技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及包含10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤之變化形式的化合物和組合物以及其在治療癌癥和炎性疾病之方法中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤(包括“10-炔丙基-10-dAM”、“普拉曲沙”(“pralatrexate”)、“外消旋PDX”、“(2S)-2-[[4-[(1RS)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲酰基]氨基]戊二酸”、“(2RS)-2-[[4-[(1RS)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲?；鵠氨基]戊二酸”和“PDX”)是已被測(cè)試并發(fā)現(xiàn)可用于治療癌癥的化合物。外消旋形式的(2S)-2-[[4-[(1RS)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲?；鵠氨基]戊二酸已被美國(guó)食品及藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)用作復(fù)發(fā)性和難治性外周T細(xì)胞淋巴瘤的治療。(2S)-2-[[4-[(1RS)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲酰基]氨基]戊二酸還被研究用于淋巴瘤、肺癌、膀胱癌和乳腺癌。
該化合物(其具有圖1所示的結(jié)構(gòu))由DeGraw等,"Synthesis and Antitumor Activity of 10-Propargyl-10-deazaaminopterin,"J.Med.Chem.36:2228-2231(1993)首次公開，并且被證明在鼠L1210細(xì)胞系中作為酶二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase，“DHFR”)抑制劑以及作為生長(zhǎng)抑制劑而發(fā)揮作用。此外，一些結(jié)果表明了使用E0771鼠乳腺腫瘤模型時(shí)該化合物的抗腫瘤特性。
美國(guó)專利No.6,028,071和PCT公開No.WO 1998/02163公開了高度純化的PDX組合物當(dāng)在異種移植模型中測(cè)試時(shí)具有抗人腫瘤的效力。使用PDX的后續(xù)研究表明所述PDX可單獨(dú)使用以及與其他治療劑組合使用。例如，Sirotnak等,Clinical Cancer Research Vol.6,3705-3712(2000)報(bào)道了共施用PDX和丙磺舒(一種cMOAT/MRP樣質(zhì)膜ATP酶抑制劑)大大增強(qiáng)了PDX抗人實(shí)體腫瘤的效力。PDX以及PDX與基于鉑化療劑的組合表明可有效對(duì)抗間皮瘤。(Khokar等,Clin.Cancer Res.7:3199-3205(2001)。與吉西他濱(Gem)共施用用于治療淋巴瘤已在WO/2005/117892中公開。(美國(guó)專利No.6,323,205中公開了PDX與紫杉醇(taxols)的組合是有效的。PDX還表明可有效治療T細(xì)胞淋巴瘤，參見美國(guó)專利No.7,622,470。另一些研究顯示了通過測(cè)定樣品所表達(dá)的還原性葉酸載體-1酶(reduced folate carrier-1 enzyme，RFC-1)之量來評(píng)價(jià)用PDX治療淋巴瘤之敏感性的方法，其中較高水平表達(dá)的RFC-1指示對(duì)10-炔丙基-10-dAM的較大敏感性，這在PCT公開No.WO 2005/117892中公開。
本發(fā)明涉及克服上述一個(gè)或更多個(gè)問題。
發(fā)明概述
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤或其鹽的基本上純的非對(duì)映體，其中所述非對(duì)映體是(2S)-2-[[4-[(1S)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲?；鵠氨基]戊二酸或(2S)-2-[[4-[(1R)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲?；鵠氨基]戊二酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基本上純的非對(duì)映體是(2S)-2-[[4-[(1S)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲?；鵠氨基]戊二酸或其鹽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述基本上純的非對(duì)映體是(2S)-2-[[4-[(1R)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲?；鵠氨基]戊二酸或其鹽。在一個(gè)方面中，所述鹽是鹽酸鹽。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括藥物組合物，其包含基本上純的(2S)-2-[[4-[(1S)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲?；鵠氨基]戊二酸或其鹽或者基本上純的(2S)-2-[[4-[(1R)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲酰基]氨基]戊二酸或其鹽，以及可藥用載體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括藥物組合物，其包含藥學(xué)有效量的基本上純的(2S)-2-[[4-[(1R)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲?；鵠氨基]戊二酸或其鹽或者基本上純的(2S)-2-[[4-[(1S)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲?；鵠氨基]戊二酸或其鹽，以及可藥用載體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可用在治療癌癥的方法中。待治療的癌癥包括前列腺癌、T細(xì)胞淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、血液惡性腫瘤(hematologic malignancy)、頭頸癌、胃腸道的癌癥、卵巢癌和骨肉瘤。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可用在治療炎性疾病的方法中。待治療的炎性疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物被配制用于口服施用；在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物被配制用于靜脈內(nèi)施用。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括治療癌癥的方法，其包括向需要所述治療的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的基本上純的非對(duì)映體或其鹽，所述非對(duì)映體是(2S)-2-[[4-[(1S)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲?；鵠氨基]戊二酸或(2S)-2-[[4-[(1R)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲?；鵠氨基]戊二酸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括治療炎癥的方法，其包括向需要所述治療的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的基本上純的非對(duì)映體或其鹽，所述非對(duì)映體是(2S)-2-[[4-[(1S)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲?；鵠氨基]戊二酸或(2S)-2-[[4-[(1R)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲酰基]氨基]戊二酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基本上純的非對(duì)映體是(2S)-2-[[4-[(1S)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲?