本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及包含核酸、酶或微生物的測(cè)定或檢驗(yàn)方法的檢測(cè)試劑。

背景技術(shù)：

埃博拉病毒是一種能引起的人畜共患烈性傳染病的絲狀病毒科病毒，能引起埃博拉出血熱，具有高致病性，病死率高的特點(diǎn)，被世界衛(wèi)生組織列為對(duì)人類危害最嚴(yán)重的病毒之一，生物安全等級(jí)4級(jí)(BSL-4)。

目前，我國(guó)扎伊爾型埃博拉病毒常規(guī)檢測(cè)方法有血清學(xué)反應(yīng)、核酸雜交、抗原抗體ELISA等技術(shù)，但這些試驗(yàn)或方法，存在操作繁瑣，所需時(shí)間長(zhǎng)(約2天以上)。現(xiàn)有扎伊爾型埃博拉病毒檢測(cè)技術(shù)依然很少，且大多并不可靠，靈敏度低、特異性差。過去推廣使用的核酸檢測(cè)方法于2014年西非疫情中被證實(shí)存在嚴(yán)重的假陰性情況，表明扎伊爾型埃博拉病毒檢測(cè)引物、探針亟需更新。本專利旨在建立一種檢測(cè)扎伊爾型埃博拉病毒的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，對(duì)過去的方法進(jìn)行更新推廣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測(cè)扎伊爾型埃博拉病毒的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒具有特異性好、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案是：

一種檢測(cè)扎伊爾型埃博拉病毒的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒包括引物、TaqMan熒光探針和陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，其特征在于：

(1)所述的引物為擴(kuò)增扎伊爾型埃博拉病毒包膜糖蛋白的編碼基因的高度保守片段的一對(duì)引物，其中，

上游引物序列為：5’-GAACCACATGATTGGACCAAGA-3’(SEQ NO.1)，

下游引物序列為：5’-TAACTCCAATACCTGCCGGTATC-3’(SEQ NO.2)；

(2)所述的TaqMan熒光探針序列為：

5’FAM-TTGTTGATAAAACCCTTCCGGACCAGG-BHQ 3’(SEQ NO.3)；

(3)所述的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品為含有以下序列DNA片段的重組質(zhì)粒：

TGGGACCGGACTGCTGTATCGAACCACATGATTGGACCAAGAACATAACAGACAAAATTGATCAGATTATTCATGATTTTGTTGATAAAACCCTTCCGGACCAGGGGGACAATGACAATTGGTGGACAGGATGGAGACAATGGATACCGGCAGGTATTGGAGTTACAGG(SEQ NO.4)。

上述方案中，所述的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品由以下方法制得：

1)根據(jù)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank上公布的扎伊爾型埃博拉病毒包膜糖蛋白的編碼基因序列，利用Clustal_X軟件進(jìn)行序列同源性分析，然后以blastn網(wǎng)絡(luò)工具比對(duì)分析其特異性，尋找所述編碼基因中高度保守區(qū)域的氨基酸序列，再按常規(guī)方法合成出所述氨基酸序列的DNA片段；

2)將步驟(1)合成的DNA片段插入質(zhì)粒載體pUC57(Amp⁺)中構(gòu)建成重組質(zhì)粒；

3)取5μl步驟(1)所得到的重組質(zhì)粒與100μl DH5α感受態(tài)細(xì)胞混合后，冰浴20分鐘；42℃水浴槽中熱沖擊70～90秒后，迅速冰浴5分鐘；加入500μl LB肉湯培養(yǎng)基，混勻，37℃200rpm搖床培養(yǎng)1小時(shí)，得菌液；取100μl菌液在含濃度為100μg/μl的氨芐西林、濃度為20μg/μl的X-gal和濃度為200μg/μl的IPTG的LB培養(yǎng)基平板上進(jìn)行涂布，培養(yǎng)18小時(shí)；然后通過藍(lán)白斑篩選，挑取培養(yǎng)基上的白色菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；

4)取擴(kuò)大培養(yǎng)后的白色菌株按Omega公司提供的質(zhì)粒快速提取試劑盒的要求進(jìn)行提取，然后用去離子水稀釋至10⁶copies/μl即得陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。

本發(fā)明所述的試劑盒的使用方法如下：

(1)反應(yīng)體系如表1所示：

表1本發(fā)明試劑盒PCR反應(yīng)體系

(3)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：將定量陽(yáng)性模板按10倍稀釋法稀釋成10⁹～10³copies/μl 7個(gè)濃度梯度，按照步驟(1)和(2)所述的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增；

(4)樣品檢測(cè)：將陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對(duì)照和待檢樣品RNA按照上述反應(yīng)體系進(jìn)行配制和反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增后，從儀器配套軟件中得到各個(gè)樣品對(duì)應(yīng)Ct值；

