地衣芽胞桿菌是近年來(lái)被廣泛研究的一種革蘭氏陽(yáng)性菌，廣泛存在于自然界中，是公認(rèn)的生物安全性菌株(GRAS)，具有遺傳背景清晰，遺傳操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。其發(fā)酵后可以合成多種生物化工產(chǎn)品(聚γ-谷氨酸，桿菌肽，乙偶姻，2,3-丁二醇等)。與此同時(shí)，地衣芽胞桿菌具有良好的外源蛋白分泌能力，可作為一種優(yōu)良的宿主菌用于外源蛋白的生產(chǎn)。

在地衣芽胞桿菌外源蛋白分泌過(guò)程中，前體蛋白經(jīng)過(guò)信號(hào)肽酶的剪切作用后從而分泌到胞外，而信號(hào)肽則殘留于細(xì)胞膜上，而抑制了前體蛋白進(jìn)一步分泌到胞外，影響蛋白分泌水平。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種提高地衣芽胞桿菌外源蛋白分泌效率的方法。所述方法是在在地衣芽胞桿菌的基礎(chǔ)上，通過(guò)過(guò)表達(dá)信號(hào)肽肽酶SppA，得到信號(hào)肽肽酶過(guò)表達(dá)菌株，所述菌株能有效提高外源蛋白的分泌量。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：

一種提高地衣芽胞桿菌外源蛋白分泌水平的方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

S1，構(gòu)建信號(hào)肽肽酶SppA整合載體，導(dǎo)入地衣芽胞桿菌中，通過(guò)同源單雙交換，過(guò)表達(dá)信號(hào)肽肽酶SppA，從而得到地衣芽胞桿菌整合菌株；

S2，將外源蛋白的表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入S1所述地衣芽胞桿菌整合菌株中，從而得到地衣芽胞桿菌外源蛋白表達(dá)菌株；

S3，將S2所述地衣芽胞桿菌外源蛋白表達(dá)菌株于種子培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，得到活化的種子液；

S4，將S3中所述種子液于相應(yīng)外源蛋白液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，即可提高所述外源蛋白分泌水平。

過(guò)表達(dá)地衣芽胞桿菌中信號(hào)肽肽酶SppA的具體步驟為：

1)采用PCR的方法擴(kuò)增出信號(hào)肽肽酶sppA基因所需的上下游同源臂；

2)所述上下游同源臂片段回收純化后，進(jìn)行SOE-PCR并回收純化，酶切，并與相同酶酶切的整合表達(dá)質(zhì)粒T₂(2)-Ori連接，并進(jìn)行PCR驗(yàn)證，得到信號(hào)肽肽酶SppA整合載體；

3)將所述信號(hào)肽肽酶SppA整合載體轉(zhuǎn)入地衣芽胞桿菌中。

所述地衣芽胞桿菌為地衣芽胞桿菌BL10，所述地衣芽胞桿菌BL10(Bacillus licheniformis BL10)保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC NO：M2013400，保藏日期為：2013年9月10日，保藏地址為：中國(guó)武漢大學(xué)。

所述信號(hào)肽肽酶sppA基因的DNA序列表為序列表中的SEQ ID NO:1。

所述外源蛋白包括淀粉酶、納豆激酶、甘露聚糖酶中的一種。

所述淀粉酶、納豆激酶、甘露聚糖酶的液體發(fā)酵培養(yǎng)基分別對(duì)應(yīng)為淀粉酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基、納豆激酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基和甘露聚糖酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基。

一種淀粉酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述淀粉酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為：5～8g/L玉米漿；5～8g/L酵母粉；6～12g/L蛋白胨；8～14g/L檸檬酸鈉；2～3g/L一水合磷酸氫二鉀；0.5～2g/L七水合硫酸鎂及余量的水；所述淀粉酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基pH 7.0～7.2。

