相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本專利申請(qǐng)要求于2012年2月9日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/597,053的利益，所述美國臨時(shí)申請(qǐng)以引用的方式全文并入本文。

本專利申請(qǐng)要求于2012年10月26日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/719,045的利益，所述美國臨時(shí)申請(qǐng)以引用的方式全文并入本文。

本專利申請(qǐng)要求于2012年11月30日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/731,873的利益，所述美國臨時(shí)申請(qǐng)以引用的方式全文并入本文。

技術(shù)領(lǐng)域

總的來說，本公開內(nèi)容涉及親水性聚合物顆粒，并且涉及用于制備并使用此類親水性聚合物顆粒的方法。

背景技術(shù)：

聚合物顆粒越來越多地用作分離技術(shù)中的組分，并且?guī)椭鷻z測化學(xué)和生物系統(tǒng)兩者中的分析物。例如，聚合物顆粒已用于色譜技術(shù)中以從溶液中分離靶分子。在另一個(gè)例子中，具有磁性涂層的聚合物顆粒用于磁性分離技術(shù)中。最近以來，聚合物顆粒已用于增強(qiáng)ELISA型技術(shù)并且可用于捕獲多核苷酸。

然而，此類分離和分析技術(shù)已具有由于顆粒大小中的變異的缺點(diǎn)。顆粒大小中的大變異導(dǎo)致顆粒重量中的變異，以及可用于與靶分析物相互作用的反應(yīng)位點(diǎn)數(shù)目中的變異。對(duì)于磁性分離技術(shù)，大小中的變異可導(dǎo)致低效率分離。對(duì)于色譜技術(shù)和多種多核苷酸捕獲技術(shù)，大小中的變異可導(dǎo)致可用于與多核苷酸相互作用的位點(diǎn)數(shù)目中的變異，導(dǎo)致捕獲或分離效率中的變異。

像這樣，改善的聚合物顆粒和用于制造此類聚合物顆粒的方法將是期望的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在第一個(gè)方面，形成顆粒的方法包括在水性懸浮液內(nèi)的分散相中，使具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的親水性單體的多個(gè)聚體單元聚合，由此形成包括多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)的聚合物顆粒，并且將聚合物顆粒轉(zhuǎn)換為水凝膠顆粒。

在第二個(gè)方面，形成顆粒的方法包括在水性懸浮液內(nèi)的分散相中，使具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的丙烯酰胺單體的多個(gè)聚體單元聚合，由此形成包括多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)的聚合物顆粒，并且將聚合物顆粒轉(zhuǎn)換為親水性顆粒。

在第三個(gè)方面，形成顆粒的方法包括在水性懸浮液內(nèi)的分散相中，使可自由基聚合單體的多個(gè)聚體單元與具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的二丙烯酰胺交聯(lián)劑聚合，由此形成包括多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)的聚合物顆粒。該方法還包括去除至少一部分所述多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)。

在第四個(gè)方面，形成顆粒的方法包括使具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的親水性單體的多個(gè)聚體單元聚合，由此形成包括多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)的聚合物顆粒；從聚合物顆粒中去除至少一部分所述多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)，形成親水性顆粒；并且使寡核苷酸與親水性顆粒結(jié)合。

在第五個(gè)方面，多個(gè)顆粒包括至少100,000個(gè)顆粒。多個(gè)顆粒中的至少一個(gè)顆粒包括水凝膠。多個(gè)顆粒具有不超過100微米的平均粒度和不超過5％的變異系數(shù)。

在第六個(gè)方面，系統(tǒng)包括孔陣列?？钻嚵械闹辽僖粋€(gè)孔與ISFET傳感器可操作地連接。該系統(tǒng)還包括具有不超過5％的變異系數(shù)的多個(gè)水凝膠顆粒。多個(gè)水凝膠顆粒中的至少一個(gè)水凝膠顆粒設(shè)置在孔陣列的孔中。

在第七個(gè)方面，多個(gè)顆粒通過包括下述的方法形成：在水性懸浮液內(nèi)的分散相中，使具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的親水性單體的多個(gè)聚體單元聚合，由此形成包括多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)的聚合物顆粒，并且包括將聚合物顆粒轉(zhuǎn)換為水凝膠顆粒。

在第八個(gè)方面，組合物包括丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑的水性混合物，該丙烯酰胺單體包括疏水性保護(hù)基團(tuán)，單體和交聯(lián)劑以在15:1至1:2范圍內(nèi)的單體:交聯(lián)劑的質(zhì)量比包括。

在第九個(gè)方面，測序多核苷酸的方法包括提供包括孔陣列的裝置。至少一個(gè)孔與ISFET可操作地連接，并且包括通過上述方面的方法形成的顆粒。該顆粒附著至多核苷酸。該方法還包括將包括預(yù)定類型的核苷酸的溶液施加于裝置，并且觀測對(duì)施加溶液的離子應(yīng)答。

在第十個(gè)方面，用于核苷酸摻入的方法包括提供通過上述方面的方法形成的顆粒。該顆粒附著至包括與引物雜交的模板核酸的核酸雙鏈體。該雙鏈體與聚合酶結(jié)合。該方法還包括使顆粒與一種或多種核苷酸接觸，并且使用聚合酶將至少一種核苷酸摻入引物的末端上。

在第十一個(gè)方面，形成顆粒的方法包括促進(jìn)種子顆粒在水性懸浮液中形成分散相，在分散相中使具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的親水性單體的多個(gè)聚體單元聚合，由此形成包括多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)的聚合物顆粒，并且將聚合物顆粒轉(zhuǎn)換為水凝膠顆粒。

在第十二個(gè)方面，形成顆粒的方法包括提供在水性懸浮液中的種子顆粒，該種子顆粒包含疏水性聚合物，并且包括促進(jìn)種子顆粒在水性懸浮液中形成分散相。該方法還包括在分散相中使具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的親水性單體的多個(gè)聚體單元聚合，由此形成包括具有多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)的親水性聚合物的聚合物顆粒。聚合物顆粒包括疏水性聚合物。該方法還包括從親水性聚合物中切割多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)，并且從聚合物顆粒中提取疏水性聚合物，形成水凝膠顆粒。

在第十三個(gè)方面，顆粒包括由羥烷基丙烯酰胺和二丙烯酰胺聚合形成的聚合物。二丙烯酰胺包括羥基。當(dāng)暴露于水時(shí)，顆粒吸收基于聚合物重量至少300重量％的水。

具體地，本發(fā)明包括：

1.一種形成顆粒的方法，所述方法包括：

在水性懸浮液內(nèi)的分散相中，使具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的親水性單體的多個(gè)聚體單元聚合，由此形成包括多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)的聚合物顆粒；和

將所述聚合物顆粒轉(zhuǎn)換為親水性顆粒。

2.根據(jù)項(xiàng)1所述的方法，其中所述親水性顆粒是水凝膠顆粒。

3.根據(jù)項(xiàng)1或項(xiàng)2所述的方法，其中所述親水性單體包括丙烯酰胺單體。

4.根據(jù)項(xiàng)1或項(xiàng)2所述的方法，其中所述親水性單體是可自由基聚合的單體，并且所述分散相還包括具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的二丙烯酰胺交聯(lián)劑。

5.根據(jù)項(xiàng)1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中轉(zhuǎn)換所述聚合物顆粒包括從所述聚合物顆粒中去除至少一部分所述多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)。

6.根據(jù)項(xiàng)5所述的方法，其中去除至少一部分所述多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)包括從所述聚合物顆粒中酸切割至少一部分所述多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)。

7.根據(jù)項(xiàng)1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中轉(zhuǎn)換所述聚合物顆粒包括從所述聚合物顆粒中去除基本上全部的所述多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)。

8.根據(jù)項(xiàng)1-7中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括促進(jìn)所述水性懸浮液中的種子顆粒形成所述分散相。

9.根據(jù)項(xiàng)8所述的方法，其中受保護(hù)單體:種子顆粒的質(zhì)量比在150:1至1:1的范圍內(nèi)。

10.根據(jù)項(xiàng)8所述的方法，其中所述種子顆粒包括種子聚合物。

11.根據(jù)項(xiàng)10所述的方法，所述方法還包括在轉(zhuǎn)換所述聚合物顆粒后提取所述種子聚合物。

12.根據(jù)項(xiàng)10所述的方法，其中所述種子聚合物是疏水的。

13.根據(jù)項(xiàng)10所述的方法，其中所述種子聚合物包括苯乙烯類聚合物、丙烯酸類聚合物、丙烯酰胺、另一種乙烯基聚合物，或其組合。

14.根據(jù)項(xiàng)8所述的方法，其中所述種子顆粒具有不超過0.6微米的初始粒度。

15.根據(jù)項(xiàng)14所述的方法，其中所述初始粒度不超過0.45微米。

16.根據(jù)項(xiàng)15所述的方法，其中所述初始粒度不超過0.35微米。

17.根據(jù)項(xiàng)16所述的方法，其中所述初始粒度不超過0.15微米。

18.根據(jù)項(xiàng)8所述的方法，其中所述種子顆粒具有在1微米至7微米范圍內(nèi)的初始粒度。

19.根據(jù)項(xiàng)8所述的方法，其中促進(jìn)所述種子顆粒包括使溶劑和促進(jìn)試劑與所述種子顆粒混合。

20.根據(jù)項(xiàng)19所述的方法，其中所述促進(jìn)試劑是疏水的，并且具有在25℃下小于0.01g/l的水溶性。

21.根據(jù)項(xiàng)19所述的方法，其中所述促進(jìn)試劑包括二辛酰過氧化物或己二酸二辛酯或分子量低于20kD的聚苯乙烯。

22.根據(jù)項(xiàng)1-21中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述親水性單體包括丙烯酰胺。

23.根據(jù)項(xiàng)4-22中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述可自由基聚合的單體是基于乙烯基的單體。

24.根據(jù)項(xiàng)23所述的方法，其中所述基于乙烯基的單體包括丙烯酸酯、丙烯酰胺、乙烯醇、乙酸乙烯酯、丙烯酰胺-甲基-丙烷磺酸，或其組合。

25.根據(jù)項(xiàng)24所述的方法，其中所述基于乙烯基的單體是丙烯酰胺。

26.根據(jù)項(xiàng)1-25中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述疏水性保護(hù)基團(tuán)包括羥基保護(hù)基團(tuán)。

27.根據(jù)項(xiàng)1-25中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述疏水性保護(hù)基團(tuán)包括胺保護(hù)基團(tuán)。

28.根據(jù)項(xiàng)1-27中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述疏水性保護(hù)基團(tuán)包括有機(jī)金屬部分。

29.根據(jù)項(xiàng)28所述的方法，其中所述有機(jī)金屬部分形成甲硅烷基醚官能團(tuán)。

30.根據(jù)項(xiàng)29所述的方法，其中所述甲硅烷基醚官能團(tuán)源自叔丁基二甲基硅烷醚、三甲基甲硅烷基醚、三乙基甲硅烷基醚、二苯基甲基甲硅烷基醚，或其組合。

31.根據(jù)項(xiàng)1-30中任一項(xiàng)所述的方法，其中使所述多個(gè)聚體單元聚合還包括使交聯(lián)劑與具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的所述親水性單體混合。

32.根據(jù)項(xiàng)31所述的方法，其中混合所述交聯(lián)劑包括以在15:1至1:2范圍內(nèi)的親水性單體:交聯(lián)劑的質(zhì)量比混合所述交聯(lián)劑。

33.根據(jù)項(xiàng)32所述的方法，其中所述范圍是10:1至1:1。

34.根據(jù)項(xiàng)31所述的方法，其中所述交聯(lián)劑是低水溶性交聯(lián)劑，并且具有在25℃下小于10g/l的水溶性。

35.根據(jù)項(xiàng)31所述的方法，其中所述交聯(lián)劑是二乙烯基交聯(lián)劑。

36.根據(jù)項(xiàng)35所述的方法，其中所述二乙烯基交聯(lián)劑包括二丙烯酰胺。

37.根據(jù)項(xiàng)4或項(xiàng)36所述的方法，其中所述二丙烯酰胺包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)雙(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(2-羥丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、其受保護(hù)的衍生物，或其組合。

38.根據(jù)項(xiàng)4或項(xiàng)37所述的方法，其中所述二丙烯酰胺包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)雙(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、N,N’-(乙烷-1,2-二基)雙(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、甲硅烷基-保護(hù)的N-[2-(丙烯酰氨基)-1,2-二羥乙基]丙烯酰胺例如N,N’(2,3-雙((三乙基甲硅烷基)氧基)丁烷-1,4-二基)二丙烯酰胺，或其組合。

39.根據(jù)項(xiàng)35所述的方法，其中所述二乙烯基交聯(lián)劑包括二甲基丙烯酸乙二醇酯、二乙烯基苯、六亞甲基雙丙烯酰胺、三甲基丙烯酸三羥甲基丙烷酯，或其組合。

40.根據(jù)項(xiàng)1-39中任一項(xiàng)所述的方法，其中使所述多個(gè)聚體單元聚合包括使致孔劑與具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的所述親水性單體混合。

41.根據(jù)項(xiàng)40所述的方法，其中所述致孔劑是芳香族致孔劑。

42.根據(jù)項(xiàng)41所述的方法，其中所述芳香族致孔劑包括甲苯、二甲苯、均三甲苯、乙酸苯乙基酯(phenylenethyl acetate)或苯甲酸乙酯。

43.根據(jù)項(xiàng)1-42中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括活化所述親水性顆?；蛩鏊z顆粒。

44.根據(jù)項(xiàng)43所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)換包括在所述水凝膠顆粒上提供一個(gè)或多個(gè)羥基，并且其中活化包括將所述一個(gè)或多個(gè)羥基中的至少一個(gè)轉(zhuǎn)換為烷基或芳基磺酸酯。

45.根據(jù)項(xiàng)43所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)換包括在所述水凝膠顆粒上提供一個(gè)或多個(gè)羥基，并且其中活化包括將所述一個(gè)或多個(gè)羥基中的至少一個(gè)替換為疊氮化物官能部分。

46.根據(jù)項(xiàng)43所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)換包括在所述水凝膠顆粒上提供一個(gè)或多個(gè)胺基，并且其中活化包括使所述一個(gè)或多個(gè)胺基中的至少一個(gè)與雙琥珀酰亞胺C2-C12烷基酯反應(yīng)。

47.根據(jù)項(xiàng)43所述的方法，所述方法還包括使寡核苷酸與所述活化的水凝膠聚合物結(jié)合。

48.根據(jù)項(xiàng)47所述的方法，其中所述結(jié)合包括親核取代，并且所述寡核苷酸是親核體封端的寡核苷酸。

49.根據(jù)項(xiàng)48所述的方法，其中所述親核體封端的寡核苷酸的親核體是胺基。

50.根據(jù)項(xiàng)48所述的方法，其中所述親核體封端的寡核苷酸的親核體是硫醇基。

51.根據(jù)項(xiàng)47所述的方法，所述方法還包括使多核苷酸與所述寡核苷酸雜交。

52.根據(jù)項(xiàng)51所述的方法，所述方法還包括將所述多核苷酸擴(kuò)增成多個(gè)多核苷酸，并且使所述多個(gè)多核苷酸的至少一部分附著至所述水凝膠顆粒，由此生成包括多個(gè)附著的多核苷酸的水凝膠顆粒。

53.根據(jù)項(xiàng)51所述的方法，所述方法還包括通過延伸所述寡核苷酸將所述多核苷酸擴(kuò)增成多個(gè)互補(bǔ)多核苷酸，由此生成包括多個(gè)附著的多核苷酸的水凝膠顆粒。

54.根據(jù)項(xiàng)1-53中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述水凝膠顆粒是在水中具有不超過2微米的平均粒度的多個(gè)類似形成的水凝膠顆粒之一。

55.根據(jù)項(xiàng)54所述的方法，其中所述平均粒度不超過1微米。

56.根據(jù)項(xiàng)55所述的方法，其中所述平均粒度不超過0.8微米。

57.根據(jù)項(xiàng)56所述的方法，其中所述平均粒度不超過0.5微米。

58.根據(jù)項(xiàng)1-44中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述水凝膠顆粒是在水中具有在5微米至100微米范圍內(nèi)的平均粒度的多個(gè)類似形成的水凝膠顆粒之一。

59.根據(jù)項(xiàng)1-58中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述水凝膠顆粒是大小基本上均勻的多個(gè)類似形成的水凝膠顆粒之一。

60.根據(jù)項(xiàng)1-59中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述水凝膠顆粒是具有不超過5.0％的變異系數(shù)的多個(gè)類似形成的水凝膠顆粒之一。

61.根據(jù)項(xiàng)60所述的方法，其中所述變異系數(shù)不超過3.5％。

62.一種形成顆粒的方法，所述方法包括：

使具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的親水性單體的多個(gè)聚體單元聚合，由此形成包括多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)的聚合物顆粒；

從所述聚合物顆粒中去除至少一部分所述多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)，形成親水性顆粒；和

使寡核苷酸與所述親水性顆粒結(jié)合。

63.根據(jù)項(xiàng)62所述的方法，其中去除至少一部分所述多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)包括從所述聚合物顆粒中酸切割至少一部分所述多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)。

64.根據(jù)項(xiàng)62或項(xiàng)63所述的方法，其中所述親水性單體包括丙烯酰胺。

65.根據(jù)項(xiàng)62-64中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述疏水性保護(hù)基團(tuán)包括羥基保護(hù)基團(tuán)。

66.根據(jù)項(xiàng)62-65中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述疏水性保護(hù)基團(tuán)包括有機(jī)金屬部分。

67.根據(jù)項(xiàng)66所述的方法，其中所述有機(jī)金屬部分形成甲硅烷基醚官能團(tuán)。

68.根據(jù)項(xiàng)62-67中任一項(xiàng)所述的方法，其中使所述多個(gè)聚體單元聚合還包括使交聯(lián)劑與具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的所述親水性單體混合。

69.根據(jù)項(xiàng)68所述的方法，其中所述交聯(lián)劑是二乙烯基交聯(lián)劑。

70.根據(jù)項(xiàng)69所述的方法，其中所述二乙烯基交聯(lián)劑包括二丙烯酰胺。

71.根據(jù)項(xiàng)62-70中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括在結(jié)合所述寡核苷酸前活化所述水凝膠顆粒。

72.根據(jù)項(xiàng)71所述的方法，其中所述去除包括在所述親水性顆粒上提供一個(gè)或多個(gè)羥基，并且其中活化包括將所述一個(gè)或多個(gè)羥基中的至少一個(gè)轉(zhuǎn)換為磺酸酯基團(tuán)。

73.根據(jù)項(xiàng)71所述的方法，其中所述去除包括在所述親水性顆粒上提供一個(gè)或多個(gè)羥基，并且其中活化包括將所述一個(gè)或多個(gè)羥基中的至少一個(gè)替換為疊氮化物官能部分。

74.根據(jù)項(xiàng)71所述的方法，其中所述結(jié)合包括使所述寡核苷酸與所述活化的水凝膠聚合物結(jié)合。

75.根據(jù)項(xiàng)74所述的方法，其中所述結(jié)合包括親核取代，并且所述寡核苷酸是親核體封端的寡核苷酸。

76.根據(jù)項(xiàng)75所述的方法，其中所述親核體封端的寡核苷酸的親核體是胺基。

77.根據(jù)項(xiàng)75所述的方法，其中所述親核體封端的寡核苷酸的親核體是硫醇基。

78.根據(jù)項(xiàng)62-77中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括使多核苷酸與所述寡核苷酸雜交。

79.根據(jù)項(xiàng)78所述的方法，所述方法還包括將所述多核苷酸擴(kuò)增成多個(gè)多核苷酸，并且使所述多個(gè)多核苷酸的至少一部分附著至所述水凝膠顆粒，由此生成包括多個(gè)附著的多核苷酸的水凝膠顆粒。

80.根據(jù)項(xiàng)78所述的方法，所述方法還包括通過延伸所述寡核苷酸將所述多核苷酸擴(kuò)增成多個(gè)互補(bǔ)多核苷酸，由此生成包括多個(gè)附著的多核苷酸的水凝膠顆粒。

81.包含至少100,000個(gè)顆粒的多個(gè)顆粒，所述多個(gè)顆粒中的至少一個(gè)顆粒包含水凝膠，所述多個(gè)顆粒具有不超過100微米的平均粒度和不超過5％的變異系數(shù)。

82.根據(jù)項(xiàng)81所述的多個(gè)顆粒，其中所述至少100,000個(gè)顆粒各自包含所述水凝膠。

83.根據(jù)項(xiàng)81或82所述的多個(gè)顆粒，其中所述變異系數(shù)不超過4.5％。

84.根據(jù)項(xiàng)83所述的多個(gè)顆粒，其中所述變異系數(shù)不超過4.0％。

85.根據(jù)項(xiàng)84所述的多個(gè)顆粒，其中所述變異系數(shù)不超過3.5％。

86.根據(jù)項(xiàng)85所述的多個(gè)顆粒，其中所述變異系數(shù)不超過3.0％。

87.根據(jù)項(xiàng)81-86中任一項(xiàng)所述的多個(gè)顆粒，其中所述平均粒度不超過30微米。

88.根據(jù)項(xiàng)87所述的多個(gè)顆粒，其中所述平均粒度不超過1.5微米。

89.根據(jù)項(xiàng)88所述的多個(gè)顆粒，其中所述平均粒度不超過1.1微米。

90.根據(jù)項(xiàng)89所述的多個(gè)顆粒，其中所述平均粒度不超過0.6微米。

91.根據(jù)項(xiàng)90所述的多個(gè)顆粒，其中所述平均粒度不超過0.5微米。

92.根據(jù)項(xiàng)81-91中任一項(xiàng)所述的多個(gè)顆粒，其中所述水凝膠包括丙烯酰胺聚合物。

93.根據(jù)項(xiàng)81-92中任一項(xiàng)所述的多個(gè)顆粒，其中所述多個(gè)顆粒的顆粒具有至少60％的平均孔隙率。

94.一種系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：

孔陣列，所述孔陣列的至少一個(gè)孔與ISFET傳感器可操作地連接；和

具有不超過5％的變異系數(shù)的多個(gè)水凝膠顆粒，所述多個(gè)水凝膠顆粒中的至少一個(gè)水凝膠顆粒設(shè)置在所述孔陣列的孔中。

95.通過包括下述步驟的方法形成的多個(gè)顆粒：

在水性懸浮液內(nèi)的分散相中，使具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的親水性單體的多個(gè)聚體單元聚合，由此形成包括多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)的聚合物顆粒；和

將所述聚合物顆粒轉(zhuǎn)換為水凝膠顆粒。

96.根據(jù)項(xiàng)95所述的多個(gè)顆粒，其中所述多個(gè)顆粒具有不超過5.0％的變異系數(shù)。

97.根據(jù)項(xiàng)96所述的多個(gè)顆粒，其中所述變異系數(shù)不超過4.0％。

98.根據(jù)項(xiàng)97所述的多個(gè)顆粒，其中所述變異系數(shù)不超過3.5％。

99.根據(jù)項(xiàng)98所述的多個(gè)顆粒，其中所述變異系數(shù)不超過3.0％。

100.根據(jù)項(xiàng)95-99中任一項(xiàng)所述的多個(gè)顆粒，其中所述多個(gè)顆粒具有不超過100微米的平均粒度。

101.根據(jù)項(xiàng)100所述的多個(gè)顆粒，其中所述平均粒度不超過30微米。

102.根據(jù)項(xiàng)101所述的多個(gè)顆粒，其中所述平均粒度不超過5微米。

103.根據(jù)項(xiàng)102所述的多個(gè)顆粒，其中所述平均粒度不超過1.5微米。

104.根據(jù)項(xiàng)103所述的多個(gè)顆粒，其中所述平均粒度不超過0.8微米。

105.根據(jù)項(xiàng)95-104中任一項(xiàng)所述的多個(gè)顆粒，其中所述親水性單體包括丙烯酰胺單體。

106.根據(jù)項(xiàng)95-105中任一項(xiàng)所述的多個(gè)顆粒，其中所述多個(gè)顆粒的顆粒具有至少60％的平均孔隙率。

107.一種包含丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑的水性混合物的組合物，所述丙烯酰胺單體具有疏水性保護(hù)基團(tuán)，所述單體和交聯(lián)劑以在15:1至1:2范圍內(nèi)的單體:交聯(lián)劑的質(zhì)量比包括。

108.根據(jù)項(xiàng)107所述的組合物，其中所述交聯(lián)劑是二乙烯基交聯(lián)劑。

109.根據(jù)項(xiàng)108所述的組合物，其中所述二乙烯基交聯(lián)劑包括二丙烯酰胺。

110.根據(jù)項(xiàng)109所述的組合物，其中所述二丙烯酰胺包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)雙(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(2-羥丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、其受保護(hù)的衍生物，或其組合。

111.根據(jù)項(xiàng)110所述的組合物，其中所述二丙烯酰胺包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)雙(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、N,N’-(乙烷-1,2-二基)雙(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、甲硅烷基-保護(hù)的N-[2-(丙烯酰氨基)-1,2-二羥乙基]丙烯酰胺例如N,N’(2,3-雙((三乙基甲硅烷基)氧基)丁烷-1,4-二基)二丙烯酰胺，或其組合。

112.根據(jù)項(xiàng)108所述的組合物，其中所述二乙烯基交聯(lián)劑包括二甲基丙烯酸乙二醇酯、二乙烯基苯、六亞甲基雙丙烯酰胺、三甲基丙烯酸三羥甲基丙烷酯，或其組合。

113.根據(jù)項(xiàng)107-112中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述比率在10:1至1:1的范圍內(nèi)。

114.一種測序多核苷酸的方法，所述方法包括：

提供包括孔陣列的裝置，至少一個(gè)孔與ISFET可操作地連接，并且包括通過根據(jù)項(xiàng)1-80中任一項(xiàng)所述的方法形成的顆粒，所述顆粒附著至多核苷酸，

將包括預(yù)定類型的核苷酸的溶液施加于所述裝置；和

觀測對(duì)所述施加溶液的離子應(yīng)答。

115.一種用于核苷酸摻入的方法，所述方法包括：

提供通過根據(jù)項(xiàng)1-80中任一項(xiàng)所述的方法形成的顆粒，所述顆粒附著至包括與引物雜交的模板核酸的核酸雙鏈體，所述雙鏈體與聚合酶結(jié)合；

