本發(fā)明屬于植物基因工程技術領域，具體涉及一種甘藍型油菜nap細胞質(zhì)雄性不育恢復基因及其應用。

背景技術：

植物雄性生殖器官不能產(chǎn)生正常的雄配子即花粉的現(xiàn)象稱為雄性不育，具有雄性不育特性的植物或作物品系稱為不育系。而一些品系與不育系雜交能夠產(chǎn)生具有正常育性的植株，這些植物或作物品系稱為恢復系。利用不育系作母本和恢復系作父本雜交進行雜交，可配制高純度的雜交種。因此，不育系和恢復系在作物雜交育種中具有重要價值。

對于雄性不育及其育性恢復的研究在多種農(nóng)作物如水稻、小麥、玉米、大豆、油菜等已有報道，在生產(chǎn)上已廣泛應用于雜交種生產(chǎn)。雄性不育的遺傳基礎包括核基因控制的細胞核雄性不育(Genic male sterility,簡稱GMS)和細胞質(zhì)控制的細胞質(zhì)雄性不育(Cytoplasmic male sterility,簡稱CMS)。利用CMS及其育性恢復特性進行雜交育種的方法通常稱為“三系法”，即不育系、恢復系和保持系。其中不育系具有線粒體基因組中特異基因控制的細胞質(zhì)雄性不育特性?；謴拖稻哂姓５募毎|(zhì)或不育的細胞質(zhì)，花粉正常可育，自交可結實，其特點是核基因組中攜帶育性恢復基因(fertility restorer gene，簡稱Rf)。保持系具有正常的細胞質(zhì)，花粉正?？捎浜嘶蚪M中不攜帶有功能的恢復基因。

甘藍型油菜細胞質(zhì)雄性不育有多種類型，如同源胞質(zhì)類型nap CMS和pol CMS；異源胞質(zhì)類型有ogu CMS，tour CMS，hau CMS等。pol CMS、ogu CMS及tour CMS在國內(nèi)外油菜雜交育種中有較廣泛的應用。由于大部分甘藍型油菜栽培品種中均含有nap CMS的恢復基因而表現(xiàn)為可育。只有少數(shù)品種由于缺少恢復基因Rfn而表現(xiàn)為不育或部分不育，同時nap CMS不育植株在相對較高的溫度情況下就會變?yōu)椴糠挚捎蛲耆捎?Fan和Stefan,1986)，限制了該系統(tǒng)在油菜雜交種生產(chǎn)上的應用。然而在甘藍型油菜自交系或常規(guī)品種選育過程中，經(jīng)常有品種出現(xiàn)分段結實的現(xiàn)象。具體表現(xiàn)為：低溫條件下，有效花序段部分花蕾在尚未開放時即黃化脫落，或能正常開花但不能正常發(fā)育結實，有的花即使能發(fā)育成角果，但每個角果僅有少量種子，而在溫度較高的情況下則結實完全正常。這必將導致無效角果增加，產(chǎn)量下降。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一個甘藍型油菜細胞質(zhì)雄性不育恢復基因Rfn，利用該基因可恢復甘藍型油菜nap CMS的育性，或作為分子標記，促進甘藍型油菜優(yōu)良自交系和常規(guī)品種選育。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人通過大量試驗研究并不懈努力，最終從甘藍型油菜中分離得到一種甘藍型油菜nap CMS的恢復基因Rfn，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

根據(jù)本領域的常規(guī)技術手段，本發(fā)明人可以采用已克隆的多核苷酸序列作為探針，從基因組或cDNA文庫中篩選得到本發(fā)明的基因或同源基因。同樣，采用PCR技術也可以從基因組和cNDA中擴增得到本發(fā)明的基因或任何一段感興趣的核苷酸序列或與其同源的核苷酸序列。因此，在嚴格條件下與序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列雜交且編碼相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列也屬于甘藍型油菜nap CMS的恢復基因序列。

