一種制備基于蛋白A突變體的結(jié)合蛋白的方法與流程

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本發(fā)明涉及制備具有新的特異性結(jié)合能力的異源多聚體蛋白A突變體的方法。本發(fā)明提供編碼所述異源多聚體蛋白A突變體的核苷酸文庫和對應(yīng)的蛋白質(zhì)文庫，揭示了從所述突變體文庫中篩選對預(yù)定靶分子具有結(jié)合能力的蛋白A突變體的方法，分離編碼所述蛋白A突變體的核苷酸的方法，鑒定和分析所述蛋白A突變體的方法，以及生產(chǎn)所述蛋白A突變體的方法。此外，本發(fā)明進一步提供能以高親和力特異性結(jié)合到預(yù)定靶分子上的、以異源多聚體蛋白A為基礎(chǔ)的新的結(jié)合蛋白質(zhì)。

背景技術(shù)：

抗體能夠特異性識別和結(jié)合各類外源性物質(zhì)，如小分子化合物、花粉、病毒、細菌等半抗原和抗原。在抗體分子Y型的兩個分叉頂端，各有一個由六條環(huán)狀多肽構(gòu)成的互補區(qū)域(CDR)形成鎖狀結(jié)構(gòu)，這些部位的氨基酸通過氫鍵、范德華力、電荷作用和疏水作用，與抗原表面的表位形成非共價鍵相互作用。在抗體基因中，編碼抗原結(jié)合部位的DNA可以隨機組合和突變，這一高變區(qū)的氨基酸可以發(fā)生非常豐富的變化，每一種特定的變化，可以賦予抗體具有和某一預(yù)定抗原相結(jié)合的能力。

隨著基因重組技術(shù)、蛋白質(zhì)工程和重組抗體庫體外親和篩選技術(shù)以及結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展，越來越多的抗體三維晶體結(jié)構(gòu)得到解析，抗體結(jié)合抗原的分子機理得到更好理解?？贵w的局限性，比如分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜等，促使研究者將來源于抗體CDR區(qū)域的“結(jié)合區(qū)域”這一概念，移植到一些非常穩(wěn)定的非抗體類的蛋白(如本發(fā)明用到的異源多聚體蛋白A)表面。將這些蛋白表面的某些鄰近的氨基酸高度突變，可以人為的塑造出適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合區(qū)域，從而賦予這些蛋白與各類預(yù)定靶分子結(jié)合的能力。

WO 95/19374描述了以蛋白A的一個結(jié)構(gòu)域單體為基礎(chǔ)的結(jié)合蛋白(Affibody)的產(chǎn)生。蛋白A是來源于金黃色葡萄球菌細胞表面的一種蛋白質(zhì)，由5個高度同源的結(jié)構(gòu)域組成，其結(jié)合許多哺乳動物物種(包括人)的免疫球蛋白。由于蛋白A單個結(jié)構(gòu)域的分子量非常小(約6kDa)，其表面能提供的結(jié)合區(qū)域的面積相對較小，限制了其結(jié)合能力。根據(jù)已有技術(shù)信息，WO 95/19374中產(chǎn)生的結(jié)合蛋白的親和力K_D范圍通常在10^-6-10^-8M范圍，多數(shù)情況下在10^-7M，例如初篩得到的結(jié)合EGFR的結(jié)合蛋白的親和力在130nM-185nM，結(jié)合H-Ras的結(jié)合蛋白的親和力在79nM-283nM，結(jié)合rVIII的結(jié)合蛋白的親和力在100nM-200nM。在此外，蛋白A單個結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)域由兩個并列的α螺旋一側(cè)的氨基酸構(gòu)成，形成了一個扁平的結(jié)合面，這也限制了其能結(jié)合的靶分子表位的類型。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目標(biāo)是提供具有更高結(jié)合能力的、能夠普遍的識別更多不同類型的靶分子表位的多聚體蛋白A突變體的方法。本發(fā)明的進一步目標(biāo)是提供以新穎的異源多聚體蛋白A為基礎(chǔ)，通過初始篩選，即可普遍制備高親和力結(jié)合蛋白的方法。

更具體地，本發(fā)明提供了一種制備具有新的特異性結(jié)合能力的異源多聚體蛋白A突變體的方法，包括下列主要步驟：

提供單體經(jīng)過修飾的蛋白A的異源多聚體突變體的庫，所述庫包括異源多聚體蛋白質(zhì)，所述異源多聚體蛋白質(zhì)包括兩個或更多以首尾排列的方式連接在一起的蛋白A單體，其中所述異源多聚體蛋白質(zhì)的至少兩個所述單體是通過對位于SEQ ID No：1中的9、10、11、13、14、17、18、24、25、27、28、32、35處的至少五個氨基酸的替換而進行的修飾，所述修飾的單體蛋白質(zhì)與未修飾的蛋白A具有至少80％的氨基酸序列一致性；