使所述顆粒與一種或多種核苷酸接觸；和

使用所述聚合酶將至少一種核苷酸摻入所述引物的末端上。

116.根據(jù)項(xiàng)115所述的方法，其中所述摻入還包括生成核苷酸摻入的副產(chǎn)物。

117.根據(jù)項(xiàng)115或116所述的方法，所述方法還包括通過使用場效應(yīng)晶體管(FET)檢測所述副產(chǎn)物來檢測所述摻入。

118.一種形成顆粒的方法，所述方法包括：

促進(jìn)種子顆粒在水性懸浮液中形成分散相；

在所述分散相中，使具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的親水性單體的多個(gè)聚體單元聚合，由此形成包括多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)的聚合物顆粒；和

將所述聚合物顆粒轉(zhuǎn)換為水凝膠顆粒。

119.一種形成顆粒的方法，所述方法包括：

提供在水性懸浮液中的種子顆粒，所述種子顆粒包括疏水性聚合物；

促進(jìn)所述種子顆粒在所述水性懸浮液中形成分散相；

在所述分散相中，使具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的親水性單體的多個(gè)聚體單元聚合，由此形成包括具有多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)的親水性聚合物的聚合物顆粒，所述聚合物顆粒包括所述疏水性聚合物；

從所述親水性聚合物中切割所述多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)；和

從所述聚合物顆粒中提取所述疏水性聚合物，形成水凝膠顆粒。

120.一種顆粒群體，所述顆粒群體具有不超過5％的變異系數(shù)并且包括由羥烷基丙烯酰胺和二丙烯酰胺聚合形成的聚合物，所述二丙烯酰胺包括羥基，其中當(dāng)暴露于水時(shí)，所述顆粒吸收基于所述聚合物重量至少300重量％的水。

121.根據(jù)項(xiàng)120所述的顆粒，其中當(dāng)暴露于水時(shí)，所述顆粒吸收基于所述聚合物重量至少1000重量％的水。

122.根據(jù)項(xiàng)120或121所述的顆粒，其中所述顆粒具有不超過100微米的粒度。

123.根據(jù)項(xiàng)122所述的顆粒，其中所述粒度不超過30微米。

124.根據(jù)項(xiàng)123所述的顆粒，其中所述粒度不超過1.5微米。

125.根據(jù)項(xiàng)120-124中任一項(xiàng)所述的顆粒，其中所述羥烷基丙烯酰胺包括羥乙基丙烯酰胺。

126.根據(jù)項(xiàng)120-125中任一項(xiàng)所述的顆粒，其中所述羥烷基丙烯酰胺包括N-[三(羥甲基)甲基)丙烯酰胺、N-(羥甲基)丙烯酰胺，或其組合。

127.根據(jù)項(xiàng)120-126中任一項(xiàng)所述的顆粒，其中所述二丙烯酰胺包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)雙(2-羥乙基)丙烯酰胺、N,N’-(2-羥丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、其受保護(hù)的衍生物，或其組合。

附圖說明

通過參考附圖，本公開內(nèi)容可得到更好理解，并且它的眾多特征和優(yōu)點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員變得顯而易見。

圖1包括用于制造示例性聚合物顆粒的示例性流程的舉例說明。

圖2包括利用聚合物顆粒的示例性測序方法的舉例說明。

在不同附圖中的相同參考符號(hào)的使用指示相似或相同項(xiàng)。

具體實(shí)施方式

在示例性實(shí)施方式中，形成聚合物顆粒的方法包括在水性懸浮液內(nèi)的分散相中，使具有由疏水性保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的親水性官能團(tuán)的單體的多個(gè)聚體單元聚合。聚合形成包括多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)的聚合物顆粒。該方法還包括將聚合物顆粒轉(zhuǎn)換為親水性顆粒，例如水凝膠顆粒。在一個(gè)例子中，單體包括親水性可自由基聚合單體，例如親水性基于乙烯基的單體，特別是丙烯酰胺。單體是包括由疏水性保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的親水性官能團(tuán)的親水性單體。例如，疏水性保護(hù)基團(tuán)可包括甲硅烷基官能團(tuán)或其衍生物。聚合還可包括在交聯(lián)劑的存在下聚合，所述交聯(lián)劑例如乙烯基交聯(lián)劑，包括示例性二丙烯酰胺交聯(lián)劑。交聯(lián)劑可以是具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的受保護(hù)的交聯(lián)劑。在一個(gè)例子中，將聚合物顆粒轉(zhuǎn)換為親水性顆粒可包括從聚合物顆粒中去除疏水性保護(hù)基團(tuán)的至少一部分。特別地，疏水性保護(hù)基團(tuán)可以是酸可切割的保護(hù)基團(tuán)，并且去除疏水性保護(hù)基團(tuán)可包括從聚合物顆粒中酸切割疏水性保護(hù)基團(tuán)。

通過此類方法制備的示例性聚合物顆?？删哂衅谕拇笮』蜃儺愊禂?shù)。特別地，聚合物顆?？梢允怯H水的。例如，聚合物顆?？砂ㄋz顆粒。此外，聚合物顆?？删哂胁怀^100μm，例如不超過30μm、不超過3μm、或不超過2μm的平均粒度。聚合物顆?？删哂胁怀^15％，例如不超過5％的變異系數(shù)。

特別地，此類顆?？捎糜诓东@靶分析物例如多核苷酸。在一個(gè)例子中，聚合物顆?？捎糜谑褂蒙婕肮鈾z測的測序方法或涉及離子檢測的測序方法來測序多核苷酸。

在特定實(shí)施方式中，分散相在水性懸浮液內(nèi)形成。分散相優(yōu)選是疏水的。在一個(gè)例子中，分散相由于促進(jìn)種子顆粒例如疏水性種子顆粒而形成，以獲得分散相。促進(jìn)有利于種子顆粒中疏水性組分的吸收。

具有可去除的疏水性保護(hù)基團(tuán)的單體更喜歡分散相。單體在分散相內(nèi)聚合。任選地，交聯(lián)劑與在分散相內(nèi)的單體聚合。在其中分散相由種子顆粒例如疏水性種子顆粒形成的一個(gè)例子中，可去除與種子顆粒結(jié)合的聚合物。例如，種子顆粒的聚合物可使用溶劑溶解，并且可從聚合物顆粒中提取。

疏水性保護(hù)基團(tuán)可例如通過從聚合物顆粒中切割疏水性保護(hù)基團(tuán)的至少一部分而去除。因此，形成親水性顆粒例如水凝膠顆粒。

在一個(gè)例子中，可活化所得的親水性顆粒，以有利于與靶分析物例如多核苷酸的綴合。例如，切割疏水性保護(hù)基團(tuán)可在親水性顆粒上留下親水性官能團(tuán)，例如羥基、氨基、硫醇基或其組合。在特定例子中，羥基可通過將羥基轉(zhuǎn)換為磺酸酯基團(tuán)或氯得到活化?；撬狨ス倌軋F(tuán)或氯可使用親核取代進(jìn)行取代或替換。特別地，具有親核末端基團(tuán)例如胺或硫醇基的寡核苷酸可通過磺酸酯基團(tuán)或氯的親核取代而附著至親水性顆粒。此類顆粒可特別用于捕獲在測序技術(shù)中使用的多核苷酸。

在另一個(gè)例子中，磺酸化顆粒還可與單官能或多官能單親核試劑或多親核試劑反應(yīng)，所述親核試劑可形成與顆粒的附著，同時(shí)維持關(guān)于包含親電基團(tuán)例如馬來酰亞胺的寡核苷酸的親核活性。另外，殘留親核活性可通過附著至包含多親電基團(tuán)的試劑而轉(zhuǎn)換為親電活性，所述多親電基團(tuán)隨后附著至包含親核基團(tuán)的寡核苷酸。

其他綴合技術(shù)包括在顆粒合成過程中使用包含在羧酸上的疏水性保護(hù)基團(tuán)的單體。羧酸基團(tuán)的脫保護(hù)使得可獲得羧酸基團(tuán)，所述羧酸基團(tuán)還可與具有親核基團(tuán)例如胺的寡核苷酸反應(yīng)或促使寡核苷酸附著。

其他綴合技術(shù)包括在顆粒合成過程中使用包含在胺上的疏水性保護(hù)基團(tuán)的單體。胺基的脫保護(hù)使得可獲得親核基團(tuán)，所述親核基團(tuán)還可用胺反應(yīng)性雙官能雙親電試劑修飾，所述修飾獲得在附著至聚合物顆粒后的單官能親電基團(tuán)。此類親電基團(tuán)可與具有親核基團(tuán)例如胺或硫醇的寡核苷酸反應(yīng)，促使通過與空親電體反應(yīng)的寡核苷酸附著。

如圖1中所示，方法100包括提供種子顆粒102。將單體加入懸浮液中，并且優(yōu)選位于由促進(jìn)的種子顆粒形成的分散相104中。使單體和任選的交聯(lián)劑聚合，形成聚合物顆粒108。聚合物顆粒108可剝?nèi)シN子聚合物，形成聚合物顆粒110。去除聚合物顆粒110上的疏水性保護(hù)基團(tuán)，形成親水性顆粒112?？苫罨H水性顆粒112，形成綴合顆粒114。

種子顆粒102可包括種子聚合物。在一個(gè)例子中，種子聚合物是疏水的。特別地，種子聚合物可包括苯乙烯類聚合物、丙烯酸類聚合物、丙烯酰胺、另一種疏水的乙烯基聚合物，或其任何組合。在一個(gè)例子中，種子顆粒102是單分散的，例如具有不超過20％的變異系數(shù)。變異系數(shù)(CV)定義為標(biāo)準(zhǔn)偏差除以平均值乘以100，其中“平均值”是平均粒子直徑，并且標(biāo)準(zhǔn)偏差是粒度的標(biāo)準(zhǔn)偏差。作為另外一種選擇，“平均值”可以是z-平均值或模式粒徑。依照通常實(shí)踐，CV在主模式即主峰上進(jìn)行計(jì)算，從而排除與聚集體相關(guān)的小峰。因此，低于或高于模式大小的一些顆?？稍谟?jì)算中不計(jì)算，所述計(jì)算可例如基于可檢測顆粒的總粒子數(shù)的約90％。此類CV測定可在CPS圓盤式離心機(jī)上執(zhí)行。特別地，種子顆粒102群體可具有不超過10％，例如不超過5.0％、不超過3.5％、不超過3％、不超過2.5％、不超過2％、或甚至不超過1.0％的變異系數(shù)。此外，種子顆粒102可具有不超過0.6μm的初始粒度。例如，初始粒度可以是不超過0.45μm，例如不超過0.35μm、或甚至不超過0.15μm。作為另外一種選擇，具有至少3μm，例如至少5μm、至少10μm、至少20μm、或至少50μm的初始粒度的更大種子顆?？捎糜谛纬筛蟮木酆衔镱w粒。在一個(gè)例子中，初始粒度可以是不超過100μm。

種子顆粒102可在水性懸浮液內(nèi)得到促進(jìn)，形成促進(jìn)的分散相104。特別地，促進(jìn)種子顆粒包括使溶劑和促進(jìn)劑與種子顆粒一起在水性懸浮液內(nèi)混合，形成分散相。促進(jìn)的種子顆粒更容易吸收疏水性組分。溶劑可以是與水混溶的。例如，溶劑可包括醛或酮，例如甲醛、丙酮、甲基乙基酮、二異丙基酮、二甲基甲酰胺或其組合；醚溶劑例如四氫呋喃、二甲醚或其組合；酯溶劑；雜環(huán)溶劑例如吡啶、二噁烷、四氫糠醇、N-甲基-2-吡咯烷酮或其組合；或其組合。在一個(gè)例子中，溶劑可包括酮例如丙酮。在另一個(gè)例子中，溶劑可包括醚溶劑例如四氫呋喃。在另外的例子中，溶劑可包括雜環(huán)溶劑例如吡啶。

促進(jìn)劑或促進(jìn)試劑可以是疏水的，并且具有低水溶性例如在25℃下不超過0.01g/l的水溶性。例如，促進(jìn)劑可包括二辛酰過氧化物、己二酸二辛酯、鄰苯二甲酸正丁酯、十二醇、分子量低于20kD的聚苯乙烯或其組合。在一個(gè)例子中，二辛酰過氧化物還可表現(xiàn)為聚合反應(yīng)的引發(fā)劑。促進(jìn)劑還可以是低分子量聚苯乙烯，其例如使用低單體/引發(fā)劑比率在分開的聚合步驟中，或在種子聚合過程中添加鏈轉(zhuǎn)移試劑而制備。促進(jìn)劑一般在高壓勻化器中乳化。

水性懸浮液還可包括表面活性劑。表面活性劑可以是離子表面活性劑、兩性表面活性劑、或非離子表面活性劑。離子表面活性劑可以是陰離子表面活性劑。在另一個(gè)例子中，離子表面活性劑可以是陽離子表面活性劑。示例性陰離子表面活性劑包括硫酸鹽表面活性劑、磺酸鹽表面活性劑、磷酸鹽表面活性劑、羧酸鹽表面活性劑或其任何組合。示例性硫酸鹽表面活性劑包括烷基硫酸鹽，例如月桂基硫酸銨、月桂基硫酸鈉(十二烷基硫酸鈉，(SDS))，或其組合；烷基醚硫酸鹽，例如月桂基聚醚硫酸鈉、肉豆蔻醇聚醚硫酸鈉或其任何組合；或其任何組合。示例性磺酸鹽表面活性劑包括烷基磺酸鹽例如十二烷基磺酸鈉；多庫酯鈉例如磺基琥珀酸鈉二辛酯；烷基芐基磺酸鹽；或其任何組合。示例性磷酸鹽表面活性劑包括烷基芳基醚磷酸鹽、烷基醚磷酸鹽或其任何組合。示例性羧酸表面活性劑包括烷基羧酸鹽，例如脂肪酸鹽或硬脂酸鈉；月桂酰肌氨酸鈉；膽汁酸鹽例如脫氧膽酸鈉；或其任何組合。

示例性陽離子表面活性劑包括伯胺、仲胺或叔胺，季銨表面活性劑或其任何組合。示例性季銨表面活性劑包括烷基三甲銨鹽例如十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)或十六烷基三甲基氯化銨(CTAC)；西吡氯銨(CPC)；聚乙氧基化牛油胺(POEA)；苯扎氯銨(BAC)；芐索氯銨(BZT)；5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷；雙十八烷基二甲基氯化銨；雙十八烷基二甲基溴化銨(DODAB)；或其任何組合。

示例性兩性表面活性劑包括具有磺酸鹽、羧酸鹽或磷酸鹽陰離子的伯胺、仲胺或叔胺，或季銨陽離子。示例性磺酸鹽兩性表面活性劑包括(3-[(3-膽酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸鹽)；磺基甜菜堿(sultaine)例如椰油酰胺丙基羥基磺基甜菜堿；或其任何組合。示例性羧酸兩性表面活性劑包括氨基酸、亞氨酸、甜菜堿例如椰油酰胺丙基甜菜堿或其任何組合。示例性磷酸鹽兩性表面活性劑包括卵磷脂。在進(jìn)一步的例子中，表面活性劑可以是非離子表面活性劑例如基于聚乙二醇的表面活性劑。

回到圖1，加入懸浮液中的單體優(yōu)選天然位于由促進(jìn)的種子顆粒形成的分散相104中。交聯(lián)劑例如疏水性交聯(lián)劑也可加入水性懸浮液中，并且可優(yōu)先位于分散相中。在一個(gè)例子中，交聯(lián)劑具有不超過10g/l的水溶性。此外，致孔劑(porogen)可加入水性懸浮液中，并且可優(yōu)先位于分散相中。在進(jìn)一步的例子中，分散相可包括丙烯酸亞磷酰胺(acrydite)寡核苷酸，例如離子交換的丙烯酸亞磷酰胺寡核苷酸。如圖1中所示，使單體和任選的交聯(lián)劑聚合以形成聚合物顆粒108。

單體可以是可自由基聚合的單體例如基于乙烯基的單體。特別地，單體可包括與疏水性保護(hù)基團(tuán)偶聯(lián)的親水性單體。在一個(gè)例子中，親水性單體可包括丙烯酰胺、乙酸乙烯酯、甲基丙烯酸羥烷基酯或其任何組合。在特定例子中，親水性單體是丙烯酰胺，例如包括羥基、氨基、羧基或其組合的丙烯酰胺。在一個(gè)例子中，親水性單體是氨基烷基丙烯酰胺、由胺封端的聚丙二醇官能化的丙烯酰胺(下文所示的C)、丙烯?；哙?下文所示的D)，或其組合。在另一個(gè)例子中，丙烯酰胺可以是羥烷基丙烯酰胺，例如羥乙基丙烯酰胺。特別地，羥烷基丙烯酰胺可包括N-三(羥甲基)甲基)丙烯酰胺(下文所示的A)、N-(羥甲基)丙烯酰胺(下文所示的B)，或其組合。在進(jìn)一步的例子中，可使用單體的混合物，例如羥烷基丙烯酰胺和胺官能化的丙烯酰胺的混合物，或丙烯酰胺和胺官能化的丙烯酰胺的混合物。在一個(gè)例子中，胺官能化的丙烯酰胺可以在100:1至1:1的范圍(例如100:1至2:1的范圍、50:1至3:1的范圍、50:1至5:1的范圍、或甚至50:1至10:1的范圍)內(nèi)的羥烷基丙烯酰胺:胺官能化的丙烯酰胺或丙烯酰:胺官能化的丙烯酰胺的比率包括。

在特定例子中，親水性單體包括羥基或包括胺。疏水性保護(hù)基團(tuán)例如通過與羥基或胺基鍵合來屏蔽單體的親水性。當(dāng)與羥基鍵合時(shí)，此類保護(hù)基團(tuán)在本文中被稱為羥基保護(hù)基團(tuán)或氫氧基保護(hù)基團(tuán)。特別地，疏水性保護(hù)基團(tuán)可例如通過切割例如酸切割去除。疏水性基團(tuán)可選擇為在酸性條件下切割，所述切割不導(dǎo)致潛在聚合物或其一部分的水解。例如，對(duì)于低于6的pH值，當(dāng)丙烯酰胺聚合物存在時(shí)，疏水性保護(hù)基團(tuán)在比丙烯酰胺的酰胺部分水解的pH高的pH下切割。對(duì)于高于9的pH值，疏水性保護(hù)基團(tuán)在比丙烯酰胺的酰胺部分水解的pH低的pH下切割。

示例性疏水性保護(hù)基團(tuán)包括有機(jī)金屬部分。例如，有機(jī)金屬部分可形成甲硅烷基醚官能團(tuán)。甲硅烷基醚官能團(tuán)可源自鹵代甲硅烷基化合物，例如通式R₁Si(R₂)(R₃)(R₄)的化合物，其中R₁是鹵素，例如氯，并且R₂、R₃和R₄獨(dú)立地選自氫，烷基例如甲基、乙基、丙基、丁基、芳基、甲硅烷基、其醚衍生物或其任何組合。示例性甲硅烷基醚官能團(tuán)源自叔丁基二甲基氯硅烷、三甲基氯硅烷、三乙基氯硅烷、三丙基氯硅烷、三丁基氯硅烷、二苯基甲基氯硅烷、氯(二甲基)苯基硅烷，或其組合。在特定例子中，受保護(hù)單體包括N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺或tBDMS-HEAM、N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺或TES-HEAM或其組合。在另一個(gè)例子中，疏水性保護(hù)基團(tuán)可包括有機(jī)部分。示例性有機(jī)部分可包括烷氧羰基部分，例如叔丁氧羰基、芴基甲氧羰基或其組合。在一個(gè)例子中，此類有機(jī)部分可以是與胺官能團(tuán)例如胺官能化的丙烯酰胺或其共聚物的胺官能團(tuán)結(jié)合的疏水性保護(hù)基團(tuán)。

受保護(hù)單體可以相對(duì)于初始種子聚合物作為在100:1至1:2的范圍(例如50:1至1:1的范圍、45:1至2:1的范圍、30:1至5:1的范圍、或甚至20:1至8:1的范圍)內(nèi)的重量比(受保護(hù)單體:種子聚合物)表示的量包括。作為另外一種選擇，單體可以在10:1至1:2的范圍，例如5:1至1:2的范圍，或甚至在2:1至1:2的范圍內(nèi)的量包括。

分散相還可包括交聯(lián)劑。在一個(gè)例子中，交聯(lián)劑以在15:1至1:2的范圍(例如10:1至1:1的范圍、6:1至1:1的范圍、或甚至4:1至1:1的范圍)內(nèi)的受保護(hù)單體與交聯(lián)劑的質(zhì)量比包括。交聯(lián)劑可具有低水溶性(例如小于10g/l)，導(dǎo)致對(duì)于分散相的優(yōu)先。特別地，交聯(lián)劑可以是二乙烯基交聯(lián)劑。例如，二乙烯基交聯(lián)劑可包括二丙烯酰胺，例如N,N’-(乙烷-1,2-二基)雙(2-羥乙基)丙烯酰胺、N,N’-(2-羥丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺或其組合。在另一個(gè)例子中，二乙烯基交聯(lián)劑包括二甲基丙烯酸乙二醇酯、二乙烯基苯、六亞甲基雙丙烯酰胺、三甲基丙烯酸三羥甲基丙烷酯、其受保護(hù)的衍生物，或其組合。在進(jìn)一步的例子中，交聯(lián)劑可由疏水性保護(hù)基團(tuán)例如羥基保護(hù)基團(tuán)加以保護(hù)。特別地，疏水性保護(hù)基團(tuán)可以是有機(jī)金屬部分。例如，有機(jī)金屬部分可形成甲硅烷基醚官能團(tuán)。示例性甲硅烷基醚官能團(tuán)可源自叔丁基二甲基氯硅烷、三甲基氯硅烷、三乙基氯硅烷、三丙基氯硅烷、三丁基氯硅烷、二苯基甲基氯硅烷、氯(二甲基)苯基硅烷，或其組合。示例性受保護(hù)的二丙烯酰胺交聯(lián)劑包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)雙(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、N,N’-(乙烷-1,2-二基)雙(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、甲硅烷基保護(hù)的N-[2-(丙烯酰氨基)-1,2-二羥乙基]丙烯酰胺例如N,N’(2,3-雙((三乙基甲硅烷基)氧基)丁烷-1,4-二基)二丙烯酰胺，或其組合。在另一個(gè)例子中，保護(hù)基團(tuán)可包括烷氧羰基部分，例如叔丁氧羰基、芴基甲氧羰基或其組合。特別地，包括羥基的交聯(lián)劑可由保護(hù)基團(tuán)例如上文與受保護(hù)單體相關(guān)描述的保護(hù)基團(tuán)加以保護(hù)。

另外，使具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的親水性單體聚合可包括在致孔劑的存在下聚合。示例性致孔劑包括芳香族致孔劑。在一個(gè)例子中，芳香族致孔劑包括苯、甲苯、二甲苯、均三甲苯、乙酸苯乙酯、己二酸二乙酯、乙酸己酯、苯甲酸乙酯、乙酸苯酯、乙酸丁酯，或其組合。致孔劑通常具有15-20的溶解度參數(shù)。在另一個(gè)例子中，致孔劑是烷醇致孔劑例如十二醇。致孔劑可以相對(duì)于在反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)的有機(jī)相在1重量％至99重量％的范圍(例如30重量％至90重量％的范圍或甚至50重量％至85重量％的范圍)內(nèi)的量包括。

單體選自以其無保護(hù)形式產(chǎn)生水凝膠的一組單體，使得寡核苷酸和聚合酶可在使用過程中到達(dá)其靶。

親水性丙烯酰胺和尤其是二丙烯酰胺難以在這樣的溶劑中溶解，所述溶劑與水不混溶并且同時(shí)溶解疏水性種子聚合物。關(guān)于單體和交聯(lián)劑兩者的保護(hù)基團(tuán)可這樣選擇，使得單體在疏水相中的溶解度足夠大，以實(shí)現(xiàn)足夠大的濃度以進(jìn)行聚合。同時(shí)，保護(hù)基團(tuán)可以不大得使得聚合由于立體阻礙而無法進(jìn)行。脫保護(hù)可在不水解聚合物的條件下進(jìn)行。

任選地，可包括聚合引發(fā)劑。示例性聚合引發(fā)劑可通過自由基生成而引發(fā)聚合。示例性聚合引發(fā)劑包括偶氮引發(fā)劑例如油溶性偶氮引發(fā)劑。另一種引發(fā)劑可包括過硫酸銨。進(jìn)一步的示例性引發(fā)劑可包括四甲基乙二胺。在一個(gè)例子中，聚合引發(fā)劑可以基于分散相重量0.001重量％至3重量％的量包括。

在聚合后，聚合物顆粒108可剝?nèi)シN子聚合物，形成仍具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的聚合物顆粒110。例如，種子聚合物可使用溶劑提取，所述溶劑例如醛或酮例如丙酮、甲基乙基酮、二異丙基酮、乙酸丁酯、環(huán)己酮、二甲基甲酰胺或其組合；鄰苯二甲酸酯溶劑例如鄰苯二甲酸正丁酯；醚溶劑例如四氫呋喃、二異丙醚、甲基叔丁醚、二甲醚、二乙醚或其組合；酯溶劑例如乙酸乙酯、乙酸丁酯或其組合；雜環(huán)溶劑例如吡啶、二噁烷、四氫糠醇或其組合；鹵代溶劑例如二氯甲烷、氯仿或其組合。作為另外一種選擇，種子聚合物可在聚合物顆粒轉(zhuǎn)換為親水性顆粒后進(jìn)行提取。例如，種子聚合物可在使顆粒聚合物脫保護(hù)，例如去除聚合物上起因于受保護(hù)單體的甲硅烷基后進(jìn)行提取。

如圖1中所示，一旦提取種子聚合物，聚合物顆粒110就可通過去除疏水性保護(hù)基團(tuán)的至少一部分而轉(zhuǎn)換為親水性聚合物顆粒。例如，疏水性保護(hù)基團(tuán)可從聚合物顆粒中酸切割。特別地，此類去除可從聚合物顆粒中去除基本上所有疏水性保護(hù)基團(tuán)，例如去除至少80％的疏水性保護(hù)基團(tuán)，或甚至至少90％的疏水性保護(hù)基團(tuán)。

