本發(fā)明涉及污水生物處理中污泥胞外聚合物的提取和分析領(lǐng)域，尤其涉及厭氧氨氧化污泥三種不同形態(tài)菌群胞外聚合物的提取和蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)分析，更具體地，涉及一種采用石英砂提取污泥胞外聚合物的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

胞外聚合物(eps)是微生物在一定環(huán)境條件下分泌于胞外的復(fù)雜非均相高分子聚合物，主要組成為蛋白質(zhì)、多糖、核酸和脂質(zhì)，是菌膠團(tuán)、顆粒污泥和生物膜的重要組分，是維持污泥三維網(wǎng)絡(luò)空間的重要骨架。

eps在污水生物處理過(guò)程中發(fā)揮重要作用：可以促進(jìn)細(xì)胞的粘附；維持微生物聚集體的穩(wěn)定性；減小生物毒物和非生物毒物對(duì)細(xì)胞的侵害；從環(huán)境中吸附和積累營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，必要時(shí)為微生物補(bǔ)充碳源和能源；積累、保留和穩(wěn)定細(xì)胞分泌的胞外酶等。

eps的提取是對(duì)其進(jìn)行成分和功能分析的重要前提，標(biāo)準(zhǔn)方法尚未確立。同一方法對(duì)不同樣品eps提取效率不同，不同方法提取同一樣品eps效率也相差很大。不存在一種方法可將樣品eps全部提取，所有方法在一定程度上都會(huì)造成細(xì)胞破裂。而評(píng)價(jià)一個(gè)提取方法是否合適，不僅要考慮eps產(chǎn)量高低，也要考慮提取方法對(duì)細(xì)胞和eps中大分子物質(zhì)的破壞程度以及是否干擾后續(xù)測(cè)定等相關(guān)研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種不破壞微生物活性、無(wú)化學(xué)試劑掩蔽干擾、菌體細(xì)胞無(wú)破損的污泥胞外聚合物的物理提取方法。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于所述提取方法在蛋白質(zhì)組學(xué)sds-page聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)中的應(yīng)用。

本發(fā)明目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種采用石英砂提取污泥胞外聚合物的方法，包括如下步驟：

s1.原位獲取污泥樣品，沖洗干凈，吸干水分，均一化處理；

s2.處理后的污泥加入石英砂和鹽溶液混合，在溫度0~4℃、轉(zhuǎn)速600~900rpm條件下，攪拌1~3h，得到泥砂混合液；

s3.對(duì)泥砂混合液離心取上清，過(guò)濾除去雜質(zhì)獲得胞外聚合物粗品；

s4.將胞外聚合物粗品超濾濃縮獲得胞外聚合物樣品；

其中，步驟s2所述污泥測(cè)量其vss，石英砂和vss重量比為70~140:1，石英砂尺寸為32目~150目。

本發(fā)明利用石英砂低溫中速摩擦剪切作用實(shí)現(xiàn)胞外聚合物與菌體的高效分離，通過(guò)控制溫度、轉(zhuǎn)速和時(shí)間使這種物理作用緩和不強(qiáng)烈。石英砂與污泥的重量配比以及石英砂尺寸對(duì)所述摩擦剪切作用具有影響：石英砂重量過(guò)小，不能與全部的污泥進(jìn)行作用，過(guò)大則攪拌不均勻使得作用不充分，導(dǎo)致胞外聚合物與菌體不能有效分離；石英砂尺寸過(guò)小，顆粒過(guò)細(xì)很難對(duì)污泥產(chǎn)生剪切作用，過(guò)大則不能充分與污泥接觸作用，導(dǎo)致胞外聚合物與菌體不能有效分離。本發(fā)明合理地選用石英砂的重量和尺寸，達(dá)到有效的摩擦剪切作用，提取的胞外聚合物的胞外生物大分子活性高、菌體細(xì)胞基本無(wú)破裂。而現(xiàn)有的甲醛-naoh法、加熱法等提取方法，提取的胞外聚合物易造成細(xì)胞破裂、胞外生物大分子活性降低。

