本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種冬蟲夏草菌絲體培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
冬蟲夏草是生長(zhǎng)在青藏高原及其邊緣地帶海拔3000—6000m的高寒草甸地區(qū)的麥角菌科真菌寄生在鱗翅目蝙蝠蛾幼蟲體內(nèi)而生長(zhǎng)的一類真菌類中藥材，屬中國(guó)名貴傳統(tǒng)的滋補(bǔ)強(qiáng)壯藥材。冬蟲夏草這種真菌生長(zhǎng)具有極其苛刻的寄生性和特殊的生態(tài)環(huán)境，天然資源原本就十分稀少，加之近年來生態(tài)環(huán)境的破壞、青藏高原溫度上升，使冬蟲夏草資源銳減，現(xiàn)已處瀕臨滅絕邊緣，根本無(wú)法滿足人們保健和用藥的要求。所以國(guó)內(nèi)外眾多研究機(jī)構(gòu)就冬蟲夏草的人工栽培、冬蟲夏草菌絲體生產(chǎn)、成分、藥理等方面都進(jìn)行了大量的研究開發(fā)工作。本發(fā)明人也是自1993年開始至今仍在開展冬蟲夏草領(lǐng)域的研究開發(fā)工作。下列專利文獻(xiàn)如《人工培養(yǎng)冬蟲夏草菌粉入藥的方法，公開號(hào)CN 1275403A》；《提高冬蟲夏草菌絲體發(fā)酵收率的培養(yǎng)基及其制備方法，公開號(hào)CN 1670181A》；《一種用于生產(chǎn)冬蟲夏草菌絲體的培養(yǎng)基，公開號(hào)CN 101096641A》；《冬蟲夏草菌絲體與子實(shí)體的栽培方法，公開號(hào)CN 101843196A》等都對(duì)人工培養(yǎng)冬蟲夏草菌絲體方法、工藝及其應(yīng)用進(jìn)行了研究。綜上所有專利文獻(xiàn)看，無(wú)論是固體發(fā)酵還是液體發(fā)酵的培養(yǎng)基組合中給蟲草菌絲體生長(zhǎng)提供氮源的成分不外乎是骨蛋白粉、蠶蛹粉、牛奶粉、蛋白胨等。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種冬蟲夏草菌絲體培養(yǎng)方法，采用人工飼養(yǎng)的無(wú)菌家蠅的活體幼蟲——蠅蛆經(jīng)凍干、粉碎技術(shù)制成的蠅蛆凍干粉作為發(fā)酵蟲草菌絲體的氮源，大大提高了冬蟲夏草菌絲體的收率及冬蟲夏草菌絲體的藥用營(yíng)養(yǎng)成分含量。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：
冬蟲夏草菌絲體培養(yǎng)方法，其特征在于：
由以下步驟實(shí)現(xiàn)：
工業(yè)生產(chǎn)前期：
將冬蟲夏草菌種轉(zhuǎn)接到傳統(tǒng)的PDA斜面上，在24-25℃下培養(yǎng)5天；
然后挑取完整的白色致密絮狀菌絲轉(zhuǎn)接到適應(yīng)性斜面培養(yǎng)基進(jìn)行適應(yīng)性育種，在24-25℃下培養(yǎng)5天；
然后再挑取完整的白色致密絮狀菌絲再轉(zhuǎn)接到適應(yīng)性斜面培養(yǎng)基進(jìn)行適應(yīng)性育種；
如此重復(fù)適應(yīng)性育種三次，最后生產(chǎn)出適應(yīng)于發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)用的菌種；
所述適應(yīng)性斜面培養(yǎng)基為：在土豆汁1000ml中，加入葡萄糖15-20g、玉米粉0-2g、蠅蛆凍干粉1-10g、蛋白胨1-10g、硫酸鎂0.5-2g、磷酸二氫鉀0.5-2g、維生素B1 0.1-1.5g、瓊脂粉15-20g，煮沸，補(bǔ)水定容于1000ml；蠅蛆凍干粉用量自1g開始，每代增加1-5g，直至適應(yīng)性斜面培養(yǎng)基中蠅蛆凍干粉用量達(dá)3-10g；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：以質(zhì)量百分比計(jì)，大米45-50%，玉米粉2%，土豆汁15-20%，蠅蛆凍干粉20-35%，硫酸鎂0.01-0.03%、磷酸二氫鉀0.01-0.03%，維生素B1 0.003-0.005%，其余為水；
所述土豆汁是將經(jīng)削皮挖眼切片后的100-200克土豆用1000ml水煮爛，取其濾液，補(bǔ)水定容于1000ml后得到的；