在一個(gè)例子中，疏水性保護(hù)基團(tuán)通過添加酸例如有機(jī)酸進(jìn)行酸切割。特別地，有機(jī)酸可具有在3.0至5.5的范圍內(nèi)的pKa。例如，有機(jī)酸可包括乙酸、乳酸、檸檬酸或其任何組合。作為另外一種選擇，可使用無機(jī)酸。

一旦去除疏水性保護(hù)基團(tuán)的至少一部分，就形成親水性顆粒112。親水性顆粒112可以是水凝膠顆粒。水凝膠是可吸收其重量至少20％的水，例如其重量至少45％、至少65％、至少85％、至少100％、至少300％、至少1000％、至少1500％或甚至至少2000％的水的聚合物。

可活化親水性聚合物112，以有利于與靶分析物例如多核苷酸的綴合。例如，可增強(qiáng)在親水性顆粒112上的官能團(tuán)，以允許與靶分析物或分析物受體的結(jié)合。在特定例子中，親水性聚合物的官能團(tuán)可用能夠?qū)⒂H水性聚合物官能團(tuán)轉(zhuǎn)換為反應(yīng)部分的試劑進(jìn)行修飾，所述反應(yīng)部分可經(jīng)歷親核或親電取代。例如，親水性顆粒112上的羥基可通過將羥基的至少一部分替換為磺酸酯基團(tuán)或氯進(jìn)行活化。示例性磺酸酯基團(tuán)可源自三氟乙基磺酰氯、甲磺酰氯、對(duì)甲苯磺酰氯或4-氟苯磺酰氯(fosyl chloride)、或其任何組合。磺酸酯可作用于允許親核體替換磺酸酯。磺酸酯還可與釋放的氯反應(yīng)，以提供可在過程中用于綴合顆粒的氯化基團(tuán)。在另一個(gè)例子中，可活化在親水性聚合物112上的胺基。

例如，靶分析物或分散物受體可通過由磺酸酯基團(tuán)的親核取代而與親水性聚合物結(jié)合。在特定例子中，由親核體例如胺或硫醇封端的靶分析物受體可經(jīng)歷親核取代，以替換親水性聚合物112的表面上的磺酸酯基團(tuán)。由于活化，可形成綴合顆粒114。

在另一個(gè)例子中，磺酸化顆粒還可與單官能或多官能單親核試劑或多親核試劑反應(yīng)，所述親核試劑可形成與顆粒的附著，同時(shí)維持對(duì)包含親電基團(tuán)例如馬來酰亞胺的寡核苷酸的親核活性。另外，殘留親核活性可通過附著至包含多親電基團(tuán)的試劑而轉(zhuǎn)換為親電活性，所述多親電基團(tuán)隨后附著至包含親核基團(tuán)的寡核苷酸。

在另一個(gè)例子中，含有官能團(tuán)的單體可在聚合過程中添加。單體可包括例如含有羧酸、酯、鹵素或其他胺反應(yīng)基團(tuán)的丙烯酰胺。酯基團(tuán)可在與胺寡核苷酸反應(yīng)前水解。

其他綴合技術(shù)包括在顆粒合成過程中使用包含在胺上的疏水性保護(hù)基團(tuán)的單體。胺基的脫保護(hù)使得可獲得親核基團(tuán)，所述親核基團(tuán)還可用胺反應(yīng)性雙官能雙親電試劑修飾，所述修飾獲得在附著至聚合物顆粒后的單官能親電基團(tuán)。此類親電基團(tuán)可與具有親核基團(tuán)例如胺或硫醇的寡核苷酸反應(yīng)，促使通過與空親電體反應(yīng)的寡核苷酸附著。

如果顆粒112由氨基和羥基丙烯酰胺的組合制備，則水凝膠顆粒的脫保護(hù)導(dǎo)致親核氨基和中性羥基的組合。氨基可由二官能雙親電部分例如二異氰酸酯或雙-NHS酯進(jìn)行修飾，導(dǎo)致與親核體反應(yīng)的親水性顆粒。示例性雙-NHS酯包括雙琥珀酰亞胺C2-C12烷基酯，例如雙琥珀酰亞胺辛二酸酯或雙琥珀酰亞胺戊二酸酯。

其他活化化學(xué)包括摻入多步以轉(zhuǎn)化特定官能團(tuán)，以容納特定所需連接。例如，磺酸酯修飾的羥基可通過幾種方法轉(zhuǎn)化成親核基團(tuán)。在一個(gè)例子中，磺酸酯與疊氮化物陰離子的反應(yīng)獲得疊氮化物取代的親水聚合物。疊氮化物可經(jīng)由“CLICK”化學(xué)直接用于與乙炔取代的生物分子綴合，所述“CLICK”化學(xué)可伴隨或不伴隨銅催化進(jìn)行。任選地，疊氮化物可通過例如與氫的催化還原或與有機(jī)膦的還原而轉(zhuǎn)化為胺。所得的胺隨后可用多種試劑轉(zhuǎn)化為親電基團(tuán)，所述多種試劑例如二異氰酸酯、雙NHS酯、三聚氯氰或其組合。在一個(gè)例子中，使用二異氰酸酯獲得在聚合物和接頭之間的脲連接，所述脲連接導(dǎo)致能夠與氨基取代的生物分子反應(yīng)的殘留異氰酸酯基團(tuán)，以獲得在接頭和生物分子之間的脲連接。在另一個(gè)例子中，使用雙NHS酯獲得在聚合物和接頭之間的酰胺連接，和能夠與氨基取代的生物分子反應(yīng)的殘留的NHS酯基團(tuán)，以獲得在接頭和生物分子之間的酰胺連接。在進(jìn)一步的例子中，使用三聚氯氰(cyanuric chloride)獲得在聚合物和接頭之間的氨基-三嗪連接，和兩個(gè)殘留的氯-三嗪基團(tuán)，其中之一能夠與氨基取代的生物分子反應(yīng)，以獲得在接頭和生物分子之間的氨基-三嗪連接。其他親核基團(tuán)可經(jīng)由磺酸酯活化摻入顆粒內(nèi)。例如，磺酸化的顆粒與硫代苯甲酸陰離子的反應(yīng)和后續(xù)硫代苯甲酸酯的水解將硫醇摻入顆粒內(nèi)，所述顆粒可隨后與馬來酰亞胺取代的生物分子反應(yīng)，以獲得與生物分子的硫代-琥珀酰亞胺連接。硫醇還可與溴-乙酰基反應(yīng)。

作為另外一種選擇，丙烯酸亞磷酰胺寡核苷酸可在聚合過程中用于摻入寡核苷酸。示例性丙烯酸亞磷酰胺寡核苷酸可包括離子交換的寡核苷酸。

使用與在生物分子上的親核部分偶聯(lián)的在基底上的親電部分、或與在生物分子上的親電連接偶聯(lián)的在基底上的親核連接基團(tuán)，可在難熔性(refractory)基底或聚合基底上產(chǎn)生生物分子的共價(jià)連接。由于大多數(shù)常見目的生物分子的親水性性質(zhì)，對(duì)于這些偶聯(lián)選擇的溶劑是水或含一些水溶性有機(jī)溶劑的水，以便將生物分子分散到基底上。特別地，由于其聚陰離子性質(zhì)，多核苷酸一般在水系統(tǒng)中與基底偶聯(lián)。因?yàn)樗ㄟ^使親電體水解為失活部分用于綴合而與親核體競爭親電體，所以水性系統(tǒng)一般導(dǎo)致偶聯(lián)產(chǎn)物的低得率，其中得率基于該偶聯(lián)對(duì)的親電部分。當(dāng)期望反應(yīng)的對(duì)的親電部分的高得率時(shí)，需要高濃度的親核體以驅(qū)動(dòng)反應(yīng)并減輕水解，導(dǎo)致親核體的無效使用。在多核酸的情況下，磷酸鹽的金屬抗衡離子可替換為親脂抗衡離子，以便幫助生物分子溶解于極性、非反應(yīng)性、非水性溶劑中。這些溶劑可包括酰胺或脲，例如甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、乙酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、六甲基磷酰胺、吡咯烷酮、N-甲基吡咯烷酮、N,N,N’,N’-四甲基脲、N,N’-二甲基-N,N’-三亞甲基脲或其組合；碳酸酯；例如碳酸二甲基酯、碳酸亞丙基酯或其組合；醚例如四氫呋喃；亞砜和砜例如二甲基亞砜、二甲基砜或其組合；受阻醇例如叔丁醇；或其組合。親脂陽離子可包括四烷基銨或四芳基銨陽離子例如四甲基銨、四乙基銨、四丙基胺、四丁基銨、四戊基銨、四己基銨、四庚基銨、四辛基胺、以及其烷基和芳基混合物，四芳基鏻陽離子例如四苯基鏻，四烷基鉮或四芳基鉮例如四苯基鉮，以及三烷基锍陽離子例如三甲基锍或其組合。通過用親脂陽離子交換金屬陽離子將多核酸轉(zhuǎn)換成有機(jī)溶劑可溶性材料，可通過多種標(biāo)準(zhǔn)陽離子交換技術(shù)進(jìn)行。

在另一個(gè)例子中，顆?？墒褂萌闋钜壕酆霞夹g(shù)形成，其中疏水相在親水相內(nèi)形成分散相。上文描述的有利于疏水相的單體、交聯(lián)劑以及其他試劑和化合物趨于位于在其中發(fā)生聚合的疏水相中。

表面活性劑例如上文描述的表面活性劑可用于親水相中，以支持乳狀液形成。當(dāng)使用種子顆粒時(shí)，表面活性劑可以低于臨界膠束濃度的濃度使用。作為另外一種選擇，表面活性劑可以大于臨界膠束濃度的濃度使用。乳狀液聚合通常用水溶性引發(fā)劑如過硫酸鉀或過硫酸銨進(jìn)行。

通過將引發(fā)劑加入單體的加熱乳狀液中，顆粒成核在水相中開始，并且形成的顆粒通過表面活性劑得到穩(wěn)定。如果大多數(shù)顆粒在短時(shí)間段內(nèi)產(chǎn)生，則可產(chǎn)生單一尺寸的種子顆粒。因?yàn)閱误w通過水相從大單體小滴擴(kuò)散到小得多的種子顆粒內(nèi)，所以顆粒大小隨后發(fā)生增加。

特別地，上述方法可產(chǎn)生具有期望粒度和變異系數(shù)的多個(gè)顆粒。顆粒組可包括100,000個(gè)顆粒，例如500,000個(gè)顆粒、大于1百萬個(gè)顆粒、大于1千萬個(gè)顆?；蛏踔林辽?x10¹⁰。多個(gè)顆粒的顆粒可以是親水性聚合物顆粒，例如水凝膠顆粒。在特定例子中，水凝膠顆粒可以是丙烯酰胺顆粒，例如包括交聯(lián)的羥烷基丙烯酰胺聚合物或羥烷基(hydroalkyl)丙烯酰胺和胺官能化的丙烯酰胺的交聯(lián)共聚物的顆粒。在另一個(gè)例子中，顆?？梢允潜０泛桶饭倌芑谋０返慕宦?lián)共聚物。

該多個(gè)顆?？删哂衅谕牧６?，例如不超過100μm、不超過30μm、或不超過3μm的粒度。平均粒度是平均粒子直徑。例如，平均粒度可以是不超過2μm，例如不超過1.5μm、不超過1.1μm、不超過0.8μm、不超過0.6μm、不超過0.5μm、或甚至不超過0.3μm。在特定例子中，平均粒度可在0.1μm至100μm的范圍內(nèi)，例如0.1μm至50μm的范圍或0.1μm至1.1μm的范圍。在一些方面，上述方法提供了用于產(chǎn)生顆粒的技術(shù)優(yōu)點(diǎn)，所述顆粒具有在5μm至100μm的范圍，例如20μm至100μm的范圍或30μm至70μm的范圍內(nèi)的粒度。在其他方面，上述方法提供了用于產(chǎn)生具有不超過1.1μm的粒度的顆粒的技術(shù)優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)種子更大時(shí)，可形成更大的顆粒。顆粒的大小可基于種子顆粒的大小進(jìn)行調(diào)整。使用本發(fā)明的方法，聚合物顆粒的大小比使用其他方法時(shí)更不依賴于表面活性劑選擇和濃度。

此外，多個(gè)顆粒是單分散的，并且可具有期望的低變異系數(shù)，例如不超過20％的變異系數(shù)。如上，變異系數(shù)(CV)定義為標(biāo)準(zhǔn)偏差除以平均值乘以100，其中“平均值”是平均粒子直徑，并且標(biāo)準(zhǔn)偏差是粒度中的標(biāo)準(zhǔn)偏差。作為另外一種選擇，“平均值”可以是z-平均值或模式粒徑。依照通常實(shí)踐，CV在主模式即主峰上進(jìn)行計(jì)算，從而排除與聚集體相關(guān)的小峰。因此，低于或高于模式大小的一些顆粒可在計(jì)算中不計(jì)算，所述計(jì)算可例如基于可檢測顆粒的總粒子數(shù)的約90％。此類CV測定可在CPS圓盤式離心機(jī)或庫爾特粒度儀上執(zhí)行。例如，多個(gè)顆粒的變異系數(shù)(CV)可以是不超過15％，例如不超過10％、不超過5％、不超過4.5％、不超過4.0％、不超過3.5％、或甚至不超過3.0％。此類CV可無需過濾或其他尺寸排阻技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。

特別地，為了維持珠大小的低變異，在聚合過程中應(yīng)避免小滴的合并。該避免在水包油乳狀液中比油包水乳狀液中更容易實(shí)現(xiàn)，因?yàn)楦菀资蛊渲兴沁B續(xù)相的系統(tǒng)穩(wěn)定。然而，親水性單體不優(yōu)先位于油相中。

在進(jìn)一步的例子中，在水中的親水性聚合物顆粒可以是不超過50重量％聚合物，例如不超過30重量％聚合物、不超過20重量％聚合物、不超過10重量％聚合物、不超過5重量％聚合物、或甚至不超過2重量％聚合物。

在另外的例子中，聚合物顆?？删哂性试S蛋白質(zhì)和酶擴(kuò)散的孔隙率。在一個(gè)例子中，聚合物顆?？删哂性试S具有下述大小的蛋白質(zhì)擴(kuò)散的孔隙率：至少50千道爾頓，例如至少100千道爾頓、至少200千道爾頓、至少250千道爾頓、或甚至至少350千道爾頓。

在另一個(gè)例子中，當(dāng)綴合時(shí)，聚合物顆?？砂ㄖ辽?x 10⁴/μm³的多核苷酸密度，稱為核苷酸密度。例如，核苷酸密度可以是至少10⁵/μm³，例如至少10⁶/μm³、至少5x10⁶/μm³、至少8x10⁶/μm³、至少1x 10⁷/μm³、或甚至至少3x10⁷/μm³。在進(jìn)一步的例子中，核苷酸密度可以是不超過10¹⁵/μm³。

此類聚合物顆粒可用于多種分離技術(shù)和分析技術(shù)中。特別地，聚合物顆?？捎糜诮Y(jié)合多核苷酸。此類結(jié)合多核苷酸可用于從溶液中分離多核苷酸或可用于分析技術(shù)例如測序。在圖2中所示的具體例子中，此類聚合物顆粒可在測序技術(shù)過程中用作多核苷酸的載體。例如，此類親水性顆?？晒潭ǘ嗪塑账嵊糜谑褂脽晒鉁y序技術(shù)的測序。在另一個(gè)例子中，親水性顆?？晒潭ǘ嗪塑账岬亩鄠€(gè)拷貝用于使用離子感測技術(shù)的測序。

一般而言，聚合物顆?？蛇M(jìn)行處理，以包括生物分子，所述生物分子包括核苷、核苷酸、核酸(寡核苷酸和多核苷酸)、多肽、糖、多糖、脂質(zhì)或其衍生物或類似物。例如，聚合物顆粒可與生物分子結(jié)合或附著。生物分子的末端或任何中間部分都可與聚合物顆粒結(jié)合或附著。聚合物顆?？墒褂眠B接化學(xué)與生物分子結(jié)合或附著。連接化學(xué)包括共價(jià)或非共價(jià)鍵，包括離子鍵、氫鍵、親和鍵、偶極-偶極鍵、范德華鍵和疏水鍵。連接化學(xué)包括在結(jié)合配偶體之間，例如在下述物質(zhì)之間的親和力：抗生物素蛋白部分和生物素部分；抗原表位和抗體或其免疫反應(yīng)片段；抗體和半抗原；地高辛配基(digoxigen)部分和抗地高辛配基抗體；熒光素部分和抗熒光素抗體；操縱子和阻遏子；核酸酶和核苷酸；凝集素和多糖；類固醇和類固醇結(jié)合蛋白；活性化合物和活性化合物受體；激素和激素受體；酶和底物；免疫球蛋白和蛋白A；或者寡核苷酸或多核苷酸及其相應(yīng)互補(bǔ)體。

在一個(gè)例子中，聚合物顆粒可用于具有表面的系統(tǒng)中。該系統(tǒng)包括在表面上的一個(gè)或多個(gè)聚合物顆粒。表面可以是固體表面。表面可包括平面、凹或凸表面、或其任何組合。表面可包括紋理或特征，包括蝕刻、空穴化或隆起。表面可缺乏任何紋理或特點(diǎn)。表面可包括毛細(xì)管、通道、凹槽、孔或儲(chǔ)庫的內(nèi)壁。表面可以是網(wǎng)。表面可以是多孔、半多孔或非多孔的。表面可以是濾器或凝膠。表面可包括針(例如針陣列)的頂端。表面可由例如下述材料制備：玻璃、硼硅玻璃、二氧化硅、石英、熔融石英、云母、聚丙烯酰胺、塑料聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸酯(PMA)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、硅、鍺、石墨、陶瓷、硅、半導(dǎo)體、高折射率電解質(zhì)、晶體、凝膠、聚合物或薄膜(例如金、銀、鋁或鉆石的薄膜)。表面可包括具有金屬薄膜或金屬涂層的固體基底。表面是光學(xué)透明、最低限度反射、最低限度吸收的或顯示出低熒光。

表面可具有類似于含96、384、1536、3456或9600個(gè)孔的微量滴定板的尺度。表面可在任何一個(gè)尺度上是約1-20cm，在任何一個(gè)尺度上是約1-10cm，在任何一個(gè)尺度上是約0.10-1cm，或在任何一個(gè)尺度上是約0.001nm–1cm。表面(以及任何紋理或特點(diǎn))可通過納米構(gòu)造技術(shù)產(chǎn)生。

多個(gè)聚合物顆?？稍诒砻嫔弦噪S機(jī)或有序陣列排列，或以隨機(jī)和有序陣列的組合排列。有序陣列包括直線和六角形模式。表面可包括以隨機(jī)或有序陣列或兩者的組合排列的多個(gè)位點(diǎn)。一個(gè)或多個(gè)聚合物顆?？晌挥谝粋€(gè)位點(diǎn)、一些位點(diǎn)或所有位點(diǎn)處。一些位點(diǎn)可具有一個(gè)聚合物顆粒，并且其他位點(diǎn)可具有多個(gè)聚合物顆粒。至少一個(gè)位點(diǎn)可缺乏聚合物顆粒。在陣列中，至少兩個(gè)聚合物顆?？杀舜私佑|，或在聚合物顆粒之間不具有接觸。

如圖2中所示，多個(gè)聚合物顆粒204可連同多個(gè)多核苷酸202一起置于溶液中。多個(gè)顆粒204可被活化或以其他方式制備，以與多核苷酸202結(jié)合。例如，顆粒204可包括與多個(gè)多核苷酸202的多核苷酸一部分互補(bǔ)的寡核苷酸。在另一個(gè)例子中，聚合物顆粒204可使用諸如生物素-鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合的技術(shù)由靶多核苷酸204進(jìn)行修飾。

在特定實(shí)施方式中，對(duì)親水性顆粒和多核苷酸實(shí)施聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增。例如，分散相小滴206或208作為乳狀液的一部分形成，并且可包括親水性顆?；蚨嗪塑账?。在一個(gè)例子中，多核苷酸202和親水性顆粒204以低濃度和相對(duì)于彼此的低比率提供，使得單個(gè)多核苷酸202可能位于與單個(gè)親水性顆粒204相同的分散相小滴內(nèi)。其他小滴例如小滴208可包括單個(gè)親水性顆粒且不包括多核苷酸。每個(gè)小滴206或208可包括酶、核苷酸、鹽或足以促進(jìn)多核苷酸復(fù)制的其他組分。

在特定實(shí)施方式中，酶例如聚合酶存在于分散相小滴的親水性顆?；蛩z顆粒中，與分散相小滴的親水性顆?；蛩z顆粒結(jié)合或緊密接近。在一個(gè)例子中，聚合酶存在于分散相小滴中，以有利于多核苷酸的復(fù)制。多種核酸聚合酶可用于本文描述的方法中。在示例性實(shí)施方式中，聚合酶可包括可催化多核苷酸復(fù)制的酶、其片段或子單元。在另一個(gè)實(shí)施方式中，聚合酶可以是天然存在的聚合酶、重組聚合酶、突變型聚合酶、變體聚合酶、融合物或以其他方式改造的聚合酶、化學(xué)修飾的聚合酶、合成分子、或其類似物、衍生物或片段。

在一個(gè)實(shí)施方式中，聚合酶可以是任何家族A DNA聚合酶(也稱為pol I家族)或任何家族B DNA聚合酶。在實(shí)施方式中，DNA聚合酶可以是與非重組DNA聚合酶相比較，能夠以優(yōu)良的準(zhǔn)確度和得率復(fù)制多核苷酸的重組形式。例如，聚合酶可包括高保真聚合酶或熱穩(wěn)定聚合酶。在實(shí)施方式中，用于多核苷酸復(fù)制的條件可包括‘熱啟動(dòng)’條件，例如熱啟動(dòng)聚合酶例如Amplitaq DNA聚合酶(Applied Biosciences)或KOD熱啟動(dòng)DNA聚合酶(EMD Biosciences)。通常，‘熱啟動(dòng)’聚合酶包括熱穩(wěn)定聚合酶和一種或多種抗體，所述抗體抑制在環(huán)境溫度下的DNA聚合酶和3’-5’外切核酸酶活性。

在實(shí)施方式中，聚合酶可以是酶例如Taq聚合酶(來自水生棲熱菌(Thermus aquaticus))、Tfi聚合酶(來自絲狀棲熱菌(Thermus filiformis))、Bst聚合酶(來自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus))、Pfu聚合酶(來自強(qiáng)烈熾熱球菌(Pyrococcus furiosus))、Tth聚合酶(來自嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus))、Pow聚合酶(來自沃氏熱球菌(Pyrococcus woesei))、Tli聚合酶(來自棲熱球菌(Thermococcus litoralis))、Ultima聚合酶(來自海棲熱袍菌(Thermotoga maritima))、KOD聚合酶(來自超好熱原始菌(Thermococcus kodakaraensis))、Pol I和II聚合酶(來自激烈火球菌(Pyrococcus abyssi))以及Pab(來自激烈火球菌)。

在實(shí)施方式中，聚合酶可以是重組形式的超好熱原始菌。在實(shí)施方式中，聚合酶可以是KOD或KOD樣DNA聚合酶，例如KOD聚合酶(EMD Biosciences)、KOD“熱啟動(dòng)”聚合酶(EMD Biosciences)、KOD Xtreme熱啟動(dòng)DNA聚合酶(EMD Biosciences)、KOD XL DNA聚合酶(EMD Biosciences)、 Taq DNA聚合酶(Invitrogen)、 Taq DNA聚合酶高保真度(Invitrogen)、 Pfx(Invitrogen)、Accuprime^TM Pfx(Invitrogen)、Accuprime^TM Taq DNA聚合酶高保真度(Invitrogen)或Amplitaq DNA聚合酶(Applied Biosystems)。在實(shí)施方式中，聚合酶可以是含有與本文討論的聚合酶相似的突變的DNA聚合酶。

在實(shí)施方式中，多核苷酸的復(fù)制可包括調(diào)節(jié)復(fù)制條件。調(diào)節(jié)可任選包括：增加或降低聚合酶濃度；增加或降低核苷酸濃度；增加或降低陽離子濃度；增加或降低反應(yīng)溫度、時(shí)間或pH等等。調(diào)節(jié)可包括增加或降低反應(yīng)速率、增加或降低反應(yīng)產(chǎn)物得率等等。在實(shí)施方式中，復(fù)制可在適當(dāng)緩沖劑或核苷酸(包括核苷酸類似物或生物素化的核苷酸)的存在下進(jìn)行。

特別地，待擴(kuò)增的多核苷酸可通過聚合物顆粒捕獲。用于捕獲核酸的示例性方法可包括：使多核苷酸與寡核苷酸雜交，所述寡核苷酸附著至聚合物顆粒。在實(shí)施方式中，用于捕獲核酸的方法包括：(a)提供附著至單鏈寡核苷酸(例如捕獲寡核苷酸)的聚合物顆粒；(b)提供單鏈多核苷酸；和(c)使單鏈寡核苷酸與單鏈多核苷酸雜交，由此將單鏈多核苷酸捕獲至聚合物顆粒。在實(shí)施方式中，聚合物顆粒各自可與多個(gè)單鏈寡核苷酸(例如捕獲寡核苷酸)附著。在實(shí)施方式中，步驟(c)可用多個(gè)單鏈多核苷酸進(jìn)行。在實(shí)施方式中，單鏈寡核苷酸的至少一部分包含與單鏈多核苷酸的至少一部分互補(bǔ)(或部分互補(bǔ))的核苷酸序列。

在一個(gè)例子中，該方法還包括將多核苷酸擴(kuò)增成多個(gè)多核苷酸，并且使多個(gè)多核苷酸的至少一部分附著至親水性顆粒，由此生成包括多個(gè)附著的多核苷酸的親水性顆粒。作為另外一種選擇，該方法還可包括通過延伸寡核苷酸將多核苷酸擴(kuò)增成多個(gè)互補(bǔ)多核苷酸，由此生成包括多個(gè)附著的多核苷酸的水凝膠顆粒。

