1.一種提高地衣芽胞桿菌外源蛋白分泌水平的方法,其特征在于,具體包括以下步驟:
S1,構(gòu)建信號肽肽酶SppA整合載體,導入地衣芽胞桿菌中,通過同源單雙交換,過表達信號肽肽酶SppA,從而得到地衣芽胞桿菌整合菌株;
S2,將外源蛋白的表達質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入S1所述地衣芽胞桿菌整合菌株中,從而得到地衣芽胞桿菌外源蛋白表達菌株;
S3,將S2所述地衣芽胞桿菌外源蛋白表達菌株于種子培養(yǎng)基中進行活化,得到活化的種子液;
S4,將S3中所述種子液于相應(yīng)外源蛋白液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵,即可提高所述外源蛋白分泌水平。
2.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種提高地衣芽胞桿菌外源蛋白分泌水平的方法,其特征在于,過表達地衣芽胞桿菌中信號肽肽酶SppA的具體步驟為:
1)采用PCR的方法擴增出信號肽肽酶sppA基因所需的上下游同源臂;
2)所述上下游同源臂片段回收純化后,進行SOE-PCR并回收純化,酶切,并與相同酶酶切的整合表達質(zhì)粒T2(2)-Ori連接,并進行PCR驗證,得到信號肽肽酶SppA整合載體;
3)將所述信號肽肽酶SppA整合載體轉(zhuǎn)入地衣芽胞桿菌中。
3.根據(jù)權(quán)利要求2中所述提高地衣芽胞桿菌外源蛋白分泌水平的方法,其特征在于,所述地衣芽胞桿菌為地衣芽胞桿菌BL10,所述地衣芽胞桿菌BL10保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),保藏編號為CCTCC NO:M2013400。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種提高地衣芽胞桿菌外源蛋白分泌水平的方法,其特征在于,所述信號肽肽酶sppA基因的DNA序列表為序列表中的SEQ ID NO:1。
5.根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高地衣芽胞桿菌外源蛋白分泌水平的方法,其特征在于,所述外源蛋白包括淀粉酶、納豆激酶、甘露聚糖酶中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種提高地衣芽胞桿菌外源蛋白分泌水平的方法,其特征在于,所述淀粉酶、納豆激酶、甘露聚糖酶的液體發(fā)酵培養(yǎng)基分別對應(yīng)為淀粉酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基、納豆激酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基和甘露聚糖酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求6所述方法中的淀粉酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基,其特征在于,所述淀粉酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為:5~8g/L玉米漿;5~8g/L酵母粉;6~12g/L蛋白胨;8~14g/L檸檬酸鈉;2~3g/L一水合磷酸氫二鉀;0.5~2g/L七水合硫酸鎂及余量的水;所述淀粉酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基pH 7.0~7.2。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求6所述方法中的納豆激酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基,其特征在于,所述納豆激酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為:10~30g/L葡萄糖;5~20g/L蛋白胨;10~25g/L酵母粉;5~15g/L大豆蛋白胨;5~12g/L氯化鈉;3~12g/L硫酸銨及余量的水;所述納豆激酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基pH 7.0~7.2。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求6所述方法中的甘露聚糖酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基,其特征在于,所述甘露聚糖酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為:15~30g/L魔芋粉;15~35g/L豆粕;3~8g/L玉米漿;3~8g/L硫酸銨;1~3g/L一水合磷酸二氫鉀及余量的水;所述甘露聚糖酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基pH 7.0~7.4。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種提高地衣芽胞桿菌外源蛋白分泌水平的方法,其特征在于,所述淀粉酶的表達質(zhì)粒為pHY-amyL;所述納豆激酶的表達質(zhì)粒為pP3SacCNK;所述甘露聚糖酶的表達質(zhì)粒為pHY-manA。