一種納豆激酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述納豆激酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為：10～30g/L葡萄糖；5～20g/L蛋白胨；10～25g/L酵母粉；5～15g/L大豆蛋白胨；5～12g/L氯化鈉；3～12g/L硫酸銨及余量的水；所述納豆激酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基pH 7.0～7.2。

一種甘露聚糖酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述甘露聚糖酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為：15～30g/L魔芋粉；15～35g/L豆粕；3～8g/L玉米漿；3～8g/L硫酸銨；1～3g/L一水合磷酸二氫鉀及余量的水；所述甘露聚糖酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基pH 7.0～7.4。

所述淀粉酶的表達(dá)質(zhì)粒為pHY-amyL；所述納豆激酶的表達(dá)質(zhì)粒為pP3SacCNK；所述甘露聚糖酶的表達(dá)質(zhì)粒為pHY-manA。

本發(fā)明的技術(shù)效果為：

本發(fā)明通過(guò)過(guò)表達(dá)地衣芽胞桿菌中信號(hào)肽肽酶SppA，信號(hào)肽肽酶SppA高效溶解地衣芽胞桿菌細(xì)胞膜上被信號(hào)肽酶切割后殘留的信號(hào)肽，從而打通地衣芽胞桿菌源蛋白分泌至胞外的通道，所述方法以淀粉酶、納豆激酶、甘露聚糖酶為目標(biāo)蛋白進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)地衣芽胞桿菌過(guò)表達(dá)信號(hào)肽肽酶SppA后其外源蛋白的分泌量顯著提高，分別提高了70％，33％，48.8％，說(shuō)明對(duì)地衣芽胞桿菌過(guò)表達(dá)信號(hào)肽肽酶SppA可以有效提高其外源蛋白的分泌水平；另外本發(fā)明所述的外源蛋白發(fā)酵培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)有效全面，能輔助提高地衣芽胞桿菌外源蛋白分泌水平。

附圖說(shuō)明

圖1：sppA過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)件圖(上下游同源臂擴(kuò)增圖)；

其中，泳道1，2：整合基因sppA所擴(kuò)增的上下游同源臂A和B；泳道3：5K DNA marker(從上到下依次為：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)。

圖2：整合載體轉(zhuǎn)化地衣芽胞桿菌BL10菌落PCR驗(yàn)證圖；

其中，泳道1：載體構(gòu)建中的菌落PCR驗(yàn)證膠圖，泳道2：5K marker(從上到下依次為：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)，PCR驗(yàn)證所用引物為載體上的驗(yàn)證引物T₂-F/R。

圖3：地衣芽胞桿菌BL10中整合sppA的驗(yàn)證膠圖；

其中，泳道1：野生菌的雙交換驗(yàn)證的菌落PCR膠圖，泳道2：工程菌的雙交換驗(yàn)證的菌落PCR膠圖，泳道3：5Kmarker(從上到下依次為：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)，PCR驗(yàn)證所用引物為雙交換驗(yàn)證引物GsppA-KYF/KYR。

圖4：淀粉酶表達(dá)質(zhì)粒pHY-amyL轉(zhuǎn)化地衣芽胞桿菌BL10(sppA)菌落PCR驗(yàn)證圖；

其中，泳道1：5K marker(從上到下依次為：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；

泳道2：淀粉酶質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL10(sppA)菌落PCR驗(yàn)證圖。

