本發(fā)明屬于生物體液體外檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種針對(duì)尿路上皮癌的尿脫落腫瘤細(xì)胞微流控芯片檢測(cè)技術(shù)。

背景技術(shù)：

1、臨床現(xiàn)役技術(shù)-尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查：尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查(Cytology)是目前臨床上普遍使用的尿路上皮癌檢測(cè)方法。為尋找腫瘤細(xì)胞，該方法依賴病理醫(yī)生對(duì)涂片進(jìn)行主觀觀察(針對(duì)細(xì)胞的細(xì)胞核、染色質(zhì)、胞漿等因素對(duì)細(xì)胞進(jìn)行判斷)，主要有以下缺點(diǎn)：

(1)檢測(cè)敏感度低，一般只有30-50％。

(2)閱片完全依賴于病理醫(yī)生的主觀經(jīng)驗(yàn)，不同病理醫(yī)生之間的判斷結(jié)果或不一致。

(3)染色過(guò)程繁瑣，人工參與度大、工作強(qiáng)度大。細(xì)胞染色效果受人員經(jīng)驗(yàn)、熟練度的影響。

2、臨床現(xiàn)役技術(shù)-膀胱鏡、輸尿管軟鏡檢查

膀胱鏡、輸尿管軟鏡檢查是目前臨床診斷尿路上皮癌的金標(biāo)準(zhǔn)。其通過(guò)導(dǎo)管將窺鏡經(jīng)尿道傳送至目標(biāo)區(qū)域，對(duì)可疑占位進(jìn)行成像、觀察。但仍具有如下缺陷：

(1)屬于侵入式檢查，患者所承受的痛苦大；

(2)腫瘤發(fā)展到肉眼可見時(shí)才能被觀察到，不利于早期診斷.

3、其他在研技術(shù)-基于微濾膜的尿液細(xì)胞檢查

為克服傳統(tǒng)尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查敏感度低的缺點(diǎn)，一些研究組使用微濾膜來(lái)檢測(cè)尿脫落腫瘤細(xì)胞。相較于傳統(tǒng)尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查，該方法利用濾膜過(guò)濾的原理捕獲尿脫落細(xì)胞，敏感度略有提升，但仍具有以下缺陷：

(1)捕獲到細(xì)胞后，仍僅采用傳統(tǒng)的病理學(xué)染色方法(巴氏染色)，該方法如同臨床現(xiàn)役的尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查，高度依賴病理科醫(yī)生，受主觀因素的制約；

(2)該濾膜的濾孔口徑單一，為7.5um；然而尿路上皮癌患者尿液中的細(xì)胞成分復(fù)雜，除了腫瘤細(xì)胞，還有正常脫落的尿路上皮細(xì)胞、白細(xì)胞、紅細(xì)胞等，這些細(xì)胞尺寸均不一致，若使用單一孔徑，仍將導(dǎo)致視野中細(xì)胞成分混亂，干擾后續(xù)的判斷分析；

(3)無(wú)法對(duì)細(xì)胞的捕獲過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)成像、監(jiān)測(cè)、調(diào)控，例如：(a)在細(xì)胞量過(guò)剩導(dǎo)致濾膜堵塞的情況下，無(wú)法及時(shí)終止進(jìn)程；(b)在流速過(guò)高導(dǎo)致細(xì)胞破損嚴(yán)重的情況下，無(wú)法實(shí)時(shí)控制流速；

(4)受最大載荷量的限制，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量過(guò)高，所有濾孔均被占據(jù),該濾膜隨即失效；隨后而來(lái)的細(xì)胞將全部堵塞于濾膜，導(dǎo)致視野混亂，難以進(jìn)行下一步細(xì)胞層面的判讀。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種針對(duì)尿路上皮癌的尿脫落腫瘤細(xì)胞微流控芯片檢測(cè)技術(shù)。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的以及其他相關(guān)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一方面，提供了一種微流控芯片，包括依次連接的樣本入口、細(xì)胞捕獲區(qū)域以及樣本出口，所述細(xì)胞捕獲區(qū)域設(shè)有多個(gè)細(xì)胞分選器，所述細(xì)胞分選器由三個(gè)整體呈弧形排布的柱狀凸起構(gòu)成，柱狀凸起之間存在間隙，弧形開口作為液流入口，中間柱狀凸起兩側(cè)的間隙作為液流出口，兩個(gè)液流出口呈對(duì)稱分布。

優(yōu)選地，所述細(xì)胞捕獲區(qū)域設(shè)有三種不同尺寸規(guī)格的細(xì)胞分選器，分別為第一尺寸細(xì)胞分選器、第二尺寸細(xì)胞分選器和第三尺寸細(xì)胞分選器，所述第一尺寸細(xì)胞分選器、第二尺寸細(xì)胞分選器和第三尺寸細(xì)胞分選器的尺寸依次減小。

