本發(fā)明涉及植物抗病相關(guān)基因LLG1及其應(yīng)用。LLG1基因的突變可以抑制擬南芥突變體edr1對(duì)白粉病、假單胞細(xì)菌以及卵菌的抗性，并參與調(diào)控對(duì)病原菌的抗性應(yīng)答。本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

白粉菌是一種重要的植物病害，屬子囊菌綱的寄生型真菌，在世界各地分布廣泛，可侵染近萬(wàn)種植物，包括重要農(nóng)作物如小麥和大麥，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大危害。白粉菌侵染植物后，產(chǎn)生的孢子可覆蓋在植物的莖、葉、花序以及果實(shí)的表面，成白色蛛網(wǎng)狀或形成白粉狀的一層，故稱為白粉病。在環(huán)境條件適宜的情況下，白粉菌可大量繁殖，影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，嚴(yán)重發(fā)病時(shí)甚至造成葉片枯落及死亡。與白粉菌相似，假單胞桿菌細(xì)菌及卵菌也能侵染多種植物，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成很大危害。

為了抵抗各種病原微生物的侵染，植物進(jìn)化出多種策略來(lái)進(jìn)行防衛(wèi)。通常植物防衛(wèi)反應(yīng)分為兩個(gè)層次，即基礎(chǔ)抗性和抗病基因介導(dǎo)的抗性?；A(chǔ)抗性通過(guò)位于細(xì)胞膜上的模式受體（Pattern Recognition Receptor, PRR）識(shí)別病原菌相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns ,PAMPs)，從而觸發(fā)PAMP引起的免疫反應(yīng)，也稱為PTI，是防衛(wèi)反應(yīng)的第一層次。而病原菌在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生了新的機(jī)制來(lái)抑制PTI，如細(xì)菌通過(guò)三型分泌系統(tǒng)，真菌通過(guò)吸器向植物體內(nèi)釋放效應(yīng)因子(effector)。有些效應(yīng)因子又被稱為無(wú)毒蛋白(Avr protein)，能夠被抗性（Resistance, R）基因編碼的蛋白所識(shí)別。這一層次的防衛(wèi)反應(yīng)也被稱為效應(yīng)因子觸發(fā)的免疫反應(yīng)(effector-triggered immunity, ETI)。

前期的研究發(fā)現(xiàn)擬南芥edr1突變體表現(xiàn)出增強(qiáng)的白粉菌抗性及白粉菌誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡表型。EDR1基因編碼一個(gè)Raf-like蛋白激酶，具有激酶活性。遺傳學(xué)分析實(shí)驗(yàn)顯示edr1突變體的表型能夠被pad4，sid2，npr1等突變體抑制，表明edr1的表型需要水楊酸信號(hào)途徑的作用。但是，目前我們對(duì)于EDR1介導(dǎo)細(xì)胞死亡和植物抗病反應(yīng)的分子機(jī)制依然知之甚少。為了尋找調(diào)控植物抗性相關(guān)基因，我們進(jìn)行了edr1抑制子突變體的篩選。我們得到了其中一個(gè)突變體，通過(guò)圖位克隆，我們獲得了相應(yīng)的基因LORELEI-LIKE-GPI-ANCHORED PROTEIN 1，即LLG1。通過(guò)對(duì)該基因的功能分析，我們首次發(fā)現(xiàn)LLG1對(duì)植物抗病反應(yīng)具有重要的作用。我們的結(jié)果表明LLG1是創(chuàng)建抗病性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因作物和作物分子設(shè)計(jì)的優(yōu)良候選基因，具有重要的理論價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供植物抗病相關(guān)基因LLG1及其應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一個(gè)擬南芥抗病相關(guān)基因LLG1的序列， CDS全長(zhǎng)507bp。其CDS全長(zhǎng)序列如SEQ ID NO.1所示。

LLG1基因編碼的蛋白序列，編碼168個(gè)氨基酸，大小18.46Kd。其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示.

LLG1突變之后能夠抑制edr1對(duì)白粉菌的抗性。

LLG1在抗白粉病、假單胞細(xì)菌以及卵菌中的應(yīng)用。LLG1可以應(yīng)用到基因工程技術(shù)領(lǐng)域，提高作物的抗病反應(yīng)。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：為了尋找調(diào)控植物抗性相關(guān)基因，我們進(jìn)行了edr1抑制子突變體的篩選。我們得到了其中一個(gè)突變體，通過(guò)圖位克隆，我們獲得了相應(yīng)的基因LLG1。通過(guò)對(duì)該基因的功能分析，我們首次發(fā)現(xiàn)LLG1對(duì)植物抗病反應(yīng)具有重要的作用。我們的結(jié)果表明LLG1是創(chuàng)建抗病性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因作物和作物分子設(shè)計(jì)的優(yōu)良候選基因，具有重要的理論價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1. 擬南芥野生型、edr1突變體及edr1 llg1在生長(zhǎng)4-5周后接種白粉病菌Golovinomyces cichoracearum UCSC1, 在侵染第8天后的表型（A），對(duì)侵染葉片進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)（Trypan blue）的染色結(jié)果（B）以及單孢子分生孢子梗定量的計(jì)數(shù)結(jié)果（C）。