為所述經(jīng)過修飾的蛋白A的庫提供潛在的靶分子；

使所述修飾的蛋白質(zhì)的庫與所述靶分子接觸；

通過篩選方法得到異源多聚體蛋白A突變體。

用于該申請中重要的術(shù)語的定義

術(shù)語“蛋白A單體”是指蛋白A的一個結(jié)構(gòu)域蛋白，包括與SEQ ID NO:1完全一致的，或者氨基酸序列一致性超過80％的蛋白質(zhì)。

本說明書中，術(shù)語“異源多聚體蛋白”是包含兩個或更多不同修飾的蛋白A單體的蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明的“異源多聚體”具有兩個獨立的結(jié)合區(qū)域的至少兩個不同修飾的蛋白A單體的融合蛋白，優(yōu)選為異源二聚體或異源三聚體。

根據(jù)本發(fā)明，由至少兩個不同的蛋白A修飾蛋白所組成的異源多聚體結(jié)合蛋白能結(jié)合預(yù)定抗原。其中的蛋白A修飾蛋白可以通過多種方式組合在一起，形成“頭尾相接”的融合蛋白，例如基因融合等。這種融合可以使多個不同的蛋白A修飾蛋白上的結(jié)合區(qū)域能夠組合起來，形成一個大的、整體性的結(jié)合區(qū)域。這種融合，類似于抗體可變區(qū)的多個CDR區(qū)域組合起來，共同形成了抗體結(jié)合部位。對應(yīng)的，多個不同的蛋白A修飾蛋白上的結(jié)合區(qū)域，能夠分別結(jié)合到同一特定抗原的不同部位，這些部位組合起來，共同形成了抗原表位。

術(shù)語“頭尾相接的融合”描述了把多個不同的蛋白A修飾蛋白連接起來形成融合蛋白的形式。把多個不同的蛋白A修飾蛋白按照(氨基端-羧基端)—(氨基端-羧基端)n的連接方向，連接起來形成異源多聚體融合蛋白，這里n取決于需要連接起來的蛋白A修飾蛋白的數(shù)量。在這種頭尾相接的連接形式中，相鄰的兩個蛋白A修飾蛋白可以直接連接在一起，也可以通過柔性連接多肽，比如，氨基酸序列為SGGGG的連接多肽，或者其他連接多肽，比如KPEVIDASELTPAVT，GGGGS等。其他通常用于基因融合的連接多肽也可以在這里使用?？傊?，異源多聚體可以通過把兩個或多個不同的蛋白A修飾蛋白，通過首尾相接的方式連接在一起，形成一個由兩個及兩個以上的蛋白A修飾蛋白組成的融合蛋白。通過柔性多肽將兩個或多個蛋白A修飾單體上的結(jié)合區(qū)域連接起來，所述的兩個或多個結(jié)合區(qū)域具有了更多的構(gòu)象，提供了識別更多類型的靶分子表位的可能性。

術(shù)語“群”或者“庫”、“文庫”特指由經(jīng)過不同修飾的蛋白A的異源多聚體突變體混合而得到的集合。編碼所述經(jīng)過修飾的蛋白A的異源多聚體突變體的DNA的混合也被成為核苷酸群。術(shù)語“群”或者“庫”、“文庫”都是同義的且能互換使用。

本發(fā)明所述的“特異結(jié)合區(qū)”表示：形成聚合物的各蛋白A單體之間，突變位點由于電荷、空間結(jié)構(gòu)和側(cè)鏈的疏水性/親水性等原因，突變的氨基酸與周圍的環(huán)境相互作用，形成一個連續(xù)的表面暴露區(qū)域，該連續(xù)區(qū)域能夠和預(yù)定靶分子特異性結(jié)合，該環(huán)境可以是溶劑，一般是水，或者其它分子。

在本發(fā)明中，“氨基酸修飾”是指氨基酸替換、插入、缺失或者化學(xué)修飾；優(yōu)選氨基酸替換。在具體的實施方式中，氨基酸修飾通過對蛋白A單體的第9、10、11、13、14、17、18、24、25、27、28、32、35處的至少五個氨基酸的替換來實現(xiàn)。術(shù)語“修飾”或“突變”指使用20種氨基酸的其他任一氨基酸對所選定位置的氨基酸進行替換。這兩者都是同義的且能互換使用。

