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一種細(xì)胞毒性低、轉(zhuǎn)染效率高的非病毒基因轉(zhuǎn)染載體材料及其制備方法與應(yīng)用與流程

文檔序號:12692643閱讀:327來源:國知局
一種細(xì)胞毒性低、轉(zhuǎn)染效率高的非病毒基因轉(zhuǎn)染載體材料及其制備方法與應(yīng)用與流程

本發(fā)明屬于生物醫(yī)用高分子材料領(lǐng)域,特別涉及一種細(xì)胞毒性低、轉(zhuǎn)染效率高的非病毒基因轉(zhuǎn)染載體材料及其制備方法與應(yīng)用。



背景技術(shù):

近二十年來,基因療法是被認(rèn)為是一種治療腫瘤和多種免疫疾病的有效方法。它是將正?;蚧蚓哂行迯?fù)作用的質(zhì)粒(pDNA)通過一定的方式導(dǎo)入靶細(xì)胞來糾正基因缺陷,從而達(dá)到治療目的;或者是通過特定方式將具有沉默功能的小干擾RNA(siRNA)導(dǎo)入靶細(xì)胞來沉默致病基因的表達(dá),從而達(dá)到治療的目的。要達(dá)到這樣的目標(biāo),必需將外源基因負(fù)載到合適載體上,然后將基因遞送至靶細(xì)胞,載體起到保護(hù)基因的目的,否則其將被核酸酶降解,以至于導(dǎo)致基因治療失敗。因此,對能夠負(fù)載并保護(hù)基因的載體材料的選擇,就變得非常關(guān)鍵。病毒具有攜帶基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的天然生物功能,因此可以高效率的將外源基因?qū)氲桨屑?xì)胞,效率非常高。常用的病毒載體主要有腺病毒,逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒等,雖然轉(zhuǎn)染效率高,但病毒載體的致命缺陷是能夠引發(fā)免疫響應(yīng)而導(dǎo)致患者死亡(N.S.Templeton,Bioscience Reports,2002,22,283-295)。此外,病毒也具有不能夠大批量制備、成本高、運(yùn)載基因容量有限等缺點(diǎn)(D.Ibraheem,A.Elaissari,H.Fessi,International Journal of Pharmaceutics,2014,459:70–83)。針對此缺點(diǎn),研究者根據(jù)基因自身帶負(fù)電的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),使帶陽離子的化合物與基因通過靜電吸引作用來形成納米尺度的復(fù)合物膠束,從而保護(hù)基因,安全性比病毒載體大大增加。非病毒載體主要有陽離子脂質(zhì)體、陽離子聚合物以及陽離子無機(jī)化合物等。陽離子脂質(zhì)體的應(yīng)用最為廣泛,但陽離子脂質(zhì)體為小分子物質(zhì),帶正電荷較少,與基因結(jié)合能力不夠強(qiáng),轉(zhuǎn)染效率也不高。更為關(guān)鍵的是,脂質(zhì)體每個分子帶正電荷數(shù)少,因此完全中和基因的負(fù)電荷時的投料量就很大,這大大增加了脂質(zhì)體類載體的細(xì)胞毒性。事實上,載體的安全性一直是困擾基因療法的瓶頸,例如,1999年,一例患肝病的18歲病人Jesse Gelsinger在使用基因療法的過程中死亡,這次事件導(dǎo)致全球基因療法的臨床試驗基本停止(N.S.Templeton,Bioscience Reports,2002,22,283-295),這是基因療法發(fā)展歷史上的重大挫折。病人死亡的原因是腺病毒載體(AV)使病人的免疫系統(tǒng)過度反應(yīng),引發(fā)患者多器官衰竭和腦死亡。盡管基因治療一直在曲折中前進(jìn),今年的麻省理工學(xué)院技術(shù)評論仍將基因治療技術(shù)評為“2017年十大技術(shù)突破”之一(E.Mulin,MIT technology review,2017,March/April),這直接得益于2012年以來更為安全的腺相關(guān)病毒載體(AAV)的使用。盡管如此,病毒載體由于自身本性的限制,安全性仍是無法避免的問題。由此看來,開發(fā)更為安全、低細(xì)胞毒性以及高轉(zhuǎn)染效率的新型非病毒類聚合物載體,無疑仍舊是解決基因療法瓶頸的關(guān)鍵。



