具有因子IX活性的融合蛋白的制作方法

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導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>有機(jī)化合物處理,合成應(yīng)用技術(shù)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及具有凝血因子IX(FIX)活性的融合蛋白。更特別地，本發(fā)明涉及包含F(xiàn)IX和轉(zhuǎn)鐵蛋白的融合蛋白(其表現(xiàn)出的比活性為非融合和天然FIX的比活性的兩倍)、編碼所述融合蛋白的基因、包含所述基因的重組載體以及包含所述重組載體的宿主細(xì)胞。

背景技術(shù)：

血友病是由X染色體上的遺傳性基因突變導(dǎo)致凝血因子缺陷所引起的出血性疾病。凝集是阻止損傷的血管失血的過程，其中損傷的血管壁被含纖維蛋白的凝塊覆蓋，所述凝塊通過與多種凝集因子相關(guān)的復(fù)雜凝集級聯(lián)形成。在凝集因子中，在因子VIII(本文稱為FVIII)和因子IX(FIX)缺陷時，它們分別與血友病A和B的發(fā)病有關(guān)。

當(dāng)FIX缺陷或失活的程度使得凝塊形成的凝集級聯(lián)不發(fā)生時，則發(fā)生血友病B。為了治療血友病B，根據(jù)凝集因子的水平和出血類型施用不同量的FIX。

為了用于治療血友病B，F(xiàn)IX通?？赏ㄟ^兩種方法產(chǎn)生：從人血中純化和基因重組。雖然重組蛋白質(zhì)可大量生產(chǎn)，但是其活性和穩(wěn)定性比通過血漿分級得到的蛋白質(zhì)差。

對重組蛋白質(zhì)已做出了多種嘗試(包括隨機(jī)突變、結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系比較、PEG化和n-糖基化)以克服所述缺點(diǎn)，但是它們中的大多數(shù)不能實(shí)現(xiàn)特別的效果。

轉(zhuǎn)鐵蛋白是運(yùn)輸鐵通過血液的血漿蛋白。這種血漿蛋白是血液中的第三大富含蛋白，半衰期為8天，該半衰期相對來說是長的(雖然比白蛋白或免疫球蛋白G(IgG)的半衰期短)，并且轉(zhuǎn)鐵蛋白的特征在于受體介導(dǎo)的循環(huán)。雖然已有數(shù)種采用轉(zhuǎn)鐵蛋白作為融合伴侶的融合蛋白，但是在已公開的任何報道中既沒有報道將轉(zhuǎn)鐵蛋白用于與FIX融合也沒有報道其作用。

因此，本發(fā)明人致力于提高FIX的活性和穩(wěn)定性；并且發(fā)現(xiàn)與非融合、天然FIX相比，當(dāng)與轉(zhuǎn)鐵蛋白直接或經(jīng)接頭連接時，F(xiàn)IX的比活性和血液穩(wěn)定性顯著增加，由此實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明。

發(fā)明概述

因此，本發(fā)明的一個目的是提供保持天然因子IX之生物活性的融合蛋白。

本發(fā)明的另一個目的是提供編碼所述融合蛋白的基因。

本發(fā)明的又一個目的是提供包含所述基因的重組載體。

本發(fā)明的再一個目的是提供包含所述重組載體的宿主細(xì)胞。

根據(jù)其一方面，本發(fā)明提供了包含人源因子IX(FIX)和人源轉(zhuǎn)鐵蛋白的融合蛋白。

根據(jù)其另一方面，本發(fā)明提供了編碼所述融合蛋白的基因。

根據(jù)其又一方面，本發(fā)明提供了包含所述基因的重組載體。

根據(jù)其再一方面，本發(fā)明提供了在其中包含所述重組載體的宿主細(xì)胞。

附圖說明

通過本發(fā)明的以下描述并結(jié)合附圖，本發(fā)明的以上和其他目的和特征將變得顯而易見，所述附圖分別示出：

圖1a：闡明使用重疊PCR構(gòu)建FIX片段的過程的示意圖；

圖1b：闡明內(nèi)含子1的結(jié)構(gòu)和構(gòu)建片段B的過程的示意圖；

圖2：闡明由分別攜帶編碼FIX(KOI)之cDNA和編碼轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)之cDNA的載體構(gòu)建FIX-Tf表達(dá)載體的過程的示意圖；

圖3：闡明構(gòu)建FIX(KOI)-GS1-Tf表達(dá)載體的過程的示意圖；

圖4：闡明構(gòu)建FIX(KOI)-GS1-THR-GS1-Tf、FIX(KOI)-GS15-Tf、FIX(KOI)-GS7-THR-GS7-Tf、FIX(KOI)-GS7-FXa-GS7-Tf和FIX(KOI)-GS7-FXIa-GS7-Tf表達(dá)載體的過程的示意圖；

圖5：闡明構(gòu)建FIX(KOI)-GS1-FXa-Tf和FIX(KOI)-GS1-FXIa-Tf表達(dá)載體的過程的示意圖；

圖6：闡明構(gòu)建FIX(KOI)-G6V-白蛋白表達(dá)載體的過程的示意圖；

圖7：FIX(KOI)-Tf(不含接頭)、FIX(KOI)-GS1-Tf、FIX(KOI)-GS1-THR-GS1-Tf、FIX(KOI)-GS15-Tf、FIX(KOI)-GS7-THR-GS7-Tf、FIX(KOI)-GS7-FXa-GS7-Tf、FIX(KOI)-GS7-FXIa-GS7-Tf、FIX(KOI)-GS1-FXa-Tf、FIX(KOI)-GS1-FXIa-Tf和FIX(KOI)表達(dá)載體的Western印跡；

圖8a：示出如通過ELISA和顯色活性測定所分析的由FIX(KOI)-Tf(不含接頭)、FIX(KOI)-GS1-Tf、FIX(KOI)-GS1-THR-GS1-Tf、FIX(KOI)-GS15-Tf、FIX(KOI)-GS7-THR-GS7-Tf、FIX(KOI)-GS7-FXa-GS7-Tf、FIX(KOI)-GS7-FXIa-GS7-Tf、FIX(KOI)-GS1-FXa-Tf、FIX(KOI)-GS1-FXIa-Tf、FIX(KOI)-G6V-白蛋白、FIX(KOI)和pcDNA3.1/hygro表達(dá)載體表達(dá)之融合蛋白的FIX活性的圖；

圖8b：示出在圖8a結(jié)果的基礎(chǔ)上計算的FIX比活性的圖；

圖8c：示出如通過ELISA和顯色活性測定所測量由FIX(KOI)-GS1-THR-GS1-Tf、FIX(KOI)-GS1-THR-GS1-del-Tf、FIX(KOI)和pcDNA3.1/hygro表達(dá)載體表達(dá)之融合蛋白的FIX活性的圖；和