在實(shí)施方式中，用于核苷酸摻入的方法包括：對(duì)多核苷酸進(jìn)行核苷酸聚合反應(yīng)，所述多核苷酸是與附著至聚合物顆粒的寡核苷酸雜交的。在實(shí)施方式中，用于核苷酸摻入的方法包括：(a)提供附著至單鏈寡核苷酸(例如引物寡核苷酸)的聚合物顆粒；(b)提供單鏈模板多核苷酸；(c)使單鏈寡核苷酸與單鏈模板多核苷酸雜交；和(d)在適合于聚合酶催化至少一個(gè)核苷酸聚合到單鏈寡核苷酸上的條件下，使單鏈模板多核苷酸與聚合酶和至少一個(gè)核苷酸接觸，由此進(jìn)行核苷酸摻入。在實(shí)施方式中，聚合物顆粒各自可與多個(gè)單鏈寡核苷酸(例如捕獲寡核苷酸)附著。在實(shí)施方式中，步驟(b)、(c)或(d)可用多個(gè)單鏈多核苷酸進(jìn)行。在實(shí)施方式中，單鏈寡核苷酸的至少一部分包含與單鏈多核苷酸的至少一部分互補(bǔ)(或部分互補(bǔ))的核苷酸序列。在實(shí)施方式中，系統(tǒng)包含與單鏈寡核苷酸雜交的單鏈多核苷酸，所述單鏈寡核苷酸附著至聚合物顆粒，其中至少一個(gè)核苷酸聚合到單鏈寡核苷酸的末端上。

在實(shí)施方式中，用于引物延伸的方法包括：對(duì)多核苷酸進(jìn)行引物延伸反應(yīng)，所述多核苷酸是與附著至聚合物顆粒的寡核苷酸雜交的。在實(shí)施方式中，用于核酸引物延伸的方法包括：(a)提供附著至單鏈寡核苷酸(例如引物寡核苷酸)的聚合物顆粒；(b)提供單鏈模板多核苷酸；(c)使單鏈寡核苷酸與單鏈模板多核苷酸雜交；和(d)在適合于聚合酶催化至少一個(gè)核苷酸聚合到單鏈寡核苷酸上的條件下，使單鏈模板多核苷酸與聚合酶和至少一個(gè)核苷酸接觸，由此延伸引物。在實(shí)施方式中，聚合物顆粒各自可與多個(gè)單鏈寡核苷酸(例如捕獲寡核苷酸)附著。在實(shí)施方式中，步驟(b)、(c)或(d)可用多個(gè)單鏈多核苷酸進(jìn)行。在實(shí)施方式中，單鏈寡核苷酸的至少一部分包含與單鏈多核苷酸的至少一部分互補(bǔ)(或部分互補(bǔ))的核苷酸序列。在實(shí)施方式中，系統(tǒng)包含與單鏈寡核苷酸雜交的單鏈多核苷酸，所述單鏈寡核苷酸附著至聚合物顆粒，其中所述單鏈寡核苷酸由一個(gè)或多個(gè)核苷酸延伸。

在實(shí)施方式中，用于核酸擴(kuò)增的方法包括：對(duì)多核苷酸進(jìn)行引物延伸反應(yīng)，所述多核苷酸與附著至聚合物顆粒的寡核苷酸雜交。在實(shí)施方式中，用于核酸擴(kuò)增的方法包括：(a)提供附著至單鏈寡核苷酸(例如引物寡核苷酸)的聚合物顆粒；(b)提供單鏈模板多核苷酸；(c)使單鏈寡核苷酸與單鏈模板多核苷酸雜交；(d)在適合于聚合酶將至少一個(gè)核苷酸催化聚合到單鏈寡核苷酸上的條件下，使單鏈模板多核苷酸與聚合酶和至少一種核苷酸接觸，以便生成延伸的單鏈寡核苷酸。在實(shí)施方式中，該方法還包括：(e)從延伸的單鏈寡核苷酸去除(例如使變性)單鏈模板多核苷酸，使得單鏈寡核苷酸保持附著至聚合物顆粒；(f)使剩余的單鏈寡核苷酸與第二單鏈模板多核苷酸雜交；和(g)在適合于第二聚合酶催化第二至少一個(gè)核苷酸聚合到單鏈寡核苷酸上的條件下，使第二單鏈模板多核苷酸與第二聚合酶和第二至少一個(gè)核苷酸接觸，以便生成后續(xù)延伸的單鏈寡核苷酸。在實(shí)施方式中，步驟(e)、(f)和(g)可重復(fù)至少一次。在實(shí)施方式中，聚合酶和第二聚合酶包含熱穩(wěn)定的聚合酶。在實(shí)施方式中，適合于核苷酸聚合的條件包括在高溫下進(jìn)行核苷酸聚合步驟(例如步驟(d)或(g))。在實(shí)施方式中，適合于核苷酸聚合的條件包括在交替溫度(例如高溫和相對(duì)更低的溫度)下進(jìn)行核苷酸聚合步驟(例如步驟(d)或(g))。在實(shí)施方式中，交替溫度范圍為60-95℃。在實(shí)施方式中，溫度循環(huán)可以是約10秒至約5分鐘、或約10分鐘、或約15分鐘或更久。在實(shí)施方式中，用于核酸擴(kuò)增的方法可生成各自附著至多個(gè)模板多核苷酸的一種或多種聚合物顆粒，所述多個(gè)模板多核苷酸包含與單鏈模板多核苷酸或第二單鏈模板多核苷酸互補(bǔ)的序列。在實(shí)施方式中，聚合物顆粒各自可與多個(gè)單鏈寡核苷酸(例如捕獲寡核苷酸)附著。在實(shí)施方式中，步驟(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)可用多個(gè)單鏈多核苷酸進(jìn)行。在實(shí)施方式中，單鏈寡核苷酸的至少一部分包含與單鏈多核苷酸的至少一部分互補(bǔ)(或部分互補(bǔ))的核苷酸序列。在實(shí)施方式中，用于核酸擴(kuò)增的方法(如上所述)可在油相(例如分散相小滴)中的水相溶液中進(jìn)行。

在PCR后，形成顆粒例如顆粒210，其可包括親水性顆粒212和多核苷酸的多個(gè)拷貝214。雖然多核苷酸214作為在顆粒210的表面上示出，但多核苷酸214可在顆粒210內(nèi)延伸。具有相對(duì)于水的低濃度聚合物的水凝膠和親水性顆?？砂ㄔ陬w粒210內(nèi)部和各處的多核苷酸區(qū)段，或多核苷酸可位于孔及其他開口內(nèi)。特別地，顆粒210可允許酶、核苷酸、引物和用于監(jiān)控反應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物的擴(kuò)散。大量多核苷酸/顆粒產(chǎn)生更佳的信號(hào)。

在實(shí)施方式中，可收集來自破乳操作的聚合物顆粒并在用于測序的制劑中洗滌。收集可通過下述進(jìn)行：使生物素部分(例如與附著至聚合物顆粒的擴(kuò)增的多核苷酸模板連接)與抗生物素蛋白部分接觸，并且與缺乏生物素化模板的聚合物顆粒分離?？墒箶y帶雙鏈模板多核苷酸的收集的聚合物顆粒變性，以獲得單鏈模板多核苷酸用于測序。變性步驟可包括用堿例如(NaOH)、甲酰胺或吡咯烷酮處理。

在示例性實(shí)施方式中，顆粒210可用于測序裝置中。例如，測序裝置216可包括孔218的陣列。顆粒210可置于孔218內(nèi)。

在一個(gè)例子中，引物可加入孔218中，或顆粒210可在置于孔218內(nèi)之前預(yù)暴露于引物。特別地，顆粒210可包括結(jié)合的引物。引物和多核苷酸形成包括與引物雜交的多核苷酸(例如模板核酸)的核酸雙鏈體。核酸雙鏈體是至少部分雙鏈的多核苷酸。酶和核苷酸可提供給孔218，以促進(jìn)可察覺的反應(yīng)，例如核苷酸摻入。

測序可通過檢測核苷酸添加進(jìn)行。核苷酸添加可使用諸如熒光發(fā)射法或離子檢測法的方法進(jìn)行檢測。例如，一組熒光標(biāo)記的核苷酸可提供給系統(tǒng)216，并且可遷移至孔218。激發(fā)能也可提供給孔218。當(dāng)核苷酸由聚合酶捕獲并加入延伸引物的末端時(shí)，核苷酸的標(biāo)記可發(fā)熒光，從而指示加入哪種類型的核苷酸。

在替代例子中，包括單一類型核苷酸的溶液可順序進(jìn)料。響應(yīng)核苷酸添加，在孔218的局部環(huán)境內(nèi)的pH可改變。此類pH變化可通過離子敏感場效應(yīng)晶體管(ISFET)進(jìn)行檢測。像這樣，pH變化可用于生成指示與顆粒210的多核苷酸互補(bǔ)的核苷酸次序的信號(hào)。

特別地，測序系統(tǒng)可包括設(shè)置在離子傳感器例如場效應(yīng)晶體管(FET)的傳感器墊上的孔或多個(gè)孔。在實(shí)施方式中，系統(tǒng)包括裝載到孔內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)聚合物顆粒，所述孔設(shè)置在離子傳感器(例如FET)的傳感器墊上，或包括裝載到多個(gè)孔內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)聚合物顆粒，所述多個(gè)孔設(shè)置在離子傳感器(例如FET)的傳感器墊上。在實(shí)施方式中，F(xiàn)ET可以是chemFET或ISFET?！癱hemFET”或化學(xué)場效應(yīng)晶體管包括充當(dāng)化學(xué)傳感器的一類場效應(yīng)晶體管。chemFET具有MOSFET晶體管的類似結(jié)構(gòu)，其中在門電極上的電荷由化學(xué)過程施加?！癐SFET”或離子敏感場效應(yīng)晶體管可用于測量溶液中的離子濃度；當(dāng)離子濃度(例如H+)改變時(shí)，通過晶體管的電流相應(yīng)地改變。

在實(shí)施方式中，F(xiàn)ET可以是FET陣列。如本文使用的，“陣列”是元件例如傳感器或孔的平面排列。陣列可以是一維或二維的。一維陣列可以是具有在第一維度中的一列(或行)元件和在第二維度中的多個(gè)列(或行)的陣列。第一和第二維度中的列(或行)數(shù)目可相同或不同。FET或陣列可包含10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷或更多FET。

在實(shí)施方式中，一種或多種微流體結(jié)構(gòu)可在FET傳感器陣列上方制造，以提供生物學(xué)或化學(xué)反應(yīng)的約束或限制。例如，在一個(gè)實(shí)現(xiàn)中，一種或多種微流體結(jié)構(gòu)可構(gòu)造為設(shè)置在陣列的一種或多種傳感器上的一個(gè)或多個(gè)孔(或微孔、或反應(yīng)室、或反應(yīng)孔，因?yàn)檫@些術(shù)語在本文中可互換使用)，使得給定孔設(shè)置在其上的一種或多種傳感器檢測并測量給定孔中的分析物存在、水平或濃度。在實(shí)施方式中，可存在FET傳感器和反應(yīng)孔的1:1對(duì)應(yīng)。

回到圖2，在另一個(gè)例子中，孔陣列的孔218可以可操作地連接至測量裝置。例如，對(duì)于熒光發(fā)射法，孔218可以可操作地偶聯(lián)至光檢測裝置。在離子檢測的情況下，孔218的下表面可設(shè)置在離子傳感器例如場效應(yīng)晶體管的傳感器墊上。

涉及經(jīng)由核苷酸摻入的離子副產(chǎn)物檢測測序的一個(gè)示例性系統(tǒng)為Ion Torrent PGM^TM測序儀(Life Technologies)，所述Ion Torrent PGM^TM測序儀是基于離子的測序系統(tǒng)，其通過檢測作為核苷酸摻入的副產(chǎn)物產(chǎn)生的氫離子來測序核酸模板。通常，氫離子作為在通過聚合酶的模板依賴性核酸合成過程中發(fā)生的核苷酸摻入的副產(chǎn)物釋放。Ion Torrent PGM^TM測序儀通過檢測核苷酸摻入的氫離子副產(chǎn)物來檢測核苷酸摻入。Ion Torrent PGM^TM測序儀可包括待測序的多個(gè)模板多核苷酸，每個(gè)模板設(shè)置在陣列中的各自測序反應(yīng)孔內(nèi)。陣列的孔可各自與至少一種離子傳感器偶聯(lián)，所述離子傳感器可檢測作為核苷酸摻入的副產(chǎn)物產(chǎn)生的H+離子的釋放或溶液pH變化。離子傳感器包括與離子敏感的檢測層偶聯(lián)的場效應(yīng)晶體管(FET)，所述離子敏感的檢測層可感測H+離子的存在或溶液pH變化。離子傳感器可提供指示核苷酸摻入的輸出信號(hào)，所述輸出信號(hào)可表示為其量級(jí)與各自孔或反應(yīng)室中的H+離子濃度關(guān)聯(lián)的電壓變化。不同核苷酸類型可連續(xù)流動(dòng)到反應(yīng)室內(nèi)，并且可以由模板序列決定的次序通過聚合酶摻入延伸引物(或聚合位點(diǎn))內(nèi)。每個(gè)核苷酸摻入可伴隨反應(yīng)孔中H+離子的釋放，連同局限性pH的伴隨變化。H+離子的釋放可通過傳感器的FET登記，所述傳感器產(chǎn)生指示核苷酸摻入的發(fā)生的信號(hào)。在特定核苷酸流動(dòng)過程中未摻入的核苷酸可能不產(chǎn)生信號(hào)。來自FET的信號(hào)幅度還可與摻入延伸核酸分子內(nèi)的特定類型核苷酸的數(shù)目關(guān)聯(lián)，由此允許分辨均聚物區(qū)域。因此，在測序儀的運(yùn)行過程中，進(jìn)入反應(yīng)室內(nèi)的多個(gè)核苷酸流連同跨越多個(gè)孔或反應(yīng)室的摻入監(jiān)控可允許儀器同時(shí)分辨多個(gè)核酸模板的序列。關(guān)于Ion Torrent PGM^TM測序儀組成、設(shè)計(jì)和操作的更多細(xì)節(jié)可例如在下述專利申請(qǐng)中找到：美國專利申請(qǐng)序列號(hào)12/002781，目前作為美國專利公開號(hào)2009/0026082和授權(quán)的美國專利號(hào)8,262,900公開；美國專利申請(qǐng)序列號(hào)12/474897，目前作為美國專利公開號(hào)2010/0137143公開；和美國專利申請(qǐng)序列號(hào)12/492844，目前作為美國專利公開號(hào)2010/0282617公開，所有所述專利申請(qǐng)均以引用的方式全文并入本文。

當(dāng)用于測序技術(shù)，特別是基于離子的測序技術(shù)中時(shí)，聚合物顆粒的實(shí)施方式顯示出技術(shù)優(yōu)點(diǎn)。特別地，聚合物顆粒的實(shí)施方式是非緩沖的或增強(qiáng)閱讀長度或準(zhǔn)確度。

在進(jìn)一步的例子中，聚合物顆粒可顯示出無需過濾而比其他方法制備的顆粒更大的均勻度和更低的CV。例如，上述方法可直接形成聚合物顆粒，而無需施加任何種類的選擇過程例如過濾或使用離心機(jī)。特別地，乳狀液聚合可用于產(chǎn)生適合于種子顆粒的顆粒。通常，種子顆粒是非交聯(lián)的，以能夠吸附促進(jìn)劑分子。

通常，苯乙烯用于產(chǎn)生CV小于5％的種子顆粒，并且其他單體的報(bào)道是有限的。出乎意料和有利的是，使用方法例如上文描述的乳狀液聚合法，tBDMS HEAM可用于產(chǎn)生CV 2％的種子。

此外，本發(fā)明方法的實(shí)施方式提供了基于種子顆粒的大小的大小控制。另外，通過此類方法制備的顆粒的實(shí)施方式提供了超過其他方法的綴合增加，例如60％至80％的綴合增加。

例如，當(dāng)在Ion Torrent 314PGM上測量時(shí)，綴合的聚合物顆粒的實(shí)施方式顯示出至少200bp，例如至少250bp、至少300bp、至少350bp或甚至至少400bp的Q17平均閱讀長度。特別地，綴合的聚合物顆粒可顯示出至少500bp的Q17平均閱讀長度。在另一個(gè)例子中，綴合的聚合物顆粒群體顯示出至少200K，例如至少300K、至少350K或甚至至少400K的200Q17運(yùn)行。

實(shí)施例

實(shí)施例1：

由羥烷基丙烯酰胺單體和鹵代甲硅烷基形成甲硅烷基保護(hù)的丙烯酰胺單體，(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺)。

在0℃下在惰性氣氛(Ar)下，將叔丁基二甲基氯硅烷(66.11g,439mmol)以三份以30分鐘間隔加入在DMF(132g)中的羥乙基丙烯酰胺(50.01g,434mmol)和咪唑(73.94g,1086mmol)溶液中。在末次添加后15分鐘加入額外的DMF(18.90g)。允許反應(yīng)混合物逐漸達(dá)到室溫，并且攪拌大約24小時(shí)。將反應(yīng)混合物用水(101g)猝滅并攪拌一小時(shí)。隨后用二乙醚提取混合物，并且用水和鹽水洗滌。使有機(jī)相干燥(MgSO₄過夜。蒸發(fā)獲得93.59g產(chǎn)物。在蒸發(fā)結(jié)束時(shí)加入4-甲氧基苯酚(MEHQ)(9mg,100ppm)。將產(chǎn)物貯存于-20℃下。

實(shí)施例2

使甲硅烷基保護(hù)的丙烯酰胺單體，(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺)(tBDMS-HEAM)，在分散相中聚合并脫保護(hù)，形成水凝膠顆粒。

通過用ultraturax型Ystral^TM X10/25勻化器(“ultraturax”)將1.14g十二烷基硫酸鈉(SDS)、190g水、9.50g丙酮和19.0g二辛酰過氧化物混合2分鐘形成引發(fā)劑乳狀液，并且用壓力勻化器勻化7分鐘。

在0.5L燒瓶中，使具有7.2重量％固體含量的202.42g 0.53微米單分散的聚苯乙烯種子分散體與115.65g引發(fā)劑乳狀液混合。將混合物在26℃下攪拌20小時(shí)，獲得促進(jìn)的種子溶液。

PVP溶液由16.02g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)K-30形成。將K-30緩慢加入959g水中，并且攪拌30分鐘，隨后添加1.08g SDS。

由加入到912g水中的47.99g碳酸氫鈉制備緩沖溶液。

由19.63g甲苯、11.49g tBDMS-HEAM、0.77g二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)、187.42g水和186.4g PVP溶液制備單體乳狀液，通過ultraturax混合2分鐘，并且進(jìn)一步勻化5分鐘。

在0.5L反應(yīng)器中，加入29.45g促進(jìn)的種子顆粒和189.93g單體乳狀液，隨后為26.65g緩沖溶液。將混合物在25℃下攪拌2小時(shí)，并且隨后加入53.33g水。將混合物加熱至60℃。在60℃下1小時(shí)后，將溫度升高至70℃并且在70℃下維持5小時(shí)。

將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至1升離心燒瓶，并且在Sorvall RC3CPlus離心機(jī)中以4500RPM離心60分鐘。將奶油狀漂浮產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至新的1升燒瓶，并且在四氫呋喃(THF)中離心兩次。

將THF溶脹凝膠沉積物與冰乙酸和水混合至1:3:1的重量比，并且在室溫下振蕩過夜。通過在離心后去除上清液，并加入以THF:水1:1比率的THF和水的混合物兩次以及水一次，隨后為二甲基甲酰胺(DMF)三次和純DMF三次，形成凝膠。

實(shí)施例3

使甲硅烷基保護(hù)的丙烯酰胺單體，(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺)(tBDMS-HEAM)，在由聚苯乙烯顆粒形成的分散相中聚合并脫保護(hù)，形成水凝膠顆粒。

由加入800g水中的42.1g碳酸氫鈉制備碳酸鹽緩沖溶液，以獲得0.5M緩沖溶液。用0.5M氫氧化鈉將緩沖液的pH調(diào)整至10。

由0.96g SDS、160g水、8.00g丙酮和16.0g二辛酰過氧化物制備引發(fā)劑乳狀液。用0.5M碳酸鹽緩沖溶液將pH調(diào)整至9。將混合物用ultraturax型Ystral^TM X10/25勻化器(“ultraturax”)勻化2分鐘，并且用壓力勻化器勻化6分鐘。

在0.5L燒瓶中，使具有15.91重量％固體含量的31.2g 0.31微米單分散的聚苯乙烯種子分散體與103.1g引發(fā)劑乳狀液混合。將混合物在26℃下攪拌20小時(shí)，獲得促進(jìn)的種子溶液。

通過將80g 87-89％水解的聚乙烯醇(PVA)緩慢加入2000g水中，攪拌并加熱至80℃1小時(shí)并冷卻，來制備PVA溶液。使量為91g的PVA溶液與867g水、0.74g SDS和4.24g 0.5M碳酸鈉緩沖液混合。

由29.2g甲苯、7.71g tBDMS-HEAM、0.76g EDMA和249g PVA溶液制備單體乳狀液，通過ultraturax混合2分鐘，并且進(jìn)一步勻化5分鐘。

在0.5L反應(yīng)器中，加入13.3g促進(jìn)的種子顆粒和287g單體乳狀液。將混合物在25℃下攪拌2小時(shí)，并且加熱至50℃。在50℃下1小時(shí)后，將溫度升高至70℃。在2小時(shí)后，加入2.8ml 0.5M緩沖溶液，并且將該溫度再維持一小時(shí)。

將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至1升離心燒瓶，并且在Sorvall RC3CPlus離心機(jī)中以4500RPM離心60分鐘。將奶油狀漂浮產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至新的1升燒瓶，并且在THF中離心兩次。

向102g THF溶脹凝膠沉積物中，以1:3:1重量比加入冰乙酸和水，并且將分散體在室溫下振蕩過夜。通過在離心后去除上清液，并加入以THF:水1:1比率的THF和水兩次，隨后用DMF離心三次和用純DMF離心三次，形成凝膠。

產(chǎn)物的固體含量測定為0.48g，并且在水中的珠直徑通過顯微鏡檢查測定為1.6微米。

實(shí)施例4

使用三氟乙基磺酰氯活化依照實(shí)施例3形成的水凝膠顆粒。

具體地，通過離心和去除上清液，用30ml無水DMF將來自上文實(shí)施例3的26g含有3.08％羥基凝膠的DMF分散體洗滌三次。在末次離心后，將DMF中的凝膠體積調(diào)整至26mL，并且用氬短暫沖洗管。加入量為0.241ml的無水吡啶，隨后為0.318g三氟乙基磺酰氯。將管振蕩過夜。用30ml冰冷的無水DMF將分散體離心四次，在每次離心后去除上清液，并且用冰冷的無水N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)離心兩次。將顆粒重懸浮于50mL(2％干(2％dry))無水NMP中。

實(shí)施例5

使用4-氟苯磺酰氯(fosyl chloride)活化依照實(shí)施例3形成的水凝膠顆粒。

通過離心和去除上清液，用30ml無水DMF將含有來自實(shí)施例3的3.08％羥基凝膠的量為26g的DMF分散體洗滌三次。在末次離心后，將DMF中的凝膠體積調(diào)整至26mL，并且用氬短暫沖洗管。加入量為0.080ml的無水吡啶，隨后為0.113g 4-氟苯磺酰氯。將管振蕩過夜并離心，去除上清液，并加入30ml冰冷的無水DMF四次和冰冷的無水NMP兩次。將顆粒重懸浮于50mL(2％干)無水NMP中。

實(shí)施例6

使用甲磺酰氯活化依照實(shí)施例3形成的水凝膠顆粒。

通過離心和去除上清液，用30ml無水DMF將含有來自實(shí)施例3的3.08％羥基凝膠的量為16g的DMF洗滌三次。在末次離心后，將DMF中的凝膠體積調(diào)整至16mL，并且用氬短暫沖洗管。加入量為0.049ml的無水吡啶，隨后為0.121g甲磺酰氯。將管振蕩過夜并離心，去除上清液，并加入30ml冰冷的無水DMF四次和冰冷的無水NMP兩次。將顆粒重懸浮于50mL(2％干)無水NMP中。

實(shí)施例7

在由聚苯乙烯顆粒形成的分散相中，使甲硅烷基保護(hù)的丙烯酰胺單體，(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺)(tBDMS-HEAM)，與二乙烯基苯交聯(lián)劑聚合并脫保護(hù)，形成水凝膠顆粒。

由1.26g SDS、210g水、10.5g丙酮和21.0g二辛酰過氧化物制備引發(fā)劑乳狀液，用ultraturax型Ystral^TM X10/25勻化器(“ultraturax”)混合2分鐘，并且用壓力勻化器勻化7分鐘。

在0.5L燒瓶中，使具有15.9重量％固體含量的40.7g 0.31微米單分散的聚苯乙烯種子分散體與142.2g引發(fā)劑乳狀液混合。將混合物在26℃下攪拌48小時(shí)，獲得促進(jìn)的種子分散體。

通過將80g聚乙烯醇(PVA)緩慢加入2000g水中，并且攪拌并加熱至80℃1小時(shí)，來制備PVA溶液。隨后使PVA溶液冷卻。

向208g濃縮的PVA溶液中，加入1806g水、1.76g SDS和7.68g硼砂，形成PVA硼砂溶液。

將量為31.08g甲苯、9.79g tBDMS HEAM、0.37g 80％二乙烯基苯(DVB)(包含0.296g DVB和0.074g乙基乙烯基苯)、273.7g PVA硼砂溶液通過ultraturax混合2分鐘，并且進(jìn)一步勻化5分鐘，形成單體乳狀液。

在0.5L反應(yīng)器中，使10.1g促進(jìn)的種子顆粒與289.9g單體乳狀液混合。將混合物在30℃下攪拌1小時(shí)，在50℃下攪拌1小時(shí)，并在75℃下攪拌2小時(shí)。

將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至1升離心燒瓶，并且在Sorvall RC3CPlus離心機(jī)中以4500RPM離心80分鐘。收集奶油狀漂浮產(chǎn)物，并在THF中離心六次。

向160g THF溶脹凝膠沉積物中，加入以1:3:1重量比的冰乙酸和水。將分散體在室溫下振蕩過夜。通過在離心后去除上清液，并加入THF:水為1:1比率的THF和水兩次以及水一次，隨后為DMF三次，形成凝膠。DMF的固體含量隨后測定為1.01g。將珠分散體轉(zhuǎn)移至水，并通過顯微鏡檢查進(jìn)行檢查。珠是單一尺寸的并且珠直徑為1.9微米。

實(shí)施例8

在由聚苯乙烯顆粒形成的分散相中，使甲硅烷基保護(hù)的丙烯酰胺單體，(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺)(tBDMS-HEAM)，與受保護(hù)的交聯(lián)劑聚合并脫保護(hù)，形成水凝膠顆粒。

