專利名稱：用于腦膠質細胞疾病治療的基因載體的制作方法
專利說明用于腦膠質細胞疾病治療的基因載體 本發(fā)明涉及一種基因載體，特別是用于腦膠質細胞疾病的治療的基因載體。目前國內外在腦膠質細胞疾病的治療方面還缺乏理想的治療方法。基因治療因為缺乏理想的基因載體而限制了其在臨床上的應用。目前基因載體有病毒載體和非病毒載體。病毒載體存在著免疫原性，潛在的致瘤性以及裝載片段的大小有限制等缺陷。目前常用的非病毒轉運體也存在著難以克服的缺陷，如細胞毒性大，轉染效率低，尤其對于腦膠質細胞疾病來說，目前的非病毒載體因無法穿越血腦屏障，所以幾乎無法用于腦膠質細胞疾病的治療。為改善目前由于腦膠質細胞疾病缺乏理想的基因載體而阻礙基因治療的狀況，本發(fā)明提供一種無毒，安全，高效的用于腦膠質細胞疾病的新型納米基因載體的制備方法及其使用方法。
本發(fā)明應用水解法合成氧化鐵磁性納米顆粒，由于其對細胞無毒性的特性，利用氧化鐵納米顆粒作為基因載體，經過表面改性成功地結合，濃縮，保護DNA、RNA，并在體內外高效的傳遞DNA、RNA進入細胞。具體技術參數如下(1)將葡聚糖，氯化亞鐵，氯化鐵按質量比葡聚糖Fe2+∶Fe3+為40～45∶1.0∶2.5～3的比例混合60～70℃反應1～2h，添加適量的氨水，反應產物高速離心15～30min，取上清，用濾膜過濾制成氧化鐵納米顆粒。
(2)將氧化鐵納米顆粒重懸于1.5mmol/L的NaCl溶液中，加入等質量的多聚賴氨酸，超聲震蕩1hr，離心后，棄上清，1.5mmol/L的NaCl洗滌后重懸于1.5mmol/L的NaCl中制成表面活性的氧化鐵納米顆粒，成為多聚賴氨酸-氧化鐵納米顆粒。
將表面活性的氧化鐵納米顆粒作為腦膠質細胞疾病治療的基因載體，其使用方法為(1)將質粒DNA按10ug/ml～20ug/ml溶解于1.5mM的NaCl中，將等體積的多聚賴氨酸-氧化鐵納米顆粒按5∶1～10∶1的質量比滴加入質粒溶液中，劇烈震蕩10s，室溫靜置1h，將復合物從尾靜脈注射入Balb/C小鼠體內。
(2)或者將多聚賴氨酸-氧化鐵納米顆粒和反義寡核苷酸鏈按質量比為5∶1～10∶1混合，加入磷酸鹽緩沖液和1.1％的戊二醛在25℃反應1hr，高速離心后，去上清，將沉淀重懸于1.5mmol/L的NaCl中，將復合物從尾靜脈注射入Balb/C小鼠體內。
本發(fā)明制作方法簡單，所制得的氧化鐵納米顆?？纱┰窖X屏障在腦膠質細胞中大量分布，可作為腦膠質細胞疾病基因治療的良好基因載體，同時該載體也可用于藥物的轉運，而且氧化鐵磁性納米顆粒具有超順磁性，外加磁場可進一步實現靶向治療。制作的納米顆粒徑粒均勻，該納米顆粒可高效攜帶和保護DNA，該納米轉運體系對細胞無毒性，在體內外將外源基因高效導入細胞內。

圖1多聚賴氨酸-氧化鐵納米顆粒電鏡圖；圖2將多聚賴氨酸-氧化鐵納米顆粒靜脈注射BALB/C小鼠，24小時后處死小鼠，取腦組織做電鏡檢測，結果顯示多聚賴氨酸-氧化鐵納米顆粒在腦膠質細胞大量分布。