；鵠氨基]戊二酸，其量按重量計(jì)大于10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤總量的約90％。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述基本上純的非對(duì)映體是(2S)-2-[[4-[(1R)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲?；鵠氨基]戊二酸，其量按重量計(jì)大于10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤總量的約90％。本發(fā)明的方法還包括與本發(fā)明的基本上純的非對(duì)映體一起使用可藥用載體?？煽诜蜢o脈內(nèi)施用本發(fā)明的所述基本上純的非對(duì)映體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的基本上純的非對(duì)映體可每周施用。在該實(shí)施方案中，可以以30mg/m2/劑量的量或以10至150mg/m2/劑量的量施用所述基本上純的非對(duì)映體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的基本上純的非對(duì)映體可每?jī)芍苁┯?。在該?shí)施方案中，以100至275mg/m2/劑量的量或以10至275mg/m2/劑量的量施用所述基本上純的非對(duì)映體。
可以在一個(gè)或更多個(gè)周期中施用本發(fā)明的基本上純的非對(duì)映體，每個(gè)周期包括以30至150mg/m2/劑量的量每周施用一次，施用6周，隨后休息1周。
任選地，施用本發(fā)明基本上純的非對(duì)映體包括補(bǔ)充葉酸和維生素B12。在一個(gè)實(shí)施方案中，以0.25至4mg/kg/劑量的量施用本發(fā)明的基本上純的非對(duì)映體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括本發(fā)明的基本上純的非對(duì)映體在制備用于治療癌癥之藥物組合物中的用途。本發(fā)明還包括本發(fā)明的基本上純的非對(duì)映體在制備用于治療炎性疾病之藥物組合物中的用途。
附圖簡(jiǎn)述
圖1顯示可用于制備(2S)-2-[[4-[(1RS)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲?；鵠氨基]戊二酸的合成方案。
發(fā)明詳述
除非另外指明，否則本說明書和權(quán)利要求書中所使用的表示成分、大小、反應(yīng)條件等之量的所有數(shù)字均應(yīng)理解為在所有情況下被術(shù)語(yǔ)“約”修飾。
在本申請(qǐng)和權(quán)利要求中，除非另有具體說明，否則沒有數(shù)量詞修飾的名詞表示一個(gè)/種或更多個(gè)/種。此外，除非另有說明，使用“或(或者)”意為“和/或”。此外，使用術(shù)語(yǔ)“包括”及其他形式(例如，“包含”和“含有”)是非限制性的。此外，除非另外具體說明，否則術(shù)語(yǔ)例如“要素”或“組分”包括包含一個(gè)單位的要素和組分以及包含超過一個(gè)單位的要素和組分。
本發(fā)明涉及有效治療癌癥和炎性疾病的方法和組合物，其包含普拉曲沙的非對(duì)映體。普拉曲沙在碳10(C10)和碳19(C19)處含有非對(duì)稱中心。在一個(gè)實(shí)施方案中，外消旋普拉曲沙包括C10手性中心處R和S構(gòu)型的約1:1的外消旋混合物，并且在C19手性中心處的S-非對(duì)映體≥98.0％。本實(shí)施方案的兩種C10非對(duì)映體稱為：
PDX-10a[S-構(gòu)型]化學(xué)名：(2S)-2-[[4-[(1S)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲酰基]氨基]戊二酸。
PDX-10b[R-構(gòu)型]化學(xué)名：(2S)-2-[[4-[(1R)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲?；鵠氨基]戊二酸。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述外消旋體可被描述為(2S)-2-[[4-[(1RS)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲?；鵠氨基]戊二酸，分子量：477.5，分子式：C23H23N7O5，在C10處非對(duì)映體的1:1混合物。
式1：PDX-10a[S-構(gòu)型]化學(xué)名：(2S)-2-[[4-[(1S)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲?；鵠氨基]戊二酸。
式2：PDX-10b[R-構(gòu)型]化學(xué)名：(2S)-2-[[4-[(1R)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲?；鵠氨基]戊二酸。
PDX的C10非對(duì)映體(PDX-10a和PDX-10b)具有觀察到的根據(jù)癌細(xì)胞系而變化的活性；在一些情況下，S非對(duì)映體表現(xiàn)出優(yōu)于外消旋體的活性，而在另一些情況中，R非對(duì)映體具有較好的活性。將所述非對(duì)映體的藥代動(dòng)力學(xué)彼此比較，也發(fā)現(xiàn)了差異。應(yīng)指出，葉酸途徑(PDX通過該途徑施加其活性的主要部分)包括多種已鑒定的酶，并且還可包括未鑒定的酶。該復(fù)雜途徑中的酶包括還原性葉酸載體-1酶(RFC-1)、二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)、葉酸多聚-γ-谷氨酸合成酶(folylpoly-gamma-glutamate synthetase，F(xiàn)PGS)、胸苷酸合酶(thymidylate synthase，TS)、γ谷氨酰水解酶(γ-glutamyl hydrolase，GGH)和甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰轉(zhuǎn)移酶(glycinamide ribonucleotide formyltransferase，GARFT)。有關(guān)其它去氮雜氨基蝶呤的現(xiàn)有技術(shù)提出對(duì)去氮雜氨基蝶呤C10手性中心附近的變化存在耐受(例如，DeGraw等,1995,Current Medicinal Chem.2:630和DeGraw等1986,J.Med.Chem.29(6):1056)，這也導(dǎo)致所觀察到的非對(duì)映體之間的活性差異出乎意料。
在具體癌癥中選擇相對(duì)于其他非對(duì)映體、外消旋體或此二者具有增強(qiáng)活性的PDX特定非對(duì)映體的能力為醫(yī)生在治療癌癥患者時(shí)提供了現(xiàn)實(shí)和實(shí)在的利益。例如，主治醫(yī)生可具有選擇PDX之外消旋體、PDX-10a[S-構(gòu)型]和PDX-10b[R-構(gòu)型]的多種選擇。如本文實(shí)施例中更詳細(xì)地列出的那樣，已在模型系統(tǒng)中測(cè)試了PDX-10a和PDX-10b對(duì)抗多種癌細(xì)胞系的效力。
可使用DeGraw 1993論文(見上文)中或DeGraw等人的美國(guó)專利No.5,354,751實(shí)施例7中所公開的方法來合成外消旋的PDX，涉及制造PDX的專利No.5,354,751實(shí)施例7通過引用全文并入本文。還可通過美國(guó)專利No.6,028,071(尤其是實(shí)施例1)中提出的方法來合成外消旋的PDX，該實(shí)施例通過引用并入本文。
為了產(chǎn)生PDX-10a和/或PDX-10b，可按照本文和別處的教導(dǎo)合成外消旋的PDX，并且最終產(chǎn)物或前期中間體產(chǎn)物均可隨后用作分離C10非對(duì)映體的原料?；蛘?，可采用手性合成，其中直接從多種原料中的任意原料產(chǎn)生基本上純的PDX-10a和/或PDX-10b。可采用本領(lǐng)域中已知的用于分離對(duì)映體或非對(duì)映體的手性柱來分離最終外消旋PDX或前期中間體的非對(duì)映體。用于分離非對(duì)映體的合適手性柱包括手性柱CHIRALPAK AD(可獲自Daicel Chemical Industries Ltd.,Japan)，使用乙醇作為流動(dòng)相。