(5)結(jié)果判斷：Ct值≤35.0為陽(yáng)性，無數(shù)值或大于35.0為陰性。

本發(fā)明試劑盒與常用的血清學(xué)方法類的試劑盒相比具有更高的特異性；與過去的埃博拉病毒熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒相比能更快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出扎伊爾型埃博拉病毒，檢測(cè)時(shí)間45min，最低檢測(cè)下限達(dá)到10copies/μl，具有良好的特異性，可用于臨床診斷，傳染病疫情預(yù)防監(jiān)控，出入境檢驗(yàn)檢疫及其相關(guān)領(lǐng)域的扎伊爾型埃博拉病毒的定性和定量快速實(shí)時(shí)核酸檢測(cè)。

附圖說明

圖1為所述編碼基因中高度保守區(qū)域的氨基酸序列SEQ NO.4在扎伊爾型埃博拉病毒基因組中的位置圖。

圖2為采用本發(fā)明所述試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增后所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖3為實(shí)施例2中本發(fā)明試劑盒敏感性測(cè)定結(jié)果的曲線圖，圖中自左向右依次為起始模板濃度分別是10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹copies/μl的擴(kuò)增曲線，最下面靠近橫坐標(biāo)的曲線(Ct值很小的)為陰性對(duì)照。

圖4為實(shí)施例2中本發(fā)明試劑盒特異性測(cè)定結(jié)果的曲線圖，圖中自左向右對(duì)應(yīng)起始模板分別是陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品、含重組質(zhì)粒的DH5ɑ工程菌的擴(kuò)增曲線，無Ct值曲線的模板是I型登革病毒RNA、寨卡病毒RNA、陰性對(duì)照的擴(kuò)增曲線。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例來說明本發(fā)明具有的有益效果。

實(shí)施例1：(制備試劑盒)

1、檢測(cè)扎伊爾型埃博拉病毒熒光定量PCR試劑盒的組成：

上游引物：5’-GAACCACATGATTGGACCAAGA-3’，10μM；

下游引物：5’-TAACTCCAATACCTGCCGGTATC-3’，10μM；

熒光探針：5’FAM-TTGTTGATAAAACCCTTCCGGACCAGG-BHQ 3’，10μM；

陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品：含有DNA片段SEQ NO.4的pUC57(Amp⁺)重組質(zhì)粒，濃度是10⁶copies/μl。

聚合酶混合液：含5U/μl Taq DNA聚合酶和200U/μl逆轉(zhuǎn)錄酶，購(gòu)自北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司；

PCR反應(yīng)緩沖液(5×)：購(gòu)自北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司；

上述核酸均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2、所述定量陽(yáng)性模板的制備方法是：

(1)根據(jù)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank上公布的扎伊爾型埃博拉病毒包膜糖蛋白的編碼基因序列，利用Clustal_X軟件進(jìn)行序列同源性分析，然后以blastn網(wǎng)絡(luò)工具比對(duì)分析其特異性，尋找編碼基因中具有高度保守的區(qū)域，然后提交序列信息由生工生物工程(上海)股份有限公司合成SEQ NO.4的DNA片段；