上述通過突變產(chǎn)生的蛋白A修飾蛋白所組成的異源多聚體蛋白文庫，可以通過噬菌體展示、核糖體展示、mRNA展示或細胞表面展示、酵母展示或細菌表面展示方法，進而通過體外定向篩選的方式，針對任一預(yù)定的靶分子進行篩選，使能特異性結(jié)合靶分子的異源多聚蛋白A突變體富集，從而得到此類結(jié)合蛋白。根據(jù)本發(fā)明，可以通過以下一種或多種方法，確定所述的蛋白A突變體與特定靶分子是否具有可定量的結(jié)合能力，比如酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)、等離子表面共振(SPR)、免疫熒光光譜(IF)、流式細胞術(shù)(FACS)、等溫滴定量熱法(ITC)和分析離心等。

在本發(fā)明所采用的噬菌體展示方法中，重組蛋白A突變體展示在M13絲狀噬菌體上，同時該突變體的編碼DNA以單鏈形式包裝在噬菌體包膜中。因此，在親和篩選中，可以從文庫中選擇出具有某些特性的突變體，其遺傳信息可以分別通過感染細菌并在下一輪親和篩選中得到擴增。突變體蛋白通過融合到噬菌體衣殼蛋白，優(yōu)選的是PIII蛋白，從而可以在噬菌體表達得到展示。此外，編碼的融合蛋白還可以含有其他功能性元件，比如便于通過親和層析檢測或純化的親和標(biāo)簽等。

作為根據(jù)本發(fā)明所產(chǎn)生的所述結(jié)合蛋白的靶分子，可以使用所有生物學(xué)和醫(yī)學(xué)活性相關(guān)的分子，包括但不限于抗原和半抗原?？乖侵改鼙幻庖呦到y(tǒng)識別為外來物質(zhì)(非自身的)的任何物質(zhì)。在大多數(shù)免疫反應(yīng)情形中，可以引起免疫反應(yīng)。半抗原通常是簡易、低分子量的化合物，其不能引起免疫反應(yīng)，但是結(jié)合到載體蛋白質(zhì)上后，可以變成完整的抗原。優(yōu)選的，靶分子可以是生物受體，優(yōu)選G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR，例如人EGFR、HER2、HER3、VEGF/R1-4、EpCAM)或其配體、或其結(jié)構(gòu)域、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、腫瘤壞死因子β(TNF-β)、白介素(例如IL-2、IL-6、IL-11、IL-12)、生長因子(例如神經(jīng)生長因子NGF)和其前體(ProNGF)、BMP、EGF、激酶、整合素(例如糖蛋白受體IIb/IIIa)、人血清白蛋白HSA、T和B細胞抗原，優(yōu)選CD4、CD11、CD14、CD16、CD20、CD22、CD25、CD34、CD47、CD56、CD137、CD154、CTLA-4等。

本發(fā)明中，以異源二聚體蛋白A為基礎(chǔ)，獲得了其在特定位點發(fā)生修飾的突變體，這些突變體獲得了其原來沒有的靶分子結(jié)合能力。本發(fā)明中，用作異源二聚體蛋白A的靶分子的實例是降鈣素原(PCT)、人血清白蛋白(HSA)、鈣粘附蛋白16(CDH16)。通過初始篩選所獲得的的蛋白A異源二聚體結(jié)合蛋白的親和力分布在3.6nM-57.6nM，明顯高于現(xiàn)有技術(shù)資料中根據(jù)WO 95/19374所制備的結(jié)合蛋白的親和力，有近10倍左右的提高。

本發(fā)明得到的異源多聚體蛋白A的突變體蛋白在細胞內(nèi)、外環(huán)境中都具有結(jié)合活性，具有廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可用于檢測、定量檢測、分離和提取對應(yīng)的靶分子，以及用于診斷和治療涉及到對應(yīng)的靶分子所參與的疾病等。例如，可以通過ELISA、Western印跡等生物分析測試直接檢測靶分子，可以用于治療腫瘤或傳染性疾病、可用于食品和營養(yǎng)工業(yè)、營養(yǎng)補充劑、化妝品、醫(yī)學(xué)和非醫(yī)學(xué)診斷和分析領(lǐng)域。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

本發(fā)明的有益效果是：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的方法具有以下優(yōu)點:

1.基于蛋白A異源二聚體或多聚體的結(jié)合蛋白能提供更大面積的結(jié)合區(qū)域，進而可以提供更高的結(jié)合能力；

2.兩個或多個蛋白A單體通過柔性的連接多肽相連，使分布在兩個蛋白A單體上的結(jié)合區(qū)域在空間構(gòu)象上是靈活多變的，從而提供了識別更多靶分子表位的能力。

