1,3-葡聚糖溶液進(jìn)行納濾濃縮并脫鹽，優(yōu)選的，納濾膜截留分子量范圍是150～500Da，并控制溫度在35℃以下；優(yōu)選的，采用目的分子量β-1,3-葡聚糖溶液體積2～4倍體積的蒸餾水對(duì)納濾濃縮的β-1,3-葡聚糖溶液稀釋后再濃縮，達(dá)到脫鹽的目的，控制過程溫度在35℃以下。

步驟(4)中，向步驟(3)中所得目的分子量β-1,3-葡聚糖濃縮液中加入乙醇溶液，沉淀β-1,3-葡聚糖。

優(yōu)選的，乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為75～85％(v/v)，沉淀30～60min，5000～8000g離心5-15min后，得沉淀再采用體積分?jǐn)?shù)為85～95％(v/v)乙醇溶液洗滌兩次，5000～8000g離心5-10min后所得沉淀即為目標(biāo)小分子β-1,3-葡聚糖。

采用75～85％(v/v)的乙醇溶液進(jìn)行醇沉，既可以將小分子量的β-1,3-葡聚糖沉淀出來，又可以使雜質(zhì)溶解在乙醇液相中，從而提高產(chǎn)品的純度和收率。

步驟(5)中將步驟(4)獲得的沉淀干燥，即獲得目的小分子量的β-1,3-葡聚糖產(chǎn)品。

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中小分子量β-1,3-葡聚糖的品質(zhì)較低，例如，產(chǎn)品的純度較低、產(chǎn)品的均一度不高，本發(fā)明提供了一種采用上述方法制備得到的小分子可溶性β-1,3-葡聚糖產(chǎn)品，其是由大分子β-1,3-葡聚糖可得然膠降解并分級(jí)純化制得，屬于完全水溶性β-葡聚糖，所述β-1,3-葡聚糖的平均分子量為8000～12000Da，其分子均一度高，分子量變化范圍在500Da以內(nèi)。

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中小分子量β-1,3-葡聚糖的活性較低的問題，本發(fā)明還提供了上述β-1,3-葡聚糖產(chǎn)品在制備具有提高生物體免疫活性、抗炎活性或抗腫瘤活性功效的藥物或食品中的應(yīng)用，其具有顯著生理活性特別是在提高生物體免疫活性、抗炎活性、抗腫瘤活性方面具有非常顯著的效果。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

(1)本發(fā)明提供了一種能夠獲得高品質(zhì)β-葡聚糖產(chǎn)品的制備技術(shù)，對(duì)于提高β-葡聚糖的品質(zhì)具有顯著作用。

(2)通過本發(fā)明一系列的物理方法處理(堿溶無化學(xué)反應(yīng)屬于物理溶解過程)，建立了一條穩(wěn)定高效的小分子可溶性β-1,3-葡聚糖制備工藝，不需要進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，減少了成品中的雜質(zhì)組分，所得目標(biāo)產(chǎn)品小分子β-1,3-葡聚糖純度高達(dá)95％以上。

(3)由于采用了堿溶微波加熱以及超聲波降解技術(shù)手段，目標(biāo)產(chǎn)品小分子β-1,3-葡聚糖產(chǎn)品對(duì)于原料大分子β-1,3-葡聚糖的收率高達(dá)到90％以上，顯著提高了小分子β-1,3-葡聚糖的產(chǎn)率。

(4)本發(fā)明的方法步驟不引入化學(xué)或有害其他雜質(zhì)，確保所得產(chǎn)品的生物安全。

(5)由于采用了超聲波降解和后續(xù)的凝膠色譜分級(jí)純化技術(shù)手段，本發(fā)明得到的目標(biāo)產(chǎn)物為均一小分子β-1,3-葡聚糖，屬于完全水溶性β-葡聚糖，具有顯著生理活性特別是提高生物體免疫活性、抗炎活性、抗腫瘤活性具有非常顯著的效果。

具體實(shí)施方式

應(yīng)該指出，以下詳細(xì)說明都是示例性的，旨在對(duì)本發(fā)明提供進(jìn)一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術(shù)語僅是為了描述具體實(shí)施方式，而非意圖限制根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施方式。除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)在本說明書中使用術(shù)語“包含”和/或“包括”時(shí)，其指明存在特征、步驟和/或它們的組合。