步驟s1所述污泥樣品為含絮體形態(tài)厭氧氨氧化菌群、含顆粒形態(tài)厭氧氨氧化菌群、含生物膜形態(tài)厭氧氨氧化菌群中的一種。

步驟s1所述沖洗可采用本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)常用溶液，如去離子水、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%nacl溶液等。

優(yōu)選地，步驟s2所述鹽溶液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%nacl溶液，以維持細(xì)胞的滲透壓。

步驟s3所述離心，離心溫度為0~4℃，離心力為10000~17000g，離心時(shí)間為20~30min；所述過(guò)濾采用0.22~0.45um聚醚砜滅菌過(guò)濾器。

步驟s4所述超濾濃縮操作為采用超濾離心管在0~4℃，3000~5000g離心力下作用45~60min，濃縮至蛋白質(zhì)濃度為1ug/ul以上。

所述超濾離心管型號(hào)為15ml10kd超濾離心管。

所述采用石英砂提取污泥胞外聚合物的方法得到的污泥胞外聚合物。

所述采用石英砂提取污泥胞外聚合物的方法在蛋白質(zhì)組學(xué)聚丙烯酰胺凝膠電泳的檢測(cè)步驟中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明公布的采用石英砂提取污泥胞外聚合物的物理方法，通過(guò)均一化、石英砂分離、離心過(guò)濾、濃縮等操作步驟，基本實(shí)現(xiàn)了對(duì)三種不同形態(tài)生物污泥eps的提取。通過(guò)石英砂低溫中速摩擦剪切作用實(shí)現(xiàn)胞外聚合物與菌體的高效分離，相比甲醛-naoh法、加熱法等提取方法，無(wú)其它試劑干擾掩蔽，胞外生物大分子活性高，細(xì)胞基本無(wú)破裂，為后續(xù)蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定等相關(guān)實(shí)驗(yàn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1提取污泥胞外聚合物的操作示意圖。

圖2為實(shí)施例1胞外聚合物的提取效果圖。

圖3為實(shí)施例1、對(duì)比例1、對(duì)比例2提取的胞外聚合物進(jìn)行sds-page聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步解釋說(shuō)明，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明范圍的限制，但凡采用等同替換或等效變換的形式所獲得的技術(shù)方案，均應(yīng)包括在本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。

以下實(shí)施例和對(duì)比例中，所用原料均為市售商品。

測(cè)試與表征方法

vss的測(cè)定，按照《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》；

對(duì)絮體、生物膜、顆粒態(tài)厭氧氨氧化污泥提取的胞外聚合物分別測(cè)定蛋白質(zhì)、多糖、dna的含量，測(cè)試方法為建立folin酚法蛋白質(zhì)標(biāo)線測(cè)定蛋白質(zhì)含量、建立苯酚-濃硫酸法標(biāo)線測(cè)定多糖的含量、建立二苯胺法標(biāo)線測(cè)定dna的含量；

建立sds-page聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)提取的絮體與顆粒態(tài)厭氧氨氧化菌胞外聚合物的電泳結(jié)果。

實(shí)施例1

一種采用石英砂提取污泥胞外聚合物的方法，操作如圖1所示。具體步驟如下：

s1.取絮體、生物膜、顆粒三種不同形態(tài)的厭氧氨氧化原位污泥；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%nacl溶液清洗污泥2~3次，然后用分析濾紙吸干污泥表面水分，再用玻璃棒輕輕碾壓均一化處理污泥樣品。上述均一化處理的三種不同形態(tài)的厭氧氨氧化原位污泥的vss分別為0.0517g、0.0502g、0.0558g。