優(yōu)選地，相鄰的細(xì)胞分選器尺寸不同。

優(yōu)選地，所述微流控芯片包括多個(gè)細(xì)胞分選單元，每個(gè)所述細(xì)胞分選單元由一個(gè)第一尺寸細(xì)胞分選器、一個(gè)第二尺寸細(xì)胞分選器和一個(gè)第三尺寸細(xì)胞分選器組成。

優(yōu)選地，位于同一行的細(xì)胞分選單元中各尺寸細(xì)胞分選器的排布方式相同。

優(yōu)選地，橫向相鄰的細(xì)胞分選器，邊距相同。

優(yōu)選地，橫向依次等邊距排列的一個(gè)第一尺寸細(xì)胞分選器、一個(gè)第二尺寸細(xì)胞分選器和一個(gè)第三尺寸細(xì)胞分選器組成一個(gè)第一細(xì)胞分選單元；橫向依次等邊距排列的一個(gè)第一尺寸細(xì)胞分選器、一個(gè)第三尺寸細(xì)胞分選器和一個(gè)第二尺寸細(xì)胞分選器組成一個(gè)第二細(xì)胞分選單元；多個(gè)第一細(xì)胞分選單元橫向循環(huán)排布構(gòu)成第一細(xì)胞分選陣列，多個(gè)第二細(xì)胞分選單元橫向循環(huán)排布構(gòu)成第二細(xì)胞分選陣列，相互平行的一個(gè)第一細(xì)胞分選陣列和一個(gè)第二捕獲陣列組成一個(gè)細(xì)胞分選二級(jí)陣列，細(xì)胞捕獲區(qū)域中多個(gè)相互平行的細(xì)胞分選二級(jí)陣列縱向等邊距循環(huán)排布。

優(yōu)選地，在每個(gè)細(xì)胞分選二級(jí)陣列中，第二細(xì)胞分選陣列的第一尺寸細(xì)胞分選器的液流入口的中點(diǎn)與對(duì)應(yīng)第一細(xì)胞分選陣列的第三尺寸細(xì)胞分選器和第二尺寸細(xì)胞分選器橫向邊距的中點(diǎn)對(duì)齊。

優(yōu)選地，各奇數(shù)行細(xì)胞分選二級(jí)陣列的首行首列細(xì)胞分選器縱向位置對(duì)齊；各偶數(shù)行細(xì)胞分選二級(jí)陣列較相鄰的前一奇數(shù)行細(xì)胞分選二級(jí)陣列向右側(cè)等距偏移。

優(yōu)選地，第一尺寸細(xì)胞分選器的液流入口的寬度為60±5μm，液流出口的寬度為22±5μm；第二尺寸細(xì)胞分選器的液流入口的寬度為30±3μm，液流出口的寬度為10±3μm；第三尺寸細(xì)胞分選器的液流入口的寬度為16μ±1m，液流出口的寬度為4±1μm。

本發(fā)明的第二方面，提供前述微流控芯片的制備方法，包括：按照聚二甲基硅氧烷標(biāo)準(zhǔn)工藝，采用常規(guī)載玻片作為基底，通過(guò)等離子處理鍵合，制備獲得微流控芯片。

本發(fā)明的第三方面，提供了前述微流控芯片用于捕獲或回收尿脫落細(xì)胞的用途。

優(yōu)選地，所述尿脫落細(xì)胞中含有尿脫落腫瘤細(xì)胞。

優(yōu)選地，所述尿脫落細(xì)胞中含有尿路上皮癌細(xì)胞。所述上皮癌包括膀胱癌、輸尿管癌、腎盂癌。

本發(fā)明的第四方面，提供了一種捕獲或回收尿脫落細(xì)胞的方法，包括步驟：將待處理的尿液樣本或者尿沉渣的懸浮液，通入本發(fā)明的微流控芯片。

優(yōu)選地，所述尿脫落細(xì)胞中含有尿脫落腫瘤細(xì)胞。

優(yōu)選地，所述尿脫落細(xì)胞中含有尿路上皮癌細(xì)胞。所述上皮癌包括膀胱癌、輸尿管癌、腎盂癌。

本發(fā)明的第五方面，提供一種巴氏染色方法，包括步驟：先用本發(fā)明的微流控芯片捕獲和分選尿脫落細(xì)胞，然后將捕獲的尿脫落細(xì)胞進(jìn)行巴氏染色。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

針對(duì)目前尿路上皮癌臨床診斷中存在的敏感度低、依賴病理醫(yī)生的主觀判斷、有創(chuàng)、低效等問(wèn)題，本發(fā)明所提供的微流控芯片可依據(jù)物理尺寸差異實(shí)現(xiàn)人尿液中各類細(xì)胞的分離捕獲、并可兼容多種下游細(xì)胞學(xué)染色方法以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞識(shí)別。該技術(shù)提高了人尿液中的尿脫落腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)準(zhǔn)確度，擺脫了常規(guī)方法對(duì)于病理醫(yī)生主觀經(jīng)驗(yàn)的依賴，且全程無(wú)創(chuàng)。此外，其無(wú)損的細(xì)胞捕獲、回收方式為下游的分子生物學(xué)分析奠定了基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1：微流控芯片結(jié)構(gòu)及基本原理示意圖。