在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的基本上純的非對(duì)映體，或其鹽、酯、溶劑化物和/或多晶型，其中所述基本上純的非對(duì)映體是(2S)-2-[[4-[(1S)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲?；鵠氨基]戊二酸或(2S)-2-[[4-[(1R)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲?；鵠氨基]戊二酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基本上純的非對(duì)映體是(2S)-2-[[4-[(1S)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲?；鵠氨基]戊二酸或其鹽、酯、溶劑化物和/或多晶型。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述基本上純的非對(duì)映體是(2S)-2-[[4-[(1R)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲酰基]氨基]戊二酸或其鹽、酯、溶劑化物和/或多晶型。
本發(fā)明還提供了在對(duì)其有需要的患者中治療癌癥的方法，包括向患者施用治療有效量的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的基本上純的非對(duì)映體，或其鹽、酯、溶劑化物和/或多晶型，其中所述基本上純的非對(duì)映體是(2S)-2-[[4-[(1S)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲?；鵠氨基]戊二酸或(2S)-2-[[4-[(1R)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲?；鵠氨基]戊二酸。
在一個(gè)癌癥治療實(shí)施方案中，所述基本上純的非對(duì)映體是(2S)-2-[[4-[(1S)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲?；鵠氨基]戊二酸或者其鹽、酯、溶劑化物和/或多晶型。在另一個(gè)癌癥治療方案中，所述基本上純的非對(duì)映體是(2S)-2-[[4-[(1R)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲?；鵠氨基]戊二酸或其鹽、酯、溶劑化物和/或多晶型。在一些實(shí)施方案中，10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的基本上純的非對(duì)映體或者其鹽、酯、溶劑化物和/或多晶型基本上不含有10-去氮雜氨基蝶呤。
本文中使用的“基本上純的PDX-10a”意為PDX-10a的量按重量計(jì)超過10-炔丙基-dAM總量的約90％；按重量計(jì)超過10-炔丙基-dAM總量的約91％；按重量計(jì)超過10-炔丙基-dAM總量的約92％；按重量計(jì)超過10-炔丙基-dAM總量的約93％；按重量計(jì)超過10-炔丙基-dAM總量的約94％；按重量計(jì)超過10-炔丙基-dAM總量按重量計(jì)超過的約95％；按重量計(jì)超過10-炔丙基-dAM總量的約96％；按重量計(jì)超過10-炔丙基-dAM總量的約97％；按重量計(jì)超過10-炔丙基-dAM總量的約98％；按重量計(jì)超過10-炔丙基-dAM總量的約98.5％；按重量計(jì)超過10-炔丙基-dAM總量的約99％；按重量計(jì)超過10-炔丙基-dAM總量的約99.5％；按重量計(jì)超過10-炔丙基-dAM總量的99.7％；按重量計(jì)超過10-炔丙基-dAM總量按重量計(jì)超過的約99.8％；以及按重量計(jì)超過10-炔丙基-dAM總量的約99.9％。類似地，本文中使用的“基本上純的PDX-10b”意為PDX-10b的量按重量計(jì)超過10-炔丙基-dAM總量的約90％；按重量計(jì)超過10-炔丙基-dAM總量的約91％；按重量計(jì)超過10-炔丙基-dAM總量的約92％；按重量計(jì)超過10-炔丙基-dAM總量的約93％；按重量計(jì)超過10-炔丙基-dAM總量的約94％；按重量計(jì)超過10-炔丙基-dAM總量按重量計(jì)超過的約95％；按重量計(jì)超過10-炔丙基-dAM總量的約96％；按重量計(jì)超過10-炔丙基-dAM總量的約97％；按重量計(jì)超過10-炔丙基-dAM總量的約98％；按重量計(jì)超過10-炔丙基-dAM總量的約98.5％；按重量計(jì)超過10-炔丙基-dAM總量的約99％；按重量計(jì)超過10-炔丙基-dAM總量的約99.5％；按重量計(jì)超過10-炔丙基-dAM總量的99.7％；按重量計(jì)超過10-炔丙基-dAM總量按重量計(jì)超過的約99.8％；以及按重量計(jì)超過10-炔丙基-dAM總量的約99.9％。
待用PDX-10a和/或PDX-10b治療的癌癥包括例如前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、肺癌和T細(xì)胞淋巴瘤。對(duì)于T細(xì)胞淋巴瘤，有多種情況使用本發(fā)明的非對(duì)映體來治療，其包括：(a)成淋巴細(xì)胞性白血病，其中該惡性腫瘤發(fā)生于來自胸腺的原始淋巴樣祖細(xì)胞；(b)成熟或外周T細(xì)胞腫瘤，包括T細(xì)胞前淋巴細(xì)胞性白血病、T細(xì)胞顆粒淋巴細(xì)胞性白血病、侵襲性NK細(xì)胞白血病、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(蕈樣肉芽腫病/塞澤里綜合征)、間變性大細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞類型、腸病型T細(xì)胞淋巴瘤、成人T細(xì)胞白血病/淋巴瘤(包括與HTLV-1相關(guān)的那些)以及血管免疫母細(xì)胞性(angioimmunoblastic)T細(xì)胞淋巴瘤以及皮下脂膜炎性T細(xì)胞淋巴瘤；以及(c)最初涉及淋巴結(jié)副皮質(zhì)并且從不長(zhǎng)成真正的濾泡型的外周T細(xì)胞淋巴瘤。待治療的其他癌癥包括血液惡性腫瘤、頭頸癌、胃腸道的癌癥、卵巢癌和骨肉瘤。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括治療炎性疾病的方法，包括向患有所述炎性疾病的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的基本上純的非對(duì)映體，或者其鹽、酯、溶劑化物和/或多晶型，其中所述基本上純的非對(duì)映體是(2S)-2-[[4-[(1S)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲酰基]氨基]戊二酸或(2S)-2-[[4-[(1R)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲?；鵠氨基]戊二酸。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)“炎性疾病”是指由炎癥引起的或者其癥狀包括炎癥的疾病。例如，由炎癥引起的炎性疾病可以是膿毒性休克，其癥狀包括炎癥的炎性疾病可以是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。本發(fā)明的炎性疾病包括但不限于：心血管疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、克羅恩病、炎性腸病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多肌炎、膿毒性休克、移植物抗宿主病、哮喘、鼻炎、銀屑病和濕疹。在一個(gè)實(shí)施方案中，待治療的炎性疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)“治療”意為減輕癥狀，暫時(shí)或永久清除癌癥或炎性疾病的病因，延緩癥狀的出現(xiàn)和/或疾病的發(fā)展，或者預(yù)防疾病(即，預(yù)防性治療)。接受預(yù)防性治療的對(duì)象通常是由于例如遺傳傾向、飲食、暴露于致病因素、暴露于病原體等而處于癌癥或炎性病癥風(fēng)險(xiǎn)中的哺乳動(dòng)物。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)“患者”或“哺乳動(dòng)物”是指歸類為哺乳動(dòng)物的任何動(dòng)物，包括人、家養(yǎng)和農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物以及動(dòng)物園動(dòng)物或伴侶動(dòng)物，例如狗、馬、貓、牛等。優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物是人。
