本發(fā)明屬于光動(dòng)力藥物及光敏劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種硅酞菁衍生物，并進(jìn)一步公開(kāi)其用于制備生物素受體靶向硅酞菁光敏劑的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

光動(dòng)力治療(Photodynamic Therapy，簡(jiǎn)稱(chēng)PDT)，又稱(chēng)光輻射療法(Photoradiation Therapy，簡(jiǎn)稱(chēng)PRT)或稱(chēng)光化學(xué)療法(Photochemotherapy)，是一種基于特定化學(xué)物質(zhì)的光化學(xué)反應(yīng)原理的治療方法，是近年來(lái)新興的一種腫瘤治療方法。所用的化學(xué)物質(zhì)稱(chēng)為腫瘤化學(xué)診治藥物(也稱(chēng)光敏劑，Photosensitizer，簡(jiǎn)稱(chēng)PS)。PDT療法過(guò)程是通過(guò)靜脈注射將光敏劑注入體內(nèi)(對(duì)于皮膚也可以將其涂于患處)，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后用特定波長(zhǎng)的光照射腫瘤組織，通過(guò)光照激發(fā)富集在腫瘤組織的光敏劑，使其產(chǎn)生活性氧物種(Reactive oxygen species，ROS)，進(jìn)而達(dá)到殺傷腫瘤的目的。相對(duì)于其他的腫瘤治療方法，光動(dòng)力療法具有選擇性好、毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)。因此，光動(dòng)力療法被公認(rèn)為臨床上除化療、放療、手術(shù)之外的第四種癌癥治療方法。自從第一個(gè)光敏藥物于1993～1997在美國(guó)、加拿大、歐盟等國(guó)家相繼上市以來(lái)，伴隨著激光技術(shù)的不斷發(fā)展，光動(dòng)力療法進(jìn)入了快速發(fā)展階段。目前，光動(dòng)力療法已經(jīng)成為腫瘤等疾病防治學(xué)科中最活躍的研究領(lǐng)域。

ROS具有很強(qiáng)的氧化性，其高活性能夠高效地氧化生物分子，如核酸，蛋白和不飽和脂肪酸等。也由于ROS的高活性也導(dǎo)致其壽命非常短暫，使光動(dòng)力效果主要集中在照射區(qū)域。但是，由于目前傳統(tǒng)的光敏劑的腫瘤靶向性差，光敏劑不可避免的會(huì)在健康組織富集，這不僅會(huì)降低光敏劑在腫瘤組織的濃度，影響治療效果，而且富集在正常組織的光敏劑也會(huì)帶來(lái)一些副作用，給病人帶來(lái)痛苦。因此，開(kāi)發(fā)對(duì)腫瘤組織具有特異性靶向能力的光敏劑是目前光動(dòng)力療法亟待解決的問(wèn)題。

酞菁類(lèi)光敏劑由于其在光療窗口(650-850nm)有強(qiáng)烈吸收，且暗毒性低、單重態(tài)氧(¹O₂)量子產(chǎn)率高和易于修飾的特點(diǎn)，使其成為第二代光敏劑中最具潛力的光敏劑。硅酞菁(silicon(IV)phthalocyanine，SiPc)作為酞菁類(lèi)光敏劑的一種，在光動(dòng)力治療的研究中得到了廣泛的關(guān)注。已有報(bào)道表明，通過(guò)引入具有腫瘤靶向能力的基團(tuán)或分子，如多胺、糖類(lèi)、多肽、單克隆抗體和維生素等，可以有助于增強(qiáng)光敏劑的腫瘤靶向性。目前已開(kāi)發(fā)了多種基于硅酞菁結(jié)構(gòu)的新型光敏劑，但均在一定程度上存在著靶向性略差的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種生物素受體靶向硅酞菁光敏劑，以解決現(xiàn)有技術(shù)中光敏劑腫瘤靶向性不強(qiáng)的問(wèn)題。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所述的硅酞菁衍生物，為生物素軸向取代的硅酞菁衍生物，其具有如下所示的結(jié)構(gòu)：