s2.各取2g上述均一化處理的三種不同形態(tài)的厭氧氨氧化原位污泥、7g尺寸為32目的石英砂、30ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%nacl溶液于50ml燒杯中，燒杯型號(hào)的上下外徑分別為5.2cm和4.3cm，高5.9cm。每種形態(tài)的污泥設(shè)置3個(gè)重復(fù)。然后在4℃條件下，用3cm的c型攪拌子，600rpm攪拌3h，得到泥砂混合液。

s3.將上述泥砂混合液轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，4℃、10000g離心力下高速離心，20min后取上清，并用0.22um聚醚砜（pes）針頭過(guò)濾器過(guò)濾，獲得胞外聚合物粗品。檢測(cè)提取的胞外聚合物粗品蛋白質(zhì)、多糖、dna的含量，測(cè)試結(jié)果如圖2所示，絮體厭氧氨氧化原位污泥提取的胞外聚合物中蛋白質(zhì)、多糖、dna含量分別為：38.1652mg/g、6.0537mg/g、1.9645mg/g；生物膜厭氧氨氧化原位污泥提取的胞外聚合物中蛋白質(zhì)、多糖、dna含量分別為：16.3015mg/g、9.6261mg/g、4.0774mg/g；顆粒態(tài)厭氧氨氧化原位污泥提取的胞外聚合物中蛋白質(zhì)、多糖、dna含量分別為：29.9695mg/g、7.5523mg/g、1.6521mg/g。提取的這三種不同形態(tài)原位污泥的蛋白質(zhì)平均含量高達(dá)73.2%。特別地，提取的絮體與顆粒態(tài)原位污泥dna含量均在4.2%左右，說(shuō)明細(xì)胞并未出現(xiàn)嚴(yán)重破裂，胞外聚合物的提取效果良好，而生物膜中雖蛋白質(zhì)相對(duì)含量較低，但dna絕對(duì)含量并未出現(xiàn)嚴(yán)重超標(biāo)，可基本認(rèn)定滿足實(shí)驗(yàn)預(yù)期要求。

s4.最后將胞外聚合物粗品濾液裝入超濾離心管，在4℃、4000g離心力作用下，濃縮45min使最終蛋白質(zhì)濃度為1ug/ul以上。

實(shí)施例2

s1.取實(shí)施例1中的三種不同形態(tài)的厭氧氨氧化原位污泥；用去離子水清洗污泥4次，然后用分析濾紙吸干污泥表面水分，再用玻璃棒輕輕碾壓均一化處理污泥樣品。

s2.準(zhǔn)確稱取各形態(tài)2g上述均一化處理的污泥、4.0g尺寸為150目的石英砂、30ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%nacl溶液于50ml燒杯中，燒杯型號(hào)的上下外徑分別為5.2cm和4.3cm，高5.9cm。每組3個(gè)重復(fù)。然后在0℃條件下，用3cm的c型攪拌子，900rpm攪拌1h，得到泥砂混合液。

s3.將上述泥砂混合液轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，0℃、17000g離心力下高速離心，30min后取上清，并用0.45um聚醚砜（pes）針頭過(guò)濾器過(guò)濾。

s4.將濾液裝入超濾離心管，在0℃、3000g離心力作用下，濃縮50min使最終蛋白質(zhì)濃度為1ug/ul以上。

實(shí)施例3

s1.取實(shí)施例1中的三種不同形態(tài)的厭氧氨氧化原位污泥；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%nacl溶液清洗污泥4次，然后用分析濾紙吸干污泥表面水分，再用玻璃棒輕輕碾壓均一化處理污泥樣品。

s2.準(zhǔn)確稱取各形態(tài)2g上述均一化處理的污泥、5g尺寸為80目的石英砂、30ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%nacl溶液于50ml燒杯中，燒杯型號(hào)的上下外徑分別為5.2cm和4.3cm，高5.9cm。每組3個(gè)重復(fù)。然后在2℃條件下，用3cm的c型攪拌子，700rpm攪拌2h，得到泥砂混合液。