(2)將該片段插入質(zhì)粒載體pUC57(Amp⁺)中構(gòu)建成重組質(zhì)粒，具體方法是：

a.DNA片段SEQ NO.4與質(zhì)粒載體pUC57(Amp⁺)的連接和轉(zhuǎn)化：

1)在微量離心管中加入：

pUC57(Amp⁺) 1μl

DNA片段(SEQ NO.4) 4μl

dH₂O 4μl；

2)加入1μl的T4DNA Ligase；

3)16℃反應(yīng)過夜，連接；

4)取感受態(tài)細(xì)胞DH5α100μl于離心管，置于冰中預(yù)冷20min；

5)加入連接產(chǎn)物5μl；

6)輕輕混勻后冰中預(yù)冷30min；

7)42℃70～90S熱沖擊處理；

8)迅速移至冰中冷卻5min；

9)加入37℃LB液體培養(yǎng)基500μl；

10)37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)1h；

11)取100μl培養(yǎng)基涂布于含100μg/μl氨芐西林、20μg/μlX-gal、200μg/μl IPTG的LB培養(yǎng)基平板；

12)37℃培養(yǎng)18h；

13)取5個(gè)菌落放入含100μg/μl氨芐西林LB體培養(yǎng)基4ml中搖菌擴(kuò)增18h。

b.重組質(zhì)粒提?。?/p>

1)取擴(kuò)增菌液50ml離心5000g 10min；

2)棄上清，加入250μl SolutionⅠ/R NaseA懸浮細(xì)胞；

3)加入250μl SolutionⅡ，輕輕混均，上下顛倒4～6次；

4)加入350μl SolutionⅢ，輕輕混均，上下顛倒直到白色絮狀物形成；

5)離心13,000g 10min；

6)小心把清澈的上清加入到干凈的HiBind^TM DNA Miricolumn中，離心Miricolumn10,000g 1min；

7)去液，加500μl bufferHB洗管后，離心10,000g 1min；

8)棄液，加入700μl DNA wash buffer，離心10,000g 1min；

9)重復(fù)步驟8)；

10)再離心空管13,000g 3min；

11)把空管放入干凈的1.5ml離心管中，加入去離子水60μl，離心13,000g 2min。

3、鑒定：將所得重組質(zhì)粒用設(shè)計(jì)的引物F、R進(jìn)行普通PCR，2.0％的瓊脂糖凝膠電泳，得到條帶大小為145bp。將樣品測(cè)定濃度后稀釋成10⁶copies/μl。

上述SEQ NO.4所示序列的長(zhǎng)度為位于169bp，位于扎伊爾型埃博拉病毒基因組序列的1949～2117bp之間(參見圖1)。

下述實(shí)施例所用的試劑盒均為實(shí)施例1所述的試劑盒。

實(shí)施例2：(體外檢測(cè)實(shí)驗(yàn))

1、模板的制備：

a.試劑：RNA提取試劑盒，購(gòu)自Axygen公司。

b.標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)及制備：

陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品：10⁶copies/μl重組質(zhì)粒；

待檢測(cè)樣品：以含重組質(zhì)粒的DH5ɑ工程菌為陽(yáng)性樣品，以I型登革病毒、寨卡病毒的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基和無重組質(zhì)粒DH5ɑ菌株作為模擬樣品，菌無需提取RNA以全基因組作模板；

陰性對(duì)照：去離子水。

c.RNA的提取：取含I型登革病毒、寨卡病毒的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基200μl，用RNA提取試劑盒提取病毒RNA，終體積為30μl(詳細(xì)步驟請(qǐng)參照試劑盒說明書)。提取的RNA模板－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2、熒光定量PCR反應(yīng)：

1)反應(yīng)體系如表2所示：

表2本實(shí)施例試劑盒PCR反應(yīng)體系

2)方法：每批反應(yīng)設(shè)一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照，一個(gè)陰性對(duì)照(由去離子水取代)，反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

儀器：Roche實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀LightCycler 96，Roche公司(瑞士)。

3)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：

將重組質(zhì)粒模板按10倍倍比稀釋成10⁹～10³copies/μl共7個(gè)濃度梯度，按照上述反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后計(jì)算機(jī)自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。起始模板在10⁹～10³copies/μl時(shí)線性良好，軟件分析得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y＝-3.7514X+43.31，R²＝0.999。

4)敏感性測(cè)定：

取陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品按10倍倍比稀釋為10⁶～10¹copies/μl共6個(gè)濃度梯度，按照上述反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增，用熒光定量PCR分析，以確定最低檢測(cè)下限，如圖3所示。起始模板在10¹copies/μl時(shí)Ct值為34.44，說明該檢測(cè)方法的最低檢測(cè)下限為10¹copies/μl。

5)特異度測(cè)定

取陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品作陽(yáng)性對(duì)照，以含重組質(zhì)粒的DH5ɑ工程菌為陽(yáng)性樣品，以I型登革病毒、寨卡病毒的RNA和無重組質(zhì)粒DH5ɑ菌株作為模擬樣品，去離子水為陰性對(duì)照，按照上述反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增，檢驗(yàn)反應(yīng)的特異性，結(jié)果如圖4所示。陽(yáng)性對(duì)照和陽(yáng)性樣品的熒光定量PCR結(jié)果呈現(xiàn)規(guī)律的擴(kuò)增曲線，Ct均小于35，呈陽(yáng)性；I型登革病毒、寨卡病毒的RNA和無重組質(zhì)粒DH5ɑ菌株作為模擬樣品的檢測(cè)結(jié)果均無Ct值，呈陰性。與預(yù)期結(jié)果完全符合，無非特異度擴(kuò)增。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方醫(yī)科大學(xué)

<120> 一種檢測(cè)扎伊爾型埃博拉病毒的熒光定量PCR試劑盒

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaaccacatg attggaccaa ga 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

taactccaat acctgccggt atc 23

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttgttgataa aacccttccg gaccagg 27

<210> 4

<211> 169

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgggaccgga ctgctgtatc gaaccacatg attggaccaa gaacataaca gacaaaattg 60

atcagattat tcatgatttt gttgataaaa cccttccgga ccagggggac aatgacaatt 120

ggtggacagg atggagacaa tggataccgg caggtattgg agttacagg 169