本發(fā)明中，產(chǎn)品收率(％)＝本發(fā)明目的分子量β-1,3-葡聚糖產(chǎn)品的質(zhì)量/原料中β-1,3-葡聚糖可得然膠的質(zhì)量×100％。

正如背景技術(shù)所介紹的，現(xiàn)有技術(shù)中存在可溶性小分子β-1,3-葡聚糖收率較低以及得到的目標(biāo)產(chǎn)物分子量均一性不足的問題，為解決如上的技術(shù)問題，本發(fā)明提出了一種高純度高收率小分子量可溶性β-1,3-葡聚糖產(chǎn)品的制備方法，包括以下方法：

工序一：以不溶性大分子β-1,3-葡聚糖可得然膠為原料，將其堿溶后進(jìn)行微波加熱，然后進(jìn)行超聲降解得到β-1,3-葡聚糖降解液；

其中，為了能夠高效的獲取小分子β-1,3-葡聚糖，本發(fā)明所選原料的純度為85％以上。

所述堿溶的具體步驟為：向β-1,3-葡聚糖可得然膠原料中加入NaOH或KOH堿溶液，使得可得然膠終濃度為1.0～1.5％(w/v)，堿終濃度為0.1～0.5mol/L。加入堿對(duì)可得然膠原料進(jìn)行物理稀釋和溶解，使得可得然膠溶解于堿溶液中，降低原理是在一定pH范圍下，破壞了可得然膠大分子之間的氫鍵。

在提高產(chǎn)品純度和收率上，本發(fā)明采用了微波加熱，一方面，微波輻射能穿透稀釋堿溶后的可得然膠溶液，達(dá)到物料內(nèi)部，物料吸收微波能，內(nèi)部溫度迅速上升，增大被分離物質(zhì)在介質(zhì)中的溶解度，從而有利于提純可得然膠；另一方面，微波能夠透射到生物組織內(nèi)部使偶極分子和蛋白質(zhì)的極性側(cè)鏈以極高的頻率振蕩，引起分子的電磁振蕩等作用，加之堿溶液的作用下，能夠降解破壞溶液中的雜蛋白，使其降解為小分子多肽，以更有利于后續(xù)醇沉的操作，在醇沉過程中，小分子多肽不會(huì)被絮凝沉淀。從產(chǎn)品純度和收率的效果來講，本發(fā)明選取了間歇式微波強(qiáng)化溶解工藝參數(shù)：微波頻率為950～1800MHz，處理2～3次，間隔3～5min，每次15～30s。采用間歇式的微波強(qiáng)化加熱方法，不僅能夠提高可得然膠的溶解效率，便于β-1,3-葡聚糖降解，而且能夠最大限度保持β-1,3-葡聚糖分子的理化性質(zhì)，同時(shí)降低能耗。在提高目標(biāo)產(chǎn)物的純度和收率的效果上，該技術(shù)手段也為本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)之一。

在堿溶和微波強(qiáng)化溶解的基礎(chǔ)上，本發(fā)明采用了超聲波降解技術(shù)，采用此技術(shù)的原因是：一是能夠有效降低β-1,3-葡聚糖的分子量，二是通過控制超聲波的工藝條件，能夠使β-1,3-葡聚糖的分子均一降解。經(jīng)過優(yōu)化，采用的超聲波頻率范圍是45～200KHz，處理時(shí)間為15～30min。該技術(shù)手段也是本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)之一。

工序二：將β-1,3-葡聚糖降解液中和后進(jìn)行凝膠色譜分級(jí)純化，得完全水溶性的β-1,3-葡聚糖溶液；

通過進(jìn)一步的凝膠色譜分級(jí)純化，能夠得到特定分子量的目標(biāo)產(chǎn)物，并進(jìn)一步使得其產(chǎn)品的分子量范圍更加均一。為達(dá)到此目的，優(yōu)選葡聚糖凝膠色譜分級(jí)體系，采用蒸餾水作為流動(dòng)相，流動(dòng)相流速范圍是0.025-0.200m/h，洗脫后，獲得不同的分子量的β-1,3-葡聚糖溶液，收集目的分子量的β-1,3-葡聚糖溶液，并將大分子量的β-1,3-葡聚糖溶液返回超聲波降解步驟重復(fù)降解，一般采用以上工藝參數(shù)后，重復(fù)降解的次數(shù)為3～5次。該技術(shù)手段也是本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)之一。