圖5：納豆激酶表達(dá)質(zhì)粒pP3SacCNK轉(zhuǎn)化地衣芽胞桿菌BL10(sppA)菌落PCR驗(yàn)證圖；

其中，泳道1：5K marker(從上到下依次為：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；

泳道3：納豆激酶質(zhì)粒轉(zhuǎn)換BL10(sppA)菌落PCR驗(yàn)證圖。

圖6：甘露聚糖酶表達(dá)質(zhì)粒pHY-manA轉(zhuǎn)化地衣芽胞桿菌BL10(sppA)菌落PCR驗(yàn)證圖；

其中，泳道1：5K marker(從上到下依次為：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；

泳道4：甘露聚糖酶質(zhì)粒轉(zhuǎn)換BL10(sppA)菌落PCR驗(yàn)證圖。

圖7：地衣芽胞桿菌BL10(sppA)/pHY-amyL與原始菌發(fā)酵終點(diǎn)測(cè)定淀粉酶酶活力柱狀圖。

圖8：地衣芽胞桿菌BL10(sppA)/pP43SacCNK與原始菌發(fā)酵終點(diǎn)測(cè)定納豆激酶酶活力柱狀圖。

圖9：地衣芽胞桿菌BL10(sppA)/pHY-manA與原始菌發(fā)酵終點(diǎn)測(cè)定甘露聚糖酶酶活力柱狀圖。

具體實(shí)施方式

結(jié)合以下實(shí)例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明：

本發(fā)明所述實(shí)施例所用地衣芽胞桿菌為地衣芽胞桿菌BL10，所述地衣芽胞桿菌BL10的拉丁文分類命名為Bacillus licheniformis BL10，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC NO：M2013400。中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)于2013年9月10日收到地衣芽胞桿菌BL10，并登記入冊(cè)，由該日起保存三十年，在期滿前收到提供培養(yǎng)物樣品的請(qǐng)求后再延續(xù)保存五年，所述地衣芽胞桿菌BL10在保藏中心于2013年9月15日檢測(cè)完畢，結(jié)果為存活。

實(shí)施例1

(1)信號(hào)肽肽酶整合表達(dá)載體T2-SppA的構(gòu)建

根據(jù)NCBI公布的地衣芽胞桿菌WX-02基因組序列及sppA基因序列，采用PCR的方法擴(kuò)增出用于過(guò)表達(dá)sppA的上下游同源臂A和B。

由圖1可知，已成功擴(kuò)增用于整合sppA的上下游同源臂。

地衣芽胞桿菌信號(hào)肽肽酶基因sppA整合載體引物：

sppA-KF1 CGGGATCC ATGATGAGGAAAAAGAGTTT

sppA-KR1 AGCGTCCCATTAAGACTTGCAGCAGAAGCGGAATCGCTGA

sppA-KF2 TCAGCGATTCCGCTTCTGCTGCAAGTCTTAATGGGACGCT

sppA-KR2 CGGGATCC ATGAAACAACACAAACGGCTTT

上下游同源臂片段回收純化后，進(jìn)行SOE-PCR并回收純化，酶切，并與相同酶酶切的整合表達(dá)質(zhì)粒T₂(2)-Ori連接，并進(jìn)行PCR驗(yàn)證，其驗(yàn)證引物為：

T₂-F ATGTGATAACTCGGCGTA

T₂-R GCAAGCAGCAGATTACGC

(2)地衣芽胞桿菌BL10中sppA的整合

將構(gòu)建好的SppA整合載體轉(zhuǎn)入地衣芽胞桿菌BL10中，如圖2所示，經(jīng)單雙交換驗(yàn)證后并測(cè)序驗(yàn)證，BL10中成功整合信號(hào)肽肽酶基因sppA。其驗(yàn)證引物為：

GsppA-KYF：CGGGATCC ATGAAAAAGAGACTGATTCA

GsppA-KYR：AAGACTTGCTGCATCTGCCGAAAATGCC

由圖3可知，野生菌PCR驗(yàn)證條帶為1835bp，整合菌株驗(yàn)證條帶為2200bp，說(shuō)明信號(hào)肽肽酶基因sppA已成功整合至地衣芽胞桿菌BL10基因組中。