圖8d：示出在圖8c結(jié)果的基礎(chǔ)上計算的FIX比活性的圖。

發(fā)明詳述

下文詳細(xì)描述本發(fā)明。

本發(fā)明提供了包含因子IX(FIX)和轉(zhuǎn)鐵蛋白的融合蛋白。

在本發(fā)明融合蛋白中使用的FIX和轉(zhuǎn)鐵蛋白可來源于任何哺乳動物，優(yōu)選來源于人。更優(yōu)選地，所述FIX和轉(zhuǎn)鐵蛋白與其各自的天然蛋白質(zhì)有95％或更高的同源性。最優(yōu)選地，所述FIX和轉(zhuǎn)鐵蛋白分別具有SEQ ID NO:1和2所示的氨基酸序列。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，融合蛋白可包含F(xiàn)IX和轉(zhuǎn)鐵蛋白的功能等價物或衍生物?！肮δ艿葍r物”可以在SEQ ID NO:1和2的氨基酸序列上具有一個或更多個氨基酸缺失、插入、非保守或保守替換或其組合，只要所述突變不引起負(fù)責(zé)FIX生物活性之活性部位或結(jié)構(gòu)域的實(shí)質(zhì)改變，則其可在任何序列位置中發(fā)生。

根據(jù)情況，本發(fā)明的融合蛋白可經(jīng)歷這些修飾以升高或降低其物理和化學(xué)性質(zhì)，例如磷酸化、硫酸化、丙烯酸化(acrylation)、糖基化、甲基化、法尼基化、乙?；?、酰胺化等。只要它們保持FIX的基本生物活性，則所修飾的融合蛋白在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

在本發(fā)明的融合蛋白中，轉(zhuǎn)鐵蛋白的N端可連接至FIX的C端。

或者，本發(fā)明的融合蛋白還可在FIX與轉(zhuǎn)鐵蛋白之間包含接頭。也就是說，F(xiàn)IX的C端可通過接頭連接至轉(zhuǎn)鐵蛋白的N端。

通過使兩種融合伴侶之間的潛在干擾最小，接頭可增加融合蛋白的FIX的活性。所述接頭優(yōu)選是長度為1至100個氨基酸的肽，但不限于此長度。只要它將融合蛋白中的FIX與轉(zhuǎn)鐵蛋白分隔開，可采用任何肽作為本發(fā)明的接頭。雖然對接頭的氨基酸序列沒有具體限制，但是其可優(yōu)選地包含重復(fù)或隨機(jī)模式的甘氨酸(G)和絲氨酸(S)殘基。例如，所述接頭可優(yōu)選地包含氨基酸序列(GGGGS)_N(其中N是1或更大的整數(shù)，優(yōu)選1至20)，更優(yōu)選SEQ ID NO:3或4的氨基酸序列(參見表2)。

而且，所述接頭可具有可被大量存在于損傷組織中的蛋白酶識別并消化的切割位點(diǎn)。選自凝血酶、因子Xa和因子XIa的蛋白酶可識別消化位點(diǎn)。在作用位點(diǎn)上，包含具有這種蛋白酶消化位點(diǎn)的接頭的融合蛋白被分為融合伴侶，F(xiàn)IX和轉(zhuǎn)鐵蛋白，它們可執(zhí)行其各自的功能。優(yōu)選地，所述接頭具有SEQ ID NO:5至11中任一個的氨基酸序列(參見表2)。

根據(jù)本發(fā)明的FIX-轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白具有為非融合、天然FIX的至少1.5倍的FIX比活性。在一個實(shí)施方案中，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的融合蛋白表現(xiàn)出的FIX比活性為與非融合、天然FIX相比的約0.5至2倍(參見表3-1和3-2，和圖7B和7D)。

根據(jù)其另一方面，本發(fā)明提供了編碼所述融合蛋白的基因。

編碼本發(fā)明融合蛋白的基因在不改變?nèi)诤系鞍装被嵝蛄械某潭葍?nèi)可在編碼區(qū)中有多種修飾(由于密碼子簡并性或者考慮到待表達(dá)其的生物體優(yōu)選的密碼子)，并且多種修飾或改變甚至可引入除編碼區(qū)之外的區(qū)域中，只要它們對基因的表達(dá)沒有影響。突變基因也在本發(fā)明范圍內(nèi)。

優(yōu)選地，所述基因可包含部分FIX內(nèi)含子的以增加FIX表達(dá)。更優(yōu)選地，所述基因可包含F(xiàn)IX內(nèi)含子1 5’端區(qū)域的981bp序列和FIX內(nèi)含子1 3’端區(qū)域的443bp序列，兩個序列均插入到FIX外顯子1的第88位堿基位點(diǎn)處。

在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的基因可包含編碼接頭的基因。

在本發(fā)明中，編碼融合蛋白的基因優(yōu)選具有SEQ ID NO:12至21之一的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的編碼融合蛋白的基因可由表達(dá)載體攜帶。

因此，本發(fā)明提供了包含編碼融合蛋白的基因的重組表達(dá)載體。

本文使用的術(shù)語“載體”指用于將編碼融合蛋白的DNA引入宿主細(xì)胞并在宿主細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白的運(yùn)載體?？刹捎贸Ｒ?guī)載體，包括質(zhì)粒載體、粘粒載體、噬菌體載體和病毒載體，優(yōu)選質(zhì)粒載體。

根據(jù)目的，可構(gòu)建合適的表達(dá)載體以使其包含用于膜靶向或分泌的信號序列或前導(dǎo)序列以及調(diào)控序列，例如啟動子、操縱子、起始密碼子、終止密碼子、多腺苷酸化信號、增強(qiáng)子等。當(dāng)應(yīng)用基因構(gòu)建體時，起始密碼子和終止密碼子必須起作用并且與編碼序列同框。此外，所述表達(dá)載體可包含用于選擇轉(zhuǎn)化有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞的選擇標(biāo)記物，以及在可復(fù)制表達(dá)載體的情況下的復(fù)制起點(diǎn)。所述載體可自主復(fù)制或者可整合入宿主細(xì)胞的染色體中。

特別地，根據(jù)本發(fā)明的重組表達(dá)載體可通過將編碼融合蛋白的基因插入到pcDNA3.1-hygro載體中來構(gòu)建。

另外，本發(fā)明提供了經(jīng)用于表達(dá)融合蛋白的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。

因?yàn)樗拗骷?xì)胞在表達(dá)水平和蛋白質(zhì)修飾方面彼此不同，所以選擇最適用于本發(fā)明目的的宿主細(xì)胞是重要的。用于本發(fā)明的宿主細(xì)胞的實(shí)例包括中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、人胚腎細(xì)胞(HEK293)、幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK-21)和人肝癌細(xì)胞系(HepG2)，但不限于此。