通常會(huì)以本領(lǐng)域中已知的為所治療患者提供最有效治療(從有效性和安全性兩個(gè)角度)的劑量方案向患者施用PDX-10a和/或PDX-10b。在實(shí)施本發(fā)明的治療方法中，可依據(jù)所治療的癌癥類型以及處方醫(yī)生根據(jù)例如已發(fā)表的臨床研究結(jié)果所作出的醫(yī)學(xué)判斷，以本領(lǐng)域中已知的任何有效方式施用PDX-10a和/或PDX-10b，例如通過口服、表面、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、經(jīng)陰道、經(jīng)直腸、顱內(nèi)或皮內(nèi)途徑施用。
所述基本上純的PDX-10a或PDX-10b可作為藥物制劑的一部分來配制。具體的劑型將取決于施用方法，但可包括片劑、膠囊、口服液體和用于口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、顱內(nèi)或腹膜內(nèi)施用的可注射溶液等。劑量可表示為mg/m2?；蛘?，劑量可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員可接受的任何方式表示為mg/kg體重。用于獲得mg/kg體重等效劑量的一種方法涉及應(yīng)用換算因子0.025mg/kg，其對(duì)于人平均而言近似相當(dāng)于1mg/m2。根據(jù)該計(jì)算，150mg/m2的劑量近似相當(dāng)于約3.75mg/kg。
本發(fā)明非對(duì)映體用于腫瘤的合適劑量包括以下劑量方案。例如，約10至120mg/m2體表面積/天的劑量(約0.25至3mg/kg體重/天)是合適的。每周30mg/m2(約0.75mg/kg)的劑量3周之后休息一周，每周30mg/m2(約0.75mg/kg)×6周后休息一周，或者在每周×6周的方案中逐漸增加PDX的劑量也是合適的。可基于患者的耐受性和惡性腫瘤的類型而適當(dāng)?shù)厥褂幂^低的劑量。當(dāng)施用頻率較低時(shí)，可使用更高的劑量。因此，一般意義上，10至275mg/m2(約0.25至約6.9mg/kg)的劑量適合用于多種劑量方案，例如每?jī)芍芗s100至275mg/m2(約2.5至約6.87mg/kg)的劑量，以及每周約10至150mg/m2(約0.25至約3.75mg/kg)，或者更具體地約10至60mg/m2的劑量。
使用類似于美國(guó)專利No.6,323,205中描述的那些方案確定合適的劑量是本領(lǐng)域中已知的技術(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以以每個(gè)劑量約10至約275mg/m2(約0.25至約6.87mg/kg)的量來施用所述基本上純的PDX-10a或PDX-10b非對(duì)映體。本發(fā)明的方法還包括每周施用所述基本上純的PDX-10a或PDX-10b非對(duì)映體；劑量為約10mg/m2(0.25mg/kg)或約30mg/m2(0.75mg/kg)；量為每劑量約10至約150mg/m2(約0.25至約3.75mg/kg)；兩周一次；并且劑量為約100至約275mg/m2(約2.5至約6.9mg/kg)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以以約0.25mg/kg至約4mg/kg、約0.75mg/kg至約3mg/kg的量、以約1.0mg/kg至約2.5mg/kg的量、以約0.25mg/kg或約0.75mg/kg的量(或者以體表面積(body surface area，BSA)計(jì)的等效量)來施用所述基本上純的PDX-10a或PDX-10b非對(duì)映體。
為了治療炎性疾病，可通過口服、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)或鞘內(nèi)途徑給予基本上純的PDX-10a或PDX-10b非對(duì)映體。本領(lǐng)域技術(shù)人員也會(huì)想到其他途徑。為治療炎性疾病(包括但不限于銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和/或幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)，劑量可包括以下那些。用于成人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或多關(guān)節(jié)性幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的本發(fā)明方法包括每周一次口服施用約1至約30mg；在一個(gè)實(shí)施方案中，每周一次施用約7.5mg。其他劑量可包括每周一次給以10mg/m2?？芍饾u調(diào)整劑量直至達(dá)到最佳響應(yīng)。在較高劑量(例如，高于20mg/m2/周或0.65至1.0mg/kg/周)時(shí)，可通過肌內(nèi)或皮下給藥來實(shí)現(xiàn)更好的吸收。合適的劑量還包括7.5mg/周，或者約0.5至約10mg的分開的口服劑量；在一個(gè)實(shí)施方案中，劑量可以是間隔12小時(shí)的分開的2.5mg的口服劑量，每周給予三個(gè)劑量作為一個(gè)療程。只要有效，就可持續(xù)該劑量，包括長(zhǎng)達(dá)兩年和更長(zhǎng)的治療。
可同時(shí)施用或者作為普通治療方案的一部分而組合使用所述基本上純的PDX-10a或PDX-10b非對(duì)映體和其它藥劑，其中在相同或不同的時(shí)間施用PDX-10a和/或PDX-10b以及所述其它藥劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物可包含與抗癌劑組合的基本上純的PDX-10a或PDX-10b非對(duì)映體，其中所述抗癌劑是選自下述的成員：烷化劑藥物、抗代謝劑、微管抑制劑、鬼臼毒素類(podophyllotoxins)、抗生素、亞硝基脲、激素治療劑、激酶抑制劑、腫瘤細(xì)胞凋亡激活劑和抗血管發(fā)生劑。
例如，可在使用所述基本上純的PDX-10a或PDX-10b非對(duì)映體之前、之后立即或一段時(shí)間(例如，24小時(shí))后施用所述其他藥劑。因此，對(duì)于本申請(qǐng)的目的而言，除非另外指明，術(shù)語(yǔ)施用一般是指同時(shí)施用或依次施用藥物，并且以平行治療方案中的任一順序施用，藥物之間在時(shí)間上分開或不分開。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基本上純的PDX-10a或PDX-10b可以2mg/kg每天1次施用，施用5天，或者進(jìn)行兩個(gè)周期，每個(gè)周期5天，始于治療方案開始時(shí)。
基本上純的PDX-10a或PDX-10b適于與葉酸和維生素B12補(bǔ)充劑組合使用以降低治療的副作用。例如，可用葉酸(每天1mg/m2，始于用所述基本上純的PDX-10a或PDX-10b非對(duì)映體治療之前1周，或者，不基于BSA而每天1mg口服(p.o.))；以及B12(每月1mg/m2，或者，每8～10周肌內(nèi)(I.M.)給予1mg(不基于BSA)，或者，每天口服給予1mg(不基于BSA))治療患者。
可以多種多樣的不同劑型施用基本上純的PDX-10a或PDX-10b。例如，可優(yōu)選口服或腸胃外施用所述基本上純的PDX-10a或PDX-10b。在一個(gè)實(shí)施方案中，可口服施用所述基本上純的PDX-10a或PDX-10b。在一個(gè)實(shí)施方案中，胃腸外施用基本上純的PDX-10a或PDX-10b，并且可通過靜脈內(nèi)途徑施用。
所述基本上純的PDX-10a或PDX-10b可以以片劑、膠囊、糖錠劑(lozenge)、錠劑(troche)、硬糖、粉末、噴霧劑、乳膏、油膏(salve)、栓劑、膠凍劑、凝膠劑、糊劑、洗劑、軟膏劑、酏劑、糖漿劑等形式與多種可藥用惰性載體一起施用?？梢砸詥蝹€(gè)或多個(gè)劑量施用這些劑型。載體包括固體稀釋劑或填充劑、無菌水性介質(zhì)以及多種無毒的有機(jī)溶劑等?？蓪?duì)口服藥物組合物適當(dāng)?shù)靥砑犹鹞秳┖?或調(diào)味劑。對(duì)于口服施用基本上純的PDX-10a或PDX-10b，可將含有一種或兩種活性劑的片劑與任何多種賦形劑組合，所述賦形劑例如微晶纖維素、檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸二鈣和甘氨酸、以及多種崩解劑(例如淀粉(且優(yōu)選玉米、馬鈴薯或木薯淀粉)、藻酸和某些復(fù)合硅酸鹽、以及造粒粘合劑(如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明膠和阿拉伯膠)。此外，潤(rùn)滑劑(例如硬脂酸鎂、月桂基硫酸鈉和滑石粉)對(duì)于壓片目的通常非常有用。類似類型的固體組合物也可用作明膠膠囊中的填充劑；在這方面，優(yōu)選的材料還包括乳糖(lactose或milk sugar)，以及高分子量的聚乙二醇。當(dāng)期望水混懸劑和/或酏劑用于口服施用時(shí)，所述基本上純的PDX-10a或PDX-10b可與不同的甜味劑或矯味劑、著色物質(zhì)或染料組合，以及如果需要還可與乳化劑和/或助懸劑以及稀釋劑(例如水、乙醇、丙二醇、甘油等及其組合)組合?？赏ㄟ^任選地與一種或更多種輔助成分或輔料壓縮或模塑來制備含有本發(fā)明組合物的片劑。可通過在合適的機(jī)器中壓縮自由流動(dòng)形式(例如，粉末或顆粒)的活性成分(任選地與粘合劑、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑、表面活性劑或分散劑混合)來制備壓制片劑。可通過在合適的機(jī)器中將以惰性液體稀釋劑潤(rùn)濕的粉末狀化合物的混合物模塑來制造模塑片劑。每個(gè)片劑優(yōu)選地含有約0.05mg至約10g活性成分，且每個(gè)扁囊劑(cachet)或膠囊優(yōu)選地含有約0.05mg至約10g活性成分；片劑還可適當(dāng)?shù)睾屑s2.5mg活性成分/片或約7.5mg/片。