進一步地，上述任意一種核苷酸序列經(jīng)核苷酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體也屬于甘藍型油菜nap CMS的恢復基因序列。

另外，本發(fā)明還提供了一種表達甘藍型油菜細胞質(zhì)雄性不育恢復基因Rfn的蛋白，其氨基酸序列由上述任意一種核苷酸序列編碼。進一步優(yōu)選地，所述表達甘藍型油菜細胞質(zhì)雄性不育恢復基因Rfn的蛋白，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

再者，本發(fā)明還提供了一種上述甘藍型油菜細胞質(zhì)雄性不育恢復基因Rfn的等位基因，其核苷酸序列選自以下的任意一種：

(1)序列表中SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；

(2)在嚴格條件下與(1)限定的核苷酸序列雜交且編碼相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；

(3)與(1)或(2)限定的核苷酸序列經(jīng)核苷酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體。

最后，本發(fā)明還提供了上述的甘藍型油菜細胞質(zhì)雄性不育恢復基因Rfn在甘藍型油菜遺傳改良中的應用。以及，上述的甘藍型油菜細胞質(zhì)雄性不育恢復基因Rfn的等位基因在甘藍型油菜遺傳改良中的應用。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明首先提供了一種甘藍型油菜nap CMS的恢復基因Rfn，該基因?qū)儆赑PR基因家族的成員，為一個組成型表達的基因。將Rfn轉(zhuǎn)化導入不含有nap細胞質(zhì)恢復基因的油菜，可以獲得育性恢復的植株?；謴突騌fn的克隆及驗證可用于甘藍型油菜優(yōu)良自交系和常規(guī)品種選育，解決部分材料在低溫條件下花粉不足、產(chǎn)量下降的現(xiàn)象。另外，以甘藍型油菜恢復基因Rfn序列本身或附近的序列產(chǎn)生的緊密連鎖的分子標記，可用于甘藍型油菜自交系和常規(guī)品種分子標記輔助選擇育種。

附圖說明

圖1為甘藍型油菜nap細胞質(zhì)雄性不育系及其恢復系不同溫度條件下的形態(tài)。

圖2為甘藍型油菜nap細胞質(zhì)雄性不育系恢復基因Rfn位點的局部遺傳連鎖圖。

圖3為甘藍型油菜nap細胞質(zhì)雄性不育系恢復基因Rfn位點的精細遺傳連鎖圖。

圖4為覆蓋甘藍型油菜nap細胞質(zhì)雄性不育恢復基因Rfn區(qū)段的物理圖譜。

圖5為甘藍型油菜功能互補測驗表達載體pFGC-Rfn載體示意圖。

圖6為具有181A遺傳背景的T₀代遺傳轉(zhuǎn)化甘藍型油菜植株開花后育性表型與181A表型的比較。181A遺傳轉(zhuǎn)化T₀代植株攜帶顯性基因Rfn的候選基因，表現(xiàn)為花絲伸長，育性恢復，花粉粒醋酸洋紅染色正常。

圖7為轉(zhuǎn)基因陽性單株自交后代株系PCR鑒定及育性共分離分析。F為可育株，S為不育株，N為陰性對照，P為陽性質(zhì)粒對照，M為DL2000分子量標準。

具體實施方式

以下結合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。在下面的描述中闡述了很多具體細節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實施，本領域技術人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進，因此本發(fā)明的保護范圍以權利要求書為準，不受下面公開的具體實施的限制。下述所使用的實驗方法若無特殊說明，均為本技術領域現(xiàn)有的常規(guī)方法和技術，所使用的試劑配方或材料，均通過商業(yè)途徑得到。