圖2. 擬南芥野生型和edr1突變體及edr1 llg1在生長(zhǎng)2周后接種卵菌（H.aNoco2）7天后對(duì)孢子定量的結(jié)果（A），以及生長(zhǎng)4周后接種丁香假單胞桿菌（Pto DC3000）3天之后菌落單克隆的數(shù)量統(tǒng)計(jì)的結(jié)果（B）。

圖3. 通過(guò)圖位克隆的方法克隆LLG1基因的略圖（a），以及LLG1基因結(jié)構(gòu)、蛋白序列和突變位點(diǎn)（b）, LLG1基因均可互補(bǔ)llg1對(duì)edr1突變體的抑制（(圖3c，d)。其中圖3c顯示白粉菌生長(zhǎng)表型，圖3d顯示圖3c植株中白粉菌定量分析結(jié)果。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 llg1突變抑制edr1突變體抗白粉病表型分析

（1）材料與方法

對(duì)擬南芥edr1突變體進(jìn)行EMS誘變，并對(duì)其M2代進(jìn)行抑制子突變體篩選，鑒定到了一個(gè)能夠抑制edr1對(duì)白粉病菌抗性的突變體，隨后對(duì)突變基因進(jìn)行了圖位克隆，我們根據(jù)其編碼蛋白將該基因命名為LLG1。

將擬南芥野生型植株Col-0,及突變體種植在22℃，9小時(shí)光照的溫室中，生長(zhǎng)5周后，接種白粉病菌。在接菌8天后進(jìn)行抗病表型鑒定，對(duì)典型的葉片照相，并對(duì)具代表性的葉片進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色(Trypan Blue Staining)，以觀察白粉菌的生長(zhǎng)情況。

為了定量分析植物的抗性，將上述植物在相同的條件下生長(zhǎng)5周后，少量接種白粉病菌，在接菌5天之后，對(duì)葉片進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色，在顯微鏡下進(jìn)行單孢子分生孢子梗計(jì)數(shù)。對(duì)20-30單孢子的計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

（2）結(jié)果與分析

在白粉菌接菌8天之后，在野生型Col-0的葉片表面產(chǎn)生大量的白粉菌，而edr1突變體的葉片上只支持少量白粉菌的生長(zhǎng)，并且出現(xiàn)明顯的細(xì)胞死亡。而edr1 llg1突變體在白粉菌接菌8天之后，在其葉表面并不產(chǎn)生類似edr1的細(xì)胞死亡，而是與Col-0類似，有大量的孢子附著（附圖1 A）。為了更好的觀察白粉菌接菌后的表型，對(duì)其進(jìn)行了臺(tái)盼藍(lán)染色（附圖1 B），由圖可見，edr1染色后可見明顯的細(xì)胞死亡，并且只產(chǎn)生少量的孢子，而Col-0和edr1 llg1均不出現(xiàn)細(xì)胞死亡，而是產(chǎn)生大量的菌絲和孢子。對(duì)各種基因型葉片上的單孢子上產(chǎn)生的分生孢子數(shù)量進(jìn)行了定量分析，結(jié)果顯示edr1分生孢子數(shù)明顯低于野生型Col-0，而llg1抑制了edr1的抗病表型（附圖1C），這些結(jié)果表明edr1對(duì)白粉菌的抗性及白粉菌誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡需要LLG1。

實(shí)施例2llg1突變體抑制edr1突變體其它病原菌的表型分析

（1）材料與方法

將擬南芥野生型植株Col-0，edr1突變體，edr1 llg1種植在22℃，9小時(shí)光照的溫室中，生長(zhǎng)2周。將pad4突變體上生長(zhǎng)7天的卵菌 (H. a. Noco2) 作為菌源，用水渦旋震蕩將卵菌孢子稀釋至5×10⁴/ml。用噴壺將孢子均勻噴灑到2周大小的植物葉片表面。苗盤覆蓋上透明蓋子，用膠帶密封四周保濕，放置在培養(yǎng)箱里(溫度16℃，相對(duì)濕度90%)中，7天后觀察抗病表型，并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行孢子計(jì)數(shù)。