可使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)將本發(fā)明的重組表達(dá)載體引入到宿主細(xì)胞中，所述技術(shù)的實(shí)例包括電穿孔、原生質(zhì)體融合、磷酸鈣(CaPO₄)共沉淀和氯化鈣(CaCl₂)沉淀，但不限于此。

根據(jù)本發(fā)明的具有FIX活性的融合蛋白表現(xiàn)出比天然FIX更高的FIX生物活性，因此可有用地應(yīng)用于治療FIX缺陷相關(guān)疾病。

以下實(shí)施例旨在進(jìn)一步闡明本發(fā)明，而不限制其范圍。

下文中，通過以下實(shí)施例更具體地描述本發(fā)明，但是提供它們僅是為了說明目的并且本發(fā)明不限于此。

實(shí)施例1：構(gòu)建FIX表達(dá)載體

為了用于構(gòu)建FIX表達(dá)載體(如圖1A所示)，制備編碼FIX蛋白的多核苷酸片段E。通過將FIX內(nèi)含子的部分插入到FIX外顯子來產(chǎn)生片段E以增加FIX的表達(dá)效力。為此，將FIX內(nèi)含子15’和3’端各自的981和443bp序列插入FIX外顯子1的第88位堿基位置處(JBC,第270卷,第5276-5281頁)。以下將給出該方法的詳細(xì)描述。

<1-1>片段A的產(chǎn)生

將FIX(Kozak+ORF)插入到pcDNA3.1/Hygro/lacZ載體(Invitrogen)中以得到重組載體，命名為pcDNA3.1 FIX pDNA。具體地，合成包含Kozak序列(gccaccatggag)的正義引物(F1,SEQ ID NO:22)和反義引物(R1,SEQ ID NO:23)并用于在HepG2中進(jìn)行PCR以得到FIX(kozak+ORF)。在pfu turbo DNA聚合酶(Invitrogen,2.5單位/μL#600252)的存在下進(jìn)行PCR，在56℃退火并在68℃延伸3分鐘，進(jìn)行30個循環(huán)。將由此得到的PCR產(chǎn)物克隆到pGEM T-easy載體(Promega,Madison,WI,貨號A1360)中用于堿基測序。當(dāng)該載體充當(dāng)模板時，使用正義引物(F2,SEQ ID NO:24)和反義引物(R2,SEQ ID NO:25)通過PCR擴(kuò)增FIX(kozak+ORF)插入物。在pfu turbo DNA聚合酶(Invitrogen,2.5單位/μL#600252)的存在下進(jìn)行PCR，在58℃退火并在68℃延伸3分鐘，進(jìn)行30個循環(huán)。在經(jīng)BamHI/SpeI消化后，使用T4 DNA連接酶(Takara,#2011A)使插入物連接至先前經(jīng)BamHI/XbaI處理的pcDNA3.1/Hygro/lacZ，以得到重組表達(dá)載體，命名為“pcDNA3.1-hygro-FIX(KOI)”。

使pcDNA3.1 FIX pDNA充當(dāng)模板，在pfu turbo DNA聚合酶(Invitrogen,2.5單位/μL#600252)存在下使用正義引物(F3,SEQ ID NO:26)和反義引物(R2,SEQ ID NO:25)通過PCR擴(kuò)增圖1a的片段A。在pfu turbo DNA聚合酶(Invitrogen,2.5單位/μL#600252)存在下進(jìn)行PCR，在58℃下退火并在68℃下延伸2分鐘，進(jìn)行30個循環(huán)。

<1-2>片段B的產(chǎn)生

根據(jù)圖1b中闡明的方法，圖1b的片段B(由“內(nèi)含子F1的部分+內(nèi)含子F2”構(gòu)成)由FIX的內(nèi)含子1(由“內(nèi)含子F1+X+內(nèi)含子F2”構(gòu)成)產(chǎn)生。具體地，在pfu turbo DNA聚合酶(Invitrogen,2.5單位/μL#600252)存在下使用正義引物(F4,SEQ ID NO:27)和反義引物(R3,SEQ ID NO:28)對HEK 293基因組DNA進(jìn)行PCR，在58℃下退火并在68℃下延伸2分鐘，進(jìn)行30個循環(huán)，以得到內(nèi)含子F2 PCR產(chǎn)物。使該內(nèi)含子F2 PCR產(chǎn)物充當(dāng)模板，在pfu turbo DNA聚合酶(Invitrogen,2.5單位/μL#600252)存在下使用正義引物(F5,SEQ ID NO:29)和反義引物(R3,SEQ ID NO:28)進(jìn)行PCR，在58℃下退火并在68℃下延伸2分鐘，進(jìn)行30個循環(huán)，以得到由內(nèi)含子F1的部分和內(nèi)含子F2組成的片段B。

<1-3>片段C的產(chǎn)生

在pfu turbo DNA聚合酶(Invitrogen,2.5單位/μL#600252)存在下使用正義引物(F5,SEQ ID NO:29)和反義引物(R2,SEQ ID NO:25)通過PCR由分別得自于實(shí)施例<1-1>和<1-2>的片段A和B擴(kuò)增由內(nèi)含子F1的部分、內(nèi)含子F2和外顯子F2組成的片段C。使用pfu turbo DNA聚合酶(Invitrogen,2.5單位/μL#600252)進(jìn)行PCR，在58℃退火并在68℃延伸3分鐘，進(jìn)行30個循環(huán)。

<1-4>片段D的產(chǎn)生

使用正義引物(F6,SEQ ID NO:30)和反義引物(R4,SEQ ID NO:31)通過PCR由HEK 293基因組DNA中擴(kuò)增由外顯子F1和內(nèi)含子F1組成的片段D。在pfu turbo DNA聚合酶(Invitrogen,2.5單位/μL#600252)存在下進(jìn)行PCR，在58℃下退火并在68℃下延伸2分鐘，進(jìn)行30個循環(huán)。

<1-5>片段E的產(chǎn)生

在pfu turbo DNA聚合酶(Invitrogen,2.5單位/μL#600252)存在下使用正義引物(F6；SEQ ID NO:30)和反義引物(R2,SEQ ID NO:25)通過PCR由分別得自于實(shí)施例<1-3>和<1-4>的片段C和D擴(kuò)增片段E。進(jìn)行PCR，在58℃退火下并在68℃下延伸3分鐘，進(jìn)行30個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物克隆到pGEM T-easy載體(Promega,Madison,WI,貨號A1360)中并進(jìn)行堿基測序。片段E由Kozak序列、ORF和內(nèi)含子1的部分構(gòu)成，并且命名為“FIX(KOI)”。