本發(fā)明還公開(kāi)了一種制備所述硅酞菁衍生物的方法，包括如下步驟：

(1)SiPc-pip的合成

惰性氣體保護(hù)下，以SiPcCl₂和4-羥基哌啶為原料、在氫化鈉為催化劑存在下，溶于甲苯溶劑中進(jìn)行回流反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸出溶劑，并水洗殘?jiān)怨枘z柱色譜分離得到深藍(lán)色產(chǎn)物，即為所需SiPc-pip；

(2)SiPc-biotin的合成

以上述得到的SiPc-pip為原料，加入N-羥基琥珀酰亞胺生物素，在有機(jī)胺存在下，溶于DMF溶劑中進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)束后減壓蒸干溶劑，以硅膠柱層析得到深藍(lán)色產(chǎn)物，即為所需SiPc-biotin；

所述步驟(1)中，所述SiPcCl₂和4-羥基哌啶的摩爾比為1-4：10。

所述步驟(1)中，所述硅膠柱色譜分離的具體步驟為：使用200-300目硅膠，用三氯甲烷裝柱；取樣品溶于DMF溶劑中，加入3倍質(zhì)量的硅膠粉吸附樣品，減壓蒸干DMF后，以硅膠粉上柱，以體積比為20：1的三氯甲烷-甲醇溶液為洗脫劑進(jìn)行洗脫。

所述步驟(2)中，所述有機(jī)胺為N，N-二異丙基乙胺或三乙胺。

所述步驟(2)中，所述N-羥基琥珀酰亞胺生物素和SiPc-pip的摩爾比為4-10：1，并優(yōu)選6：1。

所述步驟(2)中，所述硅膠柱層析的具體步驟為：使用200-300目硅膠，用三氯甲烷裝柱；取樣品溶于DMF溶劑中，加入3倍質(zhì)量的硅膠粉吸附樣品，減壓蒸干DMF后，以硅膠粉上柱，以體積比為30：1的三氯甲烷-甲醇溶液為洗脫劑進(jìn)行洗脫。

進(jìn)一步的，所述制備方法還包括制備N(xiāo)-羥基琥珀酰亞胺生物素的步驟，具體包括：在惰性氣體保護(hù)下，以生物素和N-羥基丁二酰亞胺為原料，在N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽存在下，溶于DMF溶劑進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)束后過(guò)濾反應(yīng)液并減壓蒸干，產(chǎn)物用乙醚沉淀即得所需的BNHS；

所述生物素與N-羥基丁二酰亞胺的摩爾比為1：1-3，并優(yōu)選1：1.25。

本發(fā)明還公開(kāi)了一種生物素受體靶向硅酞菁光敏劑，由所述的硅酞菁衍生物制得。

本發(fā)明還公開(kāi)了所述的硅酞菁衍生物用于制備光動(dòng)力藥物、光敏藥物或治療癌癥藥物的用途。

所述癌癥包括宮頸癌。

本發(fā)明還公開(kāi)了一種藥物組合物，包括所述的硅酞菁衍生物，以及藥學(xué)上可接受的輔料和/或載體。

本發(fā)明還公開(kāi)了由所述的藥物組合物按照常規(guī)工藝制備的臨床可接受的制劑。

本發(fā)明所述硅酞菁衍生物，是在現(xiàn)有硅酞菁化合物基礎(chǔ)上，通過(guò)共價(jià)鍵將生物素引入硅酞菁軸向結(jié)構(gòu)中，合成了一種新的硅酞菁類(lèi)衍生物。根據(jù)申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，在眾多的腫瘤靶向分子中，由于生物素可以促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此相對(duì)于正常細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞需要更多的生物素以維持它的快速增殖，進(jìn)而使得生物素受體(biotin receptor，BR)在多種腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)。本申請(qǐng)所述衍生物，則借助于生物素的這一優(yōu)勢(shì)，以生物素為靶向基團(tuán)并作為腫瘤特異性藥物的靶點(diǎn)，所合成的硅酞菁類(lèi)衍生物可以靶向生物素受體高表達(dá)腫瘤細(xì)胞，并具有優(yōu)異的光動(dòng)力活性，是一種新型的生物素受體靶向酞菁類(lèi)光敏劑。同時(shí)，所述SiPc-biotin衍生物對(duì)人正常細(xì)胞的暗毒性要大大低于它的前體SiPc-pip，是一種潛在的靶向光動(dòng)力治療光敏劑。