(3)過(guò)表達(dá)信號(hào)肽肽酶SppA對(duì)納豆激酶外源表達(dá)的影響

將構(gòu)建好的納豆激酶表達(dá)質(zhì)粒pP3SacCNK電轉(zhuǎn)入BL10(sppA)中，如圖5所示。

菌株：BL10/pP3SacCNK和BL10(sppA)/pP3SacCNK

本發(fā)明中，種子液：8～10g/L蛋白胨；3～6g/L酵母浸出粉；7～10g/L氯化鈉及余量的水，pH 7.0～7.2，250mL三角瓶裝液量為50mL。

種子培養(yǎng)時(shí)間：10h

納豆激酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基：10～30g/L葡萄糖；5～20g/L蛋白胨；10～25g/L酵母粉；5～15g/L大豆蛋白胨；5～12g/L氯化鈉；3～12g/L硫酸銨及余量的水；pH 7.0～7.2。

接種量：3％～5％

培養(yǎng)時(shí)間：48h

具體到本次實(shí)驗(yàn),種子液：9g/L蛋白胨；4g/L酵母浸出粉；9g/L氯化鈉及余量的水，pH 7.1，250mL三角瓶裝液量為50mL。

種子培養(yǎng)時(shí)間：10h

納豆激酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基：20g/L葡萄糖；15g/L蛋白胨；20g/L酵母粉；10g/L大豆蛋白胨；9g/L氯化鈉；7g/L硫酸銨及余量的水；pH 7.1。

接種量：4％

培養(yǎng)時(shí)間：48h

(4)納豆激酶酶活的測(cè)定：

1)取發(fā)酵后的樣品按倍數(shù)依次稀釋。

2)樣品吸光度AT：向試管中依次加入0.40mL纖維蛋白原溶液(0.72％,w/v)，1.4mL Tris-HCl(50mM,pH 7.8)，37℃溫浴5min，然后加入0.10mL凝血酶溶液(20U/mL)，37℃溫浴10min，然后加入0.10ml的稀釋酶樣品，37℃溫浴60min，加入2mL三氯乙酸(0.20M)靜止20min終止反應(yīng)，10000rpm離心10min，取上清于275nm比色測(cè)定吸光度AT；

3)對(duì)照吸光度AB：向試管中依次加入0.40mL纖維蛋白原溶液(0.72％,w/v)，1.40mL Tris-HCl(50mM，pH7.8)，37℃溫浴5min，然后加入0.10mL凝血酶溶液(20U/mL)，37℃溫浴10min，繼續(xù)37℃溫浴60min，然后同時(shí)加入0.10mL的稀釋酶樣品和2mL三氯乙酸(0.20M)，10000rpm離心10min，取上清于275nm比色測(cè)定吸光度AB作為對(duì)照。

1個(gè)單位的纖維蛋白降解酶活(FU)相當(dāng)于每分鐘275nm處吸光度增加0.01納豆激酶活性(FU/g或者FU/ml)＝(AT－AB)/0.01×1/60×1/0.1×D＝A100/6*D D：稀釋倍數(shù)；AT實(shí)際的A275；AB：空白A275。

由圖可知：對(duì)照菌BL10/pP43SacCNK所產(chǎn)的納豆激酶酶活為31.83FU/mL，實(shí)驗(yàn)組BL10(sppA)/pP43SacCNK所產(chǎn)納豆激酶酶活為42.33FU/mL，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組提高了33.3％。

實(shí)施例2

(1)信號(hào)肽肽酶整合表達(dá)載體T2-SppA的構(gòu)建

具體步驟與實(shí)施例1中(1)信號(hào)肽肽酶整合表達(dá)載體T2-SppA的構(gòu)建所述內(nèi)容相同。

(2)地衣芽胞桿菌BL10中sppA的整合

具體步驟與實(shí)施例1中(2)地衣芽胞桿菌BL10中sppA的整合所述內(nèi)容相同。

(3)過(guò)表達(dá)信號(hào)肽肽酶SppA對(duì)α-淀粉酶外源表達(dá)的影響

將構(gòu)建好的α-淀粉酶表達(dá)質(zhì)粒pHY-amyL電轉(zhuǎn)入BL10(sppA)中，如圖4所示。

菌株：BL10/pHY-amyL和BL10(sppA)/pHY-amyL

本發(fā)明中，種子液：8～10g/L蛋白胨；3～6g/L酵母浸出粉；7～10g/L氯化鈉及余量的水，pH 7.0～7.2，250mL三角瓶裝液量為50mL。

種子培養(yǎng)時(shí)間：10h

淀粉酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基：5～8g/L玉米漿；5～8g/L酵母粉；6～12g/L蛋白胨；8～14g/L檸檬酸鈉；2～3g/L一水合磷酸氫二鉀；0.5～2g/L七水合硫酸鎂及余量的水；pH 7.0～7.2。