圖2：細(xì)胞分選器的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖3：不同尺寸的細(xì)胞分選器依據(jù)細(xì)胞尺寸差異分級(jí)捕獲細(xì)胞原理示意圖。

圖4：微流控芯片細(xì)胞捕獲區(qū)中細(xì)胞分選單元示意圖。

圖5：微流控芯片細(xì)胞捕獲區(qū)中細(xì)胞捕獲陣列示意圖。

圖6：本發(fā)明微流控芯片捕獲到的尿脫落細(xì)胞，比例尺：20μm。

圖7：微流控芯片捕獲到的尿脫落腫瘤細(xì)胞的免疫熒光圖像：DAPI+、CK20+、CD44v6+。

圖8：尿路上皮癌尿脫落細(xì)胞微流檢測(cè)技術(shù)所得的ROC曲線。

圖9：經(jīng)巴氏染色后的細(xì)胞：(a-b)細(xì)胞團(tuán)(c)核異型(d)細(xì)胞異型(e)高核質(zhì)比(f)正常尿路上皮細(xì)胞(比例尺：20μm)。

圖10：利用本發(fā)明微流控芯片捕獲、回收的6個(gè)尿脫落細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，并分析其CNV情況。

元件標(biāo)號(hào)說(shuō)明

1-1 樣本入口

1-2 細(xì)胞捕獲區(qū)域

1-3 樣本出口

2 細(xì)胞分選器

201 柱狀凸起

202 液流入口

203 液流出口

2-1 第一尺寸細(xì)胞分選器

2-2 第二尺寸細(xì)胞分選器

2-3 第三尺寸細(xì)胞分選器

3 細(xì)胞分選單元

3-1 第一細(xì)胞分選單元

3-2 第二細(xì)胞分選單元

4 細(xì)胞分選二級(jí)陣列

4-1 第一細(xì)胞分選陣列

4-2 第二細(xì)胞分選陣列

具體實(shí)施方式

一、微流控芯片

本發(fā)明的微流控芯片的結(jié)構(gòu)及原理示意圖可參見圖1。具體地，所述微流控芯片，包括沿液流方向A依次連接的樣本入口1-1、細(xì)胞捕獲區(qū)域1-2以及樣本出口1-3。待處理的液體樣本如尿液，從樣本入口1-1進(jìn)入微流控芯片，細(xì)胞捕獲區(qū)域1-2是目標(biāo)細(xì)胞的捕獲與分選的核心區(qū)域，途徑細(xì)胞捕獲區(qū)域1-2時(shí)目標(biāo)細(xì)胞如尿脫落細(xì)胞B在分選的過(guò)程中被捕獲，剩余液體從樣本出口1-3流出微流控芯片。

為了適用于目標(biāo)細(xì)胞如尿脫落細(xì)胞的分選與捕獲，細(xì)胞捕獲區(qū)域1-2設(shè)有多個(gè)細(xì)胞分選器2，如圖2所示，所述細(xì)胞分選器2由三個(gè)整體呈弧形排布的柱狀凸起201構(gòu)成，柱狀凸起之間存在間隙，弧形開口202作為液流入口，中間柱狀凸起兩側(cè)的間隙203作為液流出口，兩個(gè)液流出口呈對(duì)稱分布。

進(jìn)一步地，各細(xì)胞分選器的底部呈弧狀，有助于最大程度保持細(xì)胞形態(tài)完整，該設(shè)計(jì)是一種適應(yīng)于回收被捕獲細(xì)胞的優(yōu)化設(shè)計(jì)。在回收所捕獲的細(xì)胞時(shí)，緩沖液會(huì)從反向流入芯片(從樣本出口1-3方向流向樣本入口1-1方向)，當(dāng)細(xì)胞被沖出原細(xì)胞分選器時(shí)，將遇到前方眾多的其他細(xì)胞分選器。此時(shí)，因細(xì)胞分選器的底部為弧形，細(xì)胞便更容易繞過(guò)細(xì)胞分選器而被順利回收，從而大大降低了細(xì)胞受到的物理?yè)p傷。