由緩慢加入2000g水中的80g聚乙烯醇(PVA)制備濃縮的PVA溶液。將溶液攪拌并加熱至80℃1小時(shí)并冷卻。

向160.5g濃縮的PVA溶液中，加入1425g水、1.56g SDS和6.06g硼砂。用2M HCl將溶液的pH調(diào)整至8.2。

量為11.8g甲苯、11.80g 3-苯丙醇、0.15g 2,2’-偶氮雙-(2-甲基丁腈)(AMBN)、7.78g tBDMS HEAM、1.44g N,N’-(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺(TES-PBAM)(82％純度)和291.6g PVA硼砂溶液通過ultraturax混合2分鐘，并且進(jìn)一步勻化5分鐘，形成單體乳狀液。

在0.5L反應(yīng)器中，將5.96g聚苯乙烯種子顆粒的水分散體(種子直徑0.385μm，8.08重量％固體)與294.5g單體乳狀液混合。使氬氣(10-20ml/分鐘)鼓泡通過混合物，同時(shí)在30℃下攪拌并加熱1小時(shí)，并且在50℃下攪拌并加熱1小時(shí)。停止氬流，并且加熱和攪拌在80℃下繼續(xù)3小時(shí)。

將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至1升離心燒瓶，并且在Sorvall RC3CPlus離心機(jī)中以4500RPM離心50分鐘。收集奶油狀漂浮產(chǎn)物，并在THF中離心四次。

向209g THF溶脹凝膠沉積物中，加入冰乙酸209g和水105g。將混合物在室溫下振蕩過夜。通過在離心后去除上清液，并加入以THF:水1:1比率的THF和水兩次以及水一次，隨后為DMF三次，形成凝膠。

分散體的固體含量測定為1.97g。水溶脹凝膠的直徑可在具有相位差(phase contrast)設(shè)備的顯微鏡中測量為1.9μm。CV不超過5.0％。

實(shí)施例9

在由聚苯乙烯顆粒形成的分散相中，使甲硅烷基保護(hù)的丙烯酰胺單體，(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺)(tBDMS-HEAM)，與N,N’-(乙烷-1,2-二基)雙(N-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺(tBDMS EBHEAM)交聯(lián)劑聚合并脫保護(hù)，形成水凝膠顆粒。

由緩慢加入2000g水中的80g聚乙烯醇(PVA)形成濃縮的PVA溶液，隨后攪拌并加熱至80℃1小時(shí)并冷卻。

向88g濃縮的PVA溶液中，加入785g水、0.88g SDS和3.33g硼砂，形成PVA硼砂溶液。

由7.82g甲苯、0.040g 2,2’-偶氮雙-(2-甲基丁腈)(AMBN)、2.06g tBDMS HEAM、0.51g tBDMS-EBHEAM(95純度)和92.9g PVA硼砂溶液形成單體乳狀液，通過ultraturax混合2分鐘，并且進(jìn)一步勻化5分鐘。

在0.5L反應(yīng)器中，將1.65g種子顆粒的水分散體(種子直徑0.319μm，8.07重量％固體)與88.34g單體乳狀液混合。使氬氣(10-20ml/分鐘)鼓泡通過混合物，同時(shí)在30℃下攪拌并加熱1小時(shí)，并且在40℃下攪拌并加熱2小時(shí)。停止氬流，并且加熱和攪拌在80℃下繼續(xù)3小時(shí)。

將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至1升離心燒瓶，并且在Sorvall RC3CPlus離心機(jī)中以4500RPM離心50分鐘。收集奶油狀漂浮產(chǎn)物，并在THF中離心兩次。

向83.9g THF溶脹凝膠沉積物中，加入相同重量的冰乙酸和一半重量的水。將混合物在室溫下振蕩過夜。通過在離心后去除上清液，并加入以THF:水1:1比率的THF和水兩次以及水一次，隨后為DMF三次，形成凝膠。

分散體的固體含量測定為1.63g。水溶脹凝膠的直徑可在具有相位差設(shè)備的顯微鏡中進(jìn)行測量，并且平均為1.6μm。CV不超過5.0％。

實(shí)施例10

在由聚苯乙烯顆粒形成的分散相中，使甲硅烷基保護(hù)的丙烯酰胺單體，(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺)(tBDMS-HEAM)，與二乙烯基苯(DVB)交聯(lián)劑聚合并脫保護(hù)，形成水凝膠顆粒。

由1.2g SDS、200g水、10g丙酮和20.0g二辛酰過氧化物制備引發(fā)劑乳狀液，用ultraturax型Ystral^TM X10/25勻化器(“ultraturax”)混合2分鐘，并且用壓力勻化器勻化7分鐘。

在0.5L燒瓶中，使具有4.55重量％固體含量的31.64g 0.13微米單分散的聚苯乙烯種子分散體與15.84g引發(fā)劑乳狀液混合。將混合物在26℃下攪拌6天，獲得促進(jìn)的種子分散體。

由與5.92g SDS和7.33g硼砂混合的1922g水制備硼砂溶液。

由172.4g甲苯、54.76g tBDMS HEAM、2.75g 80％二乙烯基苯(DVB)(包含2.2g DVB和0.55g乙基乙烯基苯)和1468g硼砂溶液制備單體乳狀液，通過ultraturax混合，并且進(jìn)一步勻化17分鐘。

在0.5L反應(yīng)器中，使22.6g促進(jìn)的種子顆粒與277.6g單體乳狀液混合。將混合物在30℃下攪拌1小時(shí)，在40℃下攪拌1小時(shí)，并在75℃下攪拌2小時(shí)。

將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至1升離心燒瓶，并且在Sorvall RC3CPlus離心機(jī)中以4500RPM離心90分鐘。收集奶油狀漂浮產(chǎn)物，并在THF中離心四次。

向73.3g THF溶脹凝膠沉積物中，加入相等重量的冰乙酸和36.7g水，并將分散體在室溫下振蕩過夜。通過在離心后去除上清液，并加入以THF:水7:3和THF:水6:4比率的THF和水，隨后用DMF離心三次，形成凝膠。

分散體的固體含量測定為1.50g。

實(shí)施例11

在由聚苯乙烯顆粒形成的分散相中，使甲硅烷基保護(hù)的丙烯酰胺單體，(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺)(tBDMS-HEAM)，與DVB交聯(lián)劑聚合并脫保護(hù)，形成親水性顆粒。

由緩慢加入2000g水中的80g聚乙烯醇(PVA)制備濃縮的PVA溶液。將分散體攪拌并加熱至80℃1小時(shí)并冷卻。

向208g濃縮的PVA溶液中，加入1814g水、2.08g SDS和7.71g硼砂，形成PVA硼砂溶液。

由22.34g甲苯、0.164g 2,2’-偶氮雙-(2-甲基丁腈)(AMBN)、16.58g tBDMS HEAM、3.46g 80％二乙烯基苯(包含2.77g DVB和0.69g乙基乙烯基苯)和275g PVA硼砂溶液制備單體乳狀液，通過ultraturax混合2分鐘，并且進(jìn)一步勻化5分鐘。

在0.5L反應(yīng)器中，將8.46g種子顆粒的水分散體(種子直徑0.550μm，7.20重量％固體)與292.15g單體乳狀液混合。將混合物在30℃下攪拌并加熱1小時(shí)，在50℃下攪拌并加熱1小時(shí)，并在75℃下攪拌并加熱2小時(shí)。

將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至1升離心燒瓶，并且在Sorvall RC3CPlus離心機(jī)中以4500RPM離心50分鐘。收集奶油狀漂浮產(chǎn)物，并在THF中離心兩次。

向83.9g THF溶脹凝膠沉積物中，加入相同重量的冰乙酸和一半重量的水。將混合物在室溫下振蕩過夜。通過在離心后去除上清液，并加入以THF:水1:1比率的THF和水兩次以及水一次，隨后為DMF三次，形成凝膠。

DMF的固體含量測定為7.5g。水溶脹凝膠的直徑可在具有相位差設(shè)備的顯微鏡中進(jìn)行測量，并且測定為平均1.8μm。CV不超過5.0％。

實(shí)施例12

在由聚苯乙烯顆粒形成的分散相中，使甲硅烷基保護(hù)的丙烯酰胺單體，(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺)(tBDMS-HEAM)，與tBDMS-EBHEAM交聯(lián)劑聚合并脫保護(hù)，形成水凝膠顆粒。

由緩慢加入2000g水中的80g聚乙烯醇(PVA)制備濃縮的PVA溶液，隨后攪拌并加熱至80℃1小時(shí)并冷卻。

向88g濃縮的PVA溶液中，加入785g水、0.88g SDS和3.33g硼砂，形成PVA硼砂溶液。

由7.82g甲苯、0.040g 2,2’-偶氮雙-(2-甲基丁腈)(AMBN)、2.06g tBDMS HEAM、0.96g tBDMS-EBHEAM(95純度)和92.9g PVA硼砂溶液形成單體乳狀液，通過ultraturax混合2分鐘，并且進(jìn)一步勻化5分鐘。

在0.5L反應(yīng)器中，將1.65g種子顆粒的水分散體(種子直徑0.319μm，8.07重量％固體)與88.34g單體乳狀液混合。使氬氣(10-20ml/分鐘)鼓泡通過混合物，同時(shí)在30℃下攪拌并加熱1小時(shí)，并且在40℃下攪拌并加熱2小時(shí)。停止氬流，并且加熱和攪拌在80℃下繼續(xù)3小時(shí)。

將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至1升離心燒瓶，并且在Sorvall RC3CPlus離心機(jī)中以4500RPM離心50分鐘。收集奶油狀漂浮產(chǎn)物，并在THF中離心兩次。

向83.9g THF溶脹凝膠沉積物中，加入相同重量的冰乙酸和一半重量的水。將混合物在室溫下振蕩過夜。通過在離心后去除上清液，并加入以THF:水1:1比率的THF和水兩次以及水一次，隨后為DMF三次，形成凝膠。

分散體的固體含量測定為1.63g。水溶脹凝膠的直徑可在具有相位差設(shè)備的顯微鏡中進(jìn)行測量，并且平均為1.6μm。CV不超過5.0％。

實(shí)施例13

在由聚苯乙烯顆粒形成的分散相中，使甲硅烷基保護(hù)的丙烯酰胺單體，(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺)(tBDMS-HEAM)，與作為交聯(lián)劑的N,N’-(乙烷-1,2-二基)雙(N-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺)(TBDMS EBHEAM)聚合并脫保護(hù)，形成親水性顆粒。

通過在攪拌的同時(shí)將80g聚乙烯醇(PVA)緩慢加入2000g水中，來制備濃縮的PVA溶液。將混合物攪拌并加熱至80℃下1小時(shí)并冷卻。

向241.8g濃縮的PVA溶液中，加入2129.6g水、2.32g SDS和9.97g硼砂，形成PVA硼砂溶液。

通過混合72.68g甲苯、0.29g 2,2’-偶氮雙-(2-甲基丁腈)(AMBN)、14.59g tBDMS HEAM、4.46g TBDMS EBHEAM和835.8g PVA硼砂溶液制備單體乳狀液，通過ultraturax混合2分鐘，并在高壓Gauline APV-100勻化器中以400巴進(jìn)一步勻化9分鐘。

在1L反應(yīng)器中，將16.86g種子顆粒的水分散體(種子直徑0.319μm，8.07重量％固體)與897g單體乳狀液混合。使混合物在40℃下攪拌并加熱3小時(shí)，同時(shí)使氬對(duì)于前2小時(shí)以0.05l/分鐘和以0.15L/分鐘1小時(shí)鼓泡通過混合物。隨后停止氬流，并且使乳狀液在80℃下加熱3小時(shí)。

將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至1升離心燒瓶，并且在Sorvall RC3CPlus離心機(jī)中以4700RPM離心60分鐘。將奶油狀漂浮產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至新的500mL玻璃燒瓶，并用水重懸浮至370.74g，用21.09g 0.5M乙酸將pH調(diào)整至3.86。將混合物在60℃下攪拌2小時(shí)。

通過將9體積的THF加入脫保護(hù)的凝膠來形成凝膠，并且在Sorvall RC3CPlus離心機(jī)中以3500RPM離心10分鐘，隨后為用DMF的兩次離心和用純DMF兩次離心，全部在離心前添加7.5％THF。DMF中的凝膠的固體含量測定為6.37g。將珠分散體轉(zhuǎn)移至水，并通過顯微鏡進(jìn)行檢查，并且在水中的珠直徑為1.7微米。

實(shí)施例14

使用甲磺酰氯活化依照實(shí)施例13形成的水凝膠顆粒。

將在DMF中分散的來自實(shí)施例13的1.51g羥基凝膠分到兩個(gè)離心瓶內(nèi)，并且使用200ml無水DMF和15g無水THF的溶劑混合物，通過離心和去除上清液洗滌三次。在末次離心后，將兩個(gè)瓶的內(nèi)容物合并在一起，并且用無水DMF再洗滌一次。干內(nèi)容物測定為2.32重量％。

將含有來自上述的2.32重量％羥基凝膠的54.74g DMF分散體轉(zhuǎn)移至具有機(jī)械攪拌的三頸圓底長頸燒瓶，之前加入8.76g DMF以將干內(nèi)容物調(diào)整至2.00％。圓底長頸燒瓶用氬連續(xù)沖洗。加入量為0.2077g的無水吡啶，隨后為0.1692g甲磺酰氯。使燒瓶在室溫下攪拌過夜。

分散體用200ml無水DMF離心三次，在每次離心后去除上清液，并且在無水N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中重懸浮至122.81g懸浮液。干內(nèi)容物測定為0.91％，獲得1.12g活化的凝膠顆粒。

實(shí)施例15

如實(shí)施例11中公開的制備大約280,000,000個(gè)水凝膠顆粒，并且使其經(jīng)受有利于分散相小滴中存在的多核苷酸復(fù)制的條件。

在DNA文庫(L499，大約70,000,000種分子)和Amplitaq DNA聚合酶(Applied Biosystems)或KOD熱啟動(dòng)DNA聚合酶(EMD Biosciences)的存在下，使水凝膠顆粒溫育?；旧细鶕?jù)制造商的說明書，將樣品應(yīng)用于Ion OneTouch^TM System(Life Technologies)，形成模板并富集。使用Guava SYBR Gold Stain系統(tǒng)測定在富集前水凝膠顆粒的回收百分比?；旧细鶕?jù)制造商的說明書(Life Technologies)，使用Ion OneTouch ES^TM System(Life Technologies)進(jìn)行水凝膠顆粒的富集。當(dāng)使用KOD聚合酶時(shí)，發(fā)現(xiàn)水凝膠顆粒的回收后百分比(表1)低；然而，與關(guān)于Amplitaq DNA聚合酶的9.5％和18.2％相比較，當(dāng)使用KOD聚合酶(27.4％)時(shí)，總富集后回收百分比更大。

表1.

實(shí)施例14

依照實(shí)施例9制備聚合物顆粒，磺酸化以提供15％甲磺?；⑶矣靡宜狨ズ蜐獍彼幚?。在綴合和PCR后，聚合物顆粒用于使用Ion Torrent 316芯片的測序測試中。

聚合物顆粒顯示出1.2M例如至少1.4百萬的200q17值。此外，聚合物顆粒顯示出至少350M，例如至少400M的aq17基礎(chǔ)測試。此外，顆粒顯示出至少175，例如至少180的q17平均值。

實(shí)施例15

在由聚苯乙烯顆粒形成的分散相中，使甲硅烷基保護(hù)的丙烯酰胺單體，(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺)(tBDMS-HEAM)，與tBDMS-EBHEAM交聯(lián)劑聚合并脫保護(hù)，形成水凝膠顆粒。

通過首先將1.74g SDS溶解于290.00g水，并且隨后加入14.50g丙酮和29.00g雙(2-乙基己基)己二酸酯(DOA)，來制備乳狀液。乳狀液通過ultraturax混合2分鐘，并在高壓Gauline APV-100勻化器中以400巴進(jìn)一步勻化5.6分鐘。

將31.14g該乳狀液加入燒瓶中的43.89g種子顆粒(種子直徑0.140μm，4.85重量％固體)。使混合物在40℃下在振蕩浴中振蕩40小時(shí)用于活化。

通過將4.54g SDS和9.69g硼砂溶解至2369.8g水來制備SDS硼砂溶液。

由125.29g乙酸2-苯乙酯、0.468g 2,2’-偶氮雙-(2-甲基丁腈)(AMBN)、19.51g tBDMS HEAM、5.99g tBDMS-EBHEAM和816.75g SDS硼砂溶液形成單體乳狀液，通過ultraturax混合5分鐘，并且進(jìn)一步勻化9.68分鐘。

在1L反應(yīng)器中，使62.53g活化種子顆粒的水分散體與938.1g單體乳狀液混合。將混合物在40℃下攪拌并加熱2小時(shí)。將混合物進(jìn)一步在40℃下攪拌并加熱另一小時(shí)，同時(shí)使氬氣(150-200ml/分鐘)鼓泡通過混合物。在這點(diǎn)時(shí)乳狀液中的O₂量測量為0ppb。停止氬流，并且加熱和攪拌在70℃下繼續(xù)10小時(shí)。

將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至四個(gè)250mL離心燒瓶，并且在Beckman Coulter Avanti J-20XP離心機(jī)中以13000RPM離心60分鐘。棄去上清液，并且通過加入水收集沉積物并轉(zhuǎn)移到玻璃燒瓶內(nèi)。

通過添加0.5M乙酸溶液將凝膠的水性分散體的pH調(diào)整至3.8。酸化的凝膠分散體在60℃下在振蕩浴中振蕩2小時(shí)并冷卻。

將凝膠分散體轉(zhuǎn)移到三個(gè)1L燒瓶內(nèi)，將300g THF加入每個(gè)燒瓶中，使燒瓶在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩30分鐘，并且在Thermo Scientific Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus離心機(jī)中以4500RPM離心25分鐘。棄去所得的雙相混合物的上相，將50g THF加入每個(gè)燒瓶中，使燒瓶在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩30分鐘，并以4500RPM離心25分鐘。棄去上清液。

將每個(gè)燒瓶的內(nèi)容物分到兩個(gè)250mL離心燒瓶內(nèi)。將大約100g DMF加到每個(gè)燒瓶上，并且使燒瓶在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩過夜。通過加入20g THF和一定量的DMF使每個(gè)燒瓶的內(nèi)容物總計(jì)200g。使燒瓶在Beckman Coulter Avanti J-20XP離心機(jī)中以13000RPM離心70分鐘。棄去上清液。

將大約100g DMF加到每個(gè)燒瓶上，并且使燒瓶在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩40分鐘。通過加入20g THF和一定量的DMF使每個(gè)燒瓶的內(nèi)容物總計(jì)200g。使燒瓶在Beckman Coulter Avanti J-20XP離心機(jī)中以13000RPM離心70分鐘。棄去上清液，并且通過使用最低限度量的DMF，將所有沉積物合并到新燒瓶內(nèi)。

分散體的固體含量測定為2.34g。水溶脹凝膠的直徑在具有相位差設(shè)備的顯微鏡中進(jìn)行測量，并且平均為0.80μm。

使用3和7重量％蔗糖溶液的梯度和15000RPM的旋轉(zhuǎn)速度，在圓盤式離心機(jī)儀器(CPS Instruments,Inc，型號(hào)DC20000)中進(jìn)一步分析水溶脹凝膠。使用1.032g/ml的顆粒密度，直徑測量為0.4995μm。CV(數(shù)目)測量為3.6％。

實(shí)施例16

在由聚苯乙烯顆粒形成的分散相中，使甲硅烷基保護(hù)的丙烯酰胺單體，(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺)(tBDMS-HEAM)，與tBDMS-EBHEAM交聯(lián)劑聚合并脫保護(hù)，形成水凝膠顆粒。

通過首先將1.98g SDS溶解于330.05g水，并且隨后加入16.51g丙酮和33.00g DOA，來制備乳狀液。乳狀液通過ultraturax混合2分鐘，并在高壓Gauline APV-100勻化器中以400巴進(jìn)一步勻化6.4分鐘。

將37.71g該乳狀液加入燒瓶中的68.57g種子顆粒(種子直徑0.081μm，4.91重量％固體)。使混合物在40℃下在振蕩浴中振蕩20小時(shí)用于活化。

通過將3.77g SDS和7.59g硼砂溶解至1975.6g水來制備SDS硼砂溶液。

由33.89g乙酸2-苯乙酯、0.126g 2,2’-偶氮雙-(2-甲基丁腈)(AMBN)、5.26g tBDMS HEAM、1.61g tBDMS-EBHEAM和223.32g SDS硼砂溶液形成單體乳狀液，通過ultraturax混合5分鐘，并且進(jìn)一步勻化2.6分鐘。

在250mL反應(yīng)器中，使20.31g活化種子顆粒的水分散體與228.23g單體乳狀液混合。將混合物在40℃下攪拌并加熱2小時(shí)。將混合物進(jìn)一步在40℃下攪拌并加熱另一小時(shí)，同時(shí)使氬氣(150-200ml/分鐘)鼓泡通過混合物。在這點(diǎn)時(shí)乳狀液中的O₂量測量為230ppb。停止氬流，并且加熱和攪拌在70℃下繼續(xù)10小時(shí)。

將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至250mL離心燒瓶，并且在Beckman Coulter Avanti J-20XP離心機(jī)中以12500RPM離心90分鐘。棄去上清液，并且通過加入水收集沉積物并轉(zhuǎn)移到玻璃燒瓶內(nèi)。

通過添加0.5M乙酸溶液將凝膠的水性分散體的pH調(diào)整至3.85。酸化的凝膠分散體在60℃下在振蕩浴中振蕩2.5小時(shí)并冷卻。

將凝膠分散體轉(zhuǎn)移到1L燒瓶內(nèi)，加入170.06g THF，使燒瓶在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩10分鐘，并且在Thermo Scientific Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus離心機(jī)中以4500RPM離心30分鐘。棄去所得的雙相混合物的上相。加入86.81g THF，使燒瓶在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩15分鐘，并以4500RPM離心30分鐘。棄去上清液。

將200g DMF加到1L燒瓶中的凝膠沉積物上，并且將該懸浮液分到兩個(gè)250mL離心燒瓶中。使燒瓶在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩153分鐘，并且通過加入30g THF和一定量的DMF使每個(gè)燒瓶的內(nèi)容物總計(jì)200g。使燒瓶在Beckman Coulter Avanti J-20XP離心機(jī)中以14000RPM離心90分鐘。棄去上清液。

將100g DMF加入每個(gè)燒瓶中，并且使懸浮液在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩20分鐘。通過加入30g THF和一定量的DMF使每個(gè)燒瓶的內(nèi)容物總計(jì)200g，并且使燒瓶在Beckman Coulter Avanti J-20XP離心機(jī)中以14000RPM離心90分鐘。棄去上清液，并且通過使用最低限度量的DMF，將所有沉積物合并到新燒瓶內(nèi)。分散體的固體含量測定為2.03g。

使用3和7重量％蔗糖溶液的梯度和20000RPM的旋轉(zhuǎn)速度，在圓盤式離心機(jī)儀器(CPS Instruments,Inc，型號(hào)DC20000)中進(jìn)一步分析水溶脹凝膠。使用1.032g/ml的顆粒密度，直徑測量為0.2885μm。CV(數(shù)目)測量為5.56％。

實(shí)施例17

在由聚苯乙烯顆粒形成的分散相中，使受保護(hù)的氨基丙烯酰胺單體(N-叔丁氧羰基-N’-丙烯酰-哌嗪)與tBDMS-HEAM單體和tBDMS-EBHEAM交聯(lián)劑聚合并脫保護(hù)，形成氨基水凝膠顆粒。

通過首先將1.74g SDS溶解于290.00g水，并且隨后加入14.50g丙酮和29.00g DOA，來制備乳狀液。乳狀液通過ultraturax混合2分鐘，并在高壓Gauline APV-100勻化器中以400巴進(jìn)一步勻化5.6分鐘。

將41.33g該乳狀液加入燒瓶中的62.93g種子顆粒(種子直徑0.126μm，4.59重量％固體)。使混合物在40℃下在振蕩浴中振蕩40小時(shí)用于活化。

通過將4.54g SDS和9.69g硼砂溶解至2369.8g水來制備SDS硼砂溶液。

由34.22g乙酸2-苯乙酯、0.13g AMBN、4.98g tBDMS HEAM、1.61g tBDMS-EBHEAM、0.37g N-叔丁氧羰基-N’-丙烯酰-哌嗪和221.73g SDS硼砂溶液形成單體乳狀液，通過ultraturax混合5分鐘，并且進(jìn)一步勻化4分鐘。

在250mL反應(yīng)器中，使17.09g活化種子顆粒的水分散體與233.1g單體乳狀液混合。將混合物在40℃下攪拌并加熱2小時(shí)。將混合物進(jìn)一步在40℃下攪拌并加熱另一小時(shí)，同時(shí)使氬氣(150-200ml/分鐘)鼓泡通過混合物。在這點(diǎn)時(shí)乳狀液中的O₂量測量為500ppb。停止氬流，并且加熱和攪拌在70℃下繼續(xù)10小時(shí)。

將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至250mL離心燒瓶，并且在Beckman Coulter Avanti J-20XP離心機(jī)中以12000RPM離心60分鐘。棄去上清液，并且通過加入水收集沉積物并轉(zhuǎn)移到玻璃燒瓶內(nèi)。

通過添加0.5M乙酸溶液將凝膠的水性分散體的pH調(diào)整至3.8。酸化的凝膠分散體在60℃下在振蕩浴中振蕩2.5小時(shí)并冷卻。

將凝膠分散體轉(zhuǎn)移到1L燒瓶內(nèi)，加入317.24g THF，使燒瓶在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩30分鐘，并且在Thermo Scientific Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus離心機(jī)中以4500RPM離心30分鐘。棄去所得的雙相混合物的上相，加入169.63g THF，使燒瓶在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩23分鐘，并將燒瓶以4500RPM離心30分鐘。棄去上清液。

將大約170g水加到凝膠沉積物上，并且使燒瓶在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩過夜。使燒瓶以4500RPM離心30分鐘。棄去上清液。