s3.將上述泥砂混合液轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，0℃、17000g離心力下高速離心，30min后取上清，并用0.45um聚醚砜（pes）針頭過(guò)濾器過(guò)濾。

s4.將濾液裝入超濾離心管，在0℃、3000g離心力作用下，濃縮60min使最終蛋白質(zhì)濃度為1ug/ul以上。

實(shí)施例4

s1.取實(shí)施例1中的三種不同形態(tài)的厭氧氨氧化原位污泥；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%nacl溶液清洗污泥4次，然后用分析濾紙吸干污泥表面水分，再用玻璃棒輕輕碾壓均一化處理污泥樣品。

s2.準(zhǔn)確稱取各形態(tài)2g上述均一化處理的污泥、6g尺寸為60目的石英砂、30ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%nacl溶液于50ml燒杯中，燒杯型號(hào)的上下外徑分別為5.2cm和4.3cm，高5.9cm。每組3個(gè)重復(fù)。然后在1℃條件下，用3cm的c型攪拌子，800rpm攪拌2h，得到泥砂混合液。

s3.將上述泥砂混合液轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，0℃、17000g離心力下高速離心，30min后取上清，并用0.35um聚醚砜（pes）針頭過(guò)濾器過(guò)濾。

s4.將濾液裝入超濾離心管，在0℃、3000g離心力作用下，濃縮55min使最終蛋白質(zhì)濃度為1ug/ul以上。

實(shí)施例5

s1.取實(shí)施例1中的三種不同形態(tài)的厭氧氨氧化原位污泥；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%nacl溶液清洗污泥4次，然后用分析濾紙吸干污泥表面水分，再用玻璃棒輕輕碾壓均一化處理污泥樣品。

s2.準(zhǔn)確稱取各形態(tài)2g上述均一化處理的污泥、4g尺寸為120目的石英砂、30ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%nacl溶液于50ml燒杯中，燒杯型號(hào)的上下外徑分別為5.2cm和4.3cm，高5.9cm。每組3個(gè)重復(fù)。然后在2℃條件下，用3cm的c型攪拌子，800rpm攪拌1h，得到泥砂混合液。

s3.將上述泥砂混合液轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，0℃、17000g離心力下高速離心，30min后取上清，并用0.30um聚醚砜（pes）針頭過(guò)濾器過(guò)濾。

s4.將濾液裝入超濾離心管，在0℃、3000g離心力作用下，濃縮60min使最終蛋白質(zhì)濃度為1ug/ul以上。

實(shí)施例6

s1.取實(shí)施例1中的三種不同形態(tài)的厭氧氨氧化原位污泥；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%nacl溶液清洗污泥4次，然后用分析濾紙吸干污泥表面水分，再用玻璃棒輕輕碾壓均一化處理污泥樣品。

s2.準(zhǔn)確稱取各形態(tài)2g上述均一化處理的污泥、6g尺寸為50目的石英砂、30ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%nacl溶液于50ml燒杯中，燒杯型號(hào)的上下外徑分別為5.2cm和4.3cm，高5.9cm。每組3個(gè)重復(fù)。然后在0℃條件下，用3cm的c型攪拌子，900rpm攪拌1h，得到泥砂混合液。

s3.將上述泥砂混合液轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，0℃、17000g離心力下高速離心，30min后取上清，并用0.45um聚醚砜（pes）針頭過(guò)濾器過(guò)濾。

s4.將濾液裝入超濾離心管，在0℃、3000g離心力作用下，濃縮60min使最終蛋白質(zhì)濃度為1ug/ul以上。

對(duì)比例1

s1.取實(shí)施例1中的三種不同形態(tài)的厭氧氨氧化原位污泥；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%nacl溶液清洗污泥2~3次，然后用分析濾紙吸干污泥表面水分，再用玻璃棒輕輕碾壓均一化處理污泥樣品。