進(jìn)一步地，如圖3所示，為了依據(jù)細(xì)胞尺寸差異分級(jí)捕獲細(xì)胞細(xì)胞，捕獲區(qū)域1-2設(shè)有三種不同尺寸規(guī)格的細(xì)胞分選器2，分別為第一尺寸細(xì)胞分選器2-1、第二尺寸細(xì)胞分選器2-2和第三尺寸細(xì)胞分選器2-3，第一尺寸細(xì)胞分選器2-1、第二尺寸細(xì)胞分選器2-2和第三尺寸細(xì)胞分選器2-3的尺寸依次減小。相鄰的細(xì)胞分選器尺寸不同，在整個(gè)細(xì)胞捕獲區(qū)域1-2內(nèi)營(yíng)造紊亂的液流環(huán)境。因此，液體樣本中的目標(biāo)細(xì)胞，如尿脫落細(xì)胞隨機(jī)流經(jīng)各個(gè)不同尺寸規(guī)格的細(xì)胞分選器，當(dāng)小尺寸的細(xì)胞進(jìn)入大尺寸細(xì)胞分選器后，會(huì)從大尺寸細(xì)胞分選器底部的兩個(gè)液流出口，并隨著液流繼續(xù)往前行，直到遇到尺寸相匹配的細(xì)胞分選器而被捕獲。所以，不同尺寸的細(xì)胞只被對(duì)應(yīng)尺寸的細(xì)胞分選器捕獲，可針對(duì)性地捕獲不同大小的目標(biāo)細(xì)胞如尿脫落細(xì)胞。小尺寸細(xì)胞不會(huì)占據(jù)大尺寸細(xì)胞分選器的空間，大幅提高了各細(xì)胞分選器的利用率。本發(fā)明的一些實(shí)施方式中列舉了：第一尺寸細(xì)胞分選器2-1的液流入口的寬度為60±5μm，兩個(gè)液流出口的寬度均為22±5μm，可捕獲直徑在22～60μm范圍內(nèi)的細(xì)胞(或細(xì)胞團(tuán))。第二尺寸細(xì)胞分選器2-2的液流入口的寬度為30±3μm，兩個(gè)液流出口的寬度均為10±3μm，可捕獲直徑在10～22μm范圍內(nèi)的細(xì)胞。第三尺寸細(xì)胞分選器2-3的液流入口的寬度為16μ±1m，兩個(gè)液流出口的寬度均為4±1μm，可捕獲直徑在4～10μm范圍內(nèi)的細(xì)胞。尿液中的細(xì)胞普遍比血液中大，且常常存在細(xì)胞團(tuán)的情況，針對(duì)尿液細(xì)胞特定設(shè)計(jì)的三種不同尺寸規(guī)格的細(xì)胞分選器，可避免出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)的缺陷。

如圖4所示，所述捕獲區(qū)域1-2包括多個(gè)細(xì)胞分選單元3，每個(gè)所述細(xì)胞分選單元3由一個(gè)第一尺寸細(xì)胞分選器2-1、一個(gè)第二尺寸細(xì)胞分選器2-2和一個(gè)第三尺寸細(xì)胞分選器2-3組成。進(jìn)一步地，位于同一行的細(xì)胞分選單元中各尺寸細(xì)胞分選器的排布方式相同。橫向相鄰的細(xì)胞分選器，邊距d1相同。本發(fā)明的一些實(shí)施例中，列舉了橫向相鄰的細(xì)胞分選器之間的邊距d1為60±3μm，該尺寸允許尿液中可能出現(xiàn)的其他雜質(zhì)順利通過(guò)，避免了芯片的堵塞。即便是當(dāng)患者尿液中有大量的細(xì)胞而將微流控芯片內(nèi)所有細(xì)胞分選器均已被占據(jù)時(shí)，60±3μm的間距也能允許過(guò)剩的細(xì)胞通過(guò)，從而避免了傳統(tǒng)濾膜法中視野混亂的問(wèn)題。

如圖5所示，橫向依次等邊距排列的一個(gè)第一尺寸細(xì)胞分選器2-1、一個(gè)第二尺寸細(xì)胞分選器2-2和一個(gè)第三尺寸細(xì)胞分選器2-3組成一個(gè)第一細(xì)胞分選單元3-1；橫向依次等邊距排列的一個(gè)第一尺寸細(xì)胞分選器2-1、一個(gè)第三尺寸細(xì)胞分選器2-3和一個(gè)第二尺寸細(xì)胞分選器2-2組成一個(gè)第二細(xì)胞分選單元3-2；多個(gè)第一細(xì)胞分選單元3-1橫向循環(huán)排布構(gòu)成第一細(xì)胞分選陣列4-1，多個(gè)第二細(xì)胞分選單元3-2橫向循環(huán)排布構(gòu)成第二細(xì)胞分選陣列4-2，相互平行的一個(gè)第一細(xì)胞分選陣列和一個(gè)第二捕獲陣列組成一個(gè)細(xì)胞分選二級(jí)陣列4，細(xì)胞捕獲區(qū)域中多個(gè)相互平行的細(xì)胞分選二級(jí)陣列縱向等邊距循環(huán)排布。

