本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是一種從擬缺香茶菜中提取的化合物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

香茶菜屬植物資源豐富，多具有清熱解毒、活血化瘀、抗菌、抗腫瘤等作用。在眾多藥用植物中，香茶菜屬植物也是被認為最有希望獲得抗腫瘤先導化合物的植物，近年來，大量新的具有細胞毒性的香茶菜二萜類成分被發(fā)現(xiàn)，一批化合物作為抗腫瘤候選化合物進入研發(fā)階段，如冬凌草甲素、毛萼香茶菜甲素、大葉香茶菜庚素等，相關(guān)中藥產(chǎn)品的銷售額也呈逐年增長的態(tài)勢，如三姐妹片(細葉香茶菜)、冬凌草糖漿、片(冬凌草)、消炎利膽片(含溪黃草)等。擬缺香茶菜isodonexcisoides(y.z.sunexc.h.hu)hara，別名野紫蘇，始載于《救荒本草》，屬多年生草本植物，廣泛分布于河南山區(qū)；在民間入煎劑，主要用于治療肝炎、慢性咽炎、食道癌等。在河南西部山區(qū)入煎劑用于慢性咽炎及食管癌的治療，其療效優(yōu)于冬凌草。從擬缺香茶中有望獲得更多結(jié)構(gòu)新穎、抗腫瘤活性顯著的香茶菜二萜。但多年來從該植物中僅報道了20多個香茶菜二萜類化合物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種從擬缺香茶菜中提取的化合物及其制備方法和應(yīng)用，可有效解決擬缺香茶菜中香茶菜二萜同系物分離制備的問題。

解決的技術(shù)方案是，一種從擬缺香茶菜中提取的化合物，所述化合物的結(jié)構(gòu)式為：

白色結(jié)晶，分子量394，分子式c22h34o6，不飽和度6，最大吸收波長為235nm；結(jié)構(gòu)為1α–乙?；?7α,14β,20α-三羥基-對映-貝殼杉烷-16-烯-15-酮，為二萜化合物，命名為excisoidesd。

所述化合物的制備方法，包括以下步驟：

（1）取擬缺香茶菜地上部分8-12kg干燥，粉碎，加水280-350l，90-110°c煮沸提取2-3次，每次提取1-2h，濃縮得相當于生藥0.1g/ml的樣品溶液；

（2）將步驟（1）所得樣品溶液上樣于徑高比6：1的d-101大孔吸附樹脂柱，依次經(jīng)過水、質(zhì)量濃度分別為25-35%、65-75%、90-98%的乙醇洗脫，得到fr.a、fr.b、fr.c和fr.d四個部分；

（3）取fr.b15-25g，經(jīng)徑高比8：1的mci凝膠柱色譜，依次用體積比3：7的甲醇-水混合液1.5l、體積比1：1的甲醇-水混合液2.5l和甲醇溶液洗脫，得到fr.b1、fr.b2和fr.b3三個部分；

（4）取fr.b14-6g，經(jīng)徑高比10：1的sephadexlh-20柱，依次用體積比2：7的甲醇-水混合液1l、體積比3：7的甲醇-水混合液1l和體積比1：1的甲醇-水混合液1l洗脫，得到fr.b1-1、fr.b1-2和fr.b1-3三個部分；

（5）取fr.b1-11-2g經(jīng)半制備hplc，以體積比20-30：70-80的meoh–h2o混合液為流動相，以速度2.7ml/min進一步純化，檢測波長235nm，于25.5min得到從擬缺香茶菜中提取的化合物。