技術(shù)實現(xiàn)要素:

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)非病毒載體的細(xì)胞毒性的缺點(diǎn)與不足并保證轉(zhuǎn)染的高效性,本發(fā)明的首要目的在于提供一種基于陽離子多肽類的細(xì)胞毒性低、轉(zhuǎn)染效率高的非病毒基因轉(zhuǎn)染載體材料。

本發(fā)明的載體材料為側(cè)鏈含有伯胺離子的多肽類載體,可有效地和siRNA結(jié)合形成納米復(fù)合物膠束,可向靶細(xì)胞中傳遞siRNA,細(xì)胞毒性低,甚至無細(xì)胞毒性;轉(zhuǎn)染效率好,可與經(jīng)典的高效率轉(zhuǎn)染載體聚乙烯亞胺(PEI)相媲美。

本發(fā)明另一目的在于提供一種上述非病毒基因轉(zhuǎn)染載體材料的制備方法。

本發(fā)明再一目的在于提供上述非病毒基因轉(zhuǎn)染載體材料在siRNA遞送中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述方案實現(xiàn):

一種基于陽離子多肽類的細(xì)胞毒性低、轉(zhuǎn)染效率高的非病毒基因轉(zhuǎn)染載體材料,其結(jié)構(gòu)如通式(1)所示:

其中,R1可以為芐基、烷基或聚乙二醇,n為聚合度,x為側(cè)鏈不含雙鍵的重復(fù)單元的聚合度,且x<n。

本發(fā)明的載體材料為側(cè)鏈含有伯胺離子的多肽類載體,可有效地和siRNA結(jié)合形成納米復(fù)合物膠束,可向靶細(xì)胞中傳遞siRNA,細(xì)胞毒性低,甚至無細(xì)胞毒性;轉(zhuǎn)染效率好,可與經(jīng)典的高效率轉(zhuǎn)染載體聚乙烯亞胺(PEI)相媲美。

一種上述基于陽離子多肽類的細(xì)胞毒性低、轉(zhuǎn)染效率高的非病毒基因轉(zhuǎn)染載體材料的制備方法,包括四步合成反應(yīng):(1)L-半胱氨酸與溴丙炔的親核取代反應(yīng)制備S-炔丙基-L-半胱胺酸;(2)制備S-炔丙基-L-半胱氨酸-N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐單體;(3)引發(fā)S-炔丙基-L-半胱氨酸-N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐單體開環(huán)聚合,得到聚(S-炔丙基-L-半胱胺酸);(4)通過光化學(xué)點(diǎn)擊技術(shù)將聚(S-炔丙基-L-半胱胺酸)側(cè)鏈改性,制備水溶性的陽離子多肽。

上述制備方法具體包括以下四個步驟:

(1)L-半胱氨酸與溴丙炔發(fā)生取代反應(yīng),生成側(cè)鏈含有C≡C鍵的S-炔丙基-L-半胱氨酸;

(2)步驟(1)得到的S-炔丙基-L-半胱氨酸和三光氣在乙酸乙酯中發(fā)生閉環(huán)反應(yīng),生成S-炔丙基-L-半胱氨酸-N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐;

(3)利用端基為伯氨基的引發(fā)劑引發(fā)步驟(2)的S-炔丙基-L-半胱氨酸-N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐單體開環(huán)聚合,得到側(cè)鏈含C≡C鍵的多肽聚(S-炔丙基-L-半胱胺酸);

(4)利用“巰基-炔”光化學(xué)點(diǎn)擊技術(shù),將半胱胺鹽酸鹽接枝到步驟(3)的多肽聚(S-炔丙基-L-半胱胺酸)的側(cè)鏈,得到陽離子多肽。