附圖說(shuō)明

為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例并結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明，其中，

圖1為化合物SiPc-pip和SiPc-biotin在DMF和0.5％CEL中UV-vis吸收光譜，其中圖(a)為SiPc-pip、圖(b)為SiPc-biotin(10μM)；0.5％CEL:0.5％Cremophor EL的PBS溶液(0.5g溶于100mL PBS)；

圖2為化合物SiPc-pip和SiPc-biotin在DMF和0.5％CEL中的熒光光譜，其中圖(a)為SiPc-pip、圖(b)為SiPc-biotin(5μM)；0.5％CEL:0.5％Cremophor EL的PBS溶液(0.5g溶于100mL PBS)；

圖3為0.5％CEL中，光照化合物SiPc-pip和SiPc-biotin產(chǎn)生的單重態(tài)氧對(duì)DPBF吸收光譜的衰減作用；

圖4為Hela細(xì)胞內(nèi)化合物SiPc-pip和SiPc-biotin的量；

圖5為過(guò)量生物素(100μM)對(duì)化合物SiPc-pip和SiPc-biotin與Hela細(xì)胞結(jié)合能力的影響；

圖6為Hela細(xì)胞的熒光成像圖像；其中，圖(a)為SiPc-pip(2μM)培養(yǎng)1h；圖(b)為Hela首先用生物素(100μM)預(yù)處理，接著用SiPc-pip(2μM)培養(yǎng)1h；圖(c)為SiPc-biotin(2μM)培養(yǎng)1h；圖(d)為Hela首先用生物素(100μM)預(yù)處理，接著用SiPc-biotin(2μM)培養(yǎng)1h；

圖7為光照下(λ≈670nm，光強(qiáng)20mW·cm^-2，總劑量24J·cm^-2)，Hela細(xì)胞的存活率；

圖8為黑暗和光照條件(λ≈670nm，光強(qiáng)20mW·cm^-2，總劑量24J·cm^-2)下，化合物SiPc-pip和SiPc-biotin對(duì)Hela的毒性；

圖9為化合物SiPc-pip和SiPc-biotin對(duì)LO2的暗毒性測(cè)試結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例中涉及的試劑、儀器及方法包括：

試劑：二氯硅酞菁(SiPcC_l2)、4-羥基哌啶(4-piperidinol)、生物素(biotin)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)、氫化鈉(NaH)，聚氧乙烯蓖麻油(CEL)分別購(gòu)自Sigma-Aldrich,Alfa Aesar和J&K公司；二甲基甲酰胺(DMF)和甲苯(toluene)用氫化鈉在氮?dú)庀轮卣?；?xì)胞培養(yǎng)試劑均購(gòu)自Bioind(BI)公司；

儀器和方法：

紫外可見(jiàn)光譜和熒光光譜在Perkin-Elmer Lambda-25分光光度計(jì)和Perkin Elmer LS-55熒光儀上測(cè)定；¹H NMR在Bruker DMX 400MHz核磁共振波譜儀上測(cè)定；ESI質(zhì)譜在Waters SQ Detector 2質(zhì)譜儀上測(cè)定；元素分析在VarioEL III CHNS元素分析儀上測(cè)定；

熒光量子產(chǎn)率(Φ_F)在DMF中測(cè)定，鋅酞菁作為參比(DMF中Φ_F＝0.28)⁷；單重態(tài)氧(¹O₂)量子產(chǎn)率在DMF中測(cè)定，DPBF作為¹O₂捕獲劑，鋅酞菁作為參比(DMF中Φ_△＝0.56)⁸。

本發(fā)明下述各實(shí)施例中使用的BNHS，可以為現(xiàn)有市售產(chǎn)品或按照現(xiàn)有技術(shù)中方法合成所得，本發(fā)明下述實(shí)施例中BNHS按照如下方法合成：

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將biotin(0.50g，2.05mmol)和NHS(0.29g，2.56mmol)溶于20mLDMF溶劑中，并加入含有DCC(0.41g，2.05mmol)的DMF溶液(5mL)，室溫反應(yīng)過(guò)夜。過(guò)濾反應(yīng)液，并減壓蒸干，產(chǎn)物用乙醚沉淀得到BNHS，并用乙醚洗滌三遍。也可將DCC替換為1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽進(jìn)行反應(yīng)。