實施例1甘藍型油菜nap細胞質(zhì)雄性不育系及其恢復系的發(fā)現(xiàn)及遺傳分析

發(fā)明人在甘藍型油菜育種過程中發(fā)現(xiàn)，含有nap細胞質(zhì)的優(yōu)良自交系181-1在相對低溫時花瓣皺縮，雄蕊發(fā)育不正常，而在溫度相對較高的條件下雄蕊發(fā)育基本恢復正常(圖1)。通過大量測交發(fā)現(xiàn)，優(yōu)良自交系H5能夠在低溫條件下專一恢復181-1至正常雄蕊表型，H5與pol不育系1141A、245A、7492A雜交后代均保持不育。H5與181-1雜交F₁與181-1回交獲得的BC₁帶在低溫條件下可育和不育表現(xiàn)為1:1的分離比，F(xiàn)₁自交后代在低溫條件下可育和不育表現(xiàn)為3:1的分離比(表1)。后續(xù)將181-1命名為181A。

表1甘藍型油菜nap細胞質(zhì)雄性不育恢復基因的遺傳分析

*χ²(0.05,1)＝3.84

實施例2甘藍型油菜nap細胞質(zhì)雄性不育恢復基因的精細定位

1.實驗材料：

本實驗用于甘藍型油菜nap細胞質(zhì)雄性不育恢復基因的精細定位的親本材料為181A和H5。由181A與H5雜交獲得F₁植株，將F₁植株自交獲得F₂群體，于2012年秋季播種于武漢，2013年春天提取225個不育單株的DNA(提取DNA的方法參見：Stewart and Via,1993)，用于Rfn基因的初步定位。同時將F₁與181A回交構建BC₁群體，于2013年秋季播種于武漢，2014年春天提取5,652個BC₁單株的DNA，用于基因的精細定位。

2.恢復基因Rfn的精細定位：

根據(jù)前人研究結果，甘藍型油菜nap細胞質(zhì)雄性不育恢復基因Rfn與pol細胞質(zhì)雄性不育恢復基因Rfp可能為同一核基因位點的不同等位基因和單倍型(Li et al.,1998)。申請人利用在pol CMS恢復基因定位過程中的引物篩選與Rfn連鎖的分子標記，發(fā)現(xiàn)6個與Rfn緊密連鎖的分子標記。

6個與Rfn緊密連鎖的分子標記的序列如下表所示：

BrIP24F：ATCAGTCCCTCTGATCGGCT

BrIP24R：GCGACCTGAAGTTGGACGA

BrIP47F：GACGCACCTCAAGCCAAAG

BrIP47R：GGCTACGACATTCCCACCA

BrIP53F：CGTTTGGACAAGTTTTCACG

BrIP53R：CTTTGAACTATTGCCGGTGA

BrIP59F：GAATCTGGTGAAGGCAGTAAC

BrIP59R：TCTCCTCTTTCTTACCTGCTG

BrIP63F：TGGGATGCTCTGTTTCTGAC

BrIP63R：GATCTAGCCGAGTGTAAGCG

BrSC39F：TAATGCGAATTTTCAGGGGT

BrSC39R：ATGGACCAGGCTTTACTTCC

申請人根據(jù)以上6個標記在F₂群體不育株基因型檢測結果，根據(jù)各標記檢測出的交換單株數(shù)目，計算標記與Rfn位點之間的重組率，并利用Kosambi函數(shù)(Kosambi,1944)計算遺傳距離，繪制如圖2所示的局部連鎖圖譜。發(fā)現(xiàn)這些標記均位于Rfn位點的一側。

為獲得另一側與Rfn基因連鎖的標記，申請人根據(jù)目標區(qū)域的序列(以公布的白菜基因組序列為參考)設計并鑒定出Rfn連鎖的多態(tài)性標記。分子標記BrIP47和BnSR21在BC₁群體中分別檢測到79個和25個交換單株，這些單株中兩個標記和Rfn之間發(fā)生了重組(圖4)。然后用其余的標記對交換單株進行分析，發(fā)現(xiàn)兩側最近的標記是BnSR33和BrIP77，兩個標記分別有4個和2個單株在標記與Rfn間表現(xiàn)交換(圖3)。通過以上精細定位，將Rfn基因定位中甘藍型油菜參考基因組約10.5kb的范圍內(nèi)。用于精細定位Rfn的引物的核苷酸序列如表2所示。

