本發(fā)明屬于作物遺傳育種領(lǐng)域，具體涉及一個(gè)控制水稻表面茸毛生長(zhǎng)發(fā)育的基因OsGL6。

背景技術(shù)：

茸毛是植物體抵御外界環(huán)境刺激的一道天然屏障，在植物體生長(zhǎng)發(fā)育過程中起到非常重要的作用，如減少水分蒸發(fā)，反射太陽(yáng)強(qiáng)光，抗紫外輻射，抗蟲害及病原菌侵染等特點(diǎn)。

在水稻中至今發(fā)現(xiàn)與水稻茸毛生長(zhǎng)發(fā)育的相關(guān)的基因有g(shù)l1，gl2，Hl1，Hl2和Hg，其中g(shù)l1與gl2為一對(duì)串聯(lián)重復(fù)的基因。葉片茸毛基因Hl-a和Hl-b屬于兩個(gè)互補(bǔ)的基因，Yu等（1995）研究表明水稻葉片及穎殼的無(wú)毛基因gl1位于水稻5號(hào)染色體上，與RFLP標(biāo)記RG182和RG403的物理距離分別為14.3±7.4 cM，20.9±8.3 cM, Wang等（2009）找到了與gl1緊密連鎖的SSR標(biāo)記RM1024、RM1200、GL8及GL311，gl1位于標(biāo)記GL8與GL311之間230 kb的區(qū)域內(nèi)，根據(jù)水稻基因組物理圖譜分析認(rèn)為該區(qū)域有兩個(gè)BAC克隆含有無(wú)毛基因。Li等（2010）的進(jìn)一步研究表明，以93-11的突變體為材料，將gl1定位于標(biāo)記RM1200/RM17786和RM2010/RM17801之間，遺傳距離分別為1.0 cM和1.0 cM，并且精細(xì)定位在標(biāo)記ID33和ID44之間54 kb的區(qū)域內(nèi)，該區(qū)域包含有10個(gè)候選基因，對(duì)其中一個(gè)候選基因（編號(hào)為Os05g0119000）進(jìn)行克隆，預(yù)測(cè)結(jié)果表明這是與鋁耐受性相關(guān)的基因，分析表明4個(gè)gl1突變體和光身稻品種在候選基因Os05g0118900的5’-UTR區(qū)具有一個(gè)共同的A→T點(diǎn)的突變，該突變影響mRNA的折疊和二級(jí)結(jié)構(gòu)。牟文斌（2013）利用來(lái)源于斯里蘭卡的茸毛葉秈稻品種蘇旺往爾與粳稻日本晴、寧稻1號(hào)，將茸毛基因HL1精細(xì)定位于6號(hào)染色體的InDel標(biāo)記WB17和WB23之間，物理距離為12.7kb，預(yù)測(cè)了一個(gè)基因LOC_Os06g44750，該基因編碼含AP2結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，由此判斷該基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子在表皮茸毛發(fā)育進(jìn)程中起到關(guān)鍵的調(diào)控作用。據(jù)研究，Glabrous Rice1(GLR1)/WUSCHEL-likehomeobox(OsWOX3B)/DEPILOUS (DEP)基因?qū)λ救酌陌l(fā)育具有重要作用，研究發(fā)現(xiàn)葉片和穎殼具有茸毛材料的三個(gè)突變體都不具有茸毛。Wang 等(2013)鑒定了一個(gè)水稻茸毛相關(guān)的突變體glr2，并將該突變體基因glr2精細(xì)定位在水稻的第1號(hào)染色體上，位于標(biāo)記RM12124和RM12136之間84.7Kb的區(qū)間內(nèi)，該區(qū)間含有12個(gè)候選基因。本研究利用具有茸毛特性的水稻品種75-1-127與無(wú)茸毛品種明恢63進(jìn)行正反交，構(gòu)建遺傳學(xué)群體，結(jié)果表明水稻葉片表面茸毛性狀是由單個(gè)的細(xì)胞核顯性基因控制的，其中有毛性狀表現(xiàn)為顯性性狀，無(wú)毛性狀為隱性性狀，并將茸毛基因OsGL6精細(xì)定位于水稻6號(hào)染色體上，位于插入缺失標(biāo)記InDel-106和InDel-115之間，遺傳距離分別為0.3cM和0.1cM，通過生物信息學(xué)分別在粳稻日本晴和秈稻93-11的基因組預(yù)測(cè)中有8個(gè)和7個(gè)預(yù)測(cè)基因。通過預(yù)測(cè)，表達(dá)載體構(gòu)建及相關(guān)表達(dá)分析，我們成功的獲得了控制茸毛生長(zhǎng)發(fā)育的基因暫命名為OsGL6。