實(shí)施例1

本實(shí)施例所述制備硅酞菁衍生物的方法，包括如下步驟：

(1)SiPc-pip的合成

氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將SiPcCl₂(0.10g，0.16mmol)、4-羥基哌啶(0.16g，1.6mmol)和氫化鈉(0.03g，1.28mmol)溶于甲苯溶劑(50mL)中，回流反應(yīng)24小時(shí)；減壓蒸出溶劑，用水洗滌殘?jiān)还枘z柱色譜分離，具體條件為：使用200-300目硅膠，用三氯甲烷裝柱；取樣品溶于20mL DMF中，加入3倍質(zhì)量的硅膠粉吸附樣品，減壓蒸干DMF溶劑，并以硅膠粉上柱，以三氯甲烷-甲醇(體積比20：1)為洗脫劑，得到0.02g深藍(lán)色產(chǎn)物，計(jì)算產(chǎn)率為21％；

檢測(cè)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)如下：¹H NMR(400MHz,CDCl₃),δ(ppm):9.62～9.64(8H,m,Pc-H_α),8.33～8.35(8H,m,Pc-H_β),0.83～0.85(4H,m,NCH₂),0.64～0.66(4H,m,NCH₂),-1.82(4H,br,CH₂),-2.31～-2.35(4H,m,CH₂),-2.68～-2.71(2H,m,OCH).ESI-MS:m/z 763.36(20％)[M+Na⁺]。Elemental analysis:Found:C,68.2；H,5.1；N,18.7％；Calc.for C₄₂H₃₆N₁₀O₂Si:C,68.1；H,4.9；N,18.9％。可見(jiàn)，產(chǎn)物結(jié)構(gòu)正確。

(2)SiPc-biotin的合成

將上述制備的BNHS(0.084mmol)和SiPc-pip(0.01g，0.014mmol)，以及DIPEA(10μL，0.056mmol)溶于DMF溶劑中，于室溫反應(yīng)過(guò)夜；減壓蒸干溶劑后，硅膠柱層析，具體步驟包括：使用200-300目硅膠，用三氯甲烷裝柱，取樣品溶于20mL DMF溶劑中，加入3倍質(zhì)量的硅膠粉吸附樣品，減壓蒸干DMF溶劑，并以硅膠粉上柱，以三氯甲烷-甲醇溶液為洗脫劑(體積比30：1)，得0.01g深藍(lán)色SiPc-biotin產(chǎn)物，計(jì)算產(chǎn)物產(chǎn)率為79％；

檢測(cè)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)如下：¹H NMR(400MHz,CDCl₃),δ(ppm):9.70(8H,br,Pc-H_α),8.53(8H,br,Pc-H_β),6.23(2H,s,biotin-NH),6.12(2H,s,biotin-NH),4.13(2H,br,biotin-CH),3.84(2H,br,biotin-CH),3.09(4H,br,biotin-SCH₂),2.72(4H,br,biotin-SCH),1.99(4H,br,biotin-COCH₂),0.95～0.74(4H,m,biotin-CH₂CH₂CH₂,CH₂NCH₂),-1.68(4H,br,CH₂),-2.51(6H,br,CHCH₂).ESI-MS:m/z 1215.78(87％)[M+Na⁺]。Elemental analysis:Found:C,62.6；H,5.5；N,16.2；S,5.3％；Calc.for C₆₂H₆₄N₁₄O₆S₂Si:C,62.4；H,5.4；N,16.4；S,5.4％?？梢?jiàn)，產(chǎn)物結(jié)構(gòu)正確。

實(shí)施例2

本實(shí)施例所述制備硅酞菁衍生物的方法與實(shí)施例1相同，其區(qū)別僅在于，所述步驟(2)中，將N，N-二異丙基乙胺催化劑替換為三乙胺作為催化劑。經(jīng)檢測(cè)，所得產(chǎn)物結(jié)構(gòu)正確。

實(shí)驗(yàn)例

1、脂水分配系數(shù)(log P)