<1-6>表達(dá)載體的構(gòu)建

開始在98℃下維持30秒以變性之后，在高保真DNA聚合酶(Finnzyme,2單元/μL,#F-530S)存在下使用正義引物(F2,SEQ ID NO:24)和反義引物(R5,SEQ ID NO:32)對得自于實(shí)施例<1-5>的FIX(KOI)進(jìn)行PCR，在98℃下10秒，在58℃下45秒，在72℃下2分鐘，進(jìn)行30個循環(huán)，然后在72℃下進(jìn)行最終的延伸7分鐘。用BamHI和XhoI處理由此得到的PCR產(chǎn)物，然后使用T4 DNA連接酶(Takara,#2011A)連接至之前經(jīng)相同酶消化的pcDNA3.1/hygro載體，以構(gòu)建重組表達(dá)載體“pcDNA3.1-hygro-FIX(KOI)”。

在用于構(gòu)建FIX(KOI)表達(dá)載體的PCR中使用的引物歸納于下表1中。

[表1]

實(shí)施例2：FIX(KOI)-Tf表達(dá)載體(pcDNA3.1-hygro-FIX(KOI)-Tf)的構(gòu)建

構(gòu)建了能夠表達(dá)其中FIX(KOI)與人轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)連接的融合蛋白的載體。

圖2示意性地闡明了表達(dá)載體的構(gòu)建。為此，使用得自于實(shí)施例1的pcDNA3.1-hygro-FIX(KOI)表達(dá)載體作為模板，通過PCR來擴(kuò)增FIX(KOI)片段。對于PCR，為了從FIX(KOI)中剔除終止密碼子并且在FIX(KOI)與Tf之間插入多種大小的接頭，合成了包含BglII位點(diǎn)可翻譯成蘇氨酸(Thr)和甘氨酸(Gly)的正義引物(F7；SEQ ID NO:33)和剔除終止密碼子的反義引物(R6；SEQ ID NO:34)，兩者都基于包含AgeI(ACCGGT)和XhoI位點(diǎn)(GAGTCT)的序列。將高保真DNA聚合酶(Finnzyme,2單元/μL,#F-530S)用作PCR聚合酶。使PCR混合物(總共50μL，1μL載體模板、2μL引物F7和R6(各10pmol/μL)、10μL 5xHF緩沖液、1μL dNTP、0.5μLDNA聚合酶和35.5μL水)進(jìn)行如下反應(yīng)：在98℃下30秒；然后在98℃下10秒，在58℃下45秒以及在72℃下2分鐘，進(jìn)行30個循環(huán)；然后在72℃下7分鐘。在37℃用BglII和XhoI消化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物(FIX(KOI)-AgeI-XhoI)，然后克隆到之前經(jīng)BamHI and XhoI處理的pcDNA3.1/Hygro載體中。

單獨(dú)地，為了得到人轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)，制備了攜帶人轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)的重組載體pCMV6-NEO。具體地，人C型轉(zhuǎn)鐵蛋白(GenBank登錄號NM_001063.2)的cDNA購買自O(shè)rigene(貨號:SC322130)，并且發(fā)現(xiàn)其具有突變GAT→AAT(Asp197Asn)和CCA→CAA(Pro332Gln)(如堿基測序所分析的)。使用致突變引物F8、R7、F9和R8(SEQ ID NO:35至38)通過基于PCR的誘變恢復(fù)該突變序列。在該P(yáng)CR中，使PCR混合物(總共20μL，1μL含人cDNA克隆的質(zhì)粒DNA(Origene,貨號:SC322130)、1μL F8或R7引物(10μM)、1μL F9或R8引物(10μM)、0.4μL dNTP(10mM)、2μL 10X Pfu turbo PCR緩沖液(Stratagene)、14.2μL蒸餾水和0.4μL Pfu turbo DNA聚合酶(Stratagene,#600252,2.5單元/μL))進(jìn)行如下反應(yīng)：在94℃下5分鐘；然后在94℃下30秒，在58℃下1分鐘和在72℃下10.5分鐘，經(jīng)歷17個循環(huán)；然后在72℃下進(jìn)行最終處理7分鐘。在37℃下用限制性酶DpnI(NEB,#R0176S)消化PCR產(chǎn)物1小時以除去未突變的質(zhì)粒模板。在大腸桿菌(HIT感受態(tài)細(xì)胞,DH5α,#RH617)中擴(kuò)增由此構(gòu)建的重組載體，然后通過小量制備和限制性消化進(jìn)行選擇。使用F10、R9、F11、R10、F12、R11、F13、R12、F14和引物XL39(Origene)(SEQ ID NO:39至48)對所選擇的陽性克隆進(jìn)行測序。結(jié)果是，編碼區(qū)的突變得到恢復(fù)，并且發(fā)現(xiàn)克隆的核苷酸序列與人轉(zhuǎn)鐵蛋白cDNA(GenBank登錄號：NM_001063.2)完全相同。在除了采用引物F15和R13(各20pmol)之外與FIX(KOI)PCR所用條件相同的條件下，在高保真DNA聚合酶(Finnzyme,2單位/μL,#F-530S)存在下使用正義引物(F15,SEQ ID NO:49)和反義引物(R13,SEQ ID NO:50)對人轉(zhuǎn)鐵蛋白cDNA進(jìn)行PCR。在37℃下用AgeI和XhoI處理擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物(Tf)，并且使用DNA連接酶(Takara,#2011A)連接至之前經(jīng)相同限制性酶處理的pcDNA3.1/hygro載體，以得到重組表達(dá)載體FIX(KOI)-Tf。

實(shí)施例3：FIX(KOI)-GS-Tf表達(dá)載體的構(gòu)建

構(gòu)建了用于表達(dá)其中FIX(KOI)通過接頭連接至Tf的融合蛋白的重組載體。所述接頭由一個或更多個重復(fù)單元構(gòu)成，所述重復(fù)單元由四個甘氨酸殘基和一個絲氨酸殘基構(gòu)成(GGGGS)，并且命名為“GS接頭”。GS1(或1GS)、GS2(或2GS)、GS3(或3GS)和GS4(或4GS)分別代表包含一個、兩個、三個和四個重復(fù)單元的GS接頭。在該實(shí)施例中，使用GS1、GS7和GS15接頭。