該化合物具有抗腫瘤和抑制腫瘤的作用，有效用于對腫瘤的治療，實現(xiàn)在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提取分離過程簡單，易于操作，導向性強，分離速度快，產(chǎn)品純度高，分離效率高，基于臨床常用的用藥方式的提示，結(jié)合大孔吸附樹脂富集技術(shù)、小孔樹脂富集技術(shù)及半制備液相技術(shù)等現(xiàn)代分離技術(shù)對擬缺香茶菜的抗腫瘤活性成分進行分離制備，分離制備出比冬凌草甲素抗腫瘤活性更高的化合物或先導化合物，經(jīng)實驗證明該化合物具有顯著的細胞毒活性，是一種有效提取具有抗腫瘤活性化合物的新方法，開拓了擬缺香茶菜藥物的新用途和應(yīng)用價值，為制備抗腫瘤作用的藥物提供了先導化合物，經(jīng)濟和社會效益顯著。

具體實施方式

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明具體實施方式作進一步詳細說明。

實施例1

所述從擬缺香茶菜中提取的化合物的制備方法，包括以下步驟：

（1）取擬缺香茶菜地上部分10kg干燥，粉碎，加水320l，90°c煮沸提取3次，每次提取1.5h，濃縮得相當于生藥0.1g/ml的樣品溶液；

（2）將步驟（1）所得樣品溶液上樣于徑高比6：1的d-101大孔吸附樹脂柱，依次經(jīng)過水和質(zhì)量濃度分別為30%、70%、95%的乙醇洗脫，得到fr.a、fr.b、fr.c和fr.d四個部分；

（3）取fr.b20g，經(jīng)徑高比8：1的mci凝膠柱色譜，依次用體積比3：7的甲醇-水混合液1.5l、體積比1：1的甲醇-水混合液2.5l和甲醇溶液洗脫，得到fr.b1、fr.b2和fr.b3三個部分；

（4）取fr.b15g，經(jīng)徑高比10：1的sephadexlh-20柱，依次用體積比2：7的甲醇-水混合液1l、體積比3：7的甲醇-水混合液1l和體積比1：1的甲醇-水混合液1l洗脫，得到fr.b1-1、fr.b1-2和fr.b1-3三個部分；

（5）取fr.b1-11.5g經(jīng)半制備hplc，以體積比25：75的meoh–h2o混合液為流動相，以速度2.7ml/min進一步純化，檢測波長235nm，于25.5min得到從擬缺香茶菜中提取的化合物。

實施例2

所述從擬缺香茶菜中提取的化合物的制備方法，包括以下步驟：

（1）取擬缺香茶菜地上部分8kg干燥，粉碎，加水280l，90°c煮沸提取2次，每次提取1h，濃縮得相當于生藥0.1g/ml的樣品溶液；

（2）將步驟（1）所得樣品溶液上樣于徑高比6：1的d-101大孔吸附樹脂柱，依次經(jīng)過水和質(zhì)量濃度分別為25%、65%、90%的乙醇洗脫，得到fr.a、fr.b、fr.c和fr.d四個部分；

（3）取fr.b15g，經(jīng)徑高比8：1的mci凝膠柱色譜，依次用體積比3：7的甲醇-水混合液1.5l、體積比1：1的甲醇-水混合液2.5l和甲醇溶液洗脫，得到fr.b1、fr.b2和fr.b3三個部分；

（4）取fr.b14g，經(jīng)徑高比10：1的sephadexlh-20柱，依次用體積比2：7的甲醇-水混合液1l、體積比3：7的甲醇-水混合液1l和體積比1：1的甲醇-水混合液1l洗脫，得到fr.b1-1、fr.b1-2和fr.b1-3三個部分；

（5）取fr.b1-11g經(jīng)半制備hplc，以體積比2：7的meoh–h2o混合液為流動相，以速度2.7ml/min進一步純化，檢測波長235nm，于25.5min得到從擬缺香茶菜中提取的化合物。