圖3多聚賴氨酸-氧化鐵納米顆粒攜帶編碼熒光蛋白的質粒DNA或熒光標記的反義寡核苷酸經靜脈注射入BALB/C小鼠體內，24～48小時后處死小鼠，腦組織制成切片，熒光顯微鏡下顯示在腦組織有大量熒光信號。1.葡聚糖，氯化亞鐵，氯化鐵按葡聚糖Fe2+∶Fe3+為40∶1.0∶2.7的比例混合60℃反應1h，添加適量的氨水，反應產物12,000r/min離心15min，取上清，用濾膜過濾制成氧化鐵納米顆粒。(2)將氧化鐵納米顆粒重懸于1.5mM的NaCl溶液中，加入等質量的多聚賴氨酸，超聲震蕩1hr，離心后，棄上清，1.5mM的NaCl洗滌后重懸于1.5mM的NaCl中制成表面該性的氧化鐵納米顆粒，成為多聚賴氨酸-氧化鐵納米顆粒。
(a)將報道基因質粒EGFP-C2按10ug/ml溶解于1.5mM的NaCl中，將等體積的多聚賴氨酸-氧化鐵納米顆粒按10∶1的質量比滴加入質粒溶液中，劇烈震蕩10s，室溫靜置1h。
(b)或者將多聚賴氨酸-氧化鐵納米顆粒和反義寡核苷酸鏈按質量比為10∶1混合，加入磷酸鹽緩沖液和1.1％的戊二醛在25℃反應1hr，高速離心后，去上清，將沉淀重懸于1.5mM的NaCl中。
2.將(a)、(b)所得兩種復合物分別從尾靜脈注射入BALB/C小鼠體內。處死小鼠，將小鼠的腦組織制成切片，熒光顯微鏡下觀察(圖3)。
權利要求
1.一種用于腦膠質細胞疾病治療的基因載體的制備方法，其特征在于本發(fā)明應用水解法合成氧化鐵磁性納米顆粒，利用氧化鐵納米顆粒作為基因載體，經過表面改性成功地結合，濃縮，保護DNA、RNA，并在體內外高效的傳遞DNA、RNA進入細胞，具體技術參數如下(1)將葡聚糖，氯化亞鐵，氯化鐵按質量比葡聚糖Fe2+∶Fe3+為40～45∶1.0∶2.5～3的比例混合60～70℃反應1～2h，添加適量的氨水，反應產物高速離心15～30min，取上清，用濾膜過濾制成氧化鐵納米顆粒；(2)將氧化鐵納米顆粒重懸于1.5mM的NaCl溶液中，加入等質量的多聚賴氨酸，超聲震蕩1hr，離心后，棄上清，1.5mM的NaCl洗滌后重懸于1.5mM的NaCl中制成表面活性的氧化鐵納米顆粒，成為多聚賴氨酸-氧化鐵納米顆粒。
2.一種權利要求1所述基因載體，其特征在于其使用方法為采用多聚賴氨酸對氧化鐵納米顆粒進行表面修飾，將質粒DNA 10ug/ml～20ug/ml溶解于1.5mM的NaCl中，將等體積的多聚賴氨酸-氧化鐵納米顆粒按10∶1的質量比滴加入質粒溶液中，劇烈震蕩10s，室溫靜置1h。
3.一種權利要求1所述基因載體，其特征在于其使用方法為采用改性的氧化鐵納米顆粒可用作雙鏈環(huán)狀質粒DNA，單鏈反義寡核苷酸，RNA及其它藥物的載體，將多聚賴氨酸-氧化鐵納米顆粒和反義寡核苷酸鏈按質量比為10∶1混合，加入磷酸鹽緩沖液和1.1％的戊二醛在25℃反應1hr，高速離心后，去上清，將沉淀重懸于1.5mM的NaCl中。
全文摘要
一種用于腦膠質細胞疾病治療的基因載體，本發(fā)明用水解法制成氧化鐵納米顆粒，同時在其表面修飾了多聚賴氨酸，修飾后的氧化鐵納米顆粒直徑約為50nm，分布均勻。該納米顆?？山Y合并保護鏈環(huán)狀質粒DNA，單鏈反義寡核苷酸，RNA，體內實驗證明氧化鐵納米顆?？蓪⑼庠椿蚋咝У霓D運至腦膠質細胞并表達出來，可成為治療腦膠質疾病的良好的基因載體和藥物載體。
文檔編號A61K47/02GK1456356SQ02114118
公開日2003年11月19日 申請日期2002年5月9日 優(yōu)先權日2002年5月9日
發(fā)明者李桂源, 向娟娟, 朱詩國, 呂紅斌, 李小玲, 沈守榮, 張必成, 聶新民, 周鳴, 唐珂, 曹利 申請人:中南大學