將大約170g水加到凝膠沉積物上。

用33g水稀釋32.2g水凝膠懸浮液(1.55重量％固體)。用3.2mL 2M HCl將pH調(diào)整至pH 1.0。將懸浮液連同54g水一起轉(zhuǎn)移至250mL反應(yīng)器。將懸浮液在60℃下加熱18小時(shí)。隨后將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至Beckman Coulter Avanti J-20XP中的250mL離心燒瓶。

在首先用水稀釋并用10重量％NaOH將懸浮液滴定至大約pH 10后，通過離心形成凝膠，獲得175g的總重量。在重復(fù)這點(diǎn)后，凝膠進(jìn)一步用水形成三次。離心速度在該過程期間從14500rpm逐漸降低到6000rpm，持續(xù)5分鐘。在棄去上清液后，隨后將凝膠用DMF稀釋至175g，并且將獲得的懸浮液振蕩過夜。在以6500rpm離心5分鐘并棄去上清液后，再用DMF的三次相應(yīng)洗滌繼續(xù)形成。

將凝膠用NMP稀釋至175g，并且以7000rpm離心5分鐘。隨后將干物質(zhì)調(diào)整至0.29重量％固體，獲得71g懸浮液。

實(shí)施例18

在由聚苯乙烯顆粒形成的分散相中，使受保護(hù)的氨基丙烯酰胺單體(N-芴基甲氧羰基-N’-丙烯酰-哌嗪)與tBDMS-HEAM單體和tBDMS-EBHEAM交聯(lián)劑聚合并脫保護(hù)，形成氨基水凝膠顆粒。

通過首先將1.74g SDS溶解于290.00g水，并且隨后加入14.50g丙酮和29.00g DOA，來制備乳狀液。乳狀液通過ultraturax混合2分鐘，并在高壓Gauline APV-100勻化器中以400巴進(jìn)一步勻化5.6分鐘。

將41.33g該乳狀液加入燒瓶中的62.93g種子顆粒(種子直徑0.126μm，4.59重量％固體)。使混合物在40℃下在振蕩浴中振蕩40小時(shí)用于活化。

通過將4.54g SDS和9.69g硼砂溶解至2369.8g水來制備SDS硼砂溶液。

由34.22g乙酸2-苯乙酯、0.13g AMBN、4.98g tBDMS HEAM、1.61g tBDMS-EBHEAM、0.59g N-芴基甲氧羰基-N’-丙烯酰-哌嗪和221.71g SDS硼砂溶液形成單體乳狀液，通過ultraturax混合5分鐘，并且進(jìn)一步勻化4分鐘。

在250mL反應(yīng)器中，使17.09g活化種子顆粒的水分散體與233.23g單體乳狀液混合。將混合物在40℃下攪拌并加熱2小時(shí)。將混合物進(jìn)一步在40℃下攪拌并加熱另一小時(shí)，同時(shí)使氬氣(150-200ml/分鐘)鼓泡通過混合物。在這點(diǎn)時(shí)乳狀液中的O₂量測量為62ppb。停止氬流，并且加熱和攪拌在70℃下繼續(xù)10小時(shí)。

將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至250mL離心燒瓶，并且在Beckman Coulter Avanti J-20XP離心機(jī)中以12000RPM離心60分鐘。棄去上清液，并且通過加入水收集沉積物并轉(zhuǎn)移到玻璃燒瓶內(nèi)。

通過添加0.5M乙酸溶液將凝膠的水性分散體的pH調(diào)整至3.8。酸化的凝膠分散體在60℃下在振蕩浴中振蕩2.5小時(shí)并冷卻。

將凝膠分散體轉(zhuǎn)移到1L燒瓶內(nèi)，加入287.06g THF，使燒瓶在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩30分鐘，并且在Thermo Scientific Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus離心機(jī)中以4500RPM離心30分鐘。棄去所得的雙相混合物的上相。加入111.41g THF，使燒瓶在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩23分鐘，并將燒瓶以4500RPM離心30分鐘。棄去上清液。將DMF加到凝膠上，并且使燒瓶在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩過夜。

向稱重120g的在DMF中的珠懸浮液中，加入10mL哌啶，并且在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩60分鐘。加入45g THF，并且使燒瓶在Beckman Coulter Avanti J-20XP離心機(jī)中以14000RPM離心90分鐘。棄去上清液。

加入DMF直至懸浮液稱重112g，并且使凝膠在振蕩臺(tái)上振蕩4小時(shí)。加入37g THF，并且使燒瓶在Beckman Coulter Avanti J-20XP離心機(jī)中以14000RPM離心60分鐘。棄去上清液。

加入DMF直至懸浮液稱重130g，并且使凝膠在振蕩臺(tái)上振蕩90分鐘。加入40g THF，并且使燒瓶在Beckman Coulter Avanti J-20XP離心機(jī)中以14000RPM離心60分鐘。棄去上清液。

將105g無水1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)加到該批料上，并且振蕩3天。使用3和7重量％蔗糖溶液的梯度和15000RPM的旋轉(zhuǎn)速度，在圓盤式離心機(jī)儀器(CPS Instruments,Inc，型號(hào)DC20000)中分析該水溶脹凝膠。直徑測量為0.3694μm，并且CV(數(shù)目)測量為4.8％。

實(shí)施例19

在由聚苯乙烯顆粒形成的分散相中，使受保護(hù)的氨基丙烯酰胺單體(9H-芴-9-基)甲基(2-(2-(2-丙烯酰胺乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸酯與tBDMS-HEAM單體和tBDMS-EBHEAM交聯(lián)劑聚合并脫保護(hù)，形成氨基水凝膠顆粒。

通過首先將1.68g SDS溶解于280.00g水，并且隨后加入14.00g丙酮和28.00g DOA，來制備乳狀液。乳狀液通過ultraturax混合2分鐘，并在高壓Gauline APV-100勻化器中以400巴進(jìn)一步勻化5.4分鐘。

將26.58g該乳狀液加入燒瓶中的52.61g種子顆粒(種子直徑0.126μm，4.59重量％固體)。使混合物在40℃下在振蕩浴中振蕩16小時(shí)用于活化。

通過將3.21g SDS和8.07g硼砂溶解至1823.6g水來制備SDS硼砂溶液。

由33.68g乙酸2-苯乙酯、0.13g AMBN、4.89g tBDMS HEAM、1.61g tBDMS-EBHEAM、0.64g(9H-芴-9-基)甲基(2-(2-(2-丙烯酰胺乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸酯和218.95g SDS硼砂溶液形成單體乳狀液，通過ultraturax混合5分鐘，并且進(jìn)一步勻化2.6分鐘。

在250mL反應(yīng)器中，使15.53g活化種子顆粒的水分散體與234.9g單體乳狀液混合。將混合物在40℃下攪拌并加熱2小時(shí)。將混合物進(jìn)一步在40℃下攪拌并加熱另一小時(shí)，同時(shí)使氬氣(150-200ml/分鐘)鼓泡通過混合物。在這點(diǎn)時(shí)乳狀液中的O₂量測量為75ppb。停止氬流，并且加熱和攪拌在70℃下繼續(xù)10小時(shí)。

將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至250mL離心燒瓶，并且在Beckman Coulter Avanti J-20XP離心機(jī)中以13000RPM離心60分鐘。棄去上清液，并且通過加入水收集沉積物并轉(zhuǎn)移到玻璃燒瓶內(nèi)。

通過添加0.5M乙酸溶液將凝膠的水性分散體的pH調(diào)整至3.7。酸化的凝膠分散體在60℃下在振蕩浴中振蕩2.5小時(shí)并冷卻。

將凝膠分散體轉(zhuǎn)移到1L燒瓶內(nèi)，加入180g THF，并且在Thermo Scientific Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus離心機(jī)中以4500RPM離心30分鐘。棄去所得的雙相混合物的上相，并且使混合物在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩15分鐘。加入160g THF，并將燒瓶以4500RPM離心30分鐘。棄去上清液。

將凝膠轉(zhuǎn)移到具有DMF的玻璃燒瓶內(nèi)。在50g該珠的DMF懸浮液上，加入5mL哌啶，并且使燒瓶在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩60分鐘。

將50g該懸浮液轉(zhuǎn)移至250mL離心燒瓶，并且加入23g THF。使燒瓶在Beckman Coulter Avanti J-20XP離心機(jī)中以10000RPM離心10分鐘。棄去上清液。加入DMF，并且使混合物在振蕩臺(tái)上在室溫下振蕩16小時(shí)。

使用3和7重量％蔗糖溶液的梯度和15000RPM的旋轉(zhuǎn)速度，在圓盤式離心機(jī)儀器(CPS Instruments,Inc，型號(hào)DC20000)中分析水溶脹凝膠。使用1.032g/ml的顆粒密度，直徑測量為0.4517μm。CV(數(shù)目)測量為3.7％。

實(shí)施例20

在由聚苯乙烯顆粒形成的分散相中，使受保護(hù)的氨基丙烯酰胺單體，N-Boc N-丙烯酰-4,7,10-三氧雜十三烷-1,13-二胺，與tBDMS-HEAM單體和tBDMS-EBHEAM交聯(lián)劑聚合并脫保護(hù)，形成氨基水凝膠顆粒。

通過將80g 87-89％水解的聚乙烯醇(PVA)緩慢加入2000g水中，攪拌并加熱至80℃，持續(xù)1小時(shí)并冷卻，來制備PVA溶液。使量為67.66g的PVA溶液與582.70g水、0.62g SDS和2.74g硼砂混合。

由26.39g乙酸2-苯乙酯、0.098g AMBN、3.97g tBDMS HEAM、1.26g tBDMS-EBHEAM、0.21g N-Boc N-丙烯酰-4,7,10-三氧雜十三烷-1,13-二胺和176.12g PVA-硼砂溶液形成單體乳狀液，通過ultraturax混合幾分鐘，并且進(jìn)一步勻化2分鐘。

在250mL反應(yīng)器中，將7.15g種子顆粒的水分散體(種子直徑0.319μm，8.07重量％固體)與193.02g單體乳狀液混合。使混合物在40℃下攪拌并加熱2小時(shí)。使混合物進(jìn)一步在40℃下攪拌并加熱另一小時(shí)，同時(shí)使氬氣(150-200ml/分鐘)鼓泡通過混合物。在這點(diǎn)時(shí)乳狀液中的O₂量測量為40ppb。停止氬流，并且加熱和攪拌在70℃下繼續(xù)10小時(shí)。

將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至250mL離心燒瓶，并且在Beckman Coulter Avanti J-20XP離心機(jī)中以12500RPM離心40分鐘。棄去上清液，并且通過加入水收集沉積物并轉(zhuǎn)移到玻璃燒瓶內(nèi)。

將1M H₂SO₄溶液以9:1體積比加到凝膠懸浮液上，以0.1M H₂SO₄濃度終止。使懸浮液在60℃下振蕩3小時(shí)，并且冷卻至室溫。

逐滴加入濃縮的NaOH溶液，直至pH達(dá)到12。將500g THF加入懸浮液中，分到兩個(gè)250mL瓶內(nèi)，并且使混合物在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩60分鐘。使燒瓶在Thermo Scientific Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus離心機(jī)中以4500RPM離心30分鐘。棄去所得的雙相混合物的上相，將水加入每個(gè)燒瓶中，并且使燒瓶在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩過夜。通過添加濃縮的NaOH溶液將混合物的pH調(diào)整至12.3，使燒瓶在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩25分鐘，并且使燒瓶在Beckman Coulter Avanti J-20XP離心機(jī)中以4500RPM離心30分鐘。棄去上清液。

將水加入每個(gè)燒瓶中，并且通過添加濃縮的NaOH溶液將混合物的pH調(diào)整至12.2。使燒瓶在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩過夜，并且使燒瓶在Thermo Scientific Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus離心機(jī)中以4000RPM離心30分鐘。棄去上清液。

將水加入每個(gè)燒瓶中，使燒瓶在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩4小時(shí)，并且使燒瓶在Beckman Coulter Avanti J-20XP離心機(jī)中以6500RPM離心30分鐘。棄去上清液。

將NMP加入每個(gè)燒瓶中，使燒瓶在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩過夜，并且使燒瓶在Thermo Scientific Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus離心機(jī)中以4500RPM離心30分鐘。棄去大約一半上清液。

將凝膠沉積物合并到一個(gè)瓶內(nèi)，加入NMP并且使燒瓶在Thermo Scientific Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus離心機(jī)中以4500RPM離心60分鐘。棄去上清液。

將NMP加入燒瓶中，使燒瓶在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩3小時(shí)，并且使燒瓶在Beckman Coulter Avanti J-20XP離心機(jī)中以6500RPM離心50分鐘。棄去上清液。

加入更多的NMP，并且分散體的固體含量測定為0.108％。水溶脹凝膠的直徑在具有相位差設(shè)備的顯微鏡中進(jìn)行測量，并且平均為1.79μm。

使用3和7重量％蔗糖溶液的梯度和10050RPM的旋轉(zhuǎn)速度，在圓盤式離心機(jī)儀器(CPS Instruments,Inc，型號(hào)DC20000)中進(jìn)一步分析水溶脹凝膠。使用1.032g/ml的顆粒密度，直徑測量為0.934μm。

實(shí)施例21

在由聚苯乙烯顆粒形成的分散相中，使受保護(hù)的氨基丙烯酰胺單體，N-Boc N-丙烯酰-4,7,10-三氧雜十三烷-1,13-二胺，與tBDMS-HEAM單體和tBDMS-EBHEAM交聯(lián)劑聚合并脫保護(hù)，形成氨基水凝膠顆粒。

通過首先將1.74g SDS溶解于290.00g水，并且隨后加入14.50g丙酮和29.00g雙(2-乙基己基)己二酸酯(DOA)，來制備乳狀液。乳狀液通過ultraturax混合2分鐘，并在高壓Gauline APV-100勻化器中以400巴進(jìn)一步勻化5.6分鐘。

將26.58g該乳狀液加入燒瓶中的52.27g種子顆粒(種子直徑0.126μm，4.59重量％固體)。使混合物在40℃下在振蕩浴中振蕩40小時(shí)用于活化。

通過將1.87g SDS和4.04g硼砂溶解至987.5g水來制備SDS硼砂溶液。

由62.81g乙酸2-苯乙酯、0.238g AMBN、9.13g tBDMS HEAM、3.00g tBDMS-EBHEAM、1.05g N-Boc N-丙烯酰-4,7,10-三氧雜十三烷-1,13-二胺和408.39g SDS-硼砂溶液形成單體乳狀液，通過ultraturax混合幾分鐘，并且進(jìn)一步勻化4.8分鐘。

在500mL反應(yīng)器中，使31.06g活化種子顆粒的水分散體與469.6g單體乳狀液混合。將混合物在40℃下攪拌并加熱2小時(shí)。將混合物進(jìn)一步在40℃下攪拌并加熱另一小時(shí)，同時(shí)使氬氣(200ml/分鐘)鼓泡通過混合物。停止氬流，并且加熱和攪拌在70℃下繼續(xù)10小時(shí)。

將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至四個(gè)250mL離心燒瓶，并且在Beckman Coulter Avanti J-20XP離心機(jī)中以13000RPM離心60分鐘。棄去上清液，并且通過加入水收集沉積物并轉(zhuǎn)移到玻璃燒瓶內(nèi)。

通過添加0.5M乙酸溶液將凝膠的水性分散體的pH調(diào)整至3.8。酸化的凝膠分散體在60℃下在振蕩浴中振蕩2小時(shí)并冷卻。

將1M H₂SO₄溶液以9:1體積比加到凝膠懸浮液上，以0.1M H₂SO₄濃度終止。使懸浮液在60℃下振蕩3小時(shí)，并且冷卻至室溫。

逐滴加入濃縮的NaOH溶液，直至pH達(dá)到12。將懸浮液分到兩個(gè)1L離心燒瓶內(nèi)。將380g THF加入每個(gè)燒瓶中，并且使混合物在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩145分鐘。使燒瓶在Thermo Scientific Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus離心機(jī)中以4500RPM離心30分鐘。棄去上清液，將水加入每個(gè)燒瓶中，并且使燒瓶在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩2小時(shí)。加入更多的水，并且使燒瓶在Thermo Scientific Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus離心機(jī)中以4500RPM離心60分鐘。棄去上清液。

將凝膠轉(zhuǎn)移到四個(gè)250mL離心燒瓶內(nèi)，并且使燒瓶在Beckman Coulter Avanti J-20XP離心機(jī)中以14500RPM離心45分鐘。棄去上清液。

將水加入每個(gè)燒瓶中，使燒瓶在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩60分鐘，并且使燒瓶在Beckman Coulter Avanti J-20XP離心機(jī)中以14500RPM離心45分鐘。棄去上清液。

將水加入每個(gè)燒瓶中，并且通過添加濃縮的NaOH溶液將混合物的pH調(diào)整至12。使燒瓶在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩25分鐘，并且使燒瓶在Beckman Coulter Avanti J-20XP離心機(jī)中以6500RPM離心30分鐘。棄去上清液。

將水加入每個(gè)燒瓶中，并且通過添加濃縮的NaOH溶液將混合物的pH調(diào)整至12.3。使燒瓶在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩過夜，并且使燒瓶在Thermo Scientific Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus離心機(jī)中以4000RPM離心30分鐘。棄去上清液。

將水加入每個(gè)燒瓶中，使燒瓶在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩4小時(shí)，并且使燒瓶在Beckman Coulter Avanti J-20XP離心機(jī)中以6500RPM離心30分鐘。棄去上清液。

將NMP加入每個(gè)燒瓶中，使燒瓶在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩過夜，并且使燒瓶在Thermo Scientific Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus離心機(jī)中以4500RPM離心30分鐘。棄去上清液。

將NMP加入燒瓶中，使燒瓶在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩5小時(shí)，并且使燒瓶在Beckman Coulter Avanti J-20XP離心機(jī)中以6500RPM離心50分鐘。棄去上清液。

加入更多的NMP，并且分散體的固體含量測定為0.408％。水溶脹凝膠的直徑在具有相位差設(shè)備的顯微鏡中進(jìn)行測量，并且平均為0.86μm。還使用3和7重量％蔗糖溶液的梯度和15000RPM的旋轉(zhuǎn)速度，在圓盤式離心機(jī)儀器(CPS Instruments,Inc，型號(hào)DC20000)中測量水溶脹凝膠的直徑。使用1.032g/ml的顆粒密度，直徑測量為0.511μm。CV(數(shù)目)測量為4.82％。

實(shí)施例22

在由聚苯乙烯顆粒形成的分散相中，使tBDMS-HEAM與tBDMS-EBHEAM交聯(lián)劑聚合并脫保護(hù)，形成水凝膠顆粒。

通過首先將1.14g SDS溶解于190.00g水，并且隨后加入28.50g丙酮和19.00g DOA，來制備乳狀液。乳狀液通過ultraturax混合5分鐘，并在高壓Gauline APV-100勻化器中以400巴進(jìn)一步勻化4分鐘。

將30.55g該乳狀液加入燒瓶中的7.39g種子顆粒(種子直徑4.96μm，9.54重量％固體)。使混合物在40℃下在振蕩浴中振蕩22小時(shí)用于活化。

將300g H₂O加熱直至80℃，并且將4.2g Methocel K-100溶解于其中。加入332g H₂O，以獲得Methocel K-100溶液。

將2.41g硼砂加到94.8g Methocel溶液上。通過加入水使該溶液的重量合計(jì)為420.2g，以獲得通過混合制備的硼砂溶液。

由35.72g乙酸2-苯乙酯、0.138g AMBN、5.56g tBDMS HEAM、1.71g tBDMS-EBHEAM和165.89g硼砂溶液形成單體乳狀液，通過ultraturax混合幾分鐘，并且進(jìn)一步勻化2.1分鐘。

在250mL反應(yīng)器中，使9.25g活化種子顆粒的水分散體與177.0g單體乳狀液和63.26g Methocel K-100溶液混合。將混合物在40℃下攪拌并加熱2.5小時(shí)。將混合物進(jìn)一步在40℃下攪拌并加熱另外30分鐘，同時(shí)使氬氣(200ml/分鐘)鼓泡通過混合物。停止氬流，并且加熱和攪拌在70℃下繼續(xù)10小時(shí)。

將反應(yīng)混合物的一部分轉(zhuǎn)移至250mL離心燒瓶，并且在Beckman Coulter Avanti J-20XP離心機(jī)中以13000RPM離心60分鐘。棄去上清液，并且通過加入水收集沉積物并轉(zhuǎn)移到玻璃燒瓶內(nèi)。

通過添加0.5M乙酸溶液將凝膠的水性分散體的pH調(diào)整至3.8。酸化的凝膠分散體在60℃下在振蕩浴中振蕩150分鐘并冷卻。

將凝膠分散體轉(zhuǎn)移到1L燒瓶內(nèi)，加入300g THF，并且使燒瓶在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩30分鐘，并且在Thermo Scientific Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus離心機(jī)中以4500RPM離心25分鐘。棄去所得的雙相混合物的上相，將50g THF加入燒瓶中。使燒瓶在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩30分鐘，并以4500RPM離心25分鐘。棄去上清液。

將燒瓶的內(nèi)容物分到兩個(gè)250mL離心燒瓶內(nèi)。將大約100g DMF加到每個(gè)燒瓶上，并且使燒瓶在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩過夜。通過加入20g THF和一定量的DMF使每個(gè)燒瓶的內(nèi)容物總計(jì)200g。使燒瓶在Beckman Coulter Avanti J-20XP離心機(jī)中以13000RPM離心70分鐘。棄去上清液。

將大約100g DMF加到每個(gè)燒瓶上，并且使燒瓶在室溫下在振蕩臺(tái)上振蕩40分鐘。通過加入20g THF和一定量的DMF使每個(gè)燒瓶的內(nèi)容物總計(jì)200g。使燒瓶在Beckman Coulter Avanti J-20XP離心機(jī)中以13000RPM離心70分鐘。棄去上清液，并且通過使用最低限度量的DMF，將所有沉積物合并到新燒瓶內(nèi)。

分散體的固體含量測定為2.34g。水溶脹凝膠的直徑在具有相位差設(shè)備的顯微鏡中進(jìn)行測量，并且平均為47.5μm。

實(shí)施例23

使tBDMS-HEAM單體在水性乳狀液中聚合，形成單一尺寸的種子顆粒。

使250mL水在250mL錐形瓶中煮沸10分鐘，并且用冰水浴冷卻，同時(shí)將Ar氣吹掃到其內(nèi)。

在50mL錐形瓶中，通過使用磁力攪拌棒，使0.04g SDS溶解于10.1g該沸水中。

在另一個(gè)50mL錐形瓶中，通過使用磁力攪拌棒，使0.059g過硫酸鉀溶解于10g沸水中。

向100mL加套兩片反應(yīng)器內(nèi)加入先前煮沸至少30分鐘的0.20g硼砂和80g沸水，所述反應(yīng)器配備機(jī)械攪拌器、溫度探頭、運(yùn)行水的冷凝器和Ar源，并且通過使用加熱浴將反應(yīng)器加熱至80℃，同時(shí)將配備聚(四氟乙烯)葉片的頂置式攪拌器設(shè)為以150±5RPM攪拌。溶液用Ar吹掃20分鐘。

當(dāng)溶液的溫度達(dá)到80℃時(shí)，使Ar管道提升離開溶液，而Ar壓仍打開，并且將正好在之前超聲處理5分鐘的SDS溶液加入反應(yīng)器內(nèi)。

在添加SDS溶液后8分鐘，將機(jī)械攪拌器設(shè)為以250±5RPM攪拌。

將9.22g tBDMS-HEAM用Ar吹掃5分鐘，并且隨后加入反應(yīng)器內(nèi)。在添加tBDMS-HEAM后1分鐘，將機(jī)械攪拌器設(shè)為以350±5RPM攪拌。

在添加tBDMS-HEAM后5分鐘，將正好在之前用Ar吹掃5分鐘的過硫酸鉀溶液快速加入反應(yīng)器內(nèi)，并且在Ar流仍在乳狀液上方運(yùn)行的同時(shí)密封反應(yīng)器。

在添加過硫酸鉀后270分鐘，將機(jī)械攪拌器設(shè)為以250±5RPM攪拌，并且停止Ar流。使乳狀液進(jìn)一步聚合18小時(shí)。

使該批料冷卻至室溫，并且將整個(gè)批料轉(zhuǎn)移到塑料瓶內(nèi)。直徑通過動(dòng)態(tài)光散射(Malvern,Nano ZS)進(jìn)行測量，并且發(fā)現(xiàn)為0.398μm。PDI測量為0.015。通過使用凝膠滲透化色譜儀器(配備Waters 2414折射率檢測器和Polymer Laboratories 5μm混合C 300mm x 7.5mm柱的Waters 717plus)，重量平均分子量和數(shù)量平均分子量分別測量為707kDa和102kDa。

使用3和7重量％蔗糖溶液的梯度和20 000RPM的旋轉(zhuǎn)速度，在圓盤式離心機(jī)儀器(CPS Instruments,Inc，型號(hào)DC20000)中測量顆粒的CV，并且發(fā)現(xiàn)為2.0％。

實(shí)施例24.