<3-1>FIX(KOI)-GS1-Tf表達(dá)載體(pcDNA3.1-hygro-FIX(KOI)-GS1-Tf)的構(gòu)建

如下構(gòu)建能夠表達(dá)其中FIX(KOI)通過GS1接頭連接至Tf的融合蛋白的載體。圖3示意性闡明了構(gòu)建方法。

具體地，使用F16(SEQ ID NO:51)和R13(SEQ ID NO:50)引物通過PCR來實(shí)現(xiàn)Tf與GS-1接頭的連接。在高保真DNA聚合酶(Finnzyme,2單位/μL,#F-530S)存在下使PCR在98℃下開始反應(yīng)30秒；接著在98℃下10秒、在58℃下45秒并在72℃下2分鐘，進(jìn)行30個熱循環(huán)；然后在72℃下進(jìn)行最終熱處理7分鐘。由PCR產(chǎn)物，在高保真DNA聚合酶(Finnzyme,2單位/μL,#F-530S)存在下使用正義引物(F17,SEQ ID NO:52)和反義引物(R13,SEQ ID NO:50)通過PCR擴(kuò)增GS1-Tf片段。PCR條件與實(shí)施例2的Tf PCR條件相同。在37℃下用AgeI和XhoI處理所得PCR產(chǎn)物(GS1-Tf)，而用AgeI和SalI消化克隆FIX(KOI)的pBluescript SKII+載體，并且使用T4 DNA連接酶(Takara,#2011A)將由此得到的PCR產(chǎn)物連接至所得的pBluescript SKII+載體。如下構(gòu)建克隆FIX(KOI)的pBluescript SKII+載體。以與實(shí)施例2相同的方法制備不含終止密碼子的FIX PCR產(chǎn)物(FIX(KOI)-AgeI-XhoI)，用BamHI限制性酶處理，并使用T4 DNA連接酶(Takara,#2011A)連接至經(jīng)BamHI/EcoRV處理的pBluescript SKII+。

如下將FIX(KOI)-GS1-Tf片段插入到pcDNA3.1/hygro載體中。首先，在除使用引物F7和R13(每種20pmol)之外與實(shí)施例2的Tf PCR條件相同的條件下，在高保真DNA聚合酶(Finnzyme,2單位/μL,#F-530S)存在下，通過采用以上構(gòu)建的載體作為模板，正義引物(F7；SEQ ID NO:33)和反義引物(R13；SEQ ID NO:50)進(jìn)行PCR以擴(kuò)增FIX(KOI)-GS1-Tf片段。在37℃下用BglII和XhoI消化該P(yáng)CR產(chǎn)物(FIX(KOI)-GS1-Tf)2小時，而用BamHI和XhoI處理pcDNA3.1/Hygro載體，并且使用T4 DNA連接酶(Takara,#2011A)將FIX(KOI)-GS1-Tf片段連接至所得載體以構(gòu)建FIX(KOI)-Tf表達(dá)載體。

<3-2>FIX(KOI)-GS15-Tf表達(dá)載體(pcDNA3.1-hygro-FIX(KOI)-GS15-Tf)的構(gòu)建

如圖4所闡明的構(gòu)建能夠表達(dá)其中FIX(KOI)通過GS15接頭連接至Tf的融合蛋白的載體。

具體地，用AgeI處理亞克隆GS15接頭的載體以得到GS15接頭片段。單獨(dú)地，用相同限制性載體處理在實(shí)施例2中制備的FIX(KOI)-Tf表達(dá)載體，然后在T4 DNA連接酶(Takara,#2011A)存在下將GS15接頭片段連接至其中以構(gòu)建FIX(KOI)-GS15-Tf表達(dá)載體。

實(shí)施例4：包含GS接頭和凝血酶消化位點(diǎn)的FIX(KOI)-Tf表達(dá)載體的構(gòu)建

<4-1>FIX(KOI)-GS1-THR-GS1-Tf表達(dá)載體(pcDNA3.1-hygro-FIX(KOI)-GS1-THR-GS1-Tf)的構(gòu)建

如圖4所闡明的構(gòu)建包含GS1和凝血酶消化位點(diǎn)(THR)的FIX(KOI)-Tf表達(dá)載體。

具體地，在37℃下用AgeI消化亞克隆GS1-THR-GS1的載體(SK Chemical)以得到GS1-THR-GS1片段，同時用相同的限制性酶處理在實(shí)施例2中制備的FIX(KOI)-Tf表達(dá)載體，然后使用T4 DNA連接酶連接以制備FIX(KOI)-GS1-THR-GS1-Tf表達(dá)載體。

<4-2>FIX(KOI)-GS7-THR-GS7-Tf表達(dá)載體(pcDNA3.1-hygro-FIX(KOI)-GS7-THR-GS7-Tf)的構(gòu)建

如圖4所闡明的構(gòu)建包含兩個GS7接頭和位于其間的凝血酶切割位點(diǎn)(THR)的FIX(KOI)-Tf表達(dá)載體。

具體地，在37℃下用AgeI消化亞克隆GS7-THR-GS7的載體(SK Chemical)以得到GS7-THR-GS7片段，同時用相同的限制性酶處理在實(shí)施例2中制備的FIX(KOI)-Tf表達(dá)載體，然后使用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接以制備FIX(KOI)-GS7-THR-GS7-Tf表達(dá)載體。

<4-3>FIX(KOI)-GS1-THR-GS1-del-Tf表達(dá)載體(pcDNA3.1-hygro-FIX(KOI)-GS1-THR-GS1-del-Tf)的構(gòu)建

從實(shí)施例4-1中制備的包含GS1和凝血酶消化位點(diǎn)(THR)的表達(dá)載體中除去接頭通過其與Tf連接的AgeI限制性位點(diǎn)。

具體地，進(jìn)行實(shí)施例2中描述的基于PCR的誘變以從實(shí)施例<4-1>中制備的FIX(KOI)-GS1-THR-GS1-Tf表達(dá)載體中除去AgeI限制性位點(diǎn)。在大腸桿菌(HIT感受態(tài)細(xì)胞,DH5α,#RH617)中擴(kuò)增使用致突變引物F18和R14(SEQ ID NO:53和54)合成的載體，然后通過小量制備和限制性消化進(jìn)行選擇。如使用引物F19(SEQ ID NO:55)進(jìn)行堿基測序所分析的，所選擇的克隆被鑒定為不含AgeI限制性位點(diǎn)。

實(shí)施例5：包含GS接頭和FXa切割位點(diǎn)的FIX(KOI)-Tf表達(dá)載體的構(gòu)建

<5-1>FIX(KOI)-GS1-FXa-Tf表達(dá)載體(pcDNA3.1-hygro-FIX(KOI)-GS1-FXa-Tf)的構(gòu)建

如圖5所闡明的構(gòu)建包含GS1接頭和FXa切割位點(diǎn)(FXa)的FIX(KOI)-Tf表達(dá)載體。

具體地，使構(gòu)成FXa切割位點(diǎn)的兩條互補(bǔ)序列Oa(SEQ ID NO:56)和Ob(SEQ ID NO:57)(每種為5μL中100pmol)在72℃退火10分鐘，并用BglII和BamHI在37℃處理30分鐘。同時，用BamHI處理實(shí)施例<3-1>中制備的FIX(KOI)-GS1-Tf表達(dá)載體以使與GS1連接的Tf片段(下文中成為“Tf-1”)從其中缺失，然后使用T4 DNA連接酶(Takara,#2011A)與FXa切割位點(diǎn)連接。在確定FXa切割位點(diǎn)以正向克隆之后，使用T4 DNA連接酶(Takara,#2011A)將之前通過BamHI消化除去的片段Tf-1再連接至載體的BamHI位點(diǎn)。