對(duì)于腸胃外施用基本上純的PDX-10a或PDX-10b，可施用溶液以及包含活性劑或其相應(yīng)的水溶性鹽的無菌水溶液。優(yōu)選地，將這樣的無菌水溶液進(jìn)行合適地緩沖，并且還優(yōu)選使其等張(例如，用充足的鹽水或葡萄糖)。這些特定的水溶液尤其適于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)注射的目的。油性溶液適用于關(guān)節(jié)內(nèi)、肌內(nèi)和皮下注射的目的。在無菌條件下制備所有這些溶液可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)技術(shù)很容易地實(shí)現(xiàn)。
對(duì)于獸醫(yī)目的，可使用任何形式和通過上述任何途徑向動(dòng)物分開或一起施用所述活性劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，以膠囊、推注劑(bolus)、片劑、液體獸用頓服藥(drench)的形式，通過注射或作為植入劑施用基本上純的PDX-10a或PDX-10b。作為替代，可與動(dòng)物飼料一起施用所述基本上純的PDX-10a或PDX-10b，并且為此目的，可制備濃縮飼料添加劑或預(yù)混合料用于通常的動(dòng)物飼料。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的獸醫(yī)操作，以常規(guī)方式制備這些制劑。
本發(fā)明還提供包含單個(gè)容器的試劑盒，所述容器包含基本上純的PDX-10a或PDX-10b。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒容器還可包含可藥用載體。所述試劑盒還可包含無菌稀釋劑，其優(yōu)選存放于分開的額外容器中。所述試劑盒還包含插頁(yè)(package insert)，其包含指導(dǎo)使用組合治療作為用于治療癌癥和/或炎性疾病的方法的印制說明書。
優(yōu)選地，所述組合物包含可藥用載體和治療有效量的基本上純的PDX-10a或PDX-10b(包括每種組分的可藥用鹽、酯、溶劑化物和多晶型)。此外，在這個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括用于治療疾病的藥物組合物，使用所述組合物導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞、良性或惡性腫瘤或轉(zhuǎn)移的生長(zhǎng)抑制或者治療炎癥，所述組合物包含可藥用載體和無毒的治療有效量的基本上純的PDX-10a或PDX-10b(包括其可藥用鹽)。
術(shù)語(yǔ)“可藥用鹽”是指由可藥用無毒堿或酸制備的鹽。當(dāng)本發(fā)明的化合物是酸性的時(shí)，可方便地由可藥用無毒堿制備其相應(yīng)的鹽，所述堿包括無機(jī)堿和有機(jī)堿。源自這些無機(jī)堿的鹽包括鋁、銨、鈣、銅(銅和亞銅)、鐵、亞鐵、鋰、鎂、錳(錳和亞錳)、鉀、鈉、鋅等的鹽。特別優(yōu)選的是銨、鈣、鎂、鉀和鈉的鹽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述鹽是鹽酸鹽。源自可藥用有機(jī)無毒堿的鹽還包括伯胺、仲胺和叔胺、以及環(huán)胺和取代胺(例如，天然和合成的取代胺)的鹽?？捎脕硇纬甥}的其他可藥用有機(jī)無毒堿包括離子交換樹脂，例如精氨酸、甜菜堿、咖啡因、膽堿、Ν',Ν'-二芐基乙二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基嗎啉、N-乙基哌啶、還原葡糖胺(glucamine)、葡糖胺(glucosamine)、組胺、海巴明(hydrabamine)、異丙胺、賴氨酸、甲葡胺(methylglucamine)、嗎啉、哌嗪、哌啶、多胺的樹脂、普魯卡因、嘌呤、可可堿、三乙胺(triethylameine)、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇等。
除了上文中列出的常見劑型之外，還可通過控釋裝置和/或遞送設(shè)備施用基本上純的PDX-10a或PDX-10b(包括每種組分的可藥用鹽、酯、溶劑化物和多晶型)。
本發(fā)明的藥物組合物可以是其中所述載體為固體的適于直腸施用的形式。混合物優(yōu)選形成單位劑量栓劑。合適的載體包括可可豆脂和本領(lǐng)域中常用的其他材料?？赏ㄟ^首先將所述組合物與軟化或熔化的載體混合然后在模具中冷卻和成形而方便地形成所述栓劑。
除了前述載體成分之外，上文中描述的藥物組合物可酌情包括一種或更多種額外的載體成分，例如稀釋劑、緩沖劑、矯味劑、粘合劑、表面活性劑、增稠劑、潤(rùn)滑劑、防腐劑(包括抗氧化劑)等。此外，還可包含其他輔料以使制劑與待接受者的血液等張。還可以以粉末或濃縮液的形式制備含有PDX-10a和/或PDX-10b(包括每種組分的可藥用鹽、酯、溶劑化物和多晶型)的組合物。
本發(fā)明組合之化合物的劑量水平將大致地描述于本文中或者描述于這些化合物的領(lǐng)域中。然而，應(yīng)當(dāng)理解，任何具體患者的具體劑量水平將取決于多種因素，包括年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、施用時(shí)間、施用途徑、排泄率、藥物組合以及正在進(jìn)行治療之特定疾病的嚴(yán)重程度。
在一個(gè)方面中，本發(fā)明包括本發(fā)明的藥物組合物，用于治療癌癥的方法。待治療的癌癥可以是多種癌癥中的任一種(如本文中其它部分所定義的那樣)，包括但不限于前列腺癌、T細(xì)胞淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、血液惡性腫瘤、頭頸癌、胃腸道的癌癥、卵巢癌和骨肉瘤。
在一個(gè)方面，本發(fā)明包括本發(fā)明的藥物組合物，其用于治療炎性疾病。待治療的炎性疾病可以是多種炎性疾病中的任一種(如本文中其它部分所定義的那樣)，包括例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明包括根據(jù)本發(fā)明化合物用在制備用于治療癌癥之藥物組合物中的用途。待治療的癌癥可以是多種癌癥中的任一種(如本文中其它部分所定義的那樣)，包括但不限于前列腺癌、T細(xì)胞淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、血液惡性腫瘤、頭頸癌、胃腸道的癌癥、卵巢癌和骨肉瘤。
在另一個(gè)方面中，本發(fā)明包括本發(fā)明化合物在制備用于治療炎性疾病之藥物組合物中的用途。待治療的炎性疾病可以是多種炎性疾病中的任一種(如本文中其它部分所定義的那樣)，包括例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，研究了以下并不旨在限制的實(shí)施例之后，本發(fā)明的其他目標(biāo)、優(yōu)勢(shì)和新穎特征將變得很明顯。此外，上文中所描述的以及以下權(quán)利要求部分中請(qǐng)求保護(hù)的本發(fā)明多個(gè)實(shí)施方案和多個(gè)方面中的每一個(gè)均可在以下實(shí)施例中找到實(shí)驗(yàn)支持。
本公開內(nèi)容的多個(gè)實(shí)施方案還可包括置換權(quán)利要求中所記載的多種要素，如同每個(gè)從屬權(quán)利要求是包括每個(gè)前述從屬權(quán)利要求以及獨(dú)立權(quán)利要求之限定的多項(xiàng)從屬權(quán)利要求。這樣的置換明確地在本公開內(nèi)容的范圍之內(nèi)。
雖然本發(fā)明是通過參照多個(gè)實(shí)施方案而具體地展現(xiàn)和描述的，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可對(duì)本文中所公開的多個(gè)實(shí)施方案進(jìn)行形式和細(xì)節(jié)上的改變而不偏離本發(fā)明的精神和范圍，并且本文中所公開的多個(gè)實(shí)施方案并不旨在充當(dāng)對(duì)權(quán)利要求之范圍的限制。本文中所引用的所有參考文獻(xiàn)通過引用全文并入本文。