表2.精細定位Rfn基因的引物的核苷酸序列

實施例3恢復基因Rfn候選基因的分離、轉(zhuǎn)化及功能驗證

1.恢復基因Rfn候選基因的確定

本實施例中采用的序列比對的程序來自白菜基因組網(wǎng)站提供的Blast(http://brassicadb.org/brad/blastPage.php)軟件，對候選區(qū)段10.5kb的序列進行分析，從中預測一個編碼PPR蛋白的候選基因ORF2。根據(jù)參考基因組序列，開發(fā)相應引物并擴增出目標基因ORF2的基因組序列。對ORF2基因序列進行酶切位點分析，發(fā)現(xiàn)其不含有EcoR I和BamH I酶切位點。設計擴增基因全長的引物ORF2F(R)，左右引物分別加上EcoR I和BamH I的酶切位點，利用高保真PCR聚合酶(Phusion High-Fidetity DNA Potymerse，來自New England Biolabs公司)擴增獲得一個5,620bp的片段。

ORF2F(正向引物)：CGgaattcGTCCAACCACAATGGCTTTAAC

ORF2R(反向引物)：CGggatccATTGCTAAGGCGAATCCGGTTG

擴增片段包含基因上游非翻譯區(qū)2,019bp的序列、基因區(qū)間1,890bp的序列和下游非翻譯區(qū)1,711bp的序列。擴增片段用膠回收試劑盒(購自Promega公司)回收，用EcoR I和BamH I雙酶切后回收目標片段，連接到經(jīng)EcoR I和BamH I雙酶切的表達載體pFGC5941上(圖5)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α，在含有50ug/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，挑選單菌落提取質(zhì)粒，并用通過測序檢測確定核昔酸序列完全正確，成功構建了轉(zhuǎn)化植株的載體(圖5)。正確的融合質(zhì)粒pFGC-Rfn通過電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌菌株中(本實驗室長期保存的菌株)，在含有50μg/ml卡那霉素和50μg/ml慶大霉素的固體培養(yǎng)基上挑取單克隆，并進行PCR檢測確認陽性克隆后，將該單克隆于-80℃保存起來，用于甘藍型油菜的遺傳轉(zhuǎn)化。

油菜遺傳轉(zhuǎn)化采用常規(guī)的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(陳葦?shù)龋?006；Cardoza and Stewart,2003)。種子滅菌70％的酒精浸泡種子15min，0.1％升汞消毒15min，無菌水清洗3次，每次間隔5min。將滅菌的種子播于Medium 0培養(yǎng)基(配方見表3)，于25℃暗培養(yǎng)5d。在超凈工作臺內(nèi)將幼苗的下胚軸切成0.5-0.8cm的小段，在含有農(nóng)桿菌(懸浮過夜至對數(shù)生長期)的Dilution Medium上(配方見表3)浸染25-30min后，吸干液體，于25℃黑暗條件下共培養(yǎng)2d。將外植體轉(zhuǎn)移到愈傷組織誘導培養(yǎng)基Medium 1(配方見表3)上，于25℃光照培養(yǎng)7-10d。再將外植體轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基Medium 2上培養(yǎng)，每2-3周繼代1次，直至分化出芽。將分化出的芽下端切斷插入到篩選培養(yǎng)基Medium3上篩選2周，再將存活的芽轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基Medium 4上培養(yǎng)至生根后，種植于混有腐殖土的營養(yǎng)缽中，保持70％相對濕度，待根發(fā)育穩(wěn)定后移栽到大田。