工業(yè)化生產(chǎn)中：
將發(fā)酵培養(yǎng)基裝入玻璃發(fā)酵瓶中，在121℃下滅活40分鐘，放冷，采用無(wú)菌接種技術(shù)將生產(chǎn)菌種接入，置18-25℃下培養(yǎng)30-45天，即得充滿白色致密菌絲體的絮狀物。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
1、本發(fā)明中，發(fā)酵培養(yǎng)基的生物利用率達(dá)95%以上：發(fā)酵培養(yǎng)基幾乎是100%轉(zhuǎn)變成白色致密菌絲體的絮狀物。
2、工藝簡(jiǎn)單易行，整個(gè)生產(chǎn)過程中不需要進(jìn)行菌絲體與培養(yǎng)基的分離，這一點(diǎn)與傳統(tǒng)的菌絲體發(fā)酵工藝大大的不同，使本發(fā)明提供的工藝簡(jiǎn)單易行，質(zhì)量易于掌控。
3、本發(fā)明提供的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的冬蟲夏草菌絲體所含的藥用營(yíng)養(yǎng)成分遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于野生冬蟲夏草。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。
本發(fā)明涉及到一種從冬蟲夏草上分離的菌種——蝙蝠娥擬青霉的新型培養(yǎng)基，采用人工飼養(yǎng)的無(wú)菌家蠅的活體幼蟲——蠅蛆經(jīng)凍干、粉碎技術(shù)制成的蠅蛆凍干粉作為發(fā)酵生產(chǎn)蟲草菌絲體的氮源，即首次使用了人工飼養(yǎng)的家蠅幼蟲作為氮源。本發(fā)明涉及到一種中國(guó)冬蟲夏草菌（拉丁學(xué)名為Cordyceps sinensis）的無(wú)性型——蝙蝠娥擬青霉（拉丁學(xué)名為Paecilomyces hepiali Chen & Dai,）采用固體發(fā)酵工藝生產(chǎn)冬蟲夏草菌絲體的生產(chǎn)方法，具體說是涉及生產(chǎn)過程中一種新型的培養(yǎng)基配方。
蠅蛆的中醫(yī)藥名稱：蛆、五谷蟲、谷蟲、水仙子。蛆出于（集韻）、五谷子出于（滇南本草）、水仙子出于（藥性資料匯編），有資料記載，我國(guó)春秋戰(zhàn)國(guó)時(shí)就有用五谷蟲治病的實(shí)例；而民間用五谷蟲治病一直延續(xù)至今。蠅蛆凍干粉富含活性抗菌蛋白、幾丁質(zhì)、外源性凝集素以及抑制癌細(xì)胞的殼聚糖等成分，這些成分都是人類夢(mèng)寐以求的抗病菌、抗病毒、抗腫瘤的珍貴生物醫(yī)藥資源。這些年來國(guó)內(nèi)外眾多的專家學(xué)者都對(duì)蠅蛆做過多方面的研究，以下不完整的羅列一些關(guān)于蠅蛆方面的研究論文以示其應(yīng)用研究的進(jìn)展。如：《蠅蛆的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及開發(fā)利用，吳莉敏，吉林農(nóng)業(yè)2012年第04期》；《無(wú)菌蠅蛆的營(yíng)養(yǎng)分析，斯琴高娃，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技2008年第2期》；《蠅蛆蛋白粉對(duì)小鼠免疫功能的影響，覃容貴等，貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院 ，中藥材.第30卷第6期2007年6月》；《家蠅幼蟲蛋白提取物的抗病毒、抗氧化及護(hù)肝作用研究，王芙蓉，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文，2007年12月》；《家蠅蛆粉的安全性評(píng)價(jià)，黎運(yùn)西，廣東藥學(xué)院碩士學(xué)位論文2010年5月》；《不同方法干燥的蠅蛆粉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)及其對(duì)小鼠免疫的影響，陳紅雷，中山大學(xué)碩士論文，2010年5月》；《家蠅蛆粉抗高血脂與動(dòng)脈粥樣硬化的研究，褚夫江，廣東藥學(xué)院碩士學(xué)位論文2009年5月》；《蠅蛆干粉營(yíng)養(yǎng)素含量及蠅蛆殼聚糖對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠抗氧化損傷能力影響的研究，陳林軍，醫(yī)學(xué)研究雜志2011年4月 