接種量：3％～5％

培養(yǎng)時(shí)間：48h

具體到本次實(shí)驗(yàn)，種子液：9g/L蛋白胨；4g/L酵母浸出粉；9g/L氯化鈉及余量的水，pH 7.1，250mL三角瓶裝液量為50mL。

種子培養(yǎng)時(shí)間：10h

淀粉酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基：6g/L玉米漿；7g/L酵母粉；9g/L蛋白胨；12g/L檸檬酸鈉；2.5g/L一水合磷酸氫二鉀；1g/L七水合硫酸鎂及余量的水；pH 7.1。

接種量：4％

培養(yǎng)時(shí)間：48h

(4)α-淀粉酶酶活力的測(cè)定：

原碘液：稱取11.00g碘和22.00g碘化鉀，少量水使碘完全溶解，定容至500mL貯存在棕色瓶中。

稀碘液：稱取20.00g碘化鉀用水溶解，吸取2.00mL碘原液并定容至500mL，貯存于棕色瓶?jī)?nèi)。

可溶性淀粉溶液(2mg/mL)：稱取0.200g(精確至0.001g)可溶性淀粉，在燒杯內(nèi)調(diào)成漿狀物，緩慢注入70mL沸水中，攪拌加熱至完全透明，定容至100mL，。

磷酸緩沖液(PH＝6.0)：稱取45.23g磷酸氫二鈉(Na₂HPO₄·12H₂O)和8.07g檸檬酸鈉(C₆H₈O₇·H₂O)，用水溶解并定容至1000mL。

1、待測(cè)初酶液的制備：取2mL發(fā)酵液于2mL離心管中，1000rpm離心10min，取上清液，稀釋到一定倍數(shù)待用。

2、測(cè)定：吸取20.0mL可溶性淀粉溶液(2mg/mL)于50mL離心管中，加入5.00mL磷酸緩沖液(pH＝6)，搖勻后置于60±0.2℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱8min；

3、加入1.00mL待測(cè)酶液，立即計(jì)時(shí)，搖勻，準(zhǔn)確反應(yīng)10min；立即加入1.00mL反應(yīng)液至預(yù)先含有0.5mL 0.1mol/L鹽酸溶液和5.00mL稀碘液的離心管中，搖勻，并以0.5mL鹽酸溶液和5.00稀碘液為空白，在660nm波長(zhǎng)下，用10mm比色皿迅速測(cè)定其吸光度(A)。

4、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：精確配制2mg/mL的淀粉溶液，分別稀釋成0.00mg/mL，0.10mg/mL，0.20mg/mL……1.70mg/mL，1.80mg/mL，1.90mg/mL，2.00mg/mL。分別加入到盛有0.5mL 0.1mol/L鹽酸溶液和5.00mL稀碘液的離心管中，搖勻，并以0.5mL鹽酸溶液和5.00稀碘液為空白，在660nm波長(zhǎng)下，用10mm比色皿迅速測(cè)定其吸光度(A)，以吸光度(A)為橫坐標(biāo)，淀粉濃度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線和斜率K。單位U/mL，U定義為1min水解1mg淀粉的酶量。

計(jì)算：酶活力(U/mL)＝(2×20-26×AK)×n/10n：稀釋倍

由圖7可知：對(duì)照菌BL10/pHY-amyL所產(chǎn)的淀粉酶酶活為82.2U/mL，SppA過(guò)表達(dá)菌株BL10(sppA)/pHY-amyL所產(chǎn)淀粉酶酶活達(dá)到140U/mL，相比于對(duì)照組提高了70％。