具體地,步驟(1)的過程和產(chǎn)物結(jié)構(gòu)如下式(一)所示。

其中溴丙炔與L-半胱氨酸的摩爾比優(yōu)選為1:1.1~1:2.0;反應(yīng)時間優(yōu)選為2~3h。上述反應(yīng)優(yōu)選在冰浴條件下進(jìn)行,具體為向溶有L-半胱氨酸的氨水溶液中滴加溴丙炔進(jìn)行反應(yīng);氨水的濃度優(yōu)選為3.0~4.0M;。產(chǎn)物用水和乙醇混合溶劑重結(jié)晶兩次。

步驟(2)的過程和產(chǎn)物結(jié)構(gòu)如下式(二)所示。

其中,S-炔丙基-L-半胱氨酸和三光氣的反應(yīng)摩爾比例為3:1;所述反應(yīng)溫度控制在80~90℃,優(yōu)選為80~85℃;反應(yīng)時間為3~6h,優(yōu)選為4~6h。上述反應(yīng)優(yōu)選在回流狀態(tài)下進(jìn)行。反應(yīng)后,將含有產(chǎn)物的乙酸乙酯溶液用冰冷的0.5%碳酸氫鈉水溶液萃取以除掉副產(chǎn)物HCl,無水硫酸鈉吸干燥,過濾后旋蒸干有機(jī)溶液,得到白色的固體物S-炔丙基-L-半胱氨酸-N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐。

步驟(3)的過程和產(chǎn)物結(jié)構(gòu)如下式(三)所示。

所選用的引發(fā)劑可以是芐胺、丙胺、正丁胺、正戊胺、正己胺、端基為伯氨基的聚乙二醇中的至少一種。所述聚合溫度控制在0~25℃,優(yōu)選為0~5℃;聚合時間優(yōu)選為36~72h。所述聚合的反應(yīng)溶劑為N,N-二甲基甲酰胺,產(chǎn)物在乙醚或甲醇中沉淀,真空干燥得到淺紅褐色產(chǎn)物聚(S-炔丙基-L-半胱胺酸)。

步驟(4)的過程和產(chǎn)物結(jié)構(gòu)如下式(四)所示。

所述多肽側(cè)鏈的炔基和半胱胺鹽酸鹽的巰基的摩爾比為1:2~1:4,優(yōu)選為1:2.5~1:3。具體為將步驟(3)中的多肽和半胱胺鹽酸鹽分別溶于二甲基亞砜(DMSO)中,混合后加入光引發(fā)劑安息香雙甲醚,在紫外光的照射下反應(yīng)。紫外光的最大吸收波長為365nm,光強(qiáng)為4mW·cm-2,功率為4W,光照時間為10~30min。引發(fā)劑用量占所有反應(yīng)物總質(zhì)量的5%。

本發(fā)明的基于聚(L-半胱氨酸)主鏈的陽離子多肽,可以用做非病毒基因遞送載體,能有效地和siRNA結(jié)合形成納米復(fù)合物膠束,可向靶細(xì)胞中傳遞siRNA,細(xì)胞毒性低,甚至無細(xì)胞毒性;轉(zhuǎn)染效率好,可與經(jīng)典的高效率轉(zhuǎn)染載體聚乙烯亞胺(PEI)相媲美,特別適用于siRNA遞送。

具體為:

(1)載體的細(xì)胞毒性檢測(MTS法):將HeLa細(xì)胞以每孔6000個的密度種于96孔板,培養(yǎng)24h后吸出培養(yǎng)基;將載體用DMEM培養(yǎng)液按照不同濃度梯度配成溶液,加入96孔板中;培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后,每孔加入20uL的MTS,2h后,用酶標(biāo)儀測量OD值。并將PEI(分子量為25000g/mol)作為陽性對照,結(jié)果顯示其幾乎沒有細(xì)胞毒性,而PEI的細(xì)胞毒性非常大。