進(jìn)一步地，在每個(gè)細(xì)胞分選二級(jí)陣列4中，第二細(xì)胞分選陣列4-2的第一尺寸細(xì)胞分選器2-1的液流入口的中點(diǎn)與對(duì)應(yīng)第一細(xì)胞分選陣列4-1的第三尺寸細(xì)胞分選器2-2和第二2-3尺寸細(xì)胞分選器橫向邊距的中點(diǎn)對(duì)齊。

進(jìn)一步地，各奇數(shù)行細(xì)胞分選二級(jí)陣列的首行首列細(xì)胞分選器縱向位置對(duì)齊；各偶數(shù)行細(xì)胞分選二級(jí)陣列較相鄰的前一奇數(shù)行細(xì)胞分選二級(jí)陣列向右側(cè)等距偏移。有助于營(yíng)造紊亂、隨機(jī)的液流環(huán)境，避免細(xì)胞沿單一路徑取向，從而提升微流控芯片的捕獲效率。

流經(jīng)本發(fā)明的前述微流控芯片的所有目標(biāo)細(xì)胞如尿脫落細(xì)胞將以同等概率遭遇各級(jí)細(xì)胞分選器，從而達(dá)到“依據(jù)細(xì)胞尺寸差異分級(jí)捕獲細(xì)胞”的目的。當(dāng)細(xì)胞可以依據(jù)尺寸差異被分別捕獲開來(lái)，則觀察視野更整潔、細(xì)胞形態(tài)更清晰，有利于下一步針對(duì)細(xì)胞形態(tài)的分析判讀(如現(xiàn)今臨床通用的尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查)。

二、微流控芯片的制備方法

可按照聚二甲基硅氧烷(PDMS)標(biāo)準(zhǔn)工藝，采用常規(guī)載玻片作為基底，通過(guò)等離子處理鍵合，來(lái)制備本發(fā)明的微流控芯片。

PDMS是聚二甲基硅氧烷的英文縮寫。聚二甲基硅氧烷屬于固化型聚合物，固化型聚合物與固化劑混合后，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間可固化變硬得到一定結(jié)構(gòu)的微流控芯片。

三、微流控芯片的用途

本發(fā)明的微流控芯片可用于捕獲或回收尿脫落細(xì)胞。

四、捕獲或回收尿脫落細(xì)胞的方法

本發(fā)明的捕獲或回收尿脫落細(xì)胞，包括步驟：(1)捕獲：待處理的尿液樣本或者尿沉渣的懸浮液，在注射泵的推動(dòng)下由樣本入口進(jìn)入本發(fā)明的微流控芯片，細(xì)胞被捕獲于微流控芯片內(nèi)，廢液從樣本出口流出；(2)回收：磷酸鹽緩沖液在注射泵的推動(dòng)下由樣本出口進(jìn)入本發(fā)明的微流控芯片，沿著與細(xì)胞捕獲過(guò)程相反的方向流動(dòng)，所回收的細(xì)胞從樣本入口流出。

五、微流控芯片內(nèi)原位巴氏染色方法

本發(fā)明的巴氏染色方法，包括步驟：先用本發(fā)明的微流控芯片捕獲和分選尿脫落細(xì)胞，然后將捕獲的尿脫落細(xì)胞進(jìn)行微流控芯片內(nèi)原位巴氏染色。所述微流控芯片內(nèi)原位巴氏染色可采用現(xiàn)有技術(shù)中的方法。

本發(fā)明的一些實(shí)施方式中例舉了：微流控芯片內(nèi)原位巴氏染色詳細(xì)步驟為：

(1)在注射泵的控制下，濃度為95％的酒精以0.5-4ml/h的流速通過(guò)捕獲有尿脫落細(xì)胞的微流控芯片，維持15min；

(2)在注射泵的控制下，潔凈清水以0.5-4ml/h的流速通過(guò)微流控芯片，維持1min；

(3)在注射泵的控制下，蘇木素染液以0.5-4ml/h的流速通過(guò)微流控芯片，維持3min；

(4)在注射泵的控制下，潔凈清水以0.5-4ml/h的流速通過(guò)微流控芯片，維持1min；

(5)在注射泵的控制下，碳酸鋰溶液以0.5-4ml/h的流速通過(guò)微流控芯片，維持30s；

(6)在注射泵的控制下，潔凈清水以0.5-4ml/h的流速通過(guò)微流控芯片，維持1min；

(7)在注射泵的控制下，EA-OG溶液以0.5-4ml/h的流速通過(guò)微流控芯片，維持3min；

(8)在注射泵的控制下，濃度為95％的酒精以0.5-4ml/h的流速通過(guò)微流控芯片，維持1min；

(9)在注射泵的控制下，無(wú)水酒精以0.5-4ml/h的流速通過(guò)微流控芯片，維持1min；

(10)鏡下觀察。

六、微流控芯片內(nèi)原位免疫熒光染色方法

本發(fā)明的免疫熒光染色方法，包括步驟：先用本發(fā)明的微流控芯片捕獲和分選尿脫落細(xì)胞，然后將捕獲的尿脫落細(xì)胞進(jìn)行微流控芯片內(nèi)原位免疫熒光染色。所述微流控芯片內(nèi)原位免疫熒光染色可采用現(xiàn)有技術(shù)中的方法。