茸毛是研究植物體形態(tài)建成，細(xì)胞命運(yùn)決定，細(xì)胞分化的一個(gè)很好的研究對(duì)象，近年來(lái)，在雙子葉模式植物體擬南芥中，對(duì)該特性的研究已經(jīng)有了較為深入的探究，且初步了解了控制該性狀表達(dá)的網(wǎng)絡(luò)機(jī)制。但是在單子葉植物體水稻中，有報(bào)道指出其控制茸毛性狀的表達(dá)可能與雙子葉的控制機(jī)制不同，固本發(fā)明將對(duì)研究水稻這一單子葉植物茸毛的研究就顯得非常有意義。

本發(fā)明在原有報(bào)道控制水稻茸毛發(fā)育的基因OsGL1外，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的控制水稻茸毛生長(zhǎng)發(fā)育的新基因OsGL6，因此，進(jìn)一步研究水稻該基因的功能研究，闡明該基因的控制機(jī)制及水稻新材料的分子創(chuàng)制提供理論依據(jù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一個(gè)控制水稻表面茸毛生長(zhǎng)發(fā)育的基因OsGL6。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明涉及一種水稻茸毛發(fā)育相關(guān)的基因OsGL6（Oryza sativa glabrous 6，縮寫為OsGL6），其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明涉及上述水稻茸毛相關(guān)基因OsGL6的蛋白，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明涉及上述水稻茸毛生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因在水稻遺傳育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：發(fā)明中涉及的水稻茸毛相關(guān)基因OsGL6，該基因可能與不利環(huán)境下的逆境脅迫等環(huán)境影響因素相關(guān)，能夠提高水稻的抗旱能力，抗紫外輻射，抗蟲害等特點(diǎn)，提高水稻的產(chǎn)量與品質(zhì)。同時(shí)也為闡明茸毛在水稻單子葉植物中的調(diào)控機(jī)制提供更深入的研究提供理論依據(jù)。

附圖說明

圖1. 具有表達(dá)性差異基因。

圖2. 茸毛相關(guān)基因與候選基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中，凡未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的，均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1：水稻茸毛相關(guān)基因OsGL6的基因定位及生物信息學(xué)分析

以茸毛突變體75-1-127為供體親本，以光身稻品種Lemont為受體親本雜交，之后以Lemont為輪回親本回交2代，得F1，F(xiàn)2。通過初定位及精細(xì)定位，最終得到位于6號(hào)染色體在插入缺失標(biāo)記InDel-106和InDel115之間分別為0.1cM和0.3cM之間的物理距離之間，對(duì)于參考基因組日本晴序列大小為79kb.

通過對(duì)該區(qū)域進(jìn)行生物信息學(xué)分析及相關(guān)網(wǎng)站的預(yù)測(cè)（Softberry:http://linux1.softberry.com/berry.phtml;RGAP:http://rice.plantbiology.msu.edu/;Phytozome:https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html;Gramene:http://www.gramene.org/），得到該期間共7個(gè)候選基因，基因分別是：Loc_Os06g44750（AP2 domain containing），Loc_Os06g44760，Loc_Os06g44770，Loc_Os06g44780，Loc_Os06g44790，Loc_Os06g44810，Loc_Os06g44820(PPR repeat domain containing protein)。將此7個(gè)候選基因分別進(jìn)行熒光定量（qRT-PCR）表達(dá)性分析以及生物信息學(xué)分析，基因表達(dá)性結(jié)果與分析網(wǎng)站如下：

熒光定量表達(dá)性分析結(jié)果（見圖1）：結(jié)果顯示在不同水稻品種中，7個(gè)候選基因只有Loc_Os06g44750, Loc_Os06g44810, Loc_Os06g44820三個(gè)基因表達(dá)差異呈2倍以上，差異顯著。

同時(shí)，我們還將上述基因與在植物體中控制茸毛相關(guān)的基因（如擬南芥中ATGL1，ATGL3，水稻中的OsGL1，OsWOX3等）構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果如下（見圖2）：分析結(jié)果表明Loc_Os06g44810與水稻茸毛發(fā)育相關(guān)基因OsGL1同源性最近，并且與擬南芥ATGL1，ATMYB23，ATGL3同屬同一分支，很可能參與茸毛的形成。