(2)載體與siRNA的縮合:首先制備瓊脂糖凝膠。將2g瓊脂糖溶于100mL的TAE溶液,于微波爐中加熱溶解并倒膠,冷卻后取出,置于裝有TAE緩沖液的電泳槽中。將載體水溶液和siRNA水溶液按照不同的質(zhì)量比例混合以形成復(fù)合物溶液,漩渦振蕩30s。每孔加入濃度為0.264μg/μL的siRNA水溶液5μL,加入的載體與基因的質(zhì)量比為0.5:1,1:1,2:1,4:1,6:1,8:1,12:1,24:1。靜置孵育10min。將9個比例梯度按照順序加入瓊脂糖凝膠的每個孔中,在電壓為100V的條件下電泳30min后取出。用凝膠成像儀觀測基因條帶的信號。用同樣的方法制備復(fù)合物溶液,用動態(tài)光散射和Zeta電位聯(lián)用儀分析其粒徑大小和表面電荷。

(3)向HeLa細(xì)胞內(nèi)遞送siRNA:將HeLa細(xì)胞種于6孔板,24h后待匯合率約70%,把由羧基熒光素標(biāo)記的siRNA(FAM-siRNA)(0.264μg/μL)和載體試劑的水溶液用DMEM培養(yǎng)液分別稀釋。按照載體/基因的質(zhì)量比為24:1的比例,把siRNA溶液緩慢加入到上述含有載體的DMEM溶液中,siRNA的濃度A每孔固定為50nmol/L,培養(yǎng)液總體積為1mL;加完后,漩渦20s,靜置30min孵育,待復(fù)合物的形成后加入完全培養(yǎng)基至1mL,漩渦20s。將復(fù)合物溶液加入到6孔板細(xì)胞中,避光培養(yǎng)4h后,將六孔板中的復(fù)合物溶液吸掉,并用PBS洗滌3次,每次2min。在共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞在總細(xì)胞中所占的比例,同時以PEI為對照。

本發(fā)明的陽離子多肽,其側(cè)鏈含伯胺陽離子,可用于基因轉(zhuǎn)染,能有效地與siRNA形成聚電解質(zhì)納米復(fù)合膠束,可向腫瘤細(xì)胞內(nèi)傳遞siRNA,轉(zhuǎn)染效率非常好,可以和高效率載體PEI相媲美(見圖5),但細(xì)胞毒性比PEI低的多,甚至沒有細(xì)胞毒性(見圖4)。本發(fā)明制備方法結(jié)合了N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐開環(huán)聚合技術(shù)和點(diǎn)擊化學(xué)技術(shù),多肽的側(cè)鏈接枝非常高效,側(cè)鏈炔基的轉(zhuǎn)化率接近100%。通過本發(fā)明方法,可以低成本、大批量地制備一類轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性低的非病毒類基因載體,在腫瘤和多種免疫疾病的基因治療方面有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為實施例2中的聚(S-炔丙基-L-半胱氨酸)的1H NMR圖。

圖2為實施例3中的陽離子多肽的1H NMR圖。

圖3為實施例4中的納米復(fù)合物的粒徑和Zeta電位。

圖4為實施例4中陽離子多肽/siRNA復(fù)合物的瓊脂糖凝膠電泳照片。

圖5為實施例5中陽離子多肽和PEI對HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒性評估。

圖6為實施例6中的經(jīng)FAM-siRNA轉(zhuǎn)染4h后的HeLa細(xì)胞的共聚焦顯微鏡照片。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述,但本發(fā)明的實施方式不限于此。

下列實施例中使用的試劑均可從商業(yè)渠道獲得。

實施例1:S-炔丙基-L-半胱氨酸及其環(huán)狀單體的合成

將0.10mol的L-半胱氨酸置于圓底燒瓶中,加50mL、濃度為0.4M的氨水溶解,冰鹽浴冷卻至0℃。將0.30mol溴丙炔緩慢滴加到反應(yīng)瓶中,2h后結(jié)束反應(yīng),將沉淀物過濾,用乙醇和水重結(jié)晶。產(chǎn)物為淡黃色晶體,產(chǎn)率為86%。