實(shí)施例
僅以舉例說明的目的提供以下實(shí)施例，其并不旨在限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1：制備外消旋的PDX
圖1顯示可用于制備本發(fā)明的10-炔丙基-dAM的合成方案。將60％NaH(1.06g,26.5mmol)在18mL篩干燥的THF中的油分散體混合物冷卻至0℃。將冷混合物用升酞酸二甲酯(homoterephthalic acid dimethyl ester)(5.0g,24mmol，圖1中化合物1)的無水THF(7mL)溶液處理，并且在0℃下攪拌混合物1小時(shí)。添加炔丙基溴(26.4mmol)，再將混合物在00℃下攪拌1小時(shí)，隨后在室溫下攪拌16小時(shí)。將所得混合物用2.4mL50％乙酸處理，隨后傾倒進(jìn)240mL水中。用醚(2次，150mL)萃取混合物。將醚提取物合并，用Na2SO4干燥并濃縮成橙黃色油狀物。進(jìn)行硅膠(600mL，230～400目)色譜，用環(huán)己烷-EtOAc(8:1)洗脫，得到作為白色固體的產(chǎn)物α-炔丙基升酞酸二甲酯(化合物2)(4.66)，其通過TLC(環(huán)己烷-EtOAc，3:1)表明似乎是均一的。然而，該產(chǎn)物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示它是所期望產(chǎn)物2與二炔丙基化化合物的混合物。未檢測(cè)到原料1。HPLC顯示單炔丙基化產(chǎn)物與二炔丙基化產(chǎn)物的比例為約3:1。因?yàn)榕c化合物1不同，所述二炔丙基化產(chǎn)物不能在反應(yīng)的下一個(gè)步驟中產(chǎn)生不想要的副產(chǎn)物，所以該物質(zhì)適于被轉(zhuǎn)化成化合物3。優(yōu)選在用于繼續(xù)合成的產(chǎn)物中不存在起始化合物1，以避免在將載入物(lading)轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物期間隨之形成10-dAM。
通過將油分散體中的0.36g 60％NaH(9mmol)與10mL無水DMF組合而形成混合物，并將其冷卻至0～5℃。將所述冷的混合物用10mL無水DMF中的第一反應(yīng)之產(chǎn)物(化合物2)(2.94g,12mmol)的溶液逐滴處理，隨后在0℃下攪拌30分鐘。冷卻至-25℃之后，逐滴添加2,4,二氨基-6-(溴甲基)-蝶啶氫溴酸-0.2 2-丙醇(1.00g,2.9mmol)在10mL無水DMF中的溶液，同時(shí)維持溫度接近-25℃。使攪拌的混合物的溫度經(jīng)2小時(shí)升高至-10℃。在-10℃下再保持2小時(shí)后，使溫度升高至20℃，在室溫下再繼續(xù)攪拌2小時(shí)。隨后通過添加固體CO2將反應(yīng)物調(diào)節(jié)至pH 7。在真空中濃縮除去溶劑之后，將殘余物與乙醚一起攪拌，收集不溶于醚的物質(zhì)，用水清洗，真空干燥，得到1.49g粗產(chǎn)物。將該粗產(chǎn)物溶于CHCl3-MeOH(10:1)，以用于硅膠柱。通過相同的溶劑系統(tǒng)洗脫，得到10-炔丙基-10-羧甲氧基-4-去氧-4-氨基-10-去氮雜蝶酸甲酯(化合物3)，其對(duì)于TLC是均一的，產(chǎn)率為40％(485mg)。
將化合物3(400mg,0.95mmol)在2-甲氧基乙醇(5mL)中的攪拌混懸液用水(5mL)以及隨后用10％氫氧化鈉溶液(3.9mL)處理。在室溫下攪拌混合物4小時(shí)，期間產(chǎn)生溶液。將所述溶液用乙酸調(diào)節(jié)至pH 8，真空濃縮。將所得殘余物溶于15mL水中，酸化至pH 5.5～5.8，導(dǎo)致形成沉淀。收集沉淀，用水清洗，真空干燥，回收340mg化合物4(91％收率)。HPLC分析表明產(chǎn)物純度為90％。
在115～120℃下，通過在15mL DMSO中加熱而使化合物4(330mg)脫羧10分鐘。10分鐘之后，通過HPLC測(cè)試確證轉(zhuǎn)化基本完成。通過真空蒸餾除去DMSO(40℃水浴)。將殘余物與0.5N NaOH一起攪拌而得澄清溶液，用1N HCl酸化至pH 5.0，以70％的產(chǎn)率得到作為黃色固體的10-炔丙基-4-去氧-4-氨基-10-蝶酸(化合物5)。HPLC顯示此時(shí)產(chǎn)品純度為90％。
使用BOP試劑(含有三乙胺(148mg,1.46mmol)的DMF(10mL)中的(苯并三唑-1-基氧基三(二甲氨基)六氟磷酸鏻(287mg,0.65mmol,Aldrich Chemical Co.))使化合物5(225mg,0.65mmol)與L-谷氨酸二甲酯鹽酸鹽(137mg,0.65mmol)偶聯(lián)。將混合物在20～25℃下攪拌3小時(shí)，隨后蒸干。將殘余物與水一起攪拌，收集水不溶性粗產(chǎn)物并真空干燥。將粗產(chǎn)物(350mg)通過硅膠色譜純化，以含有三乙胺(按體積計(jì)0.25％)的CHCl3-MeOH(10:1)洗脫，以回收165mg 10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶啶二甲酯(化合物6,50％產(chǎn)率)，其對(duì)于TLC(CHCl3-MeOH 5:1)是均一的。
將化合物6(165mg,0.326mmol)懸于10mL攪拌的添加有0.72mL(0.72毫當(dāng)量(meq))1N NaOH的MeOH中。在室溫下繼續(xù)攪拌，直至數(shù)小時(shí)之后產(chǎn)生溶液。將溶液在20-25°下保持8小時(shí)，隨后用10mL水稀釋。減壓下蒸發(fā)除去甲醇，將濃縮水溶液在20～25℃下再放置24小時(shí)。隨后，HPLC顯示酯水解完全。用乙酸將澄清的水溶液酸化至pH 4.0，析出10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶啶的淺黃色固體，將所收集的產(chǎn)物用水清洗，真空干燥，產(chǎn)物重量為122mg(79％產(chǎn)率)。通過元素分析、質(zhì)子NMR和質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定，與指定的結(jié)構(gòu)完全一致。HPLC分析表明純度為98％，確定產(chǎn)物不含10-去氮雜氨基蝶啶。
實(shí)施例2：制備PDX-10a和PDX-10b非對(duì)映體
為了制備本發(fā)明的非對(duì)映體，將225g外消旋化合物6(由實(shí)施例1中所示的方法制備)以3.1g/l溶于流動(dòng)相(100％乙醇)中。采用攪拌和加熱以使原料溶解。使原料溶液通過0.2μ濾器過濾。注射進(jìn)手性柱的體積是每23分鐘204ml，收集大量的中間級(jí)分(mid-cut)以確保高手性純度。在40℃和50毫巴(mbar)下，將所收集的級(jí)分用20L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)。柱為CHIRALPAK AD 20μ,11cm id x 27cm L(可獲自Daicel Chemical Industries Ltd.,Japan)；流速為400ml/分鐘，溫度為30℃，在385nm UV檢測(cè)。通過Chiralpak AD-H 4.6mm ID x 250mm檢測(cè)，使用流動(dòng)相90/5/5乙醇/甲醇/異丙醇；在40℃下以0.8ml/分鐘在260nm檢測(cè)，對(duì)映體純度為97％或更高。隨后通過實(shí)施例1中所討論的方法將經(jīng)拆分的化合物6(拆分成C10處的R非對(duì)映體(峰2)和C10處的S非對(duì)映體(峰1))分別轉(zhuǎn)化成PDX(化合物7)的單個(gè)非對(duì)映體(PDX-10b和PDX-10a)。
實(shí)施例3：腫瘤細(xì)胞系中外消旋體和非對(duì)映體的IC50
評(píng)價(jià)了藥劑PDX、PDX-10a、PDX-10b對(duì)MDA-MB-435、SKBR-3和NCI-H460人腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)抑制活性。在3小時(shí)的連續(xù)處理和72小時(shí)的恢復(fù)性孵育之后，通過MTS測(cè)定測(cè)量生長(zhǎng)抑制。這些研究的目的是測(cè)定化合物在所研究的腫瘤細(xì)胞系中的細(xì)胞毒活性。