實施例3

所述從擬缺香茶菜中提取的化合物的制備方法，包括以下步驟：

（1）取擬缺香茶菜地上部分12kg干燥，粉碎，加水350l，110°c煮沸提取3次，每次提取2h，濃縮得相當于生藥0.1g/ml的樣品溶液；

（2）將步驟（1）所得樣品溶液上樣于徑高比6：1的d-101大孔吸附樹脂柱，依次經(jīng)過水和質(zhì)量濃度分別為35%、75%、98%的乙醇洗脫，得到fr.a、fr.b、fr.c和fr.d四個部分；

（3）取fr.b25g，經(jīng)徑高比8：1的mci凝膠柱色譜，依次用體積比3：7的甲醇-水混合液1.5l、體積比1：1的甲醇-水混合液2.5l和甲醇溶液洗脫，得到fr.b1、fr.b2和fr.b3三個部分；

（4）取fr.b16g，經(jīng)徑高比10：1的sephadexlh-20柱，依次用體積比2：7的甲醇-水混合液1l、體積比3：7的甲醇-水混合液1l和體積比1：1的甲醇-水混合液1l洗脫，得到fr.b1-1、fr.b1-2和fr.b1-3三個部分；

（5）取fr.b1-12g經(jīng)半制備hplc，以體積比3：8的meoh–h2o混合液為流動相，以速度2.7ml/min進一步純化，檢測波長235nm，于25.5min得到從擬缺香茶菜中提取的化合物。

本發(fā)明化合物經(jīng)色譜質(zhì)譜儀測定，結(jié)構(gòu)式為：

白色結(jié)晶，由hr-esi-msm/z：410.25214[m+nh4]⁺，hr-esi-msm/z:417.22367[m+na]⁺，可知其分子量為394，結(jié)合¹h-nmr(cdcl3,500mhz)和¹³c-nmr(cdcl3,125mhz)數(shù)據(jù)，確定其分子式為c22h34o6，不飽和度為6。

uv光譜顯示該化合物最大吸收波長為235nm。ir光譜顯示3509cm^?1和1718cm^?1的伸縮振動，提示該化合物具有羥基及酯羰基的結(jié)構(gòu)片段?；衔锏?sup>13c-nmr顯示有22個碳信號，結(jié)合dept譜可知化合物結(jié)構(gòu)中存在2個甲基信號：δc22.4,33.7；7個亞甲基信號(包括1個氧亞甲基(δc63.7)，6個次甲基信號(包括3個聯(lián)氧次甲基(δc81.6,76.1,75.4)，3個季碳，一個酮羰基(δc210.1)及一個乙?；?δc171.8(s),21.5(q)；進一步由hmqc譜歸屬了化合物的碳氫對應(yīng)關(guān)系，見表1。在化合物的hmbc譜中,沒有發(fā)現(xiàn)7β-h(δh4.10)與δc61.4(c-20)的交叉相關(guān)信號。結(jié)合從該植物中分離得到的香茶菜二萜類化合物的結(jié)構(gòu)特征，推測該化合物具有7,20-不環(huán)氧的對映-貝殼杉烷骨架，具有3個羥基及1個乙?；〈Ｗ屑毐容^該化合物和已知化合物鄂西香茶菜素的ms,nmr,與ir數(shù)據(jù)，提示該化合物為鄂西香茶菜素的同分異構(gòu)體。比較該化合物與已知化合物鄂西香茶菜素的hmbc譜數(shù)據(jù)，可知它們的差異主要在于羥基和乙酰基的取代位置不同。在該化合物的hmbc譜中，1β-h（δh4.51）與ch3coo-(δc171.8)、ch3coo-（δh1.96）與ch3coo-(δc171.8)相關(guān),表明乙?；挥赾-1上。另外，h-7(δ4.20)與c-14(δc76.1),h-14(δ4.82)與c-12(δc24.2),c-15(δc210.8),h-20(δh4.14and4.15)與c-5(δc76.1),c-1(δc85.4)相關(guān)，表明該化合物的3個羥基取代基分別位于c-7,c-14,及c-20上?；衔锏南鄬?gòu)型是由roesy譜確定的。在roesy譜中，h-1與h-5相關(guān)，h-9和18-甲基與h-5相關(guān),h-7與h-5和h-9相關(guān),h-13與h-14和h-16相關(guān),表明它們位于同一側(cè),而h-14,h-13,與h-16位于另一側(cè)。該化合物的絕對構(gòu)型由單晶x-射線衍射分析確定。6個手性中心c-5,c-7,c-8,c-9,c-10,c-13,的構(gòu)型為r,s,s,s,r,r。因此，該化合物的結(jié)構(gòu)為1α–乙?；?7α,14β,20α-三羥基-對映-貝殼杉烷-16-烯-15-酮。該化合物為一新的二萜，命名為excisoidesd