<5-2>FIX(KOI)-GS7-FXa-GS7-Tf表達(dá)載體(pcDNA3.1-hygro-FIX(KOI)-GS7-FXa-GS7-Tf)的構(gòu)建

如圖4所闡明的構(gòu)建包含兩個GS7接頭和位于其間的FXa切割位點(diǎn)的FIX(KOI)-Tf表達(dá)載體。

具體地，在37℃下用AgeI處理亞克隆GS7-FXa-GS7的載體以得到GS7-FXa-GS7片段，同時用相同的限制性酶消化實(shí)施例2中制備的FIX(KOI)-Tf表達(dá)載體，然后使用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接以得到FIX(KOI)-GS7-FXa-GS7-Tf表達(dá)載體。

如下制備亞克隆GS7-FXa-GS7的載體。合成引物Oa(SEQ ID NO:56)和Ob(SEQ ID NO:57)以使其包含氨基酸序列IEGR(FXa的切割識別位點(diǎn))。將這些合成的引物(每種5μL,100pmole/μL)在72℃下加熱10分鐘后冷卻，然后退火。使用T4 DNA連接酶將該接頭連接至已依次用限制性酶BamHI和HpaI處理的克隆7GS的pcDNA3.1/Hygro載體(SK Chemical)。用BamHI和HpaI消化所得載體，同時用BglII和HpaI處理包含7GS和Tf的插入物，然后使用T4 DNA連接酶連接。在高保真DNA聚合酶(Finnzyme,2單位/μL,#F-530S)存在下使用F16(SEQ ID NO:51)和R13(SEQ ID NO:50)在克隆7GS的pcDNA3.1/Hygro載體上進(jìn)行PCR(在58℃下退火并在68℃下延伸2分鐘，進(jìn)行30個循環(huán))來制備插入物。PCR產(chǎn)物用BglII和HpaI處理，并通過凝膠提取純化。

實(shí)施例6：包含GS接頭和FXIa切割位點(diǎn)的FIX(KOI)-Tf表達(dá)載體的構(gòu)建

<6-1>FIX(KOI)-GS1-FXIa-Tf表達(dá)載體(pcDNA3.1-hygro-FIX(KOI)-GS1-FXIa-Tf)的構(gòu)建

如圖5所闡明的構(gòu)建包含GS1接頭和FXIa切割位點(diǎn)(FXIa)的FIX(KOI)-Tf表達(dá)載體。

具體地，使構(gòu)成FXIa切割位點(diǎn)的兩條互補(bǔ)序列Oc(SEQ ID NO:58)和Od(SEQ ID NO:59)(每種為5μL中100pmol)在72℃下反應(yīng)10分鐘以退火，然后在37℃下用BamHI處理30分鐘。同時，用BamHI處理實(shí)施例<3-1>中制備的FIX(KOI)-GS1-Tf表達(dá)載體以使與GS1連接的Tf片段(Tf-1)缺失。使用T4 DNA連接酶(Takara,#2011A)將FXIa的切割識別位點(diǎn)連接至表達(dá)載體。在確定FXIa切割位點(diǎn)以正向被克隆之后，用限制性酶BamHI消化重組載體，并在T4 DNA連接酶(Takara,#2011A)存在下在BamHI位點(diǎn)處與片段Tf-1連接。

<6-2>FIX(KOI)-GS7-FXIa-GS7-Tf表達(dá)載體(pcDNA3.1-hygro-FIX(KOI)-GS7-FXIa-GS7-Tf)的構(gòu)建

如圖4所闡明的構(gòu)建包含兩個GS7接頭和位于其間的FXIa切割位點(diǎn)的FIX(KOI)-Tf表達(dá)載體。

具體地，在37℃下用AgeI處理亞克隆GS7-FXIa-GS7的載體以得到GS7-FXIa-GS7片段，同時用相同的限制性酶消化實(shí)施例2中制備的FIX(KOI)-Tf表達(dá)載體，然后使用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接以得到FIX(KOI)-GS7-FXIa-GS7-Tf表達(dá)載體。以除使用引物Oc(SEQ ID NO:58)和Od(SEQ ID NO:59)(設(shè)計成具有氨基酸序列SKLTRAETVF(FXIa的切割識別位點(diǎn)))外與實(shí)施例5-2中用于FIX(KOI)-GS7-FXa-GS7-Tf表達(dá)載體相同的方法制備克隆GS7-FXIa-GS7的載體。

比較例1：FIX(KOI)-G6V-白蛋白表達(dá)載體(pcDNA3.1-hygro-FIX(KOI)-G6V-白蛋白)的構(gòu)建

根據(jù)圖6闡明的方法制備美國專利公開No.20090042787 A1中公開的FIX(KOI)-G6V-白蛋白融合蛋白。首先，使用人肝臟mRNA(Clontech)作為模板以及基因特異性引物F20和R15(SEQ ID NO:60和61)通過RT-PCR得到人白蛋白cDNA。該RT-PCR通過以下過程進(jìn)行：使10μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溶液(1μL 10×反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、0.6μL寡dT引物、1μL dNTP、0.4μL水和5μL人肝臟mRNA(10ng/μL))在65℃下反應(yīng)5分鐘，在室溫下反應(yīng)5分鐘，然后添加1μL 100mM DTT和1μL反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液并使溶液在42℃下反應(yīng)1小時。使用引物F20和R15由作為模板的合成cDNA得到編碼人白蛋白的DNA序列。PCR通過以下過程進(jìn)行：使50μL反應(yīng)溶液(1μL cDNA、10μL 5xHF緩沖液、引物F20和R15(每種1μL)、1μL 10mM dNTP、0.5μLDNA聚合酶(FINNZYMES,#F-530S 2單位/μL)和35.5μL水)在98℃下反應(yīng)1分鐘；并在98℃下10秒、在62℃下30秒并在72℃下60秒進(jìn)行30個循環(huán)；然后在72℃下進(jìn)行最終熱處理7分鐘以終止反應(yīng)。單獨(dú)地，使用引物F21(SEQ ID NO:62)和引物R16(SEQ ID NO:63)通過PCR制備美國專利公開No.20090042787 A1中公開的GS接頭G6V(GGGGGGV)的氨基酸序列以將所得白蛋白作為模板用于覆蓋白蛋白的整個序列。在以下條件下進(jìn)行PCR：在高保真DNA聚合酶(Finnzyme,2單位/μL,#F-530S)存在下，在58℃下退火并在68℃下延伸2分鐘，進(jìn)行30個循環(huán)。用AgeI和XhoI消化PCR產(chǎn)物，同時用AgeI和XhoI處理實(shí)施例2的FIX(KOI)-AgeI-TF，然后使用T4 DNA連接酶(Takara,#2011A)進(jìn)行連接。

實(shí)施例和比較例中構(gòu)建的表達(dá)載體的性質(zhì)歸納于下表2中。

[表2]