附圖說明

圖1為在野生型蛋白A單體表面經(jīng)修飾后新生的結(jié)合位點區(qū)域；

在表面通過氨基酸隨機化替代進行修飾，從而獲得新的結(jié)合位點的野生型蛋白A單體的晶體結(jié)構(gòu)示意圖。用PyMOL軟件(DeLano Scientific)進行二級結(jié)構(gòu)元件的三維顯示。作為實例制備文庫的發(fā)生隨機替換的位點9、10、11、13、14、17、18、24、25、27、28、32、35用側(cè)鏈表示。

圖2為異源二聚體蛋白A的結(jié)構(gòu)示意圖；

兩個蛋白A單體通過柔性的多肽鏈形式首尾相接的連接，成為本發(fā)明中形成具有新結(jié)合活性的異源二聚體蛋白A的基礎(chǔ)。橢圓形線圈代表了蛋白質(zhì)表面的靶分子結(jié)合區(qū)域，通過對特定氨基酸進行替換的修飾方式形成。

圖3為用于篩選具有新結(jié)合特性的基于異源多聚體蛋白A的修飾蛋白的噬菌粒質(zhì)粒pCan-dPA；

pCan-dPA用于制備噬菌體文庫，在Lac操縱子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下，編碼g3p蛋白信號肽、蛋白A二聚體、E-tag標(biāo)簽和噬菌體衣殼蛋白III的序列被表達為融合蛋白，進而使蛋白A二聚體展示在噬菌體表面。

圖4表示檢測經(jīng)噬菌體展示篩選到的異源二聚體蛋白A的修飾蛋白PCT-P1G07與其靶分子PCT結(jié)合親和力的ELISA實驗結(jié)果。通過非線性回歸確定平衡條件下的K_D值。

圖5表示檢測經(jīng)噬菌體展示篩選到的異源二聚體蛋白A的修飾蛋白PCT-P2A08與其靶分子PCT結(jié)合親和力的ELISA實驗結(jié)果。通過非線性回歸確定平衡條件下的K_D值。

圖6表示檢測經(jīng)噬菌體展示篩選到的異源二聚體蛋白A的修飾蛋白PCT-P2A12與其靶分子PCT結(jié)合親和力的ELISA實驗結(jié)果。通過非線性回歸確定平衡條件下的K_D值。

圖7表示檢測經(jīng)噬菌體展示篩選到的異源二聚體蛋白A的修飾蛋白HSA-P1A02與其靶分子HSA結(jié)合親和力的ELISA實驗結(jié)果。通過非線性回歸確定平衡條件下的K_D值。

圖8表示檢測經(jīng)噬菌體展示篩選到的異源二聚體蛋白A的修飾蛋白HSA-P1F11與其靶分子HSA結(jié)合親和力的ELISA實驗結(jié)果。通過非線性回歸確定平衡條件下的K_D值。

圖9表示檢測經(jīng)噬菌體展示篩選到的異源二聚體蛋白A的修飾蛋白CDH16-2H03-2與其靶分子CDH16結(jié)合親和力的ELISA實驗結(jié)果。通過非線性回歸確定平衡條件下的K_D值。

圖10表示檢測經(jīng)噬菌體展示篩選到的異源二聚體蛋白A的修飾蛋白CDH16-2H07-1與其靶分子CDH16結(jié)合親和力的ELISA實驗結(jié)果。通過非線性回歸確定平衡條件下的K_D值。

圖11表示未修飾的dPA、dPA突變體文庫以及各經(jīng)修飾的異源二聚體蛋白A結(jié)合蛋白的序列信息及比對?；疑尘帮@示了未突變的保守區(qū)域的氨基酸序列，而白色背景顯示了選定進行修飾的氨基酸位點。X表示對所在位置的氨基酸進行隨機化替換，以制備修飾文庫。

具體實施方式

實施例1：合成未經(jīng)修飾的蛋白A二聚體(dPA-wt)基因

本實施例提供了通過基因合成的方式獲得未經(jīng)修飾的蛋白A二聚體核苷酸(DNA)片段的方式。

用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法進行以下基因工程操作。為制備編碼dPA-wt蛋白(Seq ID No.2)的DNA序列(Seq ID No.3)，用作制備dPA突變體文庫的起點和模板，使用以下操作步驟：為合成基因片段，在50μl體積中進行PCR反應(yīng)，使用引物(每種濃度0.1μM)作為模板進行搭橋PCR反應(yīng)，每種1μl。引物長度一般為30-59個堿基，每對前后相連的引物3’和5’端大約重疊15-20個堿基。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并用SV Gel and PCR Clean-Up試劑盒(Promega)回收目標(biāo)條帶。以上PCR均按照下面的程序進行反應(yīng)，94℃預(yù)變性5分鐘，然后進入28個循環(huán)。每個循環(huán)94℃反應(yīng)30秒，55℃反應(yīng)30秒，68℃反應(yīng)1分鐘。最后68℃保溫10分鐘。