實(shí)施例3

(1)信號(hào)肽肽酶整合表達(dá)載體T2-SppA的構(gòu)建

具體步驟與實(shí)施例1中(1)信號(hào)肽肽酶整合表達(dá)載體T2-SppA的構(gòu)建所述內(nèi)容相同。

(2)地衣芽胞桿菌BL10中sppA的整合

具體步驟與實(shí)施例1中(2)地衣芽胞桿菌BL10中sppA的整合所述內(nèi)容相同。

(3)過(guò)表達(dá)信號(hào)肽肽酶SppA對(duì)甘露聚糖酶外源表達(dá)的影響

將構(gòu)建好的甘露聚糖酶表達(dá)質(zhì)粒pHY-manA電轉(zhuǎn)入BL10(sppA)，如圖6所示。

菌株：BL10/pHY-manA和BL10(sppA)/pHY-manA。

本發(fā)明中，種子液：8～10g/L蛋白胨；3～6g/L酵母浸出粉；7～10g/L氯化鈉及余量的水，pH 7.0～7.2，250mL三角瓶裝液量為50mL。

種子培養(yǎng)時(shí)間：10h

甘露聚糖酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基：15～30g/L魔芋粉；15～35g/L豆粕；3～8g/L玉米漿；3～8g/L硫酸銨；1～3g/L一水合磷酸二氫鉀及余量的水；pH 7.0～7.4。

接種量：3％～5％

培養(yǎng)時(shí)間：48

具體到本次實(shí)驗(yàn)，種子液：9g/L蛋白胨；4g/L酵母浸出粉；9g/L氯化鈉及余量的水，pH 7.1，250mL三角瓶裝液量為50mL。

種子培養(yǎng)時(shí)間：10h

甘露聚糖酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基：22g/L魔芋粉；25g/L豆粕；6g/L玉米漿；5g/L硫酸銨；2g/L一水合磷酸二氫鉀；pH 7.2。

接種量：4％

培養(yǎng)時(shí)間：48

(4)酶活力單位(U)的定義：在40℃、pH 6.0的酶活力測(cè)定條件下，1min催化5mg/mL LBG底物溶液生成1μg還原糖(以甘露糖表示)所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)，其中樣品的酶活力以U/g(固體酶)或U/mL(液體酶)表示。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：分別吸取10mg/mL甘露糖標(biāo)準(zhǔn)液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0mL于100mL容量瓶中，用pH 6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液稀釋至刻度，得到0，100，200，300，400，500，600μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液。取不同濃度稀釋液各2mL于試管中，加2mL pH 6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，DNS試劑5mL，于沸水浴沸騰5min(樣品放入從新沸騰計(jì)時(shí))，取出后立即用自來(lái)水冷卻至室溫，并加入蒸餾水定容至25mL，混勻，以不含甘露糖的為空白，在540nm處分別測(cè)定其吸光度，并記錄。

以吸光度OD值為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)甘露糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測(cè)酶液的制備：吸取5mL發(fā)酵液4000r/min離心10min，取1.0mL上清液用0.05M pH 6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液定容至100mL作為待測(cè)酶液(用前作適當(dāng)稀釋；吸光度OD值在0.2-0.4之間)。

吸取10.0mL 10mg/mL LBG底物溶液，40℃平衡10min。

吸取10.0mL經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的待測(cè)酶液，40℃平衡10min。

吸取2.00mL經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的酶液(已經(jīng)過(guò)40℃平衡)，加入到刻度試管中，再加入5mL DNS試劑，振蕩3s。然后加入2.0mL LBG底物溶液，40℃保溫20min，沸水浴加熱5min。用自來(lái)水冷卻至室溫，加水定容至25mL，振蕩3s。以此作為下步反應(yīng)空白調(diào)零樣。