材料和方法。如實(shí)施例1～2中所述進(jìn)行PDX-10a和PDX-10b的制備。將PDX化合物以20mM的濃度在二甲基亞砜(DMSO)中稀釋。通過用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)稀釋，從該溶液制備2mM的儲(chǔ)備溶液。將在10％DMSO/90％PBS中的該2mM儲(chǔ)備溶液用于制備細(xì)胞培養(yǎng)基中2x濃度的滴定系列，將其以1:1的比例添加至細(xì)胞培養(yǎng)物中以得到1x濃度。細(xì)胞系-將人腫瘤細(xì)胞系：MDA-MB-435(黑色素瘤)、SKBR-3(乳腺癌)和NCI-H460(肺癌)培養(yǎng)在含有10％經(jīng)透析胎牛血清(FBS；Nova Tech)的RPMI培養(yǎng)基(RPMI；Nova Tech,Grand Island,NY)中。一旦細(xì)胞達(dá)到70％匯合，就將其用胰蛋白酶處理并重懸于替換培養(yǎng)基(含有5％經(jīng)透析FBS(Hyclone,Logan,UT)的RPMI)中。處理前一天(第0天)，以1～7.5×104個(gè)細(xì)胞/ml的濃度重懸培養(yǎng)物，并以1×103～7.5×103個(gè)細(xì)胞/孔的終濃度將100μl的等量份接種到96孔微滴定板的每個(gè)孔中。與藥劑接觸前，將細(xì)胞在37℃下孵育24小時(shí)。
受試藥劑-按上文所述制備的外消旋PDX，以及單個(gè)非對(duì)映體PDX-10a和PDX-10b。鋪板24小時(shí)之后(第1天)，僅用載體(培養(yǎng)基)處理或用3pM至10μM濃度的上述受試藥劑處理細(xì)胞3小時(shí)。
單個(gè)藥劑脈沖研究-接種細(xì)胞之后24小時(shí)(第1天)，開始用受試藥劑或標(biāo)準(zhǔn)藥劑(對(duì)照)處理。在37℃下，用每種受試藥劑或由終濃度為215μΜ依托泊苷(Etoposide)、20μΜ紫杉醇(Taxol)、38.5nM萬(wàn)珂(Velcade)組成的“化學(xué)雞尾酒”(“chemococktail)”(陽(yáng)性對(duì)照)孵育細(xì)胞3小時(shí)。處理之后，除去藥物，添加培養(yǎng)基，在37℃下孵育細(xì)胞72小時(shí)。孵育之后，通過下文所述的MTS測(cè)定對(duì)活細(xì)胞數(shù)進(jìn)行定量。以相同的濃度重復(fù)實(shí)驗(yàn)兩次。用這些研究的結(jié)果來計(jì)算每個(gè)化合物的IC50值(抑制載體的50％細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物濃度)。IC50值用Prizm軟件生成。
MTS測(cè)定-使用MTS測(cè)定對(duì)細(xì)胞活力進(jìn)行測(cè)定。該比色方法測(cè)量活細(xì)胞將MTS試劑(四唑鹽)向甲臜的轉(zhuǎn)化。通過490nm的分光光度測(cè)量對(duì)甲臜的產(chǎn)生進(jìn)行定量，其產(chǎn)生與活細(xì)胞數(shù)成比例。對(duì)于這些研究，按照上文所述培養(yǎng)和處理細(xì)胞。處理結(jié)束時(shí)，向細(xì)胞中添加20μl MTS四唑(1.9mg/ml，于PBS中,pH 6.0)，在37℃下保持1小時(shí)。使用Dynex HD酶標(biāo)儀以490nm的單波長(zhǎng)測(cè)量吸光度(OD)值。
數(shù)據(jù)分析-收集來自每個(gè)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，并表示為OD490對(duì)受試藥劑濃度的log10。使用Prizm分析軟件(GraphPad,San Diego,CA)的統(tǒng)計(jì)分析包進(jìn)行非線性曲線擬合，產(chǎn)生受試品的50％抑制濃度(IC50)。
結(jié)果和討論
結(jié)果和討論。使用上文中所述的MTS細(xì)胞活力測(cè)定，針對(duì)MDA-MB-435、SKBR-3和NCI-H460人腫瘤細(xì)胞系測(cè)試了受試藥劑外消旋PDX以及非對(duì)映體PDX-10a和PDX-10b。SKBR3細(xì)胞以劑量依賴性方式響應(yīng)于外消旋PDX、PDX-10a和PDX-10b，IC50分別等于27.1、11.9和26.1nM。
MDA-MB435細(xì)胞以劑量依賴性方式響應(yīng)于PDX、PDX-10a和PDX-10b受試藥劑，IC50值分別為128.7、100和120.6nM。
NCI-H460細(xì)胞以劑量依賴性方式響應(yīng)于PDX、PDX-10a和PDX-10b受試藥劑，IC50值分別為100、289和45.8nM。在重復(fù)測(cè)定中，PDX、PDX-10a和PDX-10b的IC50值分別為124.3、169.3和46.2nM。使用本文中描述的方法，在分開的實(shí)驗(yàn)中獲得了CWR22-RV1(前列腺)細(xì)胞系的數(shù)據(jù)，其包括在下表中。
IC50＝導(dǎo)致最大細(xì)胞毒性作用之一半的濃度，nM＝納摩/升。
實(shí)施例4.PDX的藥代動(dòng)力學(xué)研究
開發(fā)和驗(yàn)證了生物分析方法用于在人、大鼠和狗的血漿和尿中對(duì)兩種普拉曲沙C10非對(duì)映體(PDX-10a和PDX-10b)進(jìn)行定量?；镜纳锓治龇椒ò◤氖褂肅18固相萃取(solid-phase extraction，SPE)匣的基質(zhì)萃取PDX-10a和PDX-10b，然后使所述非對(duì)映體衍生化(用乙酰氯甲基化)用于分離檢測(cè)。將衍生化的萃取物注射到手性高效液相色譜(HPLC)柱中，用于通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC/MS/MS)定量每種非對(duì)映體。血漿和尿基質(zhì)中兩種非對(duì)映體的定量下限(lower limit of quantitation，LLOQ)為0.5ng/mL。
非對(duì)映體的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)：非臨床和臨床研究表明兩種普拉曲沙C10非對(duì)映體的清除率具有物種依賴性差異(見下表)，其中，大鼠顯示出最小的差異，而狗表現(xiàn)為PDX-10b比PDX-10a兩倍高的清除率。在人中，PDX-10b的清除率比腎清除率(CLren)和非腎清除率(CLnonren)低約50％。PDX-10b的較低清除率和約2倍低的穩(wěn)態(tài)分布容積(Vdss)很可能是在人中觀察到的PDX-10b比PDX-10a血漿暴露高兩倍的原因。然而，這兩種非對(duì)映體的血漿濃度-時(shí)間分布圖平行降低，并且這兩種非對(duì)映體的終末消除半衰期(t1/2term)幾乎相同。所觀察到的物種之間立體選擇性的生物原因還未可知，但可能是由于血漿蛋白結(jié)合的異構(gòu)差異(isomeric difference)。組織分布和/或腎及肝膽轉(zhuǎn)運(yùn)中的異構(gòu)差異也可能起作用。此外，人干細(xì)胞和肝微粒體中的體外研究數(shù)據(jù)顯示，單獨(dú)的非對(duì)映體不發(fā)生顯著代謝，并且不互相轉(zhuǎn)變。
比較重復(fù)給藥時(shí)物種之間外消旋普拉曲沙藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)
a來自密集取樣之患者的非房室PK數(shù)據(jù)(n＝10[C1D1]并且n＝6[C1D6/C2D6])
b外消旋混合物(PDX-10a+PDX-10b)，雄性和雌性(平均值)
對(duì)于雄性和雌性以及對(duì)于PDX-10a和PDX-10b所觀察到的平均值范圍
使用雄性和雌性的平均BW計(jì)算估計(jì)值；大鼠為0.35kg，狗為8.5kg，且人為85kg(來自PDX-008非房室PK群體的平均BW)
C＝周期，D＝劑量，mg＝毫克，kg＝千克，m2＝平方米，Cmax＝最大濃度，ng＝納克，mL＝毫升，AUC∞＝至無窮大時(shí)曲線下面積，min＝分鐘，CLtot＝總清除率，BW＝體重，ND＝未測(cè)定，Vdss＝穩(wěn)態(tài)分布容積，L＝升，t1/2term＝終末半衰期，h＝小時(shí)
分析了在癌癥患者中施用外消旋PDX之后PDX-10a和PDX-10b的群體(POP)藥代動(dòng)力學(xué)(PK)參數(shù)以及協(xié)變量因素(COV)的效應(yīng)。POP PK數(shù)據(jù)匯集自3項(xiàng)研究：1)靜脈內(nèi)(IV)劑量為150～325mg/m2的非小細(xì)胞肺癌患者中的1期研究，2)IV劑量為80-140mg/m2，加用紫杉烷(taxane)的晚期癌癥患者中的1期研究，以及3)劑量為30mg/m2/周IV的患有復(fù)發(fā)性或難治性PTCL之患者中的2期研究。使用具有一級(jí)條件算法(first-order conditional estimation)的非線性混合效應(yīng)模型分析了每種非對(duì)映體的POP PK數(shù)據(jù)。模型評(píng)定(Model qualification)包括非參引導(dǎo)(non-parametric bootstrap)和預(yù)測(cè)檢驗(yàn)(predictive check)。