s2.準(zhǔn)確稱取各形態(tài)2g上述均一化處理的污泥、9g尺寸為32目的石英砂、30ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%nacl溶液于50ml燒杯中，燒杯型號(hào)的上下外徑分別為5.2cm和4.3cm，高5.9cm。每組3個(gè)重復(fù)。然后在4℃條件下，用3cm的c型攪拌子，600rpm攪拌3h，得到泥砂混合液。

s3.將上述泥砂混合液轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，4℃、10000g離心力下高速離心，20min后取上清，并用0.22um聚醚砜（pes）針頭過(guò)濾器過(guò)濾。檢測(cè)蛋白質(zhì)，多糖，dna的含量，提取的三種形態(tài)污泥胞外聚合物的蛋白質(zhì)，多糖，dna最低含量分別為42.37mg/g，23.13mg/g，7.33mg/g。表明dna含量過(guò)高，細(xì)胞破裂較為嚴(yán)重。

對(duì)比例2

s1.取實(shí)施例1中的三種不同形態(tài)的厭氧氨氧化原位污泥；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%nacl溶液清洗污泥2~3次，然后用分析濾紙吸干污泥表面水分，再用玻璃棒輕輕碾壓均一化處理污泥樣品。

s2.準(zhǔn)確稱取各形態(tài)2g上述均一化處理的污泥、7g尺寸為180目的石英砂、30ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%nacl溶液于50ml燒杯中，燒杯型號(hào)的上下外徑分別為5.2cm和4.3cm，高5.9cm。每組3個(gè)重復(fù)。然后在4℃條件下，用3cm的c型攪拌子，600rpm攪拌3h，得到泥砂混合液。

s3.將上述泥砂混合液轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，4℃、10000g離心力下高速離心，20min后取上清，并用0.22um聚醚砜（pes）針頭過(guò)濾器過(guò)濾。檢測(cè)蛋白質(zhì)，多糖，dna的含量，提取的三種形態(tài)污泥胞外聚合物的蛋白質(zhì)，多糖，dna的最高含量分別為20.69mg/g，6.89mg/g，2.96mg/g。提取的物質(zhì)含量過(guò)低，提取效果不好，不利于后續(xù)的研究與應(yīng)用。

對(duì)比例3

準(zhǔn)確稱取實(shí)施例1中的2g絮體與顆粒態(tài)厭氧氨氧化污泥，加入20ml含0.6%甲醛（v/v）和0.9%nacl（w/v）溶液，4℃下固定1h。然后加入8ml1mol/lnaoh溶液，4℃解離3h。再將解離后的厭氧氨氧化菌混合液轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，4℃、10000g離心力下高速離心，20min后取上清。并用0.22um聚醚砜（pes）針頭過(guò)濾器過(guò)濾。將濾液裝入超濾離心管，在4℃、4000g離心力作用下，濃縮45min使最終蛋白質(zhì)濃度為約5ug/ul。進(jìn)行sds-page凝膠電泳檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

對(duì)比例4

準(zhǔn)確稱取實(shí)施例1中的2g絮體與顆粒態(tài)厭氧氨氧化污泥，轉(zhuǎn)移至錐形瓶中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%nacl溶液30ml，60℃水浴30min。之后轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，4℃、10000g高速離心，20min后取上清。并用0.22um聚醚砜（pes）針頭過(guò)濾器過(guò)濾。將濾液裝入超濾離心管，在4℃、4000g離心力作用下，濃縮45min使最終蛋白質(zhì)濃度為約2ug/ul。

sds-page聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，可看出僅實(shí)施例1提取的eps中蛋白質(zhì)顯現(xiàn)清晰條帶，說(shuō)明蛋白質(zhì)的生物活性高，結(jié)構(gòu)組成未被破壞，而對(duì)比例3的甲醛-naoh法、對(duì)比例4的加熱法提取的eps在不同程度上造成了蛋白質(zhì)的生物活性降低，未顯現(xiàn)條帶。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。