氨基-水凝膠的活化和水凝膠與胺封端DNA探針的綴合。

向在無水、無胺N-甲基吡咯烷酮(NMP)中的1000億氨基-水凝膠(直徑＝0.55微米，23,000,000胺/微米3)溶液(600μL)中，加入固體雙琥珀酰亞胺辛二酸酯(22.1mg,60μmol)，隨后為三丁胺(14μL,60μmol)。在60℃下攪拌1小時(shí)后，通過離心(以21300rcf 30分鐘)分離水凝膠。將水凝膠團(tuán)塊用無胺無水NMP(1ml)稀釋，并且通過離心分離；將該洗滌過程重復(fù)2次，并且將最終團(tuán)塊重懸浮于NMP(600μL)中。將該水凝膠懸浮液用乙酸酐(30μL,317μmol)和三丁胺(30μL,126μmol)處理，并且在室溫下攪拌2小時(shí)。所得的水凝膠通過離心(以21300rcf 30分鐘)分離，并且將團(tuán)塊用無胺無水NMP(1ml)稀釋，并且通過離心分離；將該洗滌過程重復(fù)2次，并且將最終活化的封端的團(tuán)塊用1μmol四丁基銨5’-氨基-寡核苷酸、三丁胺(1μmol)和無胺NMP的3μmolar NMP溶液稀釋至600μL的最終體積。在70℃下攪拌16小時(shí)后，通過離心(以21300rcf 30分鐘)分離DNA綴合的水凝膠。將團(tuán)塊用NMP(1ml)洗滌，隨后為去離子水洗滌(1ml)，使用離心以分離團(tuán)塊。將最終的水凝膠團(tuán)塊用1X TE緩沖液(1.6ml)稀釋，并且在80℃下攪拌1小時(shí)。通過離心(以21300rcf 30分鐘)分離水凝膠，并且用DI水(1ml)洗滌兩次(使用離心用于團(tuán)塊分離)。向最終團(tuán)塊中加入30％氨水；在室溫下15分鐘后，將水凝膠離心(以21300rcf 20分鐘)分離，并且用DI水(1mL)洗滌3次，使用離心用于分離。將最終團(tuán)塊再分散在對(duì)于進(jìn)行靶擴(kuò)散所需的緩沖液中。

實(shí)施例25

實(shí)施例1

使寡核苷酸直接綴合至甲磺?；罨念w粒。經(jīng)由種子乳狀液聚合制備甲磺酰氯活化的微凝膠體。因此形成的顆粒在N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中進(jìn)行洗滌，以備用于與離子交換的單鏈DNA的綴合。

將5’-NH2-C6-30聚體寡核苷酸的鈉鹽溶解于0.1M四丁基乙酸銨中，并且注射到反相HPLC柱上。洗脫用0.1M四丁基乙酸銨流動(dòng)相進(jìn)行。收集含有核酸的級(jí)分，凍干為干粉，并且重懸浮于干N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中。

將五百萬個(gè)顆粒(5.0x10⁹)分散在350uL無水NMP中，并且渦旋混合以分散。將124uL在NMP(4.10mM)中的Bu4NAc-DNA(5’-NH2-C6-30聚體寡核苷酸)直接加入顆?；旌衔镏?。隨后將19.5uL四乙基硼酸銨(26.14mM)加入反應(yīng)混合物中，至～500uL的最終體積。

將反應(yīng)混合物快速渦旋混合，并且在70℃下輕輕混合16小時(shí)。將混合物離心，將上清液傾析，并且將顆粒重懸浮于1mL NMP中。在渦旋混合后，使用在NMP中的兩輪沉淀/分散，使重懸浮的微凝膠體顆粒形成團(tuán)塊。在第二次NMP洗滌后，使團(tuán)塊放(brought up)在1mL 2xSSPE/0.1％十二烷基硫酸鈉(SDS)中，混合并離心成團(tuán)塊。最后，使顆粒放在1mL 1x PBS/0.1％Triton X-100中，混合并離心成牢固團(tuán)塊，將該過程重復(fù)三次。在末次循環(huán)后，使綴合的微凝膠體重懸浮于500uL 1xPBS/0.1％Triton X-100中。

在第一個(gè)方面，形成顆粒的方法包括在水性懸浮液內(nèi)的分散相中，使具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的親水性單體的多個(gè)聚體單元聚合，由此形成包括多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)的聚合物顆粒，并且將聚合物顆粒轉(zhuǎn)換為水凝膠顆粒。

在第一個(gè)方面的一個(gè)例子中，轉(zhuǎn)換聚合物顆粒包括從聚合物顆粒中去除至少一部分所述多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)。例如，去除至少一部分所述多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)包括從聚合物顆粒中酸切割至少一部分所述多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)。

在第一個(gè)方面的另一個(gè)例子和上述例子中，轉(zhuǎn)換聚合物顆粒包括從聚合物顆粒中去除基本上全部的多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)。

在第一個(gè)方面的進(jìn)一步例子和上述例子中，該方法還包括促進(jìn)水性懸浮液中的種子顆粒形成分散相。在一個(gè)例子中，受保護(hù)單體:種子顆粒的質(zhì)量比在150:1至1:1的范圍，例如50:1至1:1的范圍內(nèi)。在另一個(gè)例子中，種子顆粒包括種子聚合物。該方法還可包括在轉(zhuǎn)換聚合物顆粒后提取種子聚合物。在一個(gè)例子中，種子聚合物可以是疏水的。在另一個(gè)例子中，種子聚合物包括苯乙烯類聚合物、丙烯酸類聚合物、另一種乙烯基聚合物或其組合。在上述例子的具體例子中，種子顆粒具有不超過0.6微米，例如不超過0.45微米、不超過0.35微米、或不超過0.15微米的初始粒度。在上述例子的另一個(gè)例子中，促進(jìn)種子顆粒包括使溶劑和促進(jìn)試劑與種子顆?；旌?。例如，促進(jìn)試劑是疏水的。在另一個(gè)例子中，促進(jìn)試劑包括二辛酰過氧化物。

在第一個(gè)方面的另外例子和上述例子中，親水性單體包括丙烯酰胺。

在第一個(gè)方面的另一個(gè)例子和上述例子中，疏水性保護(hù)基團(tuán)包括羥基保護(hù)基團(tuán)。

在第一個(gè)方面的進(jìn)一步例子或上述例子中，疏水性保護(hù)基團(tuán)包括有機(jī)金屬部分。例如，有機(jī)金屬部分形成甲硅烷基醚官能團(tuán)。在一個(gè)例子中，甲硅烷基醚官能團(tuán)源自叔丁基二甲基硅烷醚、三甲基甲硅烷基醚、三乙基甲硅烷基醚、二苯基甲基甲硅烷基醚或其組合。

在第一個(gè)方面的一個(gè)例子和上述例子中，使多個(gè)聚體單元聚合還包括使交聯(lián)劑與具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的親水性單體混合。例如，混合交聯(lián)劑可包括以在15:1至1:2范圍內(nèi)的親水性單體:交聯(lián)劑的質(zhì)量比混合交聯(lián)劑。該范圍可以是10:1至1:1。在另一個(gè)例子中，交聯(lián)劑是低水溶性交聯(lián)劑。在上述例子的一個(gè)例子中，交聯(lián)劑是二乙烯基交聯(lián)劑。例如，二乙烯基交聯(lián)劑包括二丙烯酰胺。在上述例子的具體例子中，二丙烯酰胺包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)雙(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(2-羥丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、其受保護(hù)的衍生物或其組合。二丙烯酰胺可例如包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)雙(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、N,N’-(乙烷-1,2-二基)雙(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、甲硅烷基-保護(hù)的N-[2-(丙烯酰氨基)-1,2-二羥乙基]丙烯酰胺例如N,N’(2,3-雙((三乙基甲硅烷基)氧基)丁烷-1,4-二基)二丙烯酰胺或其組合。在上述例子的另一個(gè)例子中，二乙烯基交聯(lián)劑包括二甲基丙烯酸乙二醇酯、二乙烯基苯、六亞甲基雙丙烯酰胺、三甲基丙烯酸三羥甲基丙烷酯或其組合。

在第一個(gè)方面的另一個(gè)例子和上述例子中，使多個(gè)聚體單元聚合包括使致孔劑與具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的親水性單體混合。例如，致孔劑可以是芳香族致孔劑。在一個(gè)例子中，芳香族致孔劑包括甲苯。

在第一個(gè)方面的另外例子和上述例子中，該方法還包括活化水凝膠顆粒。在一個(gè)例子中，轉(zhuǎn)換包括在水凝膠顆粒上提供一個(gè)或多個(gè)羥基，并且其中活化包括將一個(gè)或多個(gè)羥基中的至少一個(gè)轉(zhuǎn)換為磺酸酯基團(tuán)。例如，轉(zhuǎn)換可包括在水凝膠顆粒上提供一個(gè)或多個(gè)羥基，并且其中活化包括將一個(gè)或多個(gè)羥基中的至少一個(gè)替換為疊氮化物官能部分。在另一個(gè)例子中，該方法還包括使寡核苷酸與活化的水凝膠聚合物結(jié)合。例如，結(jié)合包括親核取代，并且寡核苷酸是親核體封端的寡核苷酸。親核體封端的寡核苷酸的親核體可以是胺基。親核體封端的寡核苷酸的親核體可以是硫醇基。在上述例子的一個(gè)例子中，該方法還可包括使多核苷酸與寡核苷酸雜交。例如，該方法還可包括將多核苷酸擴(kuò)增成多個(gè)多核苷酸，并且使多個(gè)多核苷酸的至少一部分附著至水凝膠顆粒，由此生成包括多個(gè)附著的多核苷酸的水凝膠顆粒。作為另外一種選擇，該方法還可包括通過延伸寡核苷酸將多核苷酸擴(kuò)增成多個(gè)互補(bǔ)多核苷酸，由此生成包括多個(gè)附著的多核苷酸的水凝膠顆粒。

在第一個(gè)方面的另一個(gè)例子和上述例子中，水凝膠顆粒是具有不超過2微米的平均粒度的多個(gè)類似形成的水凝膠顆粒之一。例如，平均粒度可以是不超過1微米，例如不超過0.8微米、或不超過0.5微米。

在第一個(gè)方面的進(jìn)一步例子和上述例子中，水凝膠顆粒是大小基本上均勻的多個(gè)類似形成的水凝膠顆粒之一。

在第一個(gè)方面的另外例子或上述例子中，水凝膠顆粒是具有不超過5.0％的變異系數(shù)的多個(gè)類似形成的水凝膠顆粒之一。例如，變異系數(shù)不超過3.5％。

在第二個(gè)方面，形成顆粒的方法包括在水性懸浮液內(nèi)的分散相中，使具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的丙烯酰胺單體的多個(gè)聚體單元聚合，由此形成包括多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)的聚合物顆粒，并且將聚合物顆粒轉(zhuǎn)換為親水性顆粒。

在第二個(gè)方面的一個(gè)例子中，轉(zhuǎn)換聚合物顆粒包括從聚合物顆粒中去除至少一部分所述多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)。例如，去除至少一部分所述多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)包括從聚合物顆粒中酸切割至少一部分所述多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)。

在第二個(gè)方面的另一個(gè)例子或上述例子中，轉(zhuǎn)換聚合物顆粒包括從聚合物顆粒中去除多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)的基本上全部。

在第二個(gè)方面的另外例子或上述例子中，該方法還包括促進(jìn)水性懸浮液中的種子顆粒形成分散相。例如，受保護(hù)單體:種子顆粒的質(zhì)量比在50:1至1:1的范圍內(nèi)。在另一個(gè)例子中，種子顆粒包括種子聚合物。在上述例子的一個(gè)例子中，該方法還包括在轉(zhuǎn)換聚合物顆粒后提取種子聚合物。種子聚合物可以是疏水的。在另一個(gè)例子中，種子聚合物包括苯乙烯類聚合物、丙烯酸類聚合物、另一種乙烯基聚合物或其組合。在上述例子的一個(gè)例子中，種子顆粒具有不超過0.6微米的初始粒度。在上述例子的另外例子中，促進(jìn)種子顆粒包括使溶劑和促進(jìn)試劑與種子顆?；旌稀＠?，促進(jìn)試劑是疏水的。

在第二個(gè)方面的另一個(gè)例子或上述例子中，疏水性保護(hù)基團(tuán)包括羥基保護(hù)基團(tuán)。在第二個(gè)方面的另外例子和上述例子中，疏水性保護(hù)基團(tuán)包括有機(jī)金屬部分。例如，有機(jī)金屬部分可形成甲硅烷基醚官能團(tuán)。在一個(gè)例子中，甲硅烷基醚官能團(tuán)可源自叔丁基二甲基硅烷醚、三甲基甲硅烷基醚、三乙基甲硅烷基醚、二苯基甲基甲硅烷基醚或其組合。

在第二個(gè)方面的進(jìn)一步例子和上述例子中，使多個(gè)聚體單元聚合還包括使交聯(lián)劑與具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的丙烯酰胺單體混合?；旌辖宦?lián)劑可包括以在15:1至1:2范圍內(nèi)的親水性單體:交聯(lián)劑的質(zhì)量比混合交聯(lián)劑。在一個(gè)例子中，交聯(lián)劑是低水溶性交聯(lián)劑。在另一個(gè)例子中，交聯(lián)劑是二乙烯基交聯(lián)劑。

在第二個(gè)方面的另外例子和上述例子中，使多個(gè)聚體單元聚合包括使致孔劑與具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的丙烯酰胺單體混合。例如，致孔劑可包括芳香族致孔劑。

在第二個(gè)方面的另一個(gè)例子和上述例子中，該方法還包括活化親水性顆粒。在一個(gè)例子中，轉(zhuǎn)換包括提供在水凝膠顆粒上的一個(gè)或多個(gè)羥基，并且其中活化包括將一個(gè)或多個(gè)羥基中的至少一個(gè)轉(zhuǎn)換為磺酸酯基團(tuán)。在另一個(gè)例子中，轉(zhuǎn)換包括提供在水凝膠顆粒上的一個(gè)或多個(gè)羥基，并且其中活化包括將一個(gè)或多個(gè)羥基中的至少一個(gè)替換為疊氮化物官能部分。在另外的例子中，該方法還包括使寡核苷酸與活化的水凝膠聚合物結(jié)合。結(jié)合可包括親核取代，并且寡核苷酸是親核體封端的寡核苷酸。親核體封端的寡核苷酸的親核體可以是胺基。在另一個(gè)例子中，親核體封端的寡核苷酸的親核體可包括硫醇基。在另外的例子中，該方法還包括使多核苷酸與寡核苷酸雜交。在另一個(gè)例子中，該方法還包括將多核苷酸擴(kuò)增成多個(gè)多核苷酸，并且使多個(gè)多核苷酸的至少一部分附著至親水性顆粒，由此生成包括多個(gè)附著的多核苷酸的親水性顆粒。作為另外一種選擇，該方法還可包括通過延伸寡核苷酸將多核苷酸擴(kuò)增成多個(gè)互補(bǔ)多核苷酸，由此生成包括多個(gè)附著的多核苷酸的水凝膠顆粒。

在第二個(gè)方面的進(jìn)一步例子和上述例子中，親水性顆粒是具有不超過2微米的平均粒度的多個(gè)類似形成的親水性顆粒之一。

在第二個(gè)方面的另外例子和上述例子中，親水性顆粒是大小基本上均勻的多個(gè)類似形成的親水性顆粒之一。

在第二個(gè)方面的另一個(gè)例子和上述例子中，親水性顆粒是具有不超過5.0％的變異系數(shù)的多個(gè)類似形成的親水性顆粒之一。

在第三個(gè)方面，形成顆粒的方法包括在水性懸浮液內(nèi)的分散相中，使可自由基聚合單體的多個(gè)聚體單元與具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的二丙烯酰胺交聯(lián)劑聚合，由此形成包括多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)的聚合物顆粒。該方法還包括去除至少一部分所述多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)。

在第三個(gè)方面的一個(gè)例子中，二丙烯酰胺包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)雙(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(2-羥丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、其受保護(hù)的衍生物或其組合。二丙烯酰胺可例如包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)雙(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、N,N’-(乙烷-1,2-二基)雙(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、甲硅烷基-保護(hù)的N-[2-(丙烯酰氨基)-1,2-二羥乙基]丙烯酰胺例如N,N’(2,3-雙((三乙基甲硅烷基)氧基)丁烷-1,4-二基)二丙烯酰胺或其組合。

在第三個(gè)方面的另一個(gè)例子或上述例子中，聚合包括以在15:1至1:2范圍內(nèi)的可自由基聚合單體:交聯(lián)劑的質(zhì)量比混合二丙烯酰胺交聯(lián)劑。

在第三個(gè)方面的另外例子或上述例子中，去除至少一部分所述多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)包括從聚合物顆粒中酸切割至少一部分所述多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)。

在第三個(gè)方面的進(jìn)一步例子或上述例子中，可自由基聚合的單體是基于乙烯基的單體。在一個(gè)例子中，基于乙烯基的單體包括丙烯酸酯、丙烯酰胺、乙烯醇、乙酸乙烯酯、丙烯酰胺-甲基-丙烷磺酸或其組合。例如，基于乙烯基的單體是丙烯酰胺。

在第三個(gè)方面的另一個(gè)例子或上述例子中，該方法還包括促進(jìn)水性懸浮液中的種子顆粒形成分散相。例如，受保護(hù)單體:種子顆粒的質(zhì)量比在50:1至1:1的范圍內(nèi)。在另一個(gè)例子中，種子顆粒包括種子聚合物。在進(jìn)一步例子中，該方法還包括在轉(zhuǎn)換聚合物顆粒后提取種子聚合物。例如，種子聚合物是疏水的。在另一個(gè)例子中，種子聚合物包括苯乙烯類聚合物、丙烯酸類聚合物、另一種乙烯基聚合物或其組合。在另外的例子中，種子顆粒具有不超過0.6微米的初始粒度。在另一個(gè)例子中，促進(jìn)種子顆粒包括使溶劑和促進(jìn)試劑與種子顆粒混合。

在第三個(gè)方面的進(jìn)一步例子或上述例子中，疏水性保護(hù)基團(tuán)包括羥基保護(hù)基團(tuán)。

在第三個(gè)方面的另外例子或上述例子中，疏水性保護(hù)基團(tuán)包括有機(jī)金屬部分。在一個(gè)例子中，有機(jī)金屬部分形成甲硅烷基醚官能團(tuán)。在另一個(gè)例子中，甲硅烷基醚官能團(tuán)源自叔丁基二甲基硅烷醚、三甲基甲硅烷基醚、三乙基甲硅烷基醚、二苯基甲基甲硅烷基醚或其組合。

在第三個(gè)方面的另一個(gè)例子或上述例子中，使多個(gè)聚體單元聚合包括使致孔劑與可自由基聚合的單體和二丙烯酰胺交聯(lián)劑混合。例如，致孔劑可以是芳香族致孔劑。

在第三個(gè)方面的進(jìn)一步例子或上述例子中，該方法還包括活化親水性顆粒。例如，該方法還包括使寡核苷酸與活化的水凝膠聚合物結(jié)合。在另一個(gè)例子中，結(jié)合包括親核取代，并且寡核苷酸是親核體封端的寡核苷酸。例如，親核體封端的寡核苷酸的親核體是胺基。在進(jìn)一步例子中，親核體封端的寡核苷酸的親核體是硫醇基。在另一個(gè)例子中，該方法還包括使多核苷酸與寡核苷酸雜交。在另外的例子中，該方法還包括將多核苷酸擴(kuò)增成多個(gè)多核苷酸，并且使多個(gè)多核苷酸的至少一部分附著至親水性顆粒，由此生成包括多個(gè)附著的多核苷酸的親水性顆粒。作為另外一種選擇，該方法還可包括通過延伸寡核苷酸將多核苷酸擴(kuò)增成多個(gè)互補(bǔ)多核苷酸，由此生成包括多個(gè)附著的多核苷酸的水凝膠顆粒。

在第三個(gè)方面的另外例子或上述例子中，親水性顆粒是具有不超過2微米的平均粒度的多個(gè)類似形成的親水性顆粒之一。

在第三個(gè)方面的另一個(gè)例子或上述例子中，親水性顆粒是具有不超過5.0％的變異系數(shù)的多個(gè)類似形成的親水性顆粒之一。

在第四個(gè)方面，形成顆粒的方法包括使具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的親水性單體的多個(gè)聚體單元聚合，由此形成包括多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)的聚合物顆粒；從聚合物顆粒中去除至少一部分所述多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)，形成親水性顆粒；并且使寡核苷酸與親水性顆粒結(jié)合。

在第四個(gè)方面的一個(gè)例子或上述例子中，去除至少一部分所述多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)包括從聚合物顆粒中酸切割至少一部分所述多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)。

在第四個(gè)方面的另一個(gè)例子或上述例子中，親水性單體包括丙烯酰胺。

在第四個(gè)方面的另外例子或上述例子中，疏水性保護(hù)基團(tuán)包括羥基保護(hù)基團(tuán)。

在第四個(gè)方面的進(jìn)一步例子或上述例子中，疏水性保護(hù)基團(tuán)包括有機(jī)金屬部分。例如，有機(jī)金屬部分可形成甲硅烷基醚官能團(tuán)。

在第四個(gè)方面的一個(gè)例子或上述例子中，使多個(gè)聚體單元聚合還包括使交聯(lián)劑與具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的親水性單體混合。例如，交聯(lián)劑可以是二乙烯基交聯(lián)劑。在另一個(gè)例子中，二乙烯基交聯(lián)劑包括二丙烯酰胺。

在第四個(gè)方面的另一個(gè)例子或上述例子中，該方法還包括在結(jié)合寡核苷酸前活化水凝膠顆粒。例如，去除可包括在親水性顆粒上提供一個(gè)或多個(gè)羥基，并且其中活化包括將一個(gè)或多個(gè)羥基中的至少一個(gè)轉(zhuǎn)換為磺酸酯基團(tuán)。在另一個(gè)例子中，去除包括在親水性顆粒上提供一個(gè)或多個(gè)羥基，并且其中活化包括將一個(gè)或多個(gè)羥基中的至少一個(gè)替換為疊氮化物官能部分。在另外的例子中，結(jié)合包括使寡核苷酸與活化的水凝膠聚合物結(jié)合。在另外的例子中，結(jié)合包括親核取代，并且寡核苷酸是親核體封端的寡核苷酸。例如，親核體封端的寡核苷酸的親核體可以是胺基。在另一個(gè)例子中，親核體封端的寡核苷酸可包括硫醇基。

在第四個(gè)方面的進(jìn)一步例子或上述例子中，該方法還包括使多核苷酸與寡核苷酸雜交。例如，該方法還包括將多核苷酸擴(kuò)增成多個(gè)多核苷酸，并且使多個(gè)多核苷酸的至少一部分附著至水凝膠顆粒，由此生成包括多個(gè)附著的多核苷酸的水凝膠顆粒。作為另外一種選擇，該方法還可包括通過延伸寡核苷酸將多核苷酸擴(kuò)增成多個(gè)互補(bǔ)多核苷酸，由此生成包括多個(gè)附著的多核苷酸的水凝膠顆粒。

在第五個(gè)方面，多個(gè)顆粒包括至少100,000個(gè)顆粒。多個(gè)顆粒中的至少一個(gè)顆粒包括水凝膠。多個(gè)顆粒具有不超過100微米的平均粒度和不超過5％的變異系數(shù)。例如變異系數(shù)不超過4.5％，例如不超過4.0％、不超過3.5％、或不超過3.0％。

在第五個(gè)方面的一個(gè)例子或上述例子中，平均粒度不超過30微米，例如不超過1.5微米、不超過1.1微米、不超過0.6微米、或不超過0.5微米。

在第五個(gè)方面的另一個(gè)例子或上述例子中，水凝膠包括丙烯酰胺聚合物。

在第五個(gè)方面的進(jìn)一步例子或上述例子中，多個(gè)顆粒的顆粒具有至少60％的平均孔隙率。

在第六個(gè)方面，系統(tǒng)包括孔陣列?？钻嚵械闹辽僖粋€(gè)孔與ISFET傳感器可操作地連接。該系統(tǒng)還包括具有不超過5％的變異系數(shù)的多個(gè)水凝膠顆粒。多個(gè)水凝膠顆粒中的至少一個(gè)水凝膠顆粒設(shè)置在孔陣列的孔中。

在第七個(gè)方面，多個(gè)顆粒通過包括下述的方法形成：在水性懸浮液內(nèi)的分散相中，使具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的親水性單體的多個(gè)聚體單元聚合，由此形成包括多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)的聚合物顆粒，并且包括將聚合物顆粒轉(zhuǎn)換為水凝膠顆粒。

在第七個(gè)方面的一個(gè)例子中，多個(gè)顆粒具有不超過5.0％，例如不超過4.0％、不超過3.5％、或不超過3.0％的變異系數(shù)。

在第七個(gè)方面的另一個(gè)例子或上述例子中，多個(gè)顆粒具有不超過100微米的平均粒度。例如，平均粒度可以是不超過30微米，例如不超過1.5微米、或不超過0.8微米。

在第七個(gè)方面的另外例子或上述例子中，親水性單體包括丙烯酰胺單體。

在第七個(gè)方面的進(jìn)一步例子或上述例子中，多個(gè)顆粒的顆粒具有至少60％的平均孔隙率。

在第八個(gè)方面，組合物包括丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑的水性混合物，該丙烯酰胺單體包括疏水性保護(hù)基團(tuán)，單體和交聯(lián)劑以在15:1至1:2范圍內(nèi)的單體:交聯(lián)劑的質(zhì)量比包括。

在第八個(gè)方面的一個(gè)例子，交聯(lián)劑是二乙烯基交聯(lián)劑。例如，二乙烯基交聯(lián)劑可包括二丙烯酰胺。在另一個(gè)例子中，二丙烯酰胺包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)雙(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(2-羥丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、其受保護(hù)的衍生物或其組合。二丙烯酰胺可例如包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)雙(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、N,N’-(乙烷-1,2-二基)雙(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、甲硅烷基-保護(hù)的N-[2-(丙烯酰氨基)-1,2-二羥乙基]丙烯酰胺例如N,N’(2,3-雙((三乙基甲硅烷基)氧基)丁烷-1,4-二基)二丙烯酰胺或其組合。在另外的例子中，二乙烯基交聯(lián)劑包括二甲基丙烯酸乙二醇酯、二乙烯基苯、六亞甲基雙丙烯酰胺、三甲基丙烯酸三羥甲基丙烷酯或其組合。

在第八個(gè)方面的另一個(gè)例子或上述例子中，該比率在10:1至1:1的范圍內(nèi)。

在第九個(gè)方面，測序多核苷酸的方法包括提供包括孔陣列的裝置。至少一個(gè)孔與ISFET可操作地連接，并且包括通過上述方面的方法形成的顆粒。該顆粒附著至多核苷酸。該方法還包括將包括預(yù)定類型的核苷酸的溶液施加于裝置，并且觀測對(duì)施加溶液的離子應(yīng)答。

在第十個(gè)方面，用于核苷酸摻入的方法包括提供通過上述方面的方法形成的顆粒。該顆粒附著至包括與引物雜交的模板核酸的核酸雙鏈體。該雙鏈體與聚合酶結(jié)合。該方法還包括使顆粒與一種或多種核苷酸接觸，并且使用聚合酶將至少一種核苷酸摻入引物的末端上。

在第十個(gè)方面的一個(gè)例子中，摻入還包括生成核苷酸摻入的副產(chǎn)物。

在第十個(gè)方面的另一個(gè)例子和上述例子中，該方法還包括通過使用場效應(yīng)晶體管(FET)檢測副產(chǎn)物來檢測摻入。

在第十一個(gè)方面，形成顆粒的方法包括促進(jìn)種子顆粒在水性懸浮液中形成分散相，在分散相中使具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的親水性單體的多個(gè)聚體單元聚合，由此形成包括多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)的聚合物顆粒，并且將聚合物顆粒轉(zhuǎn)換為水凝膠顆粒。