將0.15mol的S-炔丙基-L-半胱氨酸用干燥的乙酸乙酯懸浮,升溫至80℃使,加入0.05mol的三光氣,80℃回流反應(yīng)5h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)溶液冷卻至室溫,用冰水洗滌一次,再用0.5%的碳酸氫鈉洗滌一次,再用冰水洗滌一次,直至pH接近中性。有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥,過濾后將乙酸乙酯旋蒸干。產(chǎn)物為白色絮狀晶體,產(chǎn)率45%。

實施例2:聚(S-炔丙基-L-半胱氨酸)的合成

將實施例1中得到的N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐單體用DMF溶解,將單體和引發(fā)劑的摩爾比設(shè)置為10:1。待單體溶解后,用注射器注入芐胺引發(fā)單體聚合,室溫反應(yīng)72h,整個過程持續(xù)通氮?dú)狻7磻?yīng)結(jié)束后,將DMF溶液滴入乙醚中沉淀出聚合物,過濾后真空干燥,得到聚(S-炔丙基-L-半胱氨酸)的1H NMR圖見圖1。

實施例3:聚(S-炔丙基-L-半胱氨酸)的側(cè)鏈接枝

取0.1g聚(S-炔丙基-L-半胱氨酸)溶于3mL的DMSO中,再按照炔基和半胱胺鹽酸鹽的摩爾比1:4,將半胱胺鹽酸鹽溶解在聚合物溶液中,然后加入0.2%的安息香雙甲醚。待光引發(fā)劑溶解后,在紫外光下照射15min,紫外燈的最大吸收波長365nm。光照結(jié)束后,取出含有DMSO的產(chǎn)物溶液,用水透析二天,每個半天換一次水,冷凍干燥后得到黃色固體產(chǎn)物,產(chǎn)率為58%。得到的陽離子多肽的1H NMR圖見圖2。

實施例4:多肽/siRNA納米復(fù)合物膠束的形成

首先分別將siRNA和陽離子多肽載體溶于去離子水。按照一定的質(zhì)量比,將載體水溶液加入siRNA水溶液中,用漩渦振蕩儀振蕩20s,充分混勻后在室溫條件下放置30min,兩種物質(zhì)依靠靜電引力作用自動組裝成納米復(fù)合物膠束。每孔加入濃度為0.264μg/μL的siRNA水溶液體積為5μL。納米復(fù)合物的粒徑和Zeta電位見圖3。瓊脂糖凝膠電泳照片見圖4。

實施例5:MTS法測定陽離子多肽和PEI的細(xì)胞毒性

將HeLa細(xì)胞以每孔6000個的密度種于96孔板,培養(yǎng)24h后吸出培養(yǎng)基;將載體用DMEM培養(yǎng)液按照不同濃度梯度配成溶液,然后加入96孔板中;在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后,每孔加入20μL的MTS,2h后用酶標(biāo)儀測量OD值。將PEI(分子量為25000g/mol)作為陽性對照,細(xì)胞毒性評估見圖5。

實施例6:用陽離子多肽向HeLa細(xì)胞內(nèi)遞送siRNA

將HeLa細(xì)胞種于6孔板中,待匯合率約為70%~80%時,取濃度為0.264μg/μL的FAM-siRNA水溶液2.5μL溶于1mL的DMEM培養(yǎng)基中。然后按照載體/基因24:1的質(zhì)量比,將載體水溶液也溶于1mL的DMEM培養(yǎng)基中,把siRNA溶液緩慢加入到含有載體的DMEM溶液中,邊加邊吹打,漩渦20s,靜置孵育30min。每孔固定siRNA的濃度為50nmol/L,終體積為1mL。避光培養(yǎng)4h后,將六孔板中的復(fù)合物溶液吸掉,用PBS洗滌3次,每次2min。在共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)出細(xì)胞個數(shù)占所有細(xì)胞數(shù)目的百分比,同時以PEI載體為對照組,共聚焦顯微鏡照片見圖6。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式,但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制,其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化,均應(yīng)為等效的置換方式,都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

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