第40卷第4期》；《家蠅抗菌肽的研究與應(yīng)用，羅金香等，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，昆蟲知識(shí)2005 42(3)》；《家蠅幼蟲作為人類潛在食物蛋白質(zhì)資源的探索，張澤生，天律輕工業(yè)學(xué)院食品工程系，食品工業(yè)科技，1997．No．6》。
本發(fā)明使用的蠅蛆凍干粉經(jīng)檢測(cè)蛋白質(zhì)含量為57.13%，氨基酸總量為50.89，氨基酸種類齊全，且富含人體所需的8種必需氨基酸（另法測(cè)定色氨酸為2.86%）以及組氨酸（組氨酸對(duì)成人為非必需氨酸，但對(duì)幼兒卻為必需氨基酸），其必需氨基酸含量占氨基酸總量的42.14%，完全超過了FAO/WHO建議的優(yōu)良蛋白質(zhì)必需氨基酸應(yīng)占氨基酸總量40%的標(biāo)準(zhǔn)。這里還要特別強(qiáng)調(diào)的是蠅蛆凍干粉的氨基酸組成比例最符合人體日常對(duì)氨基酸的需求，從營(yíng)養(yǎng)角度看其不存在限制性氨基酸。蠅蛆蛋白與其它優(yōu)質(zhì)動(dòng)物蛋白相比較毫不遜色，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值甚至要遠(yuǎn)高于其它的動(dòng)物蛋白（參見下表），因此它是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白資源。
漢瑞寶牌蠅蛆凍干粉氨基酸含量及與豬肉（里脊）氨基酸(%)對(duì)照
本發(fā)明提供一種用于固體發(fā)酵生產(chǎn)冬蟲夏草菌絲體的斜面培養(yǎng)方法以保障發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量；同時(shí)也提供一種原材料來源豐富、價(jià)格低廉、生產(chǎn)容易控制、大大提高培養(yǎng)基的生物利用率、從而能培養(yǎng)出高質(zhì)量的可用于多種醫(yī)學(xué)用途的冬蟲夏草（蝙蝠娥擬青霉）菌絲體的培養(yǎng)基。
所述冬蟲夏草菌絲體培養(yǎng)方法，具體由以下步驟實(shí)現(xiàn)：
工業(yè)生產(chǎn)前期：
將冬蟲夏草菌種轉(zhuǎn)接到傳統(tǒng)的PDA斜面上，在24-25℃下培養(yǎng)5天；
然后挑取完整的白色致密絮狀菌絲轉(zhuǎn)接到適應(yīng)性斜面培養(yǎng)基進(jìn)行適應(yīng)性育種，在24-25℃下培養(yǎng)5天；
然后再挑取完整的白色致密絮狀菌絲再轉(zhuǎn)接到適應(yīng)性斜面培養(yǎng)基進(jìn)行適應(yīng)性育種；
如此重復(fù)適應(yīng)性育種三次，最后生產(chǎn)出適應(yīng)于下面敘述的發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)用的菌種；
所述適應(yīng)性斜面培養(yǎng)基為：在土豆汁1000ml中，加入葡萄糖15-20g、玉米粉0-2g、蠅蛆凍干粉1-10g、蛋白胨1-10g、硫酸鎂0.5-2g、磷酸二氫鉀0.5-2g、維生素B1 0.1-1.5g、瓊脂粉15-20g，煮沸，補(bǔ)水定容于1000ml；適應(yīng)性育種斜面培養(yǎng)基中的蠅蛆凍干粉用量可從1g開始，每代增加1-5g，直至斜面培養(yǎng)基中蠅蛆凍干粉用量達(dá)3-10g。
所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：以質(zhì)量百分比計(jì)，大米45-50%，玉米粉2%，土豆汁15-20%，蠅蛆凍干粉20-35%，硫酸鎂0.01-0.03%、磷酸二氫鉀0.01-0.03%，維生素B1 0.003-0.005%，其余為水。
上述的土豆汁是將經(jīng)削皮挖眼切片后的100-200克土豆用1000ml水煮爛，取其濾液，補(bǔ)水定容于1000ml后所得。