本發(fā)明的一些實(shí)施方式中例舉了：微流控芯片內(nèi)原位免疫熒光染色詳細(xì)步驟為：

(1)在注射泵的控制下，多聚甲醛以0.5～4ml/h的流速通過(guò)捕獲有尿脫落細(xì)胞的微流控芯片，維持30min；

(2)在注射泵的控制下，PBS以0.5～4ml/h的流速通過(guò)所述微流控芯片，維持3-5min；

(3)在注射泵的控制下，濃度為0.1％的Triton X-100溶液以0.5～4ml/h的流速通過(guò)所述微流控芯片，維持10min；

(4)在注射泵的控制下，PBS以0.5～4ml/h的流速通過(guò)所述微流控芯片，維持3-5min；

(5)在注射泵的控制下，BSA溶液以0.5～4ml/h的流速通過(guò)所述微流控芯片，維持30min；

(6)在注射泵的控制下，抗-CK20一抗(abcam,ab76126)、抗-CD44v6一抗(abcam,ab78960)混合溶液以0.5ml/h的流速通過(guò)所述微流控芯片，維持60min；

(7)在注射泵的控制下，PBS以0.5～4ml/h的流速通過(guò)微流控芯片，維持3-5min；

(8)在注射泵的控制下，CK20對(duì)應(yīng)二抗(Invitrogen,A11070)、CD44v6對(duì)應(yīng)二抗(abcam,ab150116)、DAPI(Invitrogen,MP01306)混合溶液以0.5ml/h的流速通過(guò)所述微流控芯片，維持30min；

(9)在注射泵的控制下，PBS以0.5～4ml/h的流速通過(guò)所述微流控芯片，維持3-5min；

(10)在注射泵的控制下，最后，在熒光顯微鏡對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)的激發(fā)光下，尋找CK20、CD44v6、DAPI三者同時(shí)陽(yáng)性的細(xì)胞，為尿脫落腫瘤細(xì)胞。

本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于(1)經(jīng)微流控芯片捕獲的細(xì)胞依據(jù)尺寸差異而分布開來(lái)，使得觀察視野清晰，方便病理醫(yī)師閱片(2)所用試劑由微流注射泵控制，染色時(shí)間精確、染色過(guò)程自動(dòng)化。

在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語(yǔ)是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或者按照各制造商所建議的條件。

當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說(shuō)明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

除非另外說(shuō)明，本發(fā)明中所公開的實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說(shuō)明，具體可參見Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

實(shí)施例1微流控芯片捕獲尿脫落細(xì)胞

如圖1～5所示，本發(fā)明的微流控芯片，包括沿液流方向A依次連接的樣本入口1-1、細(xì)胞捕獲區(qū)域1-2以及樣本出口1-3。細(xì)胞捕獲區(qū)域1-2設(shè)有多個(gè)細(xì)胞分選器2，如圖2所示，所述細(xì)胞分選器2由三個(gè)整體呈弧形排布的柱狀凸起201構(gòu)成，柱狀凸起之間存在間隙，弧形開口202作為液流入口，中間柱狀凸起兩側(cè)的間隙203作為液流出口，兩個(gè)液流出口呈對(duì)稱分布。細(xì)胞捕獲區(qū)域1-2設(shè)有三種不同尺寸規(guī)格的細(xì)胞分選器2，分別為第一尺寸細(xì)胞分選器2-1、第二尺寸細(xì)胞分選器2-2和第三尺寸細(xì)胞分選器2-3，第一尺寸細(xì)胞分選器2-1、第二尺寸細(xì)胞分選器2-2和第三尺寸細(xì)胞分選器2-3的尺寸依次減小。其中，第一尺寸細(xì)胞分選器2-1的液流入口的寬度為60μm，兩個(gè)液流出口的寬度均為22μm，可捕獲直徑在22～60μm范圍內(nèi)的細(xì)胞。第二尺寸細(xì)胞分選器2-1的液流入口的寬度為30μm，兩個(gè)液流出口的寬度均為10μm，可捕獲直徑在10～22μm范圍內(nèi)的細(xì)胞。第三尺寸細(xì)胞分選器2-3的液流入口的寬度為16μm，兩個(gè)液流出口的寬度均為4μm，可捕獲直徑在4～10μm范圍內(nèi)的細(xì)胞。相鄰的細(xì)胞分選器尺寸不同，在整個(gè)細(xì)胞捕獲區(qū)域1-2內(nèi)營(yíng)造紊亂的液流環(huán)境。