在第十二個(gè)方面，形成顆粒的方法包括提供在水性懸浮液中的種子顆粒，該種子顆粒包含疏水性聚合物，并且包括促進(jìn)種子顆粒在水性懸浮液中形成分散相。該方法還包括在分散相中使具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的親水性單體的多個(gè)聚體單元聚合，由此形成包括具有多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)的親水性聚合物的聚合物顆粒。聚合物顆粒包括疏水性聚合物。該方法還包括從親水性聚合物中切割多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)，并且從聚合物顆粒中提取疏水性聚合物，形成水凝膠顆粒。

在第十三個(gè)方面，顆粒包括由羥烷基丙烯酰胺和二丙烯酰胺聚合形成的聚合物。二丙烯酰胺包括羥基。當(dāng)暴露于水時(shí)，顆粒吸收基于聚合物重量至少300重量％的水。

在第十三個(gè)方面的一個(gè)例子中，當(dāng)暴露于水時(shí)，顆粒吸收基于聚合物重量至少1000重量％的水。

在第十三個(gè)方面的另一個(gè)例子和上述例子中，顆粒具有不超過100微米的粒度。例如，粒度可以是不超過30微米，例如不超過1.5微米。

在第十三個(gè)方面的進(jìn)一步例子和上述例子中，羥烷基丙烯酰胺包括羥乙基丙烯酰胺。

在第十三個(gè)方面的另外例子和上述例子中，羥烷基丙烯酰胺包括N-[三(羥甲基)甲基)丙烯酰胺(下文所示的A)、N-(羥甲基)丙烯酰胺(下文所示的B)或其組合。

在第十三個(gè)方面的另一個(gè)例子和上述例子中，二丙烯酰胺包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)雙(2-羥乙基)丙烯酰胺、N,N’-(2-羥丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、其受保護(hù)的衍生物，或其組合。二丙烯酰胺可例如包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)雙(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、N,N’-(乙烷-1,2-二基)雙(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、甲硅烷基-保護(hù)的N-[2-(丙烯酰氨基)-1,2-二羥乙基]丙烯酰胺例如N,N’(2,3-雙((三乙基甲硅烷基)氧基)丁烷-1,4-二基)二丙烯酰胺，或其組合。

實(shí)施方式可為依照下述編號(hào)的項(xiàng)中的任一項(xiàng)。

1.一種形成顆粒的方法，所述方法包括：在水性懸浮液內(nèi)的分散相中，使具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的親水性單體的多個(gè)聚體單元聚合，由此形成包括多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)的聚合物顆粒；和將所述聚合物顆粒轉(zhuǎn)換為親水性顆粒。

2.項(xiàng)1的方法，其中所述親水性顆粒是水凝膠顆粒。

3.項(xiàng)1或項(xiàng)2的方法，其中所述親水性單體包括丙烯酰胺單體。

4.項(xiàng)1或項(xiàng)2的方法，其中所述親水性單體是可自由基聚合的單體，并且所述分散相還包括具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的二丙烯酰胺交聯(lián)劑。

5.項(xiàng)1-4中任一項(xiàng)的方法，其中轉(zhuǎn)換所述聚合物顆粒包括從所述聚合物顆粒中去除至少一部分所述多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)。

6.項(xiàng)5的方法，其中去除至少一部分所述多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)包括從所述聚合物顆粒中酸切割至少一部分所述多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)。

7.項(xiàng)1-6中任一項(xiàng)的方法，其中轉(zhuǎn)換所述聚合物顆粒包括從所述聚合物顆粒中去除所述多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)的基本上全部。

8.項(xiàng)1-7中任一項(xiàng)的方法，所述方法還包括促進(jìn)所述水性懸浮液中的種子顆粒形成所述分散相。

9.項(xiàng)8的方法，其中受保護(hù)單體:種子顆粒的質(zhì)量比在150:1至1:1的范圍內(nèi)。

10.項(xiàng)8的方法，其中所述種子顆粒包括種子聚合物。

11.項(xiàng)10的方法，所述方法還包括在轉(zhuǎn)換所述聚合物顆粒后提取所述種子聚合物。

12.項(xiàng)10的方法，其中所述種子聚合物是疏水的。

13.項(xiàng)10的方法，其中所述種子聚合物包括苯乙烯類聚合物、丙烯酸類聚合物、丙烯酰胺、另一種乙烯基聚合物，或其組合。

14.項(xiàng)8的方法，其中所述種子顆粒具有不超過0.6微米的初始粒度。

15.項(xiàng)14的方法，其中所述初始粒度不超過0.45微米。

16.項(xiàng)15的方法，其中所述初始粒度不超過0.35微米。

17.項(xiàng)16的方法，其中所述初始粒度不超過0.15微米。

18.項(xiàng)8的方法，其中所述種子顆粒具有在1微米至7微米范圍內(nèi)的初始粒度。

19.項(xiàng)8的方法，其中促進(jìn)所述種子顆粒包括使溶劑和促進(jìn)試劑與所述種子顆粒混合。

20.項(xiàng)19的方法，其中所述促進(jìn)試劑是疏水的，并且具有在25℃下小于0.01g/l的水溶性。

21.項(xiàng)19的方法，其中所述促進(jìn)試劑包括二辛酰過氧化物或己二酸二辛酯或分子量低于20kD的聚苯乙烯。

22.項(xiàng)1-21中任一項(xiàng)的方法，其中所述親水性單體包括丙烯酰胺。

23.項(xiàng)4-22中任一項(xiàng)的方法，其中所述可自由基聚合的單體是基于乙烯基的單體。

24.項(xiàng)23的方法，其中所述基于乙烯基的單體包括丙烯酸酯、丙烯酰胺、乙烯醇、乙酸乙烯酯、丙烯酰胺-甲基-丙烷磺酸，或其組合。

25.項(xiàng)24的方法，其中所述基于乙烯基的單體是丙烯酰胺。

26.項(xiàng)1-25中任一項(xiàng)的方法，其中所述疏水性保護(hù)基團(tuán)包括羥基保護(hù)基團(tuán)。

27.項(xiàng)1-25中任一項(xiàng)的方法，其中所述疏水性保護(hù)基團(tuán)包括胺保護(hù)基團(tuán)。

28.項(xiàng)1-27中任一項(xiàng)的方法，其中所述疏水性保護(hù)基團(tuán)包括有機(jī)金屬部分。

29.項(xiàng)28的方法，其中所述有機(jī)金屬部分形成甲硅烷基醚官能團(tuán)。

30.項(xiàng)29的方法，其中所述甲硅烷基醚官能團(tuán)源自叔丁基二甲基硅烷醚、三甲基甲硅烷基醚、三乙基甲硅烷基醚、二苯基甲基甲硅烷基醚，或其組合。

31.項(xiàng)1-30中任一項(xiàng)的方法，其中使所述多個(gè)聚體單元聚合還包括使交聯(lián)劑與具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的所述親水性單體混合。

32.項(xiàng)31的方法，其中混合所述交聯(lián)劑包括以在15:1至1:2范圍內(nèi)的親水性單體:交聯(lián)劑的質(zhì)量比混合所述交聯(lián)劑。

33.項(xiàng)32的方法，其中所述范圍是10:1至1:1。

34.項(xiàng)31的方法，其中所述交聯(lián)劑是低水溶性交聯(lián)劑，并且具有在25℃下小于10g/l的水溶性。

35.項(xiàng)31的方法，其中所述交聯(lián)劑是二乙烯基交聯(lián)劑。

36.項(xiàng)35的方法，其中所述二乙烯基交聯(lián)劑包括二丙烯酰胺。

37.項(xiàng)4或項(xiàng)36的方法，其中所述二丙烯酰胺包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)雙(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(2-羥丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、其受保護(hù)的衍生物，或其組合。

38.項(xiàng)4或項(xiàng)37的方法，其中所述二丙烯酰胺包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)雙(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、N,N’-(乙烷-1,2-二基)雙(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、甲硅烷基-保護(hù)的N-[2-(丙烯酰氨基)-1,2-二羥乙基]丙烯酰胺例如N,N’(2,3-雙((三乙基甲硅烷基)氧基)丁烷-1,4-二基)二丙烯酰胺，或其組合。

39.項(xiàng)35的方法，其中所述二乙烯基交聯(lián)劑包括二甲基丙烯酸乙二醇酯、二乙烯基苯、六亞甲基雙丙烯酰胺、三甲基丙烯酸三羥甲基丙烷酯，或其組合。

40.項(xiàng)1-39中任一項(xiàng)的方法，其中使所述多個(gè)聚體單元聚合包括使致孔劑與具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的所述親水性單體混合。

41.項(xiàng)40的方法，其中所述致孔劑是芳香族致孔劑。

42.項(xiàng)41的方法，其中所述芳香族致孔劑包括甲苯、二甲苯、均三甲苯、乙酸苯乙基酯(phenylenethyl acetate)或苯甲酸乙酯。

43.項(xiàng)1-42中任一項(xiàng)的方法，所述方法還包括活化所述親水性顆?；蛩鏊z顆粒。

44.項(xiàng)43的方法，其中所述轉(zhuǎn)換包括在所述水凝膠顆粒上提供一個(gè)或多個(gè)羥基，并且其中活化包括將所述一個(gè)或多個(gè)羥基中的至少一個(gè)轉(zhuǎn)換為烷基或芳基磺酸酯。

45.項(xiàng)43的方法，其中所述轉(zhuǎn)換包括在所述水凝膠顆粒上提供一個(gè)或多個(gè)羥基，并且其中活化包括將所述一個(gè)或多個(gè)羥基中的至少一個(gè)替換為疊氮化物官能部分。

46.項(xiàng)43的方法，其中所述轉(zhuǎn)換包括在所述水凝膠顆粒上提供一個(gè)或多個(gè)胺基，并且其中活化包括使所述一個(gè)或多個(gè)胺基中的至少一個(gè)與雙琥珀酰亞胺C2-C12烷基酯反應(yīng)。

47.項(xiàng)43的方法，所述方法還包括使寡核苷酸與所述活化的水凝膠聚合物結(jié)合。

48.項(xiàng)47的方法，其中所述結(jié)合包括親核取代，并且所述寡核苷酸是親核體封端的寡核苷酸。

49.項(xiàng)48的方法，其中所述親核體封端的寡核苷酸的親核體是胺基。

50.項(xiàng)48的方法，其中所述親核體封端的寡核苷酸的親核體是硫醇基。

51.項(xiàng)47的方法，所述方法還包括使多核苷酸與所述寡核苷酸雜交。

52.項(xiàng)51的方法，所述方法還包括將所述多核苷酸擴(kuò)增成多個(gè)多核苷酸，并且使所述多個(gè)多核苷酸的至少一部分附著至所述水凝膠顆粒，由此生成包括多個(gè)附著的多核苷酸的水凝膠顆粒。

53.項(xiàng)51的方法，所述方法還包括通過延伸所述寡核苷酸將所述多核苷酸擴(kuò)增成多個(gè)互補(bǔ)多核苷酸，由此生成包括多個(gè)附著的多核苷酸的水凝膠顆粒。

54.項(xiàng)1-53中任一項(xiàng)的方法，其中所述水凝膠顆粒是在水中具有不超過2微米的平均粒度的多個(gè)類似形成的水凝膠顆粒之一。

55.項(xiàng)54的方法，其中所述平均粒度不超過1微米。

56.項(xiàng)55的方法，其中所述平均粒度不超過0.8微米。

57.項(xiàng)56的方法，其中所述平均粒度不超過0.5微米。

58.項(xiàng)1-44中任一項(xiàng)的方法，其中所述水凝膠顆粒是在水中具有在5微米至100微米范圍內(nèi)的平均粒度的多個(gè)類似形成的水凝膠顆粒之一。

59.項(xiàng)1-58中任一項(xiàng)的方法，其中所述水凝膠顆粒是大小基本上均勻的多個(gè)類似形成的水凝膠顆粒之一。

60.項(xiàng)1-59中任一項(xiàng)的方法，其中所述水凝膠顆粒是具有不超過5.0％的變異系數(shù)的多個(gè)類似形成的水凝膠顆粒之一。

61.項(xiàng)60的方法，其中所述變異系數(shù)不超過3.5％。

62.一種形成顆粒的方法，所述方法包括：使具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的親水性單體的多個(gè)聚體單元聚合，由此形成包括多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)的聚合物顆粒；從所述聚合物顆粒中去除至少一部分所述多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)，形成親水性顆粒；和使寡核苷酸與所述親水性顆粒結(jié)合。

63.項(xiàng)62的方法，其中去除至少一部分所述多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)包括從所述聚合物顆粒中酸切割至少一部分所述多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)。

64.項(xiàng)62或項(xiàng)63的方法，其中所述親水性單體包括丙烯酰胺。

65.項(xiàng)62-64中任一項(xiàng)的方法，其中所述疏水性保護(hù)基團(tuán)包括羥基保護(hù)基團(tuán)。

66.項(xiàng)62-65中任一項(xiàng)的方法，其中所述疏水性保護(hù)基團(tuán)包括有機(jī)金屬部分。

67.項(xiàng)66的方法，其中所述有機(jī)金屬部分形成甲硅烷基醚官能團(tuán)。

68.項(xiàng)62-67中任一項(xiàng)的方法，其中使所述多個(gè)聚體單元聚合還包括使交聯(lián)劑與具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的所述親水性單體混合。

69.項(xiàng)68的方法，其中所述交聯(lián)劑是二乙烯基交聯(lián)劑。

70.項(xiàng)69的方法，其中所述二乙烯基交聯(lián)劑包括二丙烯酰胺。

71.項(xiàng)62-70中任一項(xiàng)的方法，所述方法還包括在結(jié)合所述寡核苷酸前活化所述水凝膠顆粒。

72.項(xiàng)71的方法，其中所述去除包括在所述親水性顆粒上提供一個(gè)或多個(gè)羥基，并且其中活化包括將所述一個(gè)或多個(gè)羥基中的至少一個(gè)轉(zhuǎn)換為磺酸酯基團(tuán)。

73.項(xiàng)71的方法，其中所述去除包括在所述親水性顆粒上提供一個(gè)或多個(gè)羥基，并且其中活化包括將所述一個(gè)或多個(gè)羥基中的至少一個(gè)替換為疊氮化物官能部分。

74.項(xiàng)71的方法，其中所述結(jié)合包括使所述寡核苷酸與所述活化的水凝膠聚合物結(jié)合。

75.項(xiàng)74的方法，其中所述結(jié)合包括親核取代，并且所述寡核苷酸是親核體封端的寡核苷酸。

76.項(xiàng)75的方法，其中所述親核體封端的寡核苷酸的親核體是胺基。

77.項(xiàng)75的方法，其中所述親核體封端的寡核苷酸的親核體是硫醇基。

78.項(xiàng)62-77中任一項(xiàng)的方法，所述方法還包括使多核苷酸與所述寡核苷酸雜交。

79.項(xiàng)78的方法，所述方法還包括將所述多核苷酸擴(kuò)增成多個(gè)多核苷酸，并且使所述多個(gè)多核苷酸的至少一部分附著至所述水凝膠顆粒，由此生成包括多個(gè)附著的多核苷酸的水凝膠顆粒。

80.項(xiàng)78的方法，所述方法還包括通過延伸所述寡核苷酸將所述多核苷酸擴(kuò)增成多個(gè)互補(bǔ)多核苷酸，由此生成包括多個(gè)附著的多核苷酸的水凝膠顆粒。

81.包含至少100,000個(gè)顆粒的多個(gè)顆粒，所述多個(gè)顆粒中的至少一個(gè)顆粒包含水凝膠，所述多個(gè)顆粒具有不超過100微米的平均粒度和不超過5％的變異系數(shù)。

82.項(xiàng)81的多個(gè)顆粒，其中所述至少100,000個(gè)顆粒各自包含所述水凝膠。

83.項(xiàng)81或82的多個(gè)顆粒，其中所述變異系數(shù)不超過4.5％。

84.項(xiàng)83的多個(gè)顆粒，其中所述變異系數(shù)不超過4.0％。

85.項(xiàng)84的多個(gè)顆粒，其中所述變異系數(shù)不超過3.5％。

86.項(xiàng)85的多個(gè)顆粒，其中所述變異系數(shù)不超過3.0％。

87.項(xiàng)81-86中任一項(xiàng)的多個(gè)顆粒，其中所述平均粒度不超過30微米。

88.項(xiàng)87的多個(gè)顆粒，其中所述平均粒度不超過1.5微米。

89.項(xiàng)88的多個(gè)顆粒，其中所述平均粒度不超過1.1微米。

90.項(xiàng)89的多個(gè)顆粒，其中所述平均粒度不超過0.6微米。

91.項(xiàng)90的多個(gè)顆粒，其中所述平均粒度不超過0.5微米。

92.項(xiàng)81-91中任一項(xiàng)的多個(gè)顆粒，其中所述水凝膠包括丙烯酰胺聚合物。

93.項(xiàng)81-92中任一項(xiàng)的多個(gè)顆粒，其中所述多個(gè)顆粒的顆粒具有至少60％的平均孔隙率。

94.一種系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：孔陣列，所述孔陣列的至少一個(gè)孔與ISFET傳感器可操作地連接；和具有不超過5％的變異系數(shù)的多個(gè)水凝膠顆粒，所述多個(gè)水凝膠顆粒中的至少一個(gè)水凝膠顆粒設(shè)置在所述孔陣列的孔中。

95.通過包括下述的方法形成的多個(gè)顆粒：在水性懸浮液內(nèi)的分散相中，使具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的親水性單體的多個(gè)聚體單元聚合，由此形成包括多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)的聚合物顆粒；和將所述聚合物顆粒轉(zhuǎn)換為水凝膠顆粒。

96.項(xiàng)95的多個(gè)顆粒，其中所述多個(gè)顆粒具有不超過5.0％的變異系數(shù)。

97.項(xiàng)96的多個(gè)顆粒，其中所述變異系數(shù)不超過4.0％。

98.項(xiàng)97的多個(gè)顆粒，其中所述變異系數(shù)不超過3.5％。

99.項(xiàng)98的多個(gè)顆粒，其中所述變異系數(shù)不超過3.0％。

100.項(xiàng)95-99中任一項(xiàng)的多個(gè)顆粒，其中所述多個(gè)顆粒具有不超過100微米的平均粒度。

101.項(xiàng)100的多個(gè)顆粒，其中所述平均粒度不超過30微米。

102.項(xiàng)101的多個(gè)顆粒，其中所述平均粒度不超過5微米。

103.項(xiàng)102的多個(gè)顆粒，其中所述平均粒度不超過1.5微米。

104.項(xiàng)103的多個(gè)顆粒，其中所述平均粒度不超過0.8微米。

105.項(xiàng)95-104中任一項(xiàng)的多個(gè)顆粒，其中所述親水性單體包括丙烯酰胺單體。

106.項(xiàng)95-105中任一項(xiàng)的多個(gè)顆粒，其中所述多個(gè)顆粒的顆粒具有至少60％的平均孔隙率。

107.一種包含丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑的水性混合物的組合物，所述丙烯酰胺單體具有疏水性保護(hù)基團(tuán)，所述單體和交聯(lián)劑以在15:1至1:2范圍內(nèi)的單體:交聯(lián)劑的質(zhì)量比包括。

108.項(xiàng)107的組合物，其中所述交聯(lián)劑是二乙烯基交聯(lián)劑。

109.項(xiàng)108的組合物，其中所述二乙烯基交聯(lián)劑包括二丙烯酰胺。

110.項(xiàng)109的組合物，其中所述二丙烯酰胺包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)雙(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(2-羥丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、其受保護(hù)的衍生物，或其組合。

111.項(xiàng)110的組合物，其中所述二丙烯酰胺包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)雙(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、N,N’-(乙烷-1,2-二基)雙(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、甲硅烷基-保護(hù)的N-[2-(丙烯酰氨基)-1,2-二羥乙基]丙烯酰胺例如N,N’(2,3-雙((三乙基甲硅烷基)氧基)丁烷-1,4-二基)二丙烯酰胺，或其組合。

112.項(xiàng)108的組合物，其中所述二乙烯基交聯(lián)劑包括二甲基丙烯酸乙二醇酯、二乙烯基苯、六亞甲基雙丙烯酰胺、三甲基丙烯酸三羥甲基丙烷酯，或其組合。

113.項(xiàng)107-112中任一項(xiàng)的組合物，其中所述比率在10:1至1:1的范圍內(nèi)。

114.一種測序多核苷酸的方法，所述方法包括提供：包括孔陣列的裝置，至少一個(gè)孔與ISFET可操作地連接，并且包括通過項(xiàng)1-80中任一項(xiàng)的方法形成的顆粒，所述顆粒附著至多核苷酸，將包括預(yù)定類型的核苷酸的溶液施加于所述裝置，和觀測對(duì)所述施加溶液的離子應(yīng)答。

115.一種用于核苷酸摻入的方法，所述方法包括：提供通過項(xiàng)1-80中任一項(xiàng)的方法形成的顆粒，所述顆粒附著至包括與引物雜交的模板核酸的核酸雙鏈體，所述雙鏈體與聚合酶結(jié)合；使所述顆粒與一種或多種核苷酸接觸；和使用所述聚合酶將至少一種核苷酸摻入所述引物的末端上。

116.項(xiàng)115的方法，其中所述摻入還包括生成核苷酸摻入的副產(chǎn)物。

117.項(xiàng)115或116的方法，所述方法還包括通過使用場效應(yīng)晶體管(FET)檢測所述副產(chǎn)物來檢測所述摻入。

118.一種形成顆粒的方法，所述方法包括：促進(jìn)種子顆粒在水性懸浮液中形成分散相；在所述分散相中，使具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的親水性單體的多個(gè)聚體單元聚合，由此形成包括多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)的聚合物顆粒；和將所述聚合物顆粒轉(zhuǎn)換為水凝膠顆粒。

119.一種形成顆粒的方法，所述方法包括：提供在水性懸浮液中的種子顆粒，所述種子顆粒包括疏水性聚合物；促進(jìn)所述種子顆粒在所述水性懸浮液中形成分散相；在所述分散相中，使具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的親水性單體的多個(gè)聚體單元聚合，由此形成包括具有多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)的親水性聚合物的聚合物顆粒，所述聚合物顆粒包括所述疏水性聚合物；從所述親水性聚合物中切割所述多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)；和從所述聚合物顆粒中提取所述疏水性聚合物，形成水凝膠顆粒。

120.一種顆粒群體，所述顆粒群體具有不超過5％的變異系數(shù)并且包括由羥烷基丙烯酰胺和二丙烯酰胺聚合形成的聚合物，所述二丙烯酰胺包括羥基，其中當(dāng)暴露于水時(shí)，所述顆粒吸收基于所述聚合物重量至少300重量％的水。

121.項(xiàng)120的顆粒，其中當(dāng)暴露于水時(shí)，所述顆粒吸收基于所述聚合物重量至少1000重量％的水。

122.項(xiàng)120或121的顆粒，其中所述顆粒具有不超過100微米的粒度。

123.項(xiàng)122的顆粒，其中所述粒度不超過30微米。

124.項(xiàng)123的顆粒，其中所述粒度不超過1.5微米。

125.項(xiàng)120-124中任一項(xiàng)的顆粒，其中所述羥烷基丙烯酰胺包括羥乙基丙烯酰胺。

126.項(xiàng)120-125中任一項(xiàng)的顆粒，其中所述羥烷基丙烯酰胺包括N-[三(羥甲基)甲基)丙烯酰胺、N-(羥甲基)丙烯酰胺，或其組合。

127.項(xiàng)120-126中任一項(xiàng)的顆粒，其中所述二丙烯酰胺包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)雙(2-羥乙基)丙烯酰胺、N,N’-(2-羥丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、其受保護(hù)的衍生物，或其組合。

應(yīng)當(dāng)指出并非需要在上文一般描述或例子中所述的活動(dòng)的全部，特定活動(dòng)的一部分可能是不需要的，并且一種或多種進(jìn)一步活動(dòng)可加上所述活動(dòng)進(jìn)行。再進(jìn)一步地，其中活動(dòng)列出的次序不一定是其中它們進(jìn)行的次序。

在前述說明書中，已就具體實(shí)施方式而言描述概念。然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解可作出多種修飾和變化，而不背離如下文權(quán)利要求中所示的本發(fā)明范圍。相應(yīng)地，說明書和附圖應(yīng)以舉例說明而不是限制性含義加以考慮，并且所有此類修飾預(yù)期包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

如本文使用的，術(shù)語“包含”、“包括”、“具有”或其任何其他變型預(yù)期覆蓋非排他性包括。例如，包括一系列特征的過程、方法、物品或儀器不一定僅限于這些特征，而是可包括對(duì)此類過程、方法、物品和或儀器未明確列出或固有的其他特征。此外，除非另有明確相反描述，“或”指包括性或而不是排他性或。例如，條件A或B由下述中的任何一種滿足：A是真實(shí)的(或存在的)并且B是假的(或不存在的)，A是假的(或不存在的)并且B是真實(shí)的(或存在的)，以及A和B均為真實(shí)的(或存在的)。

另外，“一個(gè)”或“一種”的使用用于描述本文描述的元件和組分。這僅為了方便而完成，并且給出本發(fā)明范圍的一般含義。該描述應(yīng)視為包括一個(gè)/種或至少一個(gè)/種，并且單數(shù)還包括復(fù)數(shù)，除非很明顯它以其他方式指出。

益處、其他優(yōu)點(diǎn)和問題的解決方案已在上文就具體實(shí)施方式而言進(jìn)行描述。然而，益處、優(yōu)點(diǎn)、問題的解決方案以及可引起任何益處、優(yōu)點(diǎn)或解決方案發(fā)生或變得更明顯的任何一個(gè)或多個(gè)特征不應(yīng)解釋為任何或所有權(quán)利要求的關(guān)鍵、所需或基本特征。

在閱讀說明書后，技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解為了清楚起見，本文在分開實(shí)施方式的上下文中描述的某些特征還可在單個(gè)實(shí)施方式中組合提供。相反，為了簡要起見，在單個(gè)實(shí)施方式的上下文中描述的多個(gè)特征還可分開或在任何子組合中提供。此外，對(duì)范圍中所述的值的提及包括在該范圍內(nèi)的每個(gè)和每一個(gè)值。