取一定量的實(shí)施例1所得化合物溶解在正辛醇-水1:1的混合溶劑中，超聲30分鐘使其在兩相之間平衡。離心后，用吸收光譜測(cè)定化合物在兩相之間的濃度。化合物的親水親脂性可以用它的脂水分配系數(shù)(log P)反應(yīng)，P＝正辛醇中化合物的濃度/水中化合物物的濃度。log P越大，表示化合物越親脂，反之，則更親水。而化合物的親水親脂性與它的生物活性密切相關(guān)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)施例1制得化合物SiPc-biotin(log P＝1.6)的親脂性明顯強(qiáng)于SiPc-pip(log P＝-0.9)。已有研究結(jié)果表明，SiPc的親水親脂性主要取決于軸向取代基的性質(zhì)。在SiPc-pip中，由于其軸向取代基為親水性的哌啶基團(tuán)，使SiPc-pip表現(xiàn)出了明顯的親水性。而在SiPc-biotin化合物中，疏水性的biotin的引入，導(dǎo)致SiPc-biotin的親脂性大大增加。

2、光物理和光化學(xué)性質(zhì)

檢測(cè)化合物SiPc-pip和SiPc-biotin的在DMF中的光譜性質(zhì)如下表1所示。結(jié)果顯示，SiPc-biotin的熒光(Φ_F)和單重態(tài)氧(Φ_Δ)量子產(chǎn)率明顯強(qiáng)于SiPc-pip。這一結(jié)果可以用分子內(nèi)光致電子轉(zhuǎn)移(PET)效應(yīng)來(lái)解釋?zhuān)夯衔颯iPc-pip中的胺基基團(tuán)具有很強(qiáng)的PET效應(yīng)，這會(huì)淬滅SiPc的單重激發(fā)態(tài)，抑制單重激發(fā)態(tài)的系間穿越(ISC)，最終導(dǎo)致較低的熒光和單重態(tài)氧量子產(chǎn)率。而在化合物SiPc-biotin中，胺基基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)轷０锋I，這減弱了氮原子的給電子能力，因此減弱了胺基基團(tuán)的PET效應(yīng)。

表1.SiPc-pip和SiPc-biotin的光化學(xué)光物理性質(zhì)。

^a 610nm激發(fā)。^bZnPc作為參比(DMF中，Φ_F＝0.28).^cZnPc作為參比(DMF

中，Φ_Δ＝0.56)。

由于SiPc的光動(dòng)力療法的應(yīng)用需要在水溶液中進(jìn)行，因此我們比較了化合物SiPc-pip和化合物SiPc-biotin在PBS(pH＝7.4,10mM)溶液中的光化學(xué)和光物理性質(zhì)。

結(jié)果顯示，SiPc-pip和SiPc-biotin均具有單體硅酞菁的特征吸收：位于355nm處的B帶和位于673nm左右的Q帶(如圖1所示)。在610nm波長(zhǎng)光源激發(fā)下，化合物SiPc-pip和SiPc-biotin的熒光發(fā)射分別為683nm和686nm(如圖2所示)。

如圖1中(a)所示，在PBS中，SiPc-pip的Q帶吸收較DMF中紅移了約6nm，這主要是由于溶劑效應(yīng)造成的。更重要的是，SiPc-pip的Q帶吸收譜帶在PBS中依然窄而強(qiáng)烈，這說(shuō)明SiPc-pip在PBS未發(fā)生明顯的聚集。同時(shí)，SiPc-pip在PBS中的強(qiáng)熒光發(fā)射也證明SiPc-pip在PBS中基本是以單體形式存在的(如圖2(a)所示)。另外，SiPc-pip在PBS中的熒光要略強(qiáng)于在DMF的熒光。這主要是由于哌啶的胺基在PBS的質(zhì)子化作用造成的，質(zhì)子化作用減弱了胺基基團(tuán)的PET效應(yīng)。與化合物SiPc-pip不同，化合物SiPc-biotin的Q帶吸收在PBS中發(fā)生了明顯的變化，吸收峰變寬，新出現(xiàn)了兩個(gè)紅移的吸收峰。這表明化合物SiPc-biotin在PBS中有一點(diǎn)程度的聚集，SiPc-biotin在PBS中較弱的熒光也表明SiPc-biotin發(fā)生了聚集(如圖2(b)所示)。