在以上分析的基礎(chǔ)上，我們又對(duì)候選基因進(jìn)行了基因序列差異上的序列比對(duì)，通過比對(duì)，最終我們將Loc_Os06g44810基因確定為控制本研究親本茸毛基因的候選基因,暫命名為OsGL6。

實(shí)施例2：水稻茸毛基因OsGL6的克隆及序列分析

根據(jù)Loc_Os06g44810參考基因序列設(shè)計(jì)引物，并以75-1-127及Lemont的DNA為模板，克隆相應(yīng)的DNA序列。

1、試劑

高保證DNA聚合酶Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase購(gòu)于Vazyme公司；引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成，其余試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

2、大腸桿菌菌株和植物材料

大腸桿菌(Escherichia coli) 菌株DH5α購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；廣譜抗稻瘟病水稻品種云引由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

3、培養(yǎng)基和溶液

LB 培養(yǎng)基: 胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。用NaOH 調(diào)pH 至7.0，高壓滅菌。

按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃ 3min(預(yù)變性) ；95℃ 30s(變性)，55℃ 30s(復(fù)性)，72℃ 120s(延伸)，所述變性- 復(fù)性- 延伸30 個(gè)循環(huán)；72℃ 5min(總延伸)。

引物序列如下：

OsGL6-F: ACGTTCAGAAATCCATCCGC；

OsGL6-R: GCTTAATCGCAAACTGAGGC。

通過上述引物進(jìn)行基因擴(kuò)增，得到OsGL6基因產(chǎn)物并送到博尚生物技術(shù)公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用NCBI、BLAST及DNAMAN等軟件進(jìn)行比較分析。測(cè)序結(jié)果通過比對(duì)，75-1-127與lemont存在3個(gè)氨基酸的差異，分別如下：

第一個(gè)點(diǎn)：P→L：即脯氨酸→亮氨酸；

第二個(gè)點(diǎn)：T→A: 即蘇氨酸→丙氨酸；

第三個(gè)點(diǎn)：F→I：即苯丙氨酸→異亮氨酸。

實(shí)施例3：水稻OsGL6基因的表達(dá)載體構(gòu)建

（1）過表達(dá)載體的構(gòu)建：

選擇載體pCambia-1301為目的基因連接表達(dá)載體，酶切位點(diǎn)選擇為Bgl Ⅱ和Bst EⅡ；同時(shí)用Primer premier 5 設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增目的片段，引物設(shè)計(jì)如下：

F:TGCAGATCTGCCACCGCCTCAATTTATCC；

R:TCAGGTTACCAGAGTAAGGCTGCAATGTC。

擴(kuò)增后的目的片段與載體進(jìn)行連接，連接體系：

Insert DNA：2ｕL；

載體：1ｕL；

T4連接酶：1ｕL；

Buffer：1ｕL；

ddH₂O：5ｕL；

連接后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化感受態(tài)為大腸桿菌DH5a,轉(zhuǎn)化提取質(zhì)粒后同樣的方法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)HA105，同時(shí)-80℃保存以備進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。

（2）RNAi干擾載體的構(gòu)建：

干擾載體選擇PTCK303，酶切引物分別為SpeI/SacI，KpnI/BamHI ，并且通過NCBI的BLAST功能，對(duì)目的基因進(jìn)行BLAST，選取特異性片段約200bp左右，并設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)如下：

SpeI/SacI酶切片段的引物：

F: agattttcaatcgatactagtCACATGATGTCACAGTAAAGTCAGAGA

R: cgatcggggaaattcgagctcAGGCTGCAATGTCCTTCAGAGA

KpnI/BamHI酶切片段的引物：

F: tctgtcgacctcgagggtaccCACATGATGTCACAGTAAAGTCAGAGA

R: caggtcgactctagaggatccAGGCTGCAATGTCCTTCAGAGA

分別進(jìn)行目的基因片段的擴(kuò)增及片段連接，連接轉(zhuǎn)化體系同上，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)HA105后同樣-80℃保存以備進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。