預(yù)期PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳分離目標(biāo)條帶，并用SV Gel and PCR Clean-Up試劑盒(Promega)回收目標(biāo)條帶。回收后的DNA片段分別用sfiI/NotI(New England Biolabs)雙酶切，純化回收后的DNA片段插入到同樣經(jīng)sfiI/NotI雙酶切的噬菌粒載體pCANTAB，得到質(zhì)粒pCan-dPA，結(jié)構(gòu)如圖3所示，用作構(gòu)建dPA突變體文庫的模板。

實施例2：制備dPA修飾突變體文庫

通過本領(lǐng)域已建立的和已知的方法進行修飾，可得到dPA修飾突變體文庫。在本發(fā)明中，“修飾突變體文庫”是指對選定位點的核苷酸或氨基酸序列進行任意的修飾，這種修飾導(dǎo)致核苷酸或氨基酸的替代完全隨機的，其最終的表達產(chǎn)物是具有不同氨基酸的平均分配的完全隨機的序列。本發(fā)明中，用作構(gòu)建的dPA修飾突變體文庫(Seq ID No.4)在前后兩個蛋白A單體上分別包含了11個修飾位點，分別位于單體第9、10、13、14、17、18、24、27、28、32、35氨基酸位點。

依照本發(fā)明，優(yōu)選地通過在基因水平進行修飾，優(yōu)選的通過對氨基酸進行隨機化替換，從而導(dǎo)致發(fā)生突變，從而得到氨基酸修飾。優(yōu)選地，依靠基因工程的技術(shù)手段實現(xiàn)對蛋白A的修飾。優(yōu)選地，為了將隨機化的序列恰當(dāng)?shù)匾雂PA基因片段中，可以通過合成并使用帶有隨機化突變的引物，通過多輪搭橋PCR產(chǎn)生突變體文庫。例如可以在期望的限制性內(nèi)切酶識別位點周圍構(gòu)建第一組正向和反向引物，并在待突變的密碼子的上下游構(gòu)建第二組包含隨機化突變的引物，即正向和反向突變引物。適當(dāng)?shù)氖褂眠@些引物，可以構(gòu)建第一中間片段和第二中間片段。兩個PCR反應(yīng)產(chǎn)生了線性的中間產(chǎn)物片段。每一個片段至少包含一個選定的密碼子突變、與上下游中間片段融合的共有序列。融合后的完整片段的最上游和最下游還包含了限制性酶切位點和保護堿基，以便經(jīng)過酶切后形成粘性末端，可以通過DNA連接酶與載體片段連接，產(chǎn)生環(huán)狀的核苷酸產(chǎn)物，比如環(huán)狀質(zhì)粒。本領(lǐng)域可以利用其他方法且可以代替的使用其他方法。

具體來講，得到包含突變位點的中間片段后，將全部中間片段等摩爾混合后，加入最上游和最下游包含酶切位點的引物對(Seq ID No.5和Seq ID No.6)，進行最后的PCR擴增反應(yīng)，隨后使用SV Gel and PCR Clean-Up試劑盒純化回收該DNA片段后，用SfiI和NotI對片段進行雙酶切，并用瓊脂糖凝膠電泳分離回收約400bp的DNA片段。

為制備噬菌粒載體，分別使用SfiI和NotI根據(jù)制造商說明書對質(zhì)粒pCANTAB進行酶切，并用瓊脂糖凝膠電泳分離較大的載體片段。用SV Gel and PCR Clean-Up試劑盒純化載體DNA，最后以50fmol/ul溶于水中。為進行連接反應(yīng)，把100μl 10×T4DNA連接酶緩沖液、3pmol所述經(jīng)SfiI和NotI雙酶切的dPA文庫DNA片段、9pmol pCANTAB載體片段和8000U T4DNA連接酶(New England Biolabs)在1ml反應(yīng)體積中16℃保溫24小時。65℃加熱10分鐘使T4DNA連接酶失活，然后用SV Gel and PCR Clean-Up試劑盒純化連接產(chǎn)物，最后將DNA用50ul無菌水洗脫保存，用于電轉(zhuǎn)化實驗。