表1.excisoidesd的¹h-and¹³c-nmr數(shù)據(jù)(500and125mhzδinppm)

采用的儀器與材料：

shimadzudouble-beam210a紫外光譜儀(shimadzu,kyoto,日本)；

brukeravⅲ500-nmr核磁共振儀(bruker,billerica,德國)；

ltqorbitrap高分辨質(zhì)譜儀(thermofisherscientific,bremen,德國)；

waters600/waters2487型半制備高效液相色譜儀(waters,milford,ma,美國)；

色譜柱為ymcc18柱(250mm×10mmi.d.5μm,日本ymc公司)；

柱層析硅膠(200-300目,300-400目,青島海洋化工有限公司)；d101型大孔樹脂(上海摩速科學器材有限公司)；葡聚糖凝膠sephadexlh-20為(瑞典pharmacia公司)；mci樹脂chp20(75-150μm)(日本mitsubishi化學公司)；

氘代試劑：dmso-d6、cd3od和cdcl3(cambridgeisotopelaboratories,usa)；hct-116、hepg2、bgc-823、nci-h1650和a2780細胞株(中國協(xié)和醫(yī)科大學藥物研究所藥物篩選中心傳代培養(yǎng))。所用試劑均為分析純或色譜純。

bio-rad酶聯(lián)免疫檢測儀(model-550)；

臺式高速冷凍離心機(索福st-21，美國產(chǎn))；

半自動分析測定儀(humanlyzer2000,德國產(chǎn))；adventurer^tm電子天平(奧豪斯國際貿(mào)易上海有限公司)；潔凈工作臺，北京昌平長城空氣凈化設(shè)備工程公司；

yamatoc02培養(yǎng)箱(ip-31yamato科技有限公司)；

96孔板購于美國corning公司；

3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(mtt，)和二甲基亞砜(dmso)購于美國sigma-aldrich公司；

胎牛血清(fbs，批號989267)；

rpmi1640培養(yǎng)基購于美國lifetechnologies公司；

青鏈霉素混合液購于北京索萊寶科技有限公司；

hct-116、hepg2、bgc-823、nci-h、1650、a2780細胞株(協(xié)和醫(yī)科大學藥物研究所藥物篩選中心傳代培養(yǎng))；

采用mtt法測定了excisoidesd的抗腫瘤活性，excisoidesd對5種腫瘤細胞株：hct-116、a2780、nci-h1650、bgc-823、hepg2均具有顯著的細胞毒性。

excisoidesd的抗腫瘤實驗方法：將hct-116、a2780、nci-h1650、bgc-823、hepg2腫瘤細胞分別加入到1640培養(yǎng)液(含10%fbs、100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞，分別以每孔5×10³個細胞的密度接種于96孔板中，37℃、5%co2環(huán)境中培養(yǎng)24小時；用含血清的培養(yǎng)基稀釋的受試化合物溶液，化合物的終濃度分別為0.25、2.5、10、25、50、100μmol/l，dmso終濃度不超過0.1%。每孔加入200μl藥液，設(shè)5個平行孔,并設(shè)陰性對照組。37℃、5%co2環(huán)境中，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。