工序三：采用膜處理所得目的小分子β-1,3-葡聚糖溶液，濃縮脫鹽；

該工序中，采用納濾膜過濾濃縮所得目的小分子β-1,3-葡聚糖溶液，該納濾膜截留分子量范圍是150～500Da，并控制溫度在35℃以下；并采用目的分子量β-1,3-葡聚糖溶液體積2～4倍體積的蒸餾水對(duì)納濾濃縮的β-1,3-葡聚糖溶液稀釋后再濃縮，達(dá)到脫鹽的目的。納濾膜過濾不僅能夠起到脫鹽的效果，還能起到脫除小分子單糖的作用，進(jìn)一步去除了產(chǎn)品的雜質(zhì)，提高了產(chǎn)品的純度。

工序四：乙醇沉淀脫鹽濃縮后的β-1,3-葡聚糖溶液；

工序五：60～80℃干燥沉淀后的小分子量β-1,3-葡聚糖并獲得成品。

醇沉的目的主要是能夠沉淀目標(biāo)分子量的β-1,3-葡聚糖，同時(shí)進(jìn)一步去除雜質(zhì)，醇沉處理中使用的乙醇的體積分?jǐn)?shù)和沉淀時(shí)間對(duì)于提純的效果有重要的影響，若是乙醇的體積分?jǐn)?shù)不合適，會(huì)沉淀出非目標(biāo)產(chǎn)物。本發(fā)明經(jīng)過工藝參數(shù)優(yōu)化，當(dāng)乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為75～85％(v/v)、沉淀30～60min時(shí)，獲得的小分子β-1,3-葡聚糖的純度較高。

本發(fā)明通過控制一系列的物理工序步驟和工藝參數(shù)，得到了較高品質(zhì)的β-1,3-葡聚糖，所述β-1,3-葡聚糖的平均分子量為8000～12000Da，由于具有較低的分子量且水溶性較好，具有顯著的生物活性。這種小分子量和均一度較高的β-1,3-葡聚糖產(chǎn)品，用于提高生物體免疫活性、抗炎活性、抗腫瘤活性，特別是對(duì)于提高肝炎患者免疫力具有非常顯著的效果。

以下通過具體實(shí)施例進(jìn)行描述：

實(shí)施例1

一種高效的高純度小分子β-1,3-葡聚糖產(chǎn)品的具體制取工藝步驟內(nèi)容如下：

(1)原料：大分子β-1,3-葡聚糖可得然膠產(chǎn)品，純度87％；

(2)堿溶：可得然膠終濃度1.0％(w/v)，NaOH的終濃度為0.2mol/L；

(3)微波加熱：微波頻率在950MHz，處理3次，間隔5min，每次25s；

(4)超聲波降解，將步驟(3)中完全溶解的β-1,3-葡聚糖溶液進(jìn)行超聲波處理，以降低大分子β-1,3-葡聚糖的分子量，超聲波頻率是60KHz，處理時(shí)間為25min；

(5)將步驟(4)獲得小分子β-1,3-葡聚糖采用葡聚糖凝膠色譜分級(jí)體系分級(jí)，采用蒸餾水作為流動(dòng)相，進(jìn)行洗脫，流動(dòng)相流速為0.1m/h，獲得不同分子量的β-1,3-葡聚糖溶液，收集目的分子量的β-1,3-葡聚糖溶液，并將大分子量的β-1,3-葡聚糖溶液返回步驟(4)進(jìn)行重復(fù)降解三次；

(6)納濾濃縮脫鹽：將步驟(5)中獲得的目的分子量的β-1,3-葡聚糖溶液納濾濃縮并脫鹽，納濾膜截留分子量范圍是200Da，控制溫度在35℃以下，采用目的分子量β-1,3-葡聚糖3倍體積的蒸餾水對(duì)納濾濃縮的小分子β-1,3-葡聚糖溶液稀釋再納濾濃縮脫鹽，并控制溫度在35℃以下；

(7)乙醇沉淀：向步驟(6)中所得目的分子量β-1,3-葡聚糖濃縮液中加入一定體積的乙醇，沉淀小分子β-1,3-葡聚糖，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80％(v/v)，沉淀30min，8000g離心10min后，得沉淀再采用體積分?jǐn)?shù)為90％(v/v)乙醇溶液洗滌兩次，8000g離心10min后所得沉淀即為目標(biāo)小分子可溶性β-1,3-葡聚糖產(chǎn)物；