為了將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL1Blue(Stratagene)中，使用Gene Pulser II(Bio-rad)電轉(zhuǎn)化儀和2mm間距的電轉(zhuǎn)化杯(Bio-rad)。上述連接產(chǎn)物所得溶液與電轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌XL1Blue混合后，根據(jù)制造商說明書進行轉(zhuǎn)化實驗。所得細胞混合液涂到10塊含2×YT/氨芐青霉素固體培養(yǎng)基的平皿上，經(jīng)37℃過夜培養(yǎng)平皿，并對經(jīng)梯度稀釋后的生長菌落進行計數(shù)，發(fā)現(xiàn)所構(gòu)建的文庫包含3.1×10¹⁰個獨立克隆。用2×YT培養(yǎng)基從平皿上刮下菌落，加入甘油使終濃度為20％(v/v)，分成每管1ml，保存于-80℃。隨機挑取50個單克隆，經(jīng)測序分析，發(fā)現(xiàn)26個克隆具有功能性的目的DNA序列，在預(yù)定突變位點有性質(zhì)完全不同的氨基酸替換，且DNA序列各不相同，證實該文庫的正確率約為52％。

實施例3：制備dPA修飾蛋白噬菌體展示文庫

為生產(chǎn)在表面展示了不同dPA突變體的噬菌體，在400ml 2×YT/氨芐青霉素培養(yǎng)基接種由實施例2中獲得的甘油菌，使細胞密度達到OD₆₀₀＝0.05，在37℃和200rmp條件下振蕩培養(yǎng)直至細胞密度達到OD₆₀₀＝0.6。用10¹²cfu的輔助噬菌體M13KO7感染，在30℃和50rpm條件下培養(yǎng)30分鐘。加入50mg/l卡那霉素后在30℃和200rmp條件下振蕩培養(yǎng)30分鐘后，通過離心(15分鐘，1,600×g，4℃)分離沉淀，重懸于400ml 2×YT/氨芐青霉素/卡那霉素培養(yǎng)基，在30℃和200rmp條件下振蕩培養(yǎng)16小時。最后細胞通過離心(20分鐘，8,000×g，4℃)分離沉淀并丟棄，上清用0.45μm規(guī)格濾膜過濾后，加入1/4體積20％(w/v)PEG8000、2.5M NaCl溶液并冰浴1小時沉淀噬菌體。隨后離心收集沉淀(20分鐘，12,000×g，4℃)，將噬菌體重懸于25ml預(yù)冷PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，8mM Na₂HPO₄，2mM KH₂PO₄)中，在冰上保持30分鐘后離心(5分鐘，20,000×g，4℃)。向上清液加入1/4體積20％(w/v)PEG8000、2.5M NaCl溶液，并冰浴30分鐘再次沉淀噬菌體。離心沉淀(30分鐘，20,000×g，4℃)，再次將噬菌體沉淀重懸于4ml預(yù)冷PBS中，在冰上保持30分鐘并離心(30分鐘，17,000×g，4℃)。上清液與封閉液以1:1混合，置于旋轉(zhuǎn)混合器上，室溫下保溫10分鐘，然后直接用于篩選。

實施例4：通過體外篩選富集能特異結(jié)合靶分子的噬菌粒

為從包含了各種dPA突變體的噬菌體展示文庫中，篩選出能特異性結(jié)合預(yù)定靶分子的dPA突變體，使用上述實施例3中制備的噬菌體展示文庫，分別針對預(yù)定的不同靶分子(抗原或半抗原)，實施了篩選和富集實驗。

靶分子用PBS稀釋后，在免疫管中4℃包被過夜。第二天棄上清后，加入5ml PBS-B(B代表封閉液)并在室溫下保溫90分鐘，從而封閉免疫管內(nèi)表面上的未被抗原占據(jù)的結(jié)合位點。然后吸取4ml所制備的噬菌體溶液，加到免疫管中，并在室溫下保溫2小時。分別用PBST(T代表0.1％Tween-20)和PBS洗滌五次，而除去未結(jié)合的噬菌體。最后用2ml甘氨酸-鹽酸在室溫下保溫5分鐘，將與固定在免疫管上的抗原結(jié)合的噬菌體洗脫下來，并加入300μl濃度為1M的Tris溶液。每種情況洗脫下來的噬菌體溶液與10ml細胞密度OD₆₀₀＝0.6的培養(yǎng)物中，以感染大腸桿菌XL1blue，并在37℃220rpm培養(yǎng)30分鐘。將這些細胞懸濁液鋪到含2×YT/氨芐青霉素固體培養(yǎng)基的平皿上，經(jīng)37℃過夜培養(yǎng)平皿，并計數(shù)梯度稀釋后的生長菌落。用2×YT培養(yǎng)基從平皿上刮下菌落，加入甘油使終濃度為20％(v/v)，分成每管1ml，保存于-20℃。

為增加篩選體系中dPA結(jié)合蛋白的富集程度，針對靶分子的定向篩選共進行3-5輪循環(huán)，通常為4輪循環(huán)。從第二輪篩選開始，每次在100ml培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)和噬菌體援救，并使用更苛刻的洗滌條件，即第二輪篩選中分別用PBST和PBS洗滌15次和5次，第三輪分別洗滌25次和5次，第四輪分別洗滌35次和5次。