提取抗性植株葉片總DNA(制備方法見：Stewart et al.,1993)，用引物Rfn-F和Rfn-R通過PCR進一步鑒定轉(zhuǎn)化植株。轉(zhuǎn)基因T₀代觀察育性的表現(xiàn)，驗證導入的候選基因的功能。結果顯示在19株轉(zhuǎn)基因T₀代植株中，有9株表現(xiàn)為花絲伸長，育性恢復(圖6)。將T₀代植株自交后代播于大田中，開花后調(diào)查植株育性，并提取葉片總DNA(Stewart et al.,1993)，用引物Rfn-F和Rfn-R經(jīng)PCR鑒定，可確定基因插入片段與植株育性共分離(圖7)。用于轉(zhuǎn)基因陽性植株檢測的引物序列分別為：

Rfn-F：GTTCTTGCTGTAAAGCGTTGT

Rfn-R：GTTGCGTTTTCATTGCTTGTC

表3在遺傳轉(zhuǎn)化步驟中所用的各種培養(yǎng)基配方

SEQUENCE LISTING

<110> 華中農(nóng)業(yè)大學；武漢聯(lián)農(nóng)種業(yè)科技有限責任公司

<120> 甘藍型油菜nap細胞質(zhì)雄性不育恢復基因Rfn的克隆及其應用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1890