所述捕獲區(qū)域1-2包括多個(gè)細(xì)胞分選單元3，每個(gè)所述細(xì)胞分選單元3由一個(gè)第一尺寸細(xì)胞分選器2-1、一個(gè)第二尺寸細(xì)胞分選器2-2和一個(gè)第三尺寸細(xì)胞分選器2-3組成。進(jìn)一步地，位于同一行的細(xì)胞分選單元中各尺寸細(xì)胞分選器的排布方式相同。橫向相鄰的細(xì)胞分選器，邊距d1相同，均為60μm。橫向依次等邊距排列的一個(gè)第一尺寸細(xì)胞分選器2-1、一個(gè)第二尺寸細(xì)胞分選器2-2和一個(gè)第三尺寸細(xì)胞分選器2-3組成一個(gè)第一細(xì)胞分選單元3-1；橫向依次等邊距排列的一個(gè)第一尺寸細(xì)胞分選器2-1、一個(gè)第三尺寸細(xì)胞分選器2-3和一個(gè)第二尺寸細(xì)胞分選器2-2組成一個(gè)第二細(xì)胞分選單元3-2；多個(gè)第一細(xì)胞分選單元3-1橫向循環(huán)排布構(gòu)成第一細(xì)胞分選陣列4-1，多個(gè)第二細(xì)胞分選單元3-2橫向循環(huán)排布構(gòu)成第二細(xì)胞分選陣列4-2，相互平行的一個(gè)第一細(xì)胞分選陣列和一個(gè)第二捕獲陣列組成一個(gè)細(xì)胞分選二級(jí)陣列4，細(xì)胞捕獲區(qū)域中多個(gè)相互平行的細(xì)胞分選二級(jí)陣列縱向等邊距(d3＝120μm)循環(huán)排布。

各奇數(shù)行細(xì)胞分選二級(jí)陣列的首行首列細(xì)胞分選器縱向位置對(duì)齊；各偶數(shù)行細(xì)胞分選二級(jí)陣列較相鄰的前一奇數(shù)行細(xì)胞分選二級(jí)陣列向右側(cè)等距(d2＝50μm)偏移。按次規(guī)律，直至填滿總長(zhǎng)度和總寬度均為6000μm的微流控芯片捕獲區(qū)域1-2。

按照聚二甲基硅氧烷(PDMS)標(biāo)準(zhǔn)工藝，采用常規(guī)2.5*7.5cm載玻片作為基底，通過(guò)等離子處理鍵合，來(lái)制備本發(fā)明的微流控芯片。

在注射泵的控制下，待處理的尿液樣本或者尿沉渣的PBS(磷酸鹽緩沖液)懸浮液，從樣本入口1-1進(jìn)入微流控芯片，途徑細(xì)胞捕獲區(qū)域1-2時(shí)尿脫落細(xì)胞被捕獲，剩余液體從樣本出口1-3流出微流控芯片。液體樣本中的尿脫落細(xì)胞B隨機(jī)流經(jīng)各個(gè)不同尺寸規(guī)格的細(xì)胞分選器，不同尺寸的尿脫落細(xì)胞B被對(duì)應(yīng)尺寸的細(xì)胞分選器2捕獲。因此，不同尺寸的細(xì)胞在芯片內(nèi)部規(guī)則分布開來(lái)，視野清晰，細(xì)胞形態(tài)完好，特別適用于下一步的分析。

實(shí)施例2免疫熒光法判定尿脫落腫瘤細(xì)胞

尿脫落細(xì)胞被實(shí)施例1中的微流控芯片捕獲后，如圖6所示，不同尺寸的細(xì)胞在芯片內(nèi)部規(guī)則分布開來(lái)，視野清晰，細(xì)胞形態(tài)完好，特別適用于下一步的分析。

本實(shí)施例通過(guò)免疫熒光法來(lái)區(qū)別尿脫落腫瘤細(xì)胞與正常尿路上皮細(xì)胞。

免疫熒光染色步驟：多聚甲醛以0.5～4ml/h的流速通過(guò)捕獲有尿脫落細(xì)胞的微流控芯片，維持30min；PBS以0.5～4ml/h的流速通過(guò)所述微流控芯片，維持3-5min；濃度為0.1％的Triton X-100溶液以0.5～4ml/h的流速通過(guò)所述微流控芯片，維持10min；PBS以0.5～4ml/h的流速通過(guò)所述微流控芯片，維持3-5min；BSA溶液以0.5～4ml/h的流速通過(guò)所述微流控芯片，維持30min。抗-CK20一抗(abcam,ab76126)、抗-CD44v6一抗(abcam,ab78960)混合溶液以0.5ml/h的流速通過(guò)所述微流控芯片，維持60min；PBS以0.5～4ml/h的流速通過(guò)微流控芯片，維持3-5min；CK20對(duì)應(yīng)二抗(Invitrogen,A11070)、CD44v6對(duì)應(yīng)二抗(abcam,ab150116)、DAPI(Invitrogen,MP01306)混合溶液以0.5ml/h的流速通過(guò)所述微流控芯片，維持30min；PBS以0.5～4ml/h的流速通過(guò)所述微流控芯片，維持3-5min。