(8)干燥：將步驟(7)中所得65℃干燥，即獲得了目的分子量β-1,3-葡聚糖。經(jīng)檢測(cè)，小分子β-1,3-葡聚糖的純度為96.5％，產(chǎn)品收率為91％，平均分子量為9300Da，分子量變化范圍在500Da以內(nèi)。

實(shí)施例2

一種高效的高純度小分子β-1,3-葡聚糖產(chǎn)品的具體制取工藝步驟內(nèi)容如下：

(1)原料：大分子量β-1,3-葡聚糖可得然膠產(chǎn)品，純度86％以上；

(2)堿溶：可得然膠終濃度1.2％(w/v)，KOH的終濃度為0.35mol/L；

(3)微波加熱：微波頻率在1200MHz，處理3次，間隔5min，每次20s；

(4)超聲波降解：將步驟(3)中完全溶解的β-1,3-葡聚糖溶液進(jìn)行超聲波處理，以降低大分子β-1,3-葡聚糖的分子量，超聲波頻率是120KHz，處理時(shí)間為25min；

(5)將步驟(4)獲得小分子β-1,3-葡聚糖采用葡聚糖凝膠色譜分級(jí)體系分級(jí)，采用蒸餾水作為流動(dòng)相，進(jìn)行洗脫，流動(dòng)相流速為0.15m/h，獲得不同分子量的β-1,3-葡聚糖溶液，收集目的分子量的β-1,3-葡聚糖溶液，并將大分子量的β-1,3-葡聚糖溶液返回步驟(4)進(jìn)行重復(fù)降解三次；

(6)納濾濃縮脫鹽：將步驟(5)中獲得的目的分子量的β-1,3-葡聚糖溶液納濾濃縮并脫鹽，納濾膜截留分子量范圍是400Da，并控制溫度在35℃以下，采用目的分子量β-1,3-葡聚糖溶液3倍體積的蒸餾水對(duì)納濾濃縮液稀釋再納濾濃縮脫鹽，并控制溫度在35℃以下；

(7)乙醇沉淀：向步驟(6)中所得目的分子量β-1,3-葡聚糖濃縮液中加入一定體積的乙醇，沉淀小分子β-1,3-葡聚糖，乙醇體積分?jǐn)?shù)為85％(v/v)，沉淀30min，6000g離心15min后，得沉淀再采用體積分?jǐn)?shù)為92％(v/v)乙醇溶液洗滌兩次，6000g離心10min后所得沉淀即為目標(biāo)小分子β-1,3-葡聚糖產(chǎn)物；

(8)干燥：將步驟(7)中所得沉淀干燥，干燥條件為72℃，干燥3h，干燥后所得固體即為高純度可溶性小分子β-1,3-葡聚糖。經(jīng)檢測(cè)，小分子β-1,3-葡聚糖的純度為97.8％，產(chǎn)品收率為93％，重均分子量為10500Da，分子量變化范圍在500Da以內(nèi)。

實(shí)施例3

取實(shí)施例1中制備得到的β-1,3-葡聚糖，輔料為藥用淀粉、糊精和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50％的乙醇，將上述原料充分?jǐn)嚢杌旌现瞥深w粒，在60-70℃干燥2-4小時(shí)，制成片狀，便于患者服用。

實(shí)施例4

取實(shí)施例2中制備得到的β-1,3-葡聚糖，輔料為藥用糊精，混合后裝成膠囊，便于患者服用。

實(shí)施例5

無菌條件下取實(shí)施例1中制備得到的β-1,3-葡聚糖，加入純凈水溶解后，分裝滅菌，制得口服液，便于患者服用。

從以上的描述中，可以看出，本發(fā)明上述的實(shí)施例實(shí)現(xiàn)了如下技術(shù)效果：

1)通過本發(fā)明一系列的物理方法處理(堿溶無化學(xué)反應(yīng)屬于物理溶解過程)，建立了一條穩(wěn)定高效的小分子可溶性β-1,3-葡聚糖制備工藝，不需要進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，減少了成品中的雜質(zhì)組分，所得目標(biāo)產(chǎn)品小分子可溶性β-1,3-葡聚糖純度高達(dá)95％以上。

2)由于本發(fā)明采用了堿溶微波加熱以及超聲波降解技術(shù)手段，使得小分子β-1,3-葡聚糖的收率較高。

3)由于采用了超聲波降解和后續(xù)的凝膠色譜分級(jí)純化技術(shù)手段，本發(fā)明得到的目標(biāo)產(chǎn)物為均一小分子β-1,3-葡聚糖。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。