由于聚集會(huì)導(dǎo)致光敏劑產(chǎn)生ROSs的能力下降，并降低光敏劑的PDT活性。因此，為了全面的評(píng)估這兩種光敏劑的PDT活性，進(jìn)一步測(cè)定二者在PBS中產(chǎn)生單重態(tài)氧的效率。結(jié)果如圖3所示，在PBS溶液中，化合物SiPc-pip降解DPBF的速率明顯高于化合物SiPc-biotin，說(shuō)明SiPc-pip具有更高的單重態(tài)氧量子產(chǎn)率。這與在DMF中的結(jié)果相反，這一結(jié)果可以從兩個(gè)方面解釋?zhuān)菏紫龋哙せ鶊F(tuán)在PBS中質(zhì)子化作用可以增強(qiáng)SiPc-pip的單重態(tài)氧效率；其次，SiPc-biotin的聚集導(dǎo)致它的單重態(tài)氧效率降低。

3、細(xì)胞攝取

為了證明生物素的引入可以提高SiPc與生物素受體高表達(dá)腫瘤細(xì)胞的結(jié)合能力，本申請(qǐng)用萃取法進(jìn)行了細(xì)胞吸收實(shí)驗(yàn)，即使用溶劑將細(xì)胞吸收的光敏劑萃取出來(lái)，進(jìn)行定量分析。

3.1細(xì)胞培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)中采用了生物素受體高表達(dá)Hela細(xì)胞，人宮頸癌細(xì)胞Hela和人正常肝細(xì)胞LO2在含有10％胎牛血清的DMEM(dulbecco's modified eagle medium)中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37℃，CO₂濃度為5％。

首先，將SiPcs溶于DMF中配制成濃度為1mM的母液。然后用DMEM培養(yǎng)基(含0.5％CEL)將母液稀釋為80μM次母液。次母液再根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求用DMEM稀釋到相應(yīng)濃度。

Hela細(xì)胞按1×10⁶的濃度種到6cm培養(yǎng)皿中。生長(zhǎng)24h后，棄去原培養(yǎng)基，加入含SiPc(2μM)的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)0.5、1、2和4h。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗2遍，胰酶消化收集。將收集的細(xì)胞凍干，用0.5mL DMF萃取凍干細(xì)胞中的SiPc。測(cè)定萃取液中SiPc的UV-vis吸收值，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)定量。在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞首先與生物素(100μM)共培養(yǎng)2h，然后在加入SiPc進(jìn)一步培養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，在相同的培養(yǎng)條件下，Hela細(xì)胞中SiPc-biotin的量明顯大于SiPc-pip，這說(shuō)明biotin的引入可以提高了SiPc與生物素受體高表達(dá)腫瘤細(xì)胞的結(jié)合能力。

利用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)證明了SiPc-biotin對(duì)生物素受體的靶向能力。在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，Hela細(xì)胞首先與過(guò)量生物素(100μM)共培養(yǎng)來(lái)飽和Hela細(xì)胞表面的生物素受體，接著加入SiPc進(jìn)行進(jìn)步一步培養(yǎng)。圖5所示，加入過(guò)量生物素，大大降低了Hela細(xì)胞中SiPc-biotin的量(>50％)。但是，對(duì)SiPc-pip卻影響甚微(≈5％)。這一結(jié)果說(shuō)明，SiPc-biotin與Hela細(xì)胞的結(jié)合主要是通過(guò)生物素受體介導(dǎo)的，也就是說(shuō)SiPc-biotin可以靶向結(jié)合生物素受體高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞。

3.2細(xì)胞熒光成像

將Hela細(xì)胞與1μM SiPc在37℃下共同培養(yǎng)1h。成像前，細(xì)胞用PBS漂洗三次。細(xì)胞成像在Olympus Xcellence cell活細(xì)胞工作站下獲得，激發(fā)光源為561nm激光。

細(xì)胞的熒光成像結(jié)果更進(jìn)一步證實(shí)了SiPc-biotin的生物素受體的靶向能力。如圖6所示，過(guò)量生物素大大減弱了SiPc-biotin處理細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，對(duì)SiPc-pip處理細(xì)胞的熒光強(qiáng)度幾乎沒(méi)有影響。這一結(jié)果再次證明化合物SiPc-biotin可以靶向富集在生物素受體過(guò)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞內(nèi)。