最后，在熒光顯微鏡對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)的激發(fā)光下，尋找CK20、CD44v6、DAPI三者同時(shí)陽(yáng)性的細(xì)胞，為尿脫落腫瘤細(xì)胞。如圖7所示。

具體地，CK20：激發(fā)波長(zhǎng)450nm-480nm,發(fā)射波長(zhǎng)515nm；CD44v6:激發(fā)波長(zhǎng)515nm-585nm,發(fā)射波長(zhǎng)610nm；DAPI:激發(fā)波長(zhǎng)330nm-385nm,發(fā)射波長(zhǎng)420nm。

實(shí)施例3本發(fā)明的檢測(cè)準(zhǔn)確率

為了驗(yàn)證本發(fā)明的準(zhǔn)確率，我們收集了50位確診的尿路上皮癌患者、13位非癌癥志愿者的尿液采用上述實(shí)施例2中的方法進(jìn)行檢測(cè)。尋找CK20、CD44v6、DAPI三者同時(shí)陽(yáng)性的細(xì)胞，為尿脫落腫瘤細(xì)胞?；谒邪咐蛞褐兴鶛z測(cè)到腫瘤細(xì)胞數(shù)目繪制ROC曲線(如圖8所示)，得本發(fā)明的敏感度為：88.9％；特異度為：76.9％，ROC曲線下面積為0.808。

此外，我們也實(shí)施了與臨床現(xiàn)役尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查的一對(duì)一比較。共采集17位尿路上皮癌確診患者的尿液，其中一半尿液送往醫(yī)院病理科進(jìn)行尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查，另外一半尿液送往實(shí)驗(yàn)室采用本發(fā)明上述實(shí)施例2中的方法進(jìn)行檢測(cè)。尋找CK20、CD44v6、DAPI三者同時(shí)陽(yáng)性的細(xì)胞，為尿脫落腫瘤細(xì)胞。結(jié)果為：17例確診患者中，傳統(tǒng)尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查呈陽(yáng)性(包含疑似病例)的僅4例，準(zhǔn)確率23.5％；而本發(fā)明在17位患者中檢測(cè)出了15例陽(yáng)性結(jié)果，準(zhǔn)確率88.2％。詳見下表1所示：

表1：本發(fā)明與傳統(tǒng)尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查的比較

N:陰性；S:疑似；P:陽(yáng)性

實(shí)施例4巴氏染色法判定尿脫落腫瘤細(xì)胞

在尿脫落腫瘤細(xì)胞的判定方面，本發(fā)明除了可使用上述免疫熒光法，還兼容傳統(tǒng)的病理學(xué)染色法。在捕獲到細(xì)胞后進(jìn)行芯片內(nèi)巴氏染色，所用試劑與流程和臨床用巴氏染色法一致。染色后可清晰呈現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)，以供病理醫(yī)生閱片。如下圖9所示。

實(shí)施例5回收細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序

對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分子層面的分析具有巨大的臨床價(jià)值，也充分體現(xiàn)了精準(zhǔn)醫(yī)療的理念。本發(fā)明的一大優(yōu)勢(shì)為：可無(wú)損捕獲、回收單個(gè)尿脫落腫瘤細(xì)胞，從而為下游的單細(xì)胞測(cè)序打下基礎(chǔ)。我們使用本發(fā)明上述實(shí)施例1中的微流控芯片捕獲并回收了一位尿路上皮癌患者的6個(gè)尿脫落細(xì)胞(1個(gè)正常尿路上皮細(xì)胞、5個(gè)腫瘤細(xì)胞)，然后對(duì)該6個(gè)細(xì)胞分別進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，最后分析其拷貝數(shù)變異(CNV)情況。

如圖10結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞均如預(yù)期出現(xiàn)了拷貝數(shù)紊亂的情況，而正常尿路上皮細(xì)胞的拷貝數(shù)則符合正常的二倍體特征。

這個(gè)例子充分證明了本發(fā)明可以高效地捕獲并回收單個(gè)尿脫落細(xì)胞，全過(guò)程對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的損傷極小，可以銜接下游一系列的分子分析手段，因此具有重大價(jià)值與潛力。

以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對(duì)本發(fā)明任何形式上和實(shí)質(zhì)上的限制，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還將可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，當(dāng)可利用以上所揭示的技術(shù)內(nèi)容而做出的些許更動(dòng)、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實(shí)施例；同時(shí)，凡依據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)對(duì)上述實(shí)施例所作的任何等同變化的更動(dòng)、修飾與演變，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。