每孔中加入20μlmtt溶液(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，傾去培養(yǎng)液。再向每孔中加入150μldmso溶解生成的甲臜結(jié)晶，用酶標儀于540nm波長處測定吸光度(a)值，計算細胞增殖抑制率。

細胞增殖抑制率＝(a對照－a給藥)/a對照

以細胞增殖抑制率對藥物濃度的對數(shù)值進行回歸，計算半數(shù)抑制濃度(ic50)值，活性測定結(jié)果見表2。

表2.化合物對5種腫瘤細胞株的細胞毒活性測定結(jié)果

由表2可知，化合物對5種細胞株的均具有顯著的細胞毒活性，其細胞毒作用趨勢強于冬凌草甲素。

以excisoidesd為主要成分，制備了一種抗腫瘤藥物，進行了體內(nèi)抗腫瘤實驗。

試驗方法：清潔級實驗動物裸鼠，鼠齡6~8周，選雌性裸鼠110只，各裸鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)l周后，進行a549的接種。取對數(shù)生長期的a549細胞，用胰酶消化收集，pbs洗滌兩次，離心，計數(shù)后用無菌生理鹽水調(diào)細胞濃度為3×10⁷個/ml，種于裸鼠左前上肢，每只0.2ml，接種1周后，瘤體呈橢圓形時，隨機分組。

稱量各荷瘤裸鼠體重，按瘤體積大小分別隨機分為11組，每組10只。分別灌服制備的抗腫瘤藥物高中低劑量（200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg，灌胃體積均為0.2ml/10g），陽性對照組（平陽霉素），陰性對照組（生理鹽水）。連續(xù)灌胃給藥18d。觀察擬缺香茶菜不同提取部位對腫瘤細胞生長的影響，末次給藥24h后，剝瘤稱重。用游標卡尺測量瘤體最大長徑(x)、橫徑(y)，計算各組平均腫瘤體積、繪制生長曲線。停藥2d后，處死動物，剝離腫瘤稱濕重，計算各組平均瘤重(w)及抑瘤率(ir)。

腫瘤體積(v)=(1/2)x2y；ir(%)=[(陰性對照組平均瘤重—治療組平均瘤重)/陰性對照組平均瘤重×100%。采用spss10.0統(tǒng)計軟件包進行方差分析和q檢驗比較各組結(jié)果。

a549裸小鼠移植瘤給藥后第18天解剖時，制備的抗腫瘤藥物大、中劑量組均顯示有顯著的抑瘤作用。實驗結(jié)束時，與對照組腫瘤體積(2012士625mm³)相比，大、中劑量組的腫瘤體積分別為528±407和1657±622mm³。從腫瘤體積可以看出，制備的抗腫瘤藥物在200mg／kg和100mg／kg劑量下都可以顯著抑制a549腫瘤的生長，具有很好的抗腫瘤活性。

本發(fā)明經(jīng)多次反復實驗和測定，均取得了相同或相近的結(jié)果，方法穩(wěn)定可靠，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可靠，具有實際的應(yīng)用價值，excisoidesd作為抗腫瘤先導化合物具有巨大的開發(fā)前景。

本發(fā)明提取分離過程簡單，易于操作，導向性強，分離速度快，產(chǎn)品純度達到98%，分離效率高，基于臨床常用的用藥方式的提示，結(jié)合大孔吸附樹脂富集技術(shù)、小孔樹脂富集技術(shù)及半制備液相技術(shù)等現(xiàn)代分離技術(shù)對擬缺香茶菜的抗腫瘤活性成分進行分離制備，分離制備出比冬凌草甲素抗腫瘤活性更高的化合物或先導化合物，經(jīng)實驗證明該化合物具有顯著的細胞毒活性，是一種有效提取具有抗腫瘤活性化合物的新方法，新化合物開拓了制備具有抗腫瘤作用的藥物提供了技術(shù)支持，經(jīng)濟和社會效益顯著。