（3）Crispr/Cas9敲除載體的構(gòu)建

設(shè)計(jì)靶點(diǎn)，靶點(diǎn)最好帶酶切位點(diǎn)（Cas9切割點(diǎn)（離PAM/NGG 3bp）位于酶切位點(diǎn)中），然后到http://www.rgenome.net/cas-offinder/網(wǎng)站評(píng)估脫靶情況。

設(shè)計(jì)引物，引物結(jié)構(gòu)如下：

PCR擴(kuò)增：以稀釋100倍的pCBC-MT1T2為模板進(jìn)行四引物PCR擴(kuò)增。-BsF/-BsR為正常引物濃度；-F0/-R0稀釋20倍。

純化回收PCR產(chǎn)物，建立如下酶切-連接體系（restriction-ligation）：

方法一：

連接轉(zhuǎn)化體系同上，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)HA105后同樣-80℃保存以備進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所

<120> 一個(gè)控制水稻表面茸毛生長(zhǎng)發(fā)育的基因OsGL6

<130> 14

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1446

<212> DNA

<213> 水稻OsGL6基因

<400> 1

atggagtcac ccgccgcggg cggcgcgtct ccggcgccgg aggctcctcc gcccccgccg 60

agggggtgga tctccggcct cgtctccgga gccggccgga tcctcgcctc cgtgctaggt 120

cccgactcgc ccgccgccgc ctccggctcc gccacgacga cctcagccac gtcgccgtcc 180

gcgtcctcct ccccggcgtc gtccaggcat cccggttata ttcgagatca tggtaattcc 240

ccactatttt ttctgaaagc taataagtta aacaagagtg aaaatgaagc aattatgaaa 300

gattattctg aggcatcact agcaattatc tcagagattg agccaaagga tgccataatg 360

cagttactta agcaggagac ttattcaagg tctgaatgca atgcactagt aaagataatt 420

caagagcggg ttgtggactc aaatttaaat ggagttgatg ctggtgggct tgctcttcca 480

atcaattgga agactggcag acaagcaaat attggatatt cttcattgag tccaaaagga 540

ttgttgcctg caacttcaat tcctccagtc caggaccatg tttttgataa tagtgctggt 600

gccggtgcat ctacaacaat agctcatgat aggggtcctt tcgcccacgc tactgataag 660

attcaatccg tactcaaaag aagttgctct gttgcaacgg atgcccctga ccctgaggac 720

tcccgaagag tcaggccaaa aattaatgga aattcattag aaatttcaaa ttttaagcaa 780

gtcgatgtta ttcgaactca ttcaggagat gacaataaat tatcagatgt tccccttttt 840

gggaccaaca atttaatata ttctaatatt gtttcaattg ttgggagtgc cgatgaaaaa 900

ataggcatac ctaacaaacc ttcagctggt gatgacaata aaaactatga ttctgaattt 960

ttaaatccat gtaccaataa ggatctgaag aacagcattc cattgaaggt ggaacctttg 1020

gatgtttgta ttcctttcga gcagcagatg atggatctct cacaccagaa gcatgagcat 1080

gctgcatgtg atgattcttg ttctgtctca aaattaatgt ttaaggagga tattgagact 1140

gcactcagca tgccagtggg cgtgccgcta gaaaatggtt ctaagaaccg gagacgaagg 1200

gcacccaaca cgcagaggat taccccggca aggtctcctg ccaagggttc acgtcgcaag 1260

agtaatgatg tcacagtaaa atcagagacc gacttgctag agcaaagcaa gggttcacat 1320

gatgtcacag taaagtcaga gatcgacttg ctagagcaaa gtaaattggc actgatggag 1380

cagtcaccag atttaggcga tattccggtg aagagaccag ttgggaggcc aaggaaggca 1440

aaatga 1446

<210> 2

<211> 481

<212> PRT

<213> 水稻OsGL6基因

<400> 2

Met Glu Ser Pro Ala Ala Gly Gly Ala Ser Pro Ala Pro Glu Ala Pro

1 5 10 15

Pro Pro Pro Pro Arg Gly Trp Ile Ser Gly Leu Val Ser Gly Ala Gly

20 25 30

Arg Ile Leu Ala Ser Val Leu Gly Pro Asp Ser Pro Ala Ala Ala Ser

35 40 45

Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser Ala Thr Ser Pro Ser Ala Ser Ser Ser