<212> DNA

<213> 甘藍型油菜（Brassica napus）

<400> 1

atgttgtgtc ggagattggt gcttgtgtct cgtatccccc tgagtcctgt tggtactctt 60

gcaactcctt tgctctcttt tatcagatcc tcatgcgaac gaggctactc tggtctcggc 120

agcgatagaa atctctcatc ttacaaagag agactgagaa gtggtctggt cgatatcaag 180

aagaaggatg ctgtagctct gtttcagtcc atgattaggt ctcgtcctct tcctacggtc 240

atggatttca ataaactgtt tagtgcagta gccagaacga aacagtatga tctcgtgttg 300

gatctctgca agcaaatgga actgcaaggg attgcacata gcatttacac gctgagtatt 360

atgatcaatt gcttctgccg cctccagaaa ctcggttttg ctttttctgt gatgggaaag 420

atgttgaagc ttgggtatga gcccgacaca atcacattct caactttgat caacggttta 480

tgtctggtgg gtagagtttc caaagctgtg gagttagttg atcatatggt agatatgaag 540

gttattccaa atctcatcat acttaacact attgtcaatg ggctttgtct ccaagataga 600

ctctctgaag caatgtcttt gatacatcga atgttggcta atgggtgcca acccgacgca 660

gttacatatg gtccggtttt gaacagaatg tgtaagtcag ggaacactgc ctcggccttg 720

gatctcctcg gaaagatgga acttagaaag atcaagcctc aagtagtcac atacaatatc 780

atcattgaca gtctttgcaa ggatgggagc ctcgaagatg cactctgcct tttcaatgaa 840

atggaaacca aaggaatcaa agcaaatgtc attacctaca cctctctcat aggaggcttt 900

tgtagtgccg gaagatggga tgatggtgca cagttgctga gggatatgat tacaagggga 960

gtcaccccta acgttgtcac tttcaatgct ttgattgata gttttgtgaa agaaggacag 1020

cttaccgagg ctaaaaaatt gtacaatgag atgatcacaa gaggcacaga tccaaatatc 1080

attacatata actctttgat atatgggatg tgcatggaca actgcctaga tgaggccaac 1140

cagatgctgg atatgatggt tagcaaggga ttctatcctg atattgtgac gtttaatatc 1200

cttatcaacg gatactgtaa ggctaaacag gtcgatgaag gtacgagact tttccgcaat 1260

atgtgtttaa gaggagtggt tgctgataca gtcacttata acactctcat ccaagggttt 1320

tgtcaatcgg gaaaacttaa tgttgccaaa gaactcttcc aggagatggt ctttgttggt 1380

gtgccaccca gtgttgtgac ttatagtatt ttgctggatg ggttgtgtga caatggggaa 1440

ctagaaaagg ctttggaaat acttgatcaa atgctcaaga gtaagatgga acttgacatt 1500

ggtatatata gtatcatcat tcacgggatg tgcaatgcta gtaagatcga tgatgcttgg 1560

gatctattct gtagcctccc tctcaaagga gtgaagcctg aagtcagaac atataatata 1620

atgattggag gattatgtaa gaaaggctcg ctgcctgaag cggtcttgtt gtttagaaag 1680

atgggagagg ctggggttgc gccaagcagt ggtacataca acacactaat acgagctcat 1740

ctcagaggtg gtgacttaac aaaatcagct gaacttatcg aagaaatgaa gaggtgtggg 1800

ttctctgcag atgcttcaac cataaagatt gttatggata tgttattgga tggtagaatg 1860

aagaaaagct ttctggatat gctttcttag 1890

<210> 2

<211> 629

<212> PRT

<213> 甘藍型油菜（Brassica napus）

<400> 2

Met Leu Cys Arg Arg Leu Val Leu Val Ser Arg Ile Pro Leu Ser Pro

1 5 10 15

Val Gly Thr Leu Ala Thr Pro Leu Leu Ser Phe Ile Arg Ser Ser Cys

20 25 30

Glu Arg Gly Tyr Ser Gly Leu Gly Ser Asp Arg Asn Leu Ser Ser Tyr

35 40 45

Lys Glu Arg Leu Arg Ser Gly Leu Val Asp Ile Lys Lys Lys Asp Ala

50 55 60

Val Ala Leu Phe Gln Ser Met Ile Arg Ser Arg Pro Leu Pro Thr Val

65 70 75 80

Met Asp Phe Asn Lys Leu Phe Ser Ala Val Ala Arg Thr Lys Gln Tyr

85 90 95

Asp Leu Val Leu Asp Leu Cys Lys Gln Met Glu Leu Gln Gly Ile Ala

100 105 110

His Ser Ile Tyr Thr Leu Ser Ile Met Ile Asn Cys Phe Cys Arg Leu

115 120 125

Gln Lys Leu Gly Phe Ala Phe Ser Val Met Gly Lys Met Leu Lys Leu

130 135 140

Gly Tyr Glu Pro Asp Thr Ile Thr Phe Ser Thr Leu Ile Asn Gly Leu

145 150 155 160

Cys Leu Val Gly Arg Val Ser Lys Ala Val Glu Leu Val Asp His Met

165 170 175

Val Asp Met Lys Val Ile Pro Asn Leu Ile Ile Leu Asn Thr Ile Val

180 185 190

Asn Gly Leu Cys Leu Gln Asp Arg Leu Ser Glu Ala Met Ser Leu Ile

195 200 205

His Arg Met Leu Ala Asn Gly Cys Gln Pro Asp Ala Val Thr Tyr Gly

210 215 220

Pro Val Leu Asn Arg Met Cys Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Ala Leu