3.3 Hela細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

MTT實(shí)驗(yàn)被用來(lái)評(píng)價(jià)SiPc-pip和SiPc-biotin的光動(dòng)力活性。首先，測(cè)試了單獨(dú)光照對(duì)細(xì)胞存活率的影響。

取Hela和LO2細(xì)胞以6×10³每空的濃度種在96孔板中，生長(zhǎng)24h后，加入含有不同濃度SiPc(10nm-4μM)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2h后，棄去含SiPc培養(yǎng)基，PBS洗2遍，重新加入培養(yǎng)基。用LED燈(λ≈670nm，光強(qiáng)為20mW·cm^-2，總照射劑量為24J·cm^-2)照射細(xì)胞。培養(yǎng)24h后，加入MTT(噻唑藍(lán))，繼續(xù)培養(yǎng)4h。黑暗對(duì)比實(shí)驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行。棄去培養(yǎng)基，加入DMSO。選擇490nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀(Bio-Rad microplate reader ader)讀數(shù)。

如圖7顯示，本實(shí)驗(yàn)所使用的光照的條件基本不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷。排除了光照這一影響因素后，本申請(qǐng)考察了化合物SiPc-pip和SiPc-biotin光毒性和暗毒性。如圖8所示，化合物SiPc-biotin在測(cè)試濃度(10nm～4μM)下幾乎沒(méi)有暗毒性，化合物SiPc-pip有一定的暗毒性，但暗毒性也不大。在光照條件(λ≈670nm，光強(qiáng)20mW·cm^-2，總劑量24J·cm^-2)下，化合物SiPc-pip和SiPc-biotin均表現(xiàn)出了很強(qiáng)的光毒性。

下表2中給出了SiPc-biotin在光照條件下，對(duì)Hela細(xì)胞的半致死濃度(IC₅₀)?？梢?jiàn)，本發(fā)明所述化合物SiPc-biotin除了與Hela細(xì)胞的結(jié)合能力較強(qiáng)外，同時(shí)具有較好的光毒性，是一種有效的光動(dòng)力光敏劑。

表2.SiPc-pip和SiPc-biotin對(duì)Hela的光毒性。

上表2中，由于SiPc-biotin與Hela細(xì)胞的結(jié)合主要是通過(guò)生物素受體介導(dǎo)的，因此我們認(rèn)為SiPc-biotin對(duì)Hela細(xì)胞的光毒性也應(yīng)該與細(xì)胞表面的生物素受體表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系。為了驗(yàn)證我們這一假設(shè)，參照競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)的方法，首先加入過(guò)量生物素用以飽和細(xì)胞表面的生物素受體，然后進(jìn)行光動(dòng)力活性的檢測(cè)。如上表2所示，過(guò)量生物素的存在顯著降低了SiPc-biotin的光毒性。這一結(jié)果也表明SiPc-biotin的光毒性與細(xì)胞表面的生物素受體表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系，也就是說(shuō)SiPc-biotin可以靶向殺傷生物素受體高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞。

3.4對(duì)正常細(xì)胞的暗毒性

對(duì)正常細(xì)胞的暗毒性大小也是評(píng)價(jià)光動(dòng)力光敏劑的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)，暗毒性小意味著光敏劑對(duì)正常組織的損傷小、較為安全。因此，本申請(qǐng)考察了兩種SiPc化合物對(duì)人正常肝細(xì)胞LO2的暗毒性。結(jié)果如圖9所示，化合物SiPc-pip對(duì)LO2細(xì)胞的暗毒性非常明顯(IC₅₀≈3.3μM)。相對(duì)于SiPc-pip，化合物SiPc-biotin對(duì)LO2的暗毒性就弱的多。實(shí)際上，在光敏劑濃度為4μM時(shí)，SiPc-pip造成了約80％的細(xì)胞死亡，而SiPc-biotin只導(dǎo)致約20％細(xì)胞死亡。

可見(jiàn)，本發(fā)明所述化合物SiPc-biotin作為光敏劑之用，具有更大的優(yōu)勢(shì)。

顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明所作的舉例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無(wú)需也無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之中。