實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1：融合蛋白的轉(zhuǎn)染和表達(dá)

<1-1>融合蛋白的轉(zhuǎn)染

將實(shí)施例2至6的FIX(KOI)-Tf表達(dá)載體和比較例1的FIX(KOI)-G6V-白蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到CHO-DG44(VK2)細(xì)胞(穩(wěn)定表達(dá)VKORC1(維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合物亞基1)的CHO細(xì)胞系)中以表達(dá)FIX(KOI)融合蛋白。通過將VKORC1表達(dá)載體引入購買自Invitrogen的CHO-DG44細(xì)胞中來自主制備CHO-DG44(VK2)。

具體地，在大腸桿菌(HIT感受態(tài)細(xì)胞,DH5α,#RH617)中擴(kuò)增實(shí)施例2至5和比較例1中合成的表達(dá)載體，并借助無內(nèi)毒素的maxi prep試劑盒(QIAGEN,貨號12362)進(jìn)行提取。對于表達(dá)對照，采用在實(shí)施例1中構(gòu)建的pcDNA3.1/hygro載體和pcDNA3.1-hygro-FIX(KOI)載體。

為了用于載體轉(zhuǎn)染，如下制備動物細(xì)胞。使CHO-DG44(VK2)細(xì)胞在補(bǔ)加有10％FBS(Lonza,#14-501F)、1×HT(Invitrogen,#11067-030)、4mM L-谷氨酰胺(Lonza,#17-605E)和200μg/ml潮霉素(Invitrogen,#10687-010)的α-MEM(Lonza,#12-169F)上生長48小時，然后離心培養(yǎng)基以除去懸浮細(xì)胞。將由此得到的細(xì)胞以1.5×10⁶個細(xì)胞/孔的密度接種到6孔板上。將細(xì)胞在相同培養(yǎng)基中孵育24小時，并根據(jù)制造商說明書使用Lipofectamine 2000(Invitrogen,Cat no.11668-019)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染DNA是每孔源自FIX(KOI)的DNA 3μg:β-半乳糖苷酶DNA 1μg。轉(zhuǎn)染后4小時，將培養(yǎng)基替換為不含血清的培養(yǎng)基(OptiMEM)并向其中補(bǔ)加5μg/ml維生素K。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)48小時，然后對細(xì)胞培養(yǎng)基采樣并儲存在-70℃。

<1-2>通過Western印跡分析表達(dá)模式

通過Bradford測定定量實(shí)驗(yàn)實(shí)施例<1-1>中得到的樣品的蛋白質(zhì)，并且對于每個樣品，使用4×LDS樣品緩沖液(Invitrogen#NP0008)和7×蛋白酶抑制劑混合物(Roche,Complete Mini,無EDTA,#1 836 170)將總蛋白質(zhì)濃度調(diào)節(jié)為1μg/μL。將10μL樣品加載到4-12％凝膠(Invitrogen,Novex 4-12％Bis-Tris凝膠)中并進(jìn)行凝膠電泳。將電泳中得到的凝膠轉(zhuǎn)移到硝基纖維素膜(Whatman,PROTRAN#BA83)上，然后放入omnitray中并在振蕩器中用封閉溶液(帶有0.1％吐溫20的TBS中的3％BSA)封閉1小時。之后，在4℃下使膜與第一抗體(Cedarlane#CL20040AP)孵育12小時以處理膜，然后在室溫下與第二抗體(抗山羊,Santa Cruz#SC-2350)孵育1小時，之后使用Amersham的ELC溶液混合物(GE Healthcare,#RPN1232)暴露膜。

圖7給出了Western印跡。由圖7可以看出，本發(fā)明的FIX(KOI)融合蛋白沒有片段化，而是具有預(yù)計的大小。

實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2：測定FIX(KOI)融合蛋白的比活性

<2-1>FIX(KOI)融合蛋白衍生物家族(FIX(KOI)-Tf、FIX(KOI)-GS1-Tf、FIX(KOI)-GS1-THR-GS1-Tf、FIX(KOI)-GS15-Tf、FIX(KOI)-GS7-THR-GS7-Tf、FIX(KOI)-GS7-FXa-GS7-Tf、FIX(KOI)-GS7-FXIa-GS7-Tf、FIX(KOI)-GS1-FXa-Tf、FIX(KOI)-GS1-FXIa-Tf、FIX(KOI)-G6V-Alb)和天然FIX(KOI)的比活性

測定了實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1中的FIX(KOI)融合蛋白樣品和野生型FIX(KOI)的比活性。具體地，使用FIX ELISA試劑盒(Cedarlane，用于Elisa-因子IX的成對抗體,CL20041K,批次EIA9-0025R1)測量樣品的FIX蛋白質(zhì)(抗原)水平，并使用BIOPHEN Factor IX測定試劑盒(HYPEN BioMed,Ref.221802)分析顯色活性以確定凝集活性。標(biāo)準(zhǔn)人血漿(Dade Behring,REF ORKL13,批次503214E)用作兩種分析的對照。將標(biāo)準(zhǔn)人血漿由1/100(100％)以1/2逐級稀釋至1/3200(3.13％)。在標(biāo)準(zhǔn)的OD值基礎(chǔ)上，計算樣品中的抗體效價。用于FIX(KOI)融合蛋白的培養(yǎng)基以1/4稀釋。

雖然通過ELISA測量了蛋白質(zhì)(抗原)的量，但是因?yàn)樗鼈冎杏幸恍┛赡苋鄙貴IX活性，所以比活性(活性與抗原之比)通過得自于顯色活性測定的值除以得自于ELISA的值來得到。

實(shí)施例中得到的樣品的ELISA和顯色測定結(jié)果分別歸納于和描述于表3和圖8a中。表3和圖8b給出基于結(jié)果得到的比活性。

[表3]

由表3和圖8b可看出，F(xiàn)IX(KOI)-轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白的比活性是5.86，這與野生型FIX(KOI)的比活性2.98相比顯著增加。此外，觀察到包含接頭的FIX(KOI)-轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白的比活性范圍為1.53至5.58，這也高于FIX(KOI)-G6V-白蛋白融合蛋白的比活性。

<2-2>FIX(KOI)融合蛋白衍生物(FIX(KOI)-GS1-THR-GS1-Tf、FIX(KOI)-GS1-THR-GS1-del-Tf)和野生型FIX(KOI)的比活性