吸取2.00mL經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的酶液(已經(jīng)過(guò)40℃平衡)，加入到刻度試管中，再加入2.0mL LBG底物溶液(已經(jīng)過(guò)40℃平衡)，振蕩3s，40℃精確保溫20min。加入5.0mL DNS試劑，振蕩3s，以終止酶解反應(yīng)。沸水浴加熱5min，用自來(lái)水冷卻至室溫，加水定容至25mL，混勻。以酶空白樣為空白調(diào)零，在540nm出測(cè)定吸光度OD值。需做2個(gè)平行。

查標(biāo)準(zhǔn)曲線或回歸方程式，求出樣品中還原糖量。OD值以在0.2-0.40范圍為宜，若不在此范圍需改變稀釋倍數(shù)后再做。

其中，結(jié)果表示與計(jì)算按式(1)

式中：

X——試樣甘露聚糖酶的活力，U/g或U/mL；A——從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的還原糖量，μg；

N——稀釋倍數(shù)(從固體樣品到最終液的總稀釋倍數(shù))；20——20分鐘的反應(yīng)時(shí)間。

同一試樣兩個(gè)平行測(cè)定值的相對(duì)誤差不超過(guò)8.0％，二者的平均值為最終的酶活力測(cè)定值。

由圖9可知：對(duì)照菌BL10/pHY-manA所產(chǎn)的甘露聚糖酶酶活為12.5U/mL，BL10(sppA)/pHY-manA所產(chǎn)的甘露聚糖酶酶活為18.6U/mL，相對(duì)于對(duì)照組酶活提高了48.8％。

應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的應(yīng)用不限于上述的舉例，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)上述說(shuō)明加以改進(jìn)或變換，所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。

序列表

<110> 湖北大學(xué)

<120> 一種提高芽胞桿菌外源蛋白分泌水平的方法

<130> 2016

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1008

<212> DNA

<213> 地衣芽胞桿菌中信號(hào)肽肽酶基因sppA

<400> 1

atgaatgcga aaagatggat cgcacttgtc atcgcgctgg gcgtttttgc gttatctgcg 60

gtgatgagcc ttttgcttgc agtatttgac acgatgggga atgacggaaa gatgcagttt 120

ggcctcaatg acacccagga agaaacggtg cttgaacaag gaaacagctc aagaaaaatc 180

gccgttcttg aagtgaacgg aacgatttcc gacaatggcg gcgcttcagg cctgttcagc 240

tctgaaggct acaaccacag atcgtttttg caaatgcttg aaaaagcaaa agacgattct 300

gccgtaaagg gcattgttct gcgcgtcaat tctccgggtg gcggagtata cgagagcgct 360

gagatacata agaagcttga agagatcaaa aaagatacga aaaaaccgat ttacgtatca 420

atgggatcga tggctgcgtc cggcggctat tacatttcaa cgcctgccga caaaatcttt 480

gcagcgcctg acacgctgac gggttcactc ggggtcatca tggaaagcct taactacagc 540

aagcttgcag agaagcttgg attaaaaacg gagacgatta aaagcggtga gtttaaagat 600

atcatgtcac cgacgcgcga tatgacgaaa aaagaaagag aaatcatgca gtcaatggtc 660

gatgacgcgt acgaagggtt tgtagatgtt attgccgaag ggcgcggcat gtccgaaaat 720

gacgtgaaaa aaattgccga cggacgtgtc tatgacggcc gccaggcgaa acagaaccat 780

ctcattgatg agctcggcta ttatgaagat gcggtcaaag cgatgaaaaa ggaccacaaa 840

aaccttgccg gcgcatctgt tgtcagctat gaagaatcag ccggccttgc ctcgctgttt 900

tcaatgactg caaataagat gtttaaaagc gaagctgatt tcttaaacat taaagaagcg 960

atttctcaat ccggtgcacc gagactcatg tatttatatg ccaaatag 1008