結(jié)果：POP PK數(shù)據(jù)庫(kù)包含154位患者(94位男性和60位女性，年齡21～85歲，體重42.9～158kg)，貢獻(xiàn)了1176個(gè)PDX-10a和1173個(gè)PDX-10b血漿濃度。PDX-10a和PDX-10b的POP PK數(shù)據(jù)通過參數(shù)化為清除率(CL)，CMT 1、2和3的容積，以及第1和第2CMT間CL的3室(CMT)模型而進(jìn)行了描述，參數(shù)分別估計(jì)為：對(duì)于PDX-10a為35.0L/h、11.0L、9.71L、50.6L、6.97L/h、1.43L/h，而對(duì)于PDX-10b為17.2L/h、8.89L、6.79L、12.65L、5.53L/h和0.601L/h。肌酐清除率每降低1mL/min，PDX-10a和PDX-10b的CL降低了0.13和0.08L/h。PDX-10a和PDX-10b的其他COV研究結(jié)果相似。
實(shí)施例5：在實(shí)體及血液癌細(xì)胞系中的體外細(xì)胞毒性測(cè)定
可根據(jù)實(shí)施例3中描述的方法測(cè)試其他癌細(xì)胞系。用PDX-10a和PDX-10b測(cè)試T細(xì)胞淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、血液惡性腫瘤、頭頸癌、胃腸道的癌癥、卵巢癌和骨肉瘤。每種非對(duì)映體具有不同的活性，PDX-10a在一些細(xì)胞系表現(xiàn)出相對(duì)于外消旋PDX和/或PDX-10b升高的活性，PDX-10b在另一些細(xì)胞系中表現(xiàn)出相對(duì)于PDX和/或PDX-10a升高的活性。
實(shí)施例6：實(shí)體腫瘤和淋巴瘤的體內(nèi)異種移植物模型
如實(shí)施例5中所述，在雌性裸小鼠的右脅皮下接種合適的腫瘤細(xì)胞以建立異種移植。每周兩次監(jiān)測(cè)腫瘤體積和體重。一旦所建立的腫瘤達(dá)到75-150mm3，就將小鼠隨機(jī)分入治療組(對(duì)照、外消旋PDX、PDX-10a或PDX-10b)。通過IP注射施用治療。施用磷酸鹽緩沖鹽水作為對(duì)照載體。各自的非對(duì)映體可具有不同的活性，對(duì)于一些移植體來說，PDX-10a顯示出相對(duì)于外消旋PDX和/或PDX-10b升高的活性，而對(duì)于另一些移植體來說，PDX-10b顯示出相對(duì)于外消旋PDX和/或PDX-10a升高的活性。
實(shí)施例7：哺乳動(dòng)物中外消旋PDX、PDX-10a和PDX-10b的抗關(guān)節(jié)炎作用
本實(shí)施例闡明了本發(fā)明非對(duì)映體化合物在哺乳動(dòng)物中的抗關(guān)節(jié)炎活性。本研究使用炎性疾病的小鼠模型，所述炎性疾病響應(yīng)于用II型膠原的抗原激發(fā)(根據(jù)Nature,283,666-668(1890)中描述的方法)而發(fā)生。用在弗氏完全佐劑中制備的胎牛II型膠原(1mg/ml)的懸液免疫接種DBA/1小鼠。每只小鼠使用0.1ml膠原乳劑(產(chǎn)生總共0.1mg II型膠原)給予首次注射。在第21天，通過腹膜內(nèi)注射給予動(dòng)物強(qiáng)化注射II型膠原(100μg，在0.01M乙酸中)。
外消旋PDX、PDX-10a和PDX-10b的體內(nèi)測(cè)試可表明，使用預(yù)防方案(其中在施用抗原(II型膠原)前2天開始施用藥物)比第19天(第一次且唯一一次用II型膠原強(qiáng)化之前兩天)開始給藥更有效。在第44天，在該模型中，未經(jīng)治療的陽(yáng)性對(duì)照動(dòng)物可具有經(jīng)注射動(dòng)物的90％至100％的關(guān)節(jié)炎發(fā)生率。甲氨蝶呤和受試化合物外消旋PDX、PDX-10a和PDX-10b對(duì)炎癥程度的作用是通過視覺觀察以及通過使用卡尺測(cè)量直接分析爪腫脹來確定的。如通過爪腫脹所測(cè)定的，在患病動(dòng)物數(shù)的降低與炎癥程度的降低之間可能存在直接相關(guān)性。各非對(duì)映體具有不同的活性，對(duì)于關(guān)節(jié)炎的一些組分/方面，PDX-10a顯示出相對(duì)于外消旋PDX和/或PDX-10b的升高的活性，而對(duì)于關(guān)節(jié)炎的另一些組分/方面，PDX-10b則顯示出相對(duì)于外消旋PDX和/或PDX-10a的升高的活性。
甲氨蝶呤的抗炎作用已被認(rèn)可為用于確定其他化合物之抗炎活性的有效對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)。各非對(duì)映體可具有不同的活性，對(duì)于關(guān)節(jié)炎的一些組分/方面，PDX-10a顯示出相對(duì)于外消旋PDX和/或PDX-10b的升高的活性，而對(duì)于關(guān)節(jié)炎的另一些組分/方面，PDX-10b則顯示出相對(duì)于外消旋PDX和/或PDX-10a的升高的活性。
實(shí)施例8：外消旋PDX、PDX-10a和PDX-10b在哺乳動(dòng)物中的抗關(guān)節(jié)炎作用
在本研究的第0～16天，用鹽水載體(qd)、用甲氨蝶呤(MTX，0.075、0.05或0.025mg/kg)或外消旋PDX、PDX-10a和PDX-10b(0.075、0.05或0.025mg/kg)每天一次(qd)口服或靜脈內(nèi)處理發(fā)生II型膠原關(guān)節(jié)炎17天的雌性Lewis大鼠。在研究的第17天處死動(dòng)物。基于踝卡尺測(cè)量進(jìn)行效力評(píng)價(jià)，表示為曲線下面積(AUC)，以及最終后爪重量和對(duì)踝與膝的組織病理學(xué)評(píng)價(jià)。所有動(dòng)物都存活至研究終止時(shí)。
在用某些劑量的MTX、外消旋PDX、PDX-10a和PDX-10b的口服(po)、每日一次(qd)治療的大鼠中可見對(duì)踝直徑的抑制。對(duì)于用某些劑量的MTX、外消旋PDX、PDX-10a和PDX-10b的口服每日一次治療的大鼠而言，對(duì)踝直徑AUC的抑制可以是顯著的。對(duì)于用某些劑量的MTX、外消旋PDX、PDX-10a和PDX-10b的口服每日一次治療的大鼠而言，對(duì)最終爪重量的抑制可以是顯著的。甲氨蝶呤的抗炎作用已被認(rèn)可為用于確定其他化合物之抗炎活性的有效對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)。各非對(duì)映體可具有不同的活性，對(duì)于關(guān)節(jié)炎的一些組分/方面，PDX-10a顯示出相對(duì)于外消旋PDX和/或PDX-10b的升高的活性，而對(duì)于關(guān)節(jié)炎的另一些組分/方面，PDX-10b則顯示出相對(duì)于外消旋PDX和/或PDX-10a的升高的活性。
實(shí)施例9：口服制劑-片劑
每種片劑含有等同于標(biāo)示量的基本上純的PDX-10a或PDX-10b的PDX-10a和/或PDX-10b鈉(活性成分)，并且含有以下非活性成分：無水乳糖、交聯(lián)聚維酮、羥丙基甲基纖維素、硬脂酸鎂、微晶纖維素、聚乙二醇、聚山梨酯80、預(yù)膠化淀粉、一水碳酸鈉、滑石和二氧化鈦。每片活性成分的量為2.5mg、5mg、7.5mg或10mg。
將活性成分與其他成分混合直至形成均一的混合物。將一種或更多種其他成分與水混合形成糊狀物。隨后混合直到獲得均一的顆粒。使顆粒通過使用1/4"不銹鋼篩的合適的研磨機(jī)(milling machine)進(jìn)行篩分。將研磨的顆粒在合適的干燥爐中干燥，并再次通過合適的研磨機(jī)磨碎。將所得混合物壓制成具有期望形狀、厚度、硬度和崩解度的片劑。
為舉例說明和描述的目而給出了本發(fā)明的前述討論。上文所述并不旨在將本發(fā)明限制于本文所公開的形式。盡管本發(fā)明的說明書包括對(duì)一個(gè)或更多個(gè)實(shí)施方案的描述和某些改變和修改，但其它的改變和修改也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，例如，在理解了本公開內(nèi)容后，其可在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)和知識(shí)之內(nèi)。旨在獲得包括所允許范圍的替代實(shí)施方案的權(quán)利，包括與所請(qǐng)求保護(hù)的那些實(shí)施方案的替代的、可互換的和/或等同的結(jié)構(gòu)、功能、范圍或步驟，無論此類替代、可互換的和/或等同的結(jié)構(gòu)、功能、范圍或步驟是否在本文中被公開，并且并不旨在公開任何可授予專利的主題。