測定實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1中的融合蛋白FIX(KOI)-GS1-THR-GS1-Tf和FIX(KOI)-GS1-THR-GS1-del-Tf以及野生型FIX(KOI)的FIX(KOI)融合蛋白的比活性。使用FIX ELISA試劑盒(Cedarlane,用于Elisa-因子IX的成對抗體,CL20041K,批次EIA9-0028R1)測量實(shí)施例<4-1>和<4-3>中樣品(其接頭的氨基酸序列幾乎相同)的FIX蛋白質(zhì)(抗原)水平，并使用BIOPHEN因子IX測定試劑盒(HYPEN BioMed,Ref.221802,批次01602)分析FIX的顯色活性以確定凝血活性。標(biāo)準(zhǔn)人血漿(Dade Behring,REF ORKL13,批次503216F)用作兩種分析的對照，并且以與實(shí)施例<2-1>相同的方式稀釋。

實(shí)施例<4-1>和<4-3>中樣品的ELISA和顯色活性結(jié)果示于表4和圖8c中，并且基于結(jié)果的比活性歸納于表4和圖8d中。

[表4]

由表4和圖8d可以看出，發(fā)現(xiàn)包含F(xiàn)IX(KOI)-轉(zhuǎn)鐵蛋白接頭的融合蛋白的比活性為1.6至1.8，這與野生型FIX(KOI)的比活性0.9相比增加。此外，發(fā)現(xiàn)分別包含和缺少AgeI限制性位點(diǎn)的FIX(KOI)-GS1-THR-GS1-TF和FIX(KOI)-GS1-THR-GS1-del-Tf融合蛋白的比活性相似。

在該實(shí)驗(yàn)實(shí)施例中，在接頭長度與FIX(KOI)融合蛋白的比活性之間以及接頭的切割位點(diǎn)類型與比活性之間都沒有發(fā)現(xiàn)恒定的關(guān)系。

<110> SK化學(xué)公司

<120> 具有因子IX活性的融合蛋白

<130> IP1678787D

<150> KR 10-2010-0102572

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Lys Cys Leu Lys Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Ser

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<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

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Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Gly

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<213> 人工序列

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<212> PRT

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<400> 9

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

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Gly Gly Ser Ile Glu Gly Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Gly

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<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 10

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1 5 10 15

<210> 11

<211> 82

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GS7-FXIa-GS7接頭

<400> 11

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Gly Gly Gly

35 40 45

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

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Tyr Gly

<210> 12

<211> 2840

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼融合蛋白FIX(KOI)-TF的基因

<400> 12

gaattcgatt accactttca caatctagcc accatggagc gcgtgaacat gatcatggca 60

gaatcaccag gcctcatcac catctgcctt ttaggatatc tactcagtgc tgaatgtaca 120

ggtttgtttc cttttttaaa atacattgag tatgcttgcc ttttagatat agaaatatct 180

gatgctgtct tcttcactaa attttgatta catgatttga cagcaatatt gaagagtcta 240

acagccagca cgcaggttgg taagtactgg ttctttgtta gctaggtttt cttcttcttc 300

atttttaaaa ctaaatagat cgacaatgct tatgatgcat ttatgtttaa taaacactgt 360

tcagttcatg atttggtcat gtaattcctg ttagaaaaca ttcatctcct tggtttaaaa 420

aaattaaaag tgggaaaaca aagaaatagc agaatatagt gaaaaaaaat aaccacatta 480

tttttgtttg gacttaccac tttgaaatca aaatgggaaa caaaagcaca aacaatggcc 540

ttatttacac aaaaagtctg attttaagat atatgacatt tcaaggtttc agaagtatgt 600

aatgaggtgt gtctctaatt ttttaaatta tatatcttca atttaaagtt ttagttaaaa 660

cataaagatt aacctttcat tagcaagctg ttagttatca ccaaagcttt tcatggatta 720

ggaaaaaatc attttgtctc tatgtcaaac atcttggagt tgatatttgg ggaaacacaa 780

tactcagttg agttccctag gggagaaaag caagcttaag aattgacata aagagtagga 840

agttagctaa tgcaacatat atcactttgt tttttcacaa ctacagtgac tttatgtatt 900

tcccagagga aggcatacag ggaagaaatt atcccatttg gacaaacagc atgttctcac 960

aggaagcatt tatcacactt acttgtcaac tttctagaat caaatctagt agctgacagt 1020

accaggatca ggggtgccaa ccctaagcac ccccagaaag ctgactggcc ctgtggttcc 1080

cactccagac atgatgtcag ctggaccata attaggcttc tgttcttcag gagacatttg 1140

ttcaaagtca tttgggcaac catattctga aaacagccca gccagggtga tggatcactt 1200

tgcaaagatc ctcaatgagc tattttcaag tgatgacaaa gtgtgaagtt aaccgctcat 1260

ttgagaactt tctttttcat ccaaagtaaa ttcaaatatg attagaaatc tgacctttta 1320

ttactggaat tctcttgact aaaagtaaaa ttgaatttta attcctaaat ctccatgtgt 1380

atacagtact gtgggaacat cacagatttt ggctccatgc cctaaagaga aattggcttt 1440

cagattattt ggattaaaaa caaagacttt cttaagagat gtaaaatttt catgatgttt 1500

tcttttttgc taaaactaaa gaattattct tttacatttc agtttttctt gatcatgaaa 1560

acgccaacaa aattctgaat cggccaaaga ggtataattc aggtaaattg gaagagtttg 1620

ttcaagggaa ccttgagaga gaatgtatgg aagaaaagtg tagttttgaa gaagcacgag 1680

aagtttttga aaacactgaa agaacaactg aattttggaa gcagtatgtt gatggagatc 1740

agtgtgagtc caatccatgt ttaaatggcg gcagttgcaa ggatgacatt aattcctatg 1800

aatgttggtg tccctttgga tttgaaggaa agaactgtga attagatgta acatgtaaca 1860

ttaagaatgg cagatgcgag cagttttgta aaaatagtgc tgataacaag gtggtttgct 1920

cctgtactga gggatatcga cttgcagaaa accagaagtc ctgtgaacca gcagtgccat 1980

ttccatgtgg aagagtttct gtttcacaaa cttctaagct cacccgtgct gaggctgttt 2040

ttcctgatgt ggactatgta aattctactg aagctgaaac cattttggat aacatcactc 2100

aaagcaccca atcatttaat gacttcactc gggttgttgg tggagaagat gccaaaccag 2160

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ttgctgacaa ggaatacacg aacatcttcc tcaaatttgg atctggctat gtaagtggct 2520

ggggaagagt cttccacaaa gggagatcag ctttagttct tcagtacctt agagttccac 2580

ttgttgaccg agccacatgt cttcgatcta caaagttcac catctataac aacatgttct 2640

gtgctggctt ccatgaagga ggtagagatt catgtcaagg agatagtggg ggaccccatg 2700

ttactgaagt ggaagggacc agtttcttaa ctggaattat tagctggggt gaagagtgtg 2760

caatgaaagg caaatatgga atatatacca aggtatcccg gtatgtcaac tggattaagg 2820

aaaaaacaaa gctcacttaa 2840

<210> 13

<211> 4892

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼融合蛋白FIX(KOI)-GS1-TF的基因

<400> 13