上述發(fā)酵培養(yǎng)基，按重量比(%)計(jì)，碳源25-65 %，氮源 10-40%,無(wú)機(jī)鹽 0.01-2%,維生素 0-0.01%，其余為水。優(yōu)選：碳源30-55 %，氮源 20-35%,無(wú)機(jī)鹽 0.01-1%,維生素 0.001-0.005%，其余為水。其中所述碳源可以選自大米、玉米粉、土豆汁中的幾種；氮源選自蠅蛆凍干粉；無(wú)機(jī)鹽選自硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈣中的幾種；維生素選自維生素B1。
工業(yè)化生產(chǎn)中：
將發(fā)酵培養(yǎng)基裝入玻璃發(fā)酵瓶中，在121℃下滅活40分鐘，放冷，采用無(wú)菌接種技術(shù)將生產(chǎn)菌種接入，置18-25℃下培養(yǎng)30-45天，即得充滿白色致密菌絲體的絮狀物。培養(yǎng)基幾乎是100%轉(zhuǎn)變成白色致密菌絲體的絮狀物。
實(shí)施例1：
所述適應(yīng)性斜面培養(yǎng)基為：在土豆汁1000ml中，加入葡萄糖15g、玉米粉2g、蠅蛆凍干粉3g、硫酸鎂0.5g、磷酸二氫鉀2g、維生素B1 0.1g、瓊脂粉20g，煮沸，補(bǔ)水定容于1000ml。
所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：以質(zhì)量百分比計(jì)，大米45%，玉米粉2%，土豆汁20%，蠅蛆凍干粉25%，硫酸鎂0.01%、磷酸二氫鉀0.03%，維生素B1 0.003%，其余為水。
上述的土豆汁是將經(jīng)削皮挖眼切片后的100-200克土豆用1000ml水煮爛，取其濾液，加水定容于1000ml。
實(shí)施例2：
所述適應(yīng)性斜面培養(yǎng)基為：在土豆汁1000ml中，加入葡萄糖15g、玉米粉2g、蠅蛆凍干粉8g、硫酸鎂0.5g、磷酸二氫鉀2g、維生素B1 0.1g、瓊脂粉20g，煮沸，補(bǔ)水定容于1000ml。
所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：以質(zhì)量百分比計(jì)，大米45%，玉米粉1%，土豆汁10%，蠅蛆凍干粉35%，硫酸鎂0.02%、磷酸二氫鉀0.02%，維生素B1 0.003%，其余為水。
上述的土豆汁是將經(jīng)削皮挖眼切片后的100-200克土豆用1000ml水煮爛，取其濾液，補(bǔ)水定容于1000ml。
實(shí)施例3：
所述適應(yīng)性斜面培養(yǎng)基為：在土豆汁1000ml中，加入葡萄糖15g、玉米粉2g、蠅蛆凍干粉5g、硫酸鎂0.5g、磷酸二氫鉀2g、維生素B1 0.1g、瓊脂粉20g，煮沸，補(bǔ)水定容于1000ml。
所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：以質(zhì)量百分比計(jì)，大米45%，玉米粉1%，土豆汁15%，蠅蛆凍干粉30%，硫酸鎂0.02%、磷酸二氫鉀0.03%，維生素B1 0.003%，其余為水。
上述的土豆汁是將經(jīng)削皮挖眼切片后的100-200克土豆用1000ml水煮爛，取其濾液，補(bǔ)水定容于1000ml。
下面是將上述實(shí)施例得到的白色菌絲體取出、經(jīng)切片、攤薄在不銹鋼網(wǎng)上用低于60℃的熱風(fēng)干燥至水分在5%以下，即得冬蟲夏草（蝙蝠娥擬青霉）菌絲體片。然后再根據(jù)應(yīng)用需要可將此菌絲體片進(jìn)行冷凍細(xì)胞破壁成微粉狀。菌絲體微粉的檢測(cè)結(jié)果如下。
發(fā)酵冬蟲夏草（蝙蝠娥擬青霉）菌絲體微粉與野生冬蟲夏草營(yíng)養(yǎng)藥用成分對(duì)照表
本發(fā)明的內(nèi)容不限于實(shí)施例所列舉，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過閱讀本發(fā)明說明書而對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案采取的任何等效的變換，均為本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。