225 230 235 240

Asp Leu Leu Gly Lys Met Glu Leu Arg Lys Ile Lys Pro Gln Val Val

245 250 255

Thr Tyr Asn Ile Ile Ile Asp Ser Leu Cys Lys Asp Gly Ser Leu Glu

260 265 270

Asp Ala Leu Cys Leu Phe Asn Glu Met Glu Thr Lys Gly Ile Lys Ala

275 280 285

Asn Val Ile Thr Tyr Thr Ser Leu Ile Gly Gly Phe Cys Ser Ala Gly

290 295 300

Arg Trp Asp Asp Gly Ala Gln Leu Leu Arg Asp Met Ile Thr Arg Gly

305 310 315 320

Val Thr Pro Asn Val Val Thr Phe Asn Ala Leu Ile Asp Ser Phe Val

325 330 335

Lys Glu Gly Gln Leu Thr Glu Ala Lys Lys Leu Tyr Asn Glu Met Ile

340 345 350

Thr Arg Gly Thr Asp Pro Asn Ile Ile Thr Tyr Asn Ser Leu Ile Tyr

355 360 365

Gly Met Cys Met Asp Asn Cys Leu Asp Glu Ala Asn Gln Met Leu Asp

370 375 380

Met Met Val Ser Lys Gly Phe Tyr Pro Asp Ile Val Thr Phe Asn Ile

385 390 395 400

Leu Ile Asn Gly Tyr Cys Lys Ala Lys Gln Val Asp Glu Gly Thr Arg

405 410 415

Leu Phe Arg Asn Met Cys Leu Arg Gly Val Val Ala Asp Thr Val Thr

420 425 430

Tyr Asn Thr Leu Ile Gln Gly Phe Cys Gln Ser Gly Lys Leu Asn Val

435 440 445

Ala Lys Glu Leu Phe Gln Glu Met Val Phe Val Gly Val Pro Pro Ser

450 455 460

Val Val Thr Tyr Ser Ile Leu Leu Asp Gly Leu Cys Asp Asn Gly Glu

465 470 475 480

Leu Glu Lys Ala Leu Glu Ile Leu Asp Gln Met Leu Lys Ser Lys Met

485 490 495

Glu Leu Asp Ile Gly Ile Tyr Ser Ile Ile Ile His Gly Met Cys Asn

500 505 510

Ala Ser Lys Ile Asp Asp Ala Trp Asp Leu Phe Cys Ser Leu Pro Leu

515 520 525

Lys Gly Val Lys Pro Glu Val Arg Thr Tyr Asn Ile Met Ile Gly Gly

530 535 540

Leu Cys Lys Lys Gly Ser Leu Pro Glu Ala Val Leu Leu Phe Arg Lys

545 550 555 560

Met Gly Glu Ala Gly Val Ala Pro Ser Ser Gly Thr Tyr Asn Thr Leu

565 570 575

Ile Arg Ala His Leu Arg Gly Gly Asp Leu Thr Lys Ser Ala Glu Leu

580 585 590

Ile Glu Glu Met Lys Arg Cys Gly Phe Ser Ala Asp Ala Ser Thr Ile

595 600 605

Lys Ile Val Met Asp Met Leu Leu Asp Gly Arg Met Lys Lys Ser Phe

610 615 620

Leu Asp Met Leu Ser

625

<210> 3

<211> 1890

<212> DNA

<213> 甘藍型油菜（Brassica napus）

<400> 3

atgttgtgtc ggagattggt gcttgtgtct cgtatccccc tgagtcctgt tggtactctt 60

gcaactcctt tgctctcttt tatcagatcc tcatgcgaac gaggctactc tggtctcggc 120

agcgatagaa atctctcatc ttacaaagag agactgagaa gtggtctggt cgatatcaag 180

aagaaggatg ctgtagctct gtttcagtcc atgattaggt ctcgtcctct tcctacggtc 240

atggatttca ataaactgtt tagtgcagta gccagaacga aacagtatga tctcgtgttg 300

gatctctgca agcaaatgga actgcaaggg attgcacata gcatttacac gctgagtatt 360

atgatcaatt gcttctgccg tctgcgggaa ctcggttttg ctttttctgt gatgggtaag 420

atgttgaggc ttgggtatga gcctgacaca atcacattct caactttgat caacggttta 480

tgtctggtgg gtagagtttc cgaagctgtg gagttagttg atcgtatggt ggaaatggag 540

gttataccaa atctcatcac gctcaacact attgtcaatg gactttgtct ccaaggtgaa 600

gtgtctgagg caatggcttt gatcgatcga atgatggata atggatgcca acccaatgaa 660

cgtacctatg gtccggtttt gaacagaatg tgcaagtcag gtaacactgc cttggccttg 720

gatctgctca gaaagatgga acacagaaag atcaagctcg atgcagtcac atacaatttc 780

atcattgaca gtctttgcaa agatgggagc ctcgaagatg cactcagcct tttcaatgaa 840

atggaaacca aaggtatcaa accaaatgtc tttacctaca actctctcat tagaggcttc 900

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