50 55 60

Pro Ala Ser Ser Arg His Pro Gly Tyr Ile Arg Asp His Gly Asn Ser

65 70 75 80

Pro Leu Phe Phe Leu Lys Ala Asn Lys Leu Asn Lys Ser Glu Asn Glu

85 90 95

Ala Ile Met Lys Asp Tyr Ser Glu Ala Ser Leu Ala Ile Ile Ser Glu

100 105 110

Ile Glu Pro Lys Asp Ala Ile Met Gln Leu Leu Lys Gln Glu Thr Tyr

115 120 125

Ser Arg Ser Glu Cys Asn Ala Leu Val Lys Ile Ile Gln Glu Arg Val

130 135 140

Val Asp Ser Asn Leu Asn Gly Val Asp Ala Gly Gly Leu Ala Leu Pro

145 150 155 160

Ile Asn Trp Lys Thr Gly Arg Gln Ala Asn Ile Gly Tyr Ser Ser Leu

165 170 175

Ser Pro Lys Gly Leu Leu Pro Ala Thr Ser Ile Pro Pro Val Gln Asp

180 185 190

His Val Phe Asp Asn Ser Ala Gly Ala Gly Ala Ser Thr Thr Ile Ala

195 200 205

His Asp Arg Gly Pro Phe Ala His Ala Thr Asp Lys Ile Gln Ser Val

210 215 220

Leu Lys Arg Ser Cys Ser Val Ala Thr Asp Ala Pro Asp Pro Glu Asp

225 230 235 240

Ser Arg Arg Val Arg Pro Lys Ile Asn Gly Asn Ser Leu Glu Ile Ser

245 250 255

Asn Phe Lys Gln Val Asp Val Ile Arg Thr His Ser Gly Asp Asp Asn

260 265 270

Lys Leu Ser Asp Val Pro Leu Phe Gly Thr Asn Asn Leu Ile Tyr Ser

275 280 285

Asn Ile Val Ser Ile Val Gly Ser Ala Asp Glu Lys Ile Gly Ile Pro

290 295 300

Asn Lys Pro Ser Ala Gly Asp Asp Asn Lys Asn Tyr Asp Ser Glu Phe

305 310 315 320

Leu Asn Pro Cys Thr Asn Lys Asp Leu Lys Asn Ser Ile Pro Leu Lys

325 330 335

Val Glu Pro Leu Asp Val Cys Ile Pro Phe Glu Gln Gln Met Met Asp

340 345 350

Leu Ser His Gln Lys His Glu His Ala Ala Cys Asp Asp Ser Cys Ser

355 360 365

Val Ser Lys Leu Met Phe Lys Glu Asp Ile Glu Thr Ala Leu Ser Met

370 375 380

Pro Val Gly Val Pro Leu Glu Asn Gly Ser Lys Asn Arg Arg Arg Arg

385 390 395 400

Ala Pro Asn Thr Gln Arg Ile Thr Pro Ala Arg Ser Pro Ala Lys Gly

405 410 415

Ser Arg Arg Lys Ser Asn Asp Val Thr Val Lys Ser Glu Thr Asp Leu

420 425 430

Leu Glu Gln Ser Lys Gly Ser His Asp Val Thr Val Lys Ser Glu Ile

435 440 445

Asp Leu Leu Glu Gln Ser Lys Leu Ala Leu Met Glu Gln Ser Pro Asp

450 455 460

Leu Gly Asp Ile Pro Val Lys Arg Pro Val Gly Arg Pro Arg Lys Ala

465 470 475 480

Lys

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acgttcagaa atccatccgc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcttaatcgc aaactgaggc 20

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgcagatctg ccaccgcctc aatttatcc 29

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcaggttacc agagtaaggc tgcaatgtc 29

<210> 7

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agattttcaa tcgatactag tcacatgatg tcacagtaaa gtcagaga 48

<210> 8

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cgatcgggga aattcgagct caggctgcaa tgtccttcag aga 43

<210> 9

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tctgtcgacc tcgagggtac ccacatgatg tcacagtaaa gtcagaga 48

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

caggtcgact ctagaggatc caggctgcaa tgtccttcag aga 43

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atatatggtc tctggctgga tctccggcct cgtctcgtt 39

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ttggatctcc ggcctcgtct cgttttagag ctagaaatag c 41

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

aacccgtgct aggtcccgac tcggcttctt ggtgcc 36

<210> 14

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

attattggtc tctaaacccg tgctaggtcc cgactcg 37