實施例5：鑒定和分離與不同靶分子特異性結(jié)合的噬菌粒

經(jīng)過3-5輪針對不同的預(yù)定靶分子的體外親和篩選后，從得到的克隆中隨機挑取96個克隆，使用single phage ELISA方法鑒定與對應(yīng)靶分子的結(jié)合情況。具體操作步驟如下：把每個單菌落接種到600μl 2×YT/氨芐青霉素培養(yǎng)基，在37℃220rpm培養(yǎng)16小時。次日各取30μl培養(yǎng)物，接種到新鮮的800μl 2×YT/氨芐青霉素培養(yǎng)基，在37℃220rpm培養(yǎng)2小時，隨后每孔加入10⁹cfu M13KO7輔助噬菌體。在37℃200rpm培養(yǎng)30分鐘后，加入50ml/l卡那霉素，然后繼續(xù)在37℃220rpm培養(yǎng)16小時。最后離心30分鐘(3,000×g，4℃)沉淀細菌，取上清轉(zhuǎn)移到新的預(yù)先加入了等體積20％(w/v)PEG8000、2.5M NaCl溶液的96孔培養(yǎng)板，在冰上保溫1小時沉淀上清中的噬菌體顆粒，再次離心沉淀(5,000×g，4℃，30分鐘)，將沉淀重懸于200μl PBS溶液，用于后續(xù)的ELISA實驗。

每一個待分析克隆的噬菌體，需同時針對其對應(yīng)的篩選靶分子和陰性對照蛋白(通常為牛血清白蛋白或者溶菌酶)進行ELISA檢測。將對應(yīng)抗原和溶菌酶包被在96孔板上，并使用封閉液進行封閉，使塑料表面的剩余結(jié)合位點飽和。用PBST洗滌三次后，取上述制備好的噬菌體樣品加到ELISA板的各孔。室溫下保溫2小時后，用PBST洗滌三次。為了檢測結(jié)合的噬菌體，每孔加入100μl以1:5000稀釋的抗M13噬菌體的抗體-過氧化物酶偶聯(lián)物(GE Healthcare)，室溫下保溫1小時后，用PBST和PBS分別洗滌三次。最后吸取50μl TMB底物加入到孔中，并在室溫下顯色10分鐘，隨后每孔加入50μl的2M H₂SO₄終止顯色反應(yīng)。用Microplate reader(Bio-Rad)在450nm測量吸收值。在ELISA實驗中，對靶分子顯示較強結(jié)合信號，與對照蛋白無結(jié)合信號的噬菌體，其對應(yīng)的單克隆用引物Seq ID No.7進行測序。由此獲得并進一步分析dPA修飾蛋白的氨基酸序列，在表1中示例性列出其中發(fā)生替換的氨基酸位置和序列，其中9-35標(biāo)注出了dPA蛋白的第一個蛋白A單體中發(fā)生替換修飾的氨基酸位置；9’-35’標(biāo)注了第二個蛋白A單體中發(fā)生替換修飾的氨基酸位置。

在以PCT為靶分子的實施例中，所得到的蛋白A異源二聚體結(jié)合蛋白PCT-P1G07(Seq ID No.8)、PCT-P2A08(Seq ID No.9)和PCT-P2A12(Seq ID No.10)的氨基酸替換在表1中示例性列出。在以HSA為靶分子的實施例中，所得到的蛋白A異源二聚體結(jié)合蛋白HSA-P1A02(Seq ID No.11)和HSA-P1F11(Seq ID No.12)的氨基酸替換在表1中示例性列出。在以CDH16為靶分子的實施例中，所得到的蛋白A異源二聚體結(jié)合蛋白CDH16-2H03-2(Seq ID No.13)和CDH16-2H07-1(Seq ID No.14)的氨基酸替換在表1中示例性列出。

實施例6：制備并純化基于dPA的修飾蛋白

將篩選得到的具有靶分子特異性結(jié)合活性的dPA修飾蛋白基因通過引物對(Seq ID No.15和Seq ID No.16)進行PCR擴增后，分別克隆到表達載體pET22b(+)中，并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21(DE3)。在實驗室水平使用搖瓶和常規(guī)異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)進行誘導(dǎo)表達，能大量表達dPA修飾蛋白。誘導(dǎo)表達后的大腸桿菌經(jīng)裂解后，可利用蛋白羧基端融合的六組氨酸多肽，通過固定化金屬親和層析法(IMAC)純化所述蛋白。