將丁香假單胞菌（Pto DC3000）在含有相應(yīng)抗性的KB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)12 h，用10 mM的MgCl₂收集在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌，通過(guò)梯度稀釋至濃度為OD₆₀₀=5x10^-4。將細(xì)菌注射到4周大小的擬南芥葉片背面，在注射3 h后取樣，作為0天的對(duì)照。用打孔器取葉片。加入600 μl的10 mM MgCl₂，充分研磨葉片，所得的葉片勻漿液稀釋至10^-1和10^-2兩個(gè)濃度，涂于KB平板，28℃培養(yǎng)2-3天后，對(duì)培養(yǎng)基上的菌落計(jì)數(shù)。對(duì)侵染3天后的葉片再一次用打孔器取樣，計(jì)數(shù)的步驟同上。

（2）結(jié)果與分析

對(duì)于丁香假單胞桿菌，定量結(jié)果顯示edr1對(duì)PtoDC3000表現(xiàn)出增強(qiáng)的抗病性，支持細(xì)菌生長(zhǎng)的數(shù)量顯著低于野生型。而在edr1 llg1則比野生型更感病。表明llg1完全恢復(fù)edr1對(duì)丁香假單胞桿菌Pto DC3000的抗病性。

對(duì)卵菌統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，擬南芥野生型植株Col-0支持大量的卵菌的孢子生長(zhǎng)，而在edr1中這一數(shù)量顯著降低。表明edr1對(duì)卵菌具有抗病性。而在edr1 llg11中，孢子的數(shù)量甚至高于野生型，表明llg1能夠完全抑制edr1對(duì)卵菌的抗病性。

在對(duì)丁香假單胞桿菌及卵菌的抗性反應(yīng)中，LLG1基因均可互補(bǔ)llg1對(duì)edr1突變體的抑制。

實(shí)施例3 LLG1基因的圖位克隆

（1）材料與方法

為了克隆抑制子基因，我們將edr1 llg1突變體與擬南芥野生型Landsberg生態(tài)型植株進(jìn)行雜交，獲得的F1代植株自交產(chǎn)生F2代群體。從F2代植株中選擇含有edr1突變但與edr1 llg1突變體表型相似的40個(gè)單株，用均勻分布在擬南芥染色體組上的粗定位標(biāo)記(http://signal.salk.edu/genome/SSLP_info/SSLPsordered.html)進(jìn)行基因型鑒定。粗定位的結(jié)果表明LLG1定位在5號(hào)染色體。隨后，我們?cè)O(shè)計(jì)了精細(xì)定位的標(biāo)記，對(duì)2000株左右的F2植株進(jìn)行基因型鑒定，把LLG1定位到MDA7這個(gè)BAC克隆中。對(duì)該區(qū)域內(nèi)所有基因進(jìn)行測(cè)序，找到突變基因（附圖3）。

（2）結(jié)果與分析

我們對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在LLG1 (AT5G56170)這個(gè)基因的有一個(gè)G--A的堿基變化，導(dǎo)致蛋白序列第114位氨基酸的變化(G114R) (圖3a，b)，而LLG1基因可互補(bǔ)llg1對(duì)edr1突變體的抑制（(圖3c，d)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建農(nóng)林大學(xué)

<120> 植物抗病相關(guān)基因LLG1的克隆及其應(yīng)用

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<400> 1

000

<210> 2

<211> 168

<212> PRT

<213> 氨基酸序列

<400> 2

Met Glu Leu Leu Ser Arg Ala Leu Phe Phe Phe Leu Leu Leu Ser Val

1 5 10 15

Leu Ser Ser Phe Ser Ser Ser Ser Phe Ile Ser Asp Gly Val Phe Glu

20 25 30

Ser Gln Ser Leu Val Leu Gly Arg Asn Leu Leu Gln Thr Lys Lys Thr

35 40 45

Cys Pro Val Asn Phe Glu Phe Met Asn Tyr Thr Ile Ile Thr Ser Lys

50 55 60

Cys Lys Gly Pro Lys Tyr Pro Pro Lys Glu Cys Cys Gly Ala Phe Lys

65 70 75 80

Asp Phe Ala Cys Pro Tyr Thr Asp Gln Leu Asn Asp Leu Ser Ser Asp

85 90 95

Cys Ala Thr Thr Met Phe Ser Tyr Ile Asn Leu Tyr Gly Lys Tyr Pro

100 105 110

Pro Gly Leu Phe Ala Asn Gln Cys Lys Glu Gly Lys Glu Gly Leu Glu

115 120 125

Cys Pro Ala Gly Ser Gln Leu Pro Pro Glu Thr Ser Ala Glu Val Asn

130 135 140

Ala Ala Thr Thr Ser Ser Ser Arg Leu Trp Leu Thr Val Ser Ala Ala

145 150 155 160

Leu Leu Val Phe Val Lys Leu Phe

165