為生產(chǎn)具有新結(jié)合活性的dPA修飾蛋白，挑取單菌落接種到5ml 2×YT/氨芐青霉素培養(yǎng)基，在37℃、220rpm震蕩培養(yǎng)16小時。培養(yǎng)物以1:100轉(zhuǎn)接到200ml 2×YT/氨芐青霉素培養(yǎng)基，并在37℃220rpm震蕩培養(yǎng)，直至細胞密度達到約OD₆₀₀＝0.6。加入1mM異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)外源基因表達，在30℃、220rpm震蕩培養(yǎng)6小時。離心(4,000×g，4℃，15分鐘)收集細胞沉淀，并重懸于15ml NPI-20溶液(50mM MaH₂PO₄,150mM NaCl,20mM咪唑，pH 8.0)。加入200μg/ml溶菌酶和80U Benzonase在室溫下混勻30分鐘，隨后使用超聲破碎細胞，在冰水浴中每工作15秒間隔30秒，共重復(fù)5次。離心(15,000×g，4℃，30分鐘)去除細胞碎片沉淀，可溶性目標(biāo)蛋白存在于上清液中，可直接用于接下來的固定化金屬親和層析。

使用5倍柱體積的所述NPI-20緩沖液，預(yù)先平衡5ml HisTrap HP純化柱，然后使上述細胞裂解上清液流過純化柱。用8倍柱體積的NPI-50緩沖液(50mM MaH₂PO₄,500mM NaCl,50mM咪唑，pH 8.0)洗去未結(jié)合的雜蛋白，隨后用NPI-250緩沖液(50mM MaH₂PO₄,150mM NaCl,250mM咪唑，pH 8.0)洗脫結(jié)合的目的蛋白。將蛋白樣品透析到PBS緩沖液，通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析純化后的蛋白的組分和純度，并用BCA法測定蛋白濃度。在搖瓶培養(yǎng)條件下，dPA修飾蛋白的產(chǎn)率一般為10-150mg/l細胞培養(yǎng)物。

實施例7:鑒定具有新結(jié)合特性的dPA修飾蛋白的結(jié)合活性

通過濃度梯度ELISA實驗，測定dPA修飾蛋白對不同靶分子的結(jié)合活性。為此目的，用0.1M NaHCO₃(pH 9.6)包被液稀釋靶分子，每孔包被200ng，50μl/孔，4℃包被過夜，并用含封閉液的PBST于室溫下封閉2小時。然后用PBST漂洗平板三次并去除干凈。隨后，向每個孔板加入100μl含一系列濃度的各dPA修飾蛋白的PBST溶液，每個樣品的測定使用平行三孔分析。37℃保溫2小時后，用PBST漂洗三次，隨后加入1:5000稀釋的HRP標(biāo)記鼠抗E-tag抗體(購自金斯瑞)100μl/孔，37℃反應(yīng)1小時。為了檢測，用PBST漂洗孔三次，然后用PBS漂洗三次，最后加入TMB顯示15分鐘，用每孔50μl的2M H₂SO₄終止顯色反應(yīng)，用酶聯(lián)免疫檢測儀(Bio-Rad)在450nm測量光吸收值。用Sigma Plot軟件評估所得到的吸光強度值，計算抗體的結(jié)合強度。為此目的，每種情況下測量的消光值對相應(yīng)的結(jié)合蛋白濃度作圖，并用下面的非線性回歸對所得曲線進行擬合。

其中鑒定固定的靶分子和dPA修飾蛋白之間的結(jié)合/解離平衡是：

x＝dPA修飾蛋白的濃度

y＝靶分子/dPA修飾蛋白復(fù)合體的濃度(通過顯色反應(yīng)后吸光值間接測量)

a＝固定化靶分子的總濃度

b＝解離常數(shù)(K_D值)

SEQUENCE LISTING

<110> 武漢海沙百得生物技術(shù)有限公司

<120> 一種制備基于蛋白A突變體的結(jié)合蛋白的方法

<130> 2017-03-10

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 2

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser

50 55 60

Gly Gly Gly Gly Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala

65 70 75 80

Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn

85 90 95

Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu

100 105 110

Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

115 120 125

<210> 3

<211> 378

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtagacaaca aattcaacaa agaacaacaa aacgcgttct atgagatctt acatttacct 60

aacttaaacg aagaacaacg aaacgccttc atccaaagtt taaaagatga cccaagccaa 120

agcgctaacc ttttagcaga agctaaaaag ctaaatgatg ctcaggcgcc gaaatctggt 180

ggtggcggta gtggaggtgg tggagtggac aataaattta acaaggagca gcagaacgct 240

ttctacgaaa tcctgcacct gccgaacctg aacgaagaac agcgtaacgc gttcattcag 300

tctctgaagg acgacccgtc gcagtctgcc aacctgctgg ctgaagccaa gaaactgaac 360

gatgcgcagg ccccgaaa 378

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(10)