本發(fā)明涉及基因檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前胎兒α型地貧基因突變檢測(cè)文庫(kù)構(gòu)建方法、檢測(cè)方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
：地中海貧血(簡(jiǎn)稱地貧)是全世界的高發(fā)病率遺傳病之一，是由于人體基因突變或者缺失而導(dǎo)致α，β-珠蛋白肽鏈合成速率的不平衡，從而引起的溶血性貧血。地貧常見(jiàn)的兩種類型是α-地貧和β-地貧，α-地貧相關(guān)基因?yàn)镠BA2和HBA1，β-地貧相關(guān)基因?yàn)镠BB。地貧集中在熱帶和亞熱帶地區(qū)，多發(fā)生于地中海沿岸國(guó)家，其次為中東、印度、巴基斯坦、東南亞、中國(guó)南方和北非，美國(guó)是移民國(guó)家，其發(fā)生率也較高。我國(guó)長(zhǎng)江以南各省是地貧高發(fā)區(qū)，廣東、廣西、海南、臺(tái)灣和香港等地受累人口超過(guò)2億。中國(guó)人群中，α-地貧的基因型別常見(jiàn)的有-αSEA、-α3.7、-α4.2、αCS、αQS和αWS，β-地貧常見(jiàn)的有26種基因突變型別。目前地貧尚無(wú)根治的方法，只能依靠傳統(tǒng)方法治療，即以輸血治療為主，價(jià)格昂貴，因此產(chǎn)前篩查和診斷對(duì)預(yù)防該種出生缺陷疾病具有重大意義。1997年，盧煜明發(fā)現(xiàn)孕婦外周血漿中存在來(lái)自于胎兒的游離DNA，這一發(fā)現(xiàn)為通過(guò)孕婦外周血無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷和檢測(cè)胚胎基因型提供了新的可能，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用，無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)胚胎染色體異常(如21、18、13染色體非整倍體變異)以及部分大的拷貝數(shù)變異已經(jīng)成功應(yīng)用于臨床產(chǎn)前篩查和診斷，但是孕婦體內(nèi)胎兒游離DNA僅占孕婦血漿中總游離DNA的3％-6％，對(duì)于胎兒無(wú)創(chuàng)式的遺傳性疾病的檢測(cè)帶來(lái)挑戰(zhàn)。不斷有研究人員嘗試通過(guò)孕婦外周血游離DNA對(duì)胎兒地貧基因做出檢測(cè)，由于孕婦外周血中存在大量母源游離DNA，所以如何有效區(qū)分胚胎基因的突變，對(duì)檢測(cè)方法的靈敏度提出了很高的要求。目前臨床報(bào)道產(chǎn)前檢測(cè)地貧基因突變的方法有幾種：傳統(tǒng)的羊膜穿刺、腹絨毛活檢等，由于是有創(chuàng)傷性的操作，可能伴有胎兒損傷、流產(chǎn)或?qū)m內(nèi)感染等風(fēng)險(xiǎn)。利用母體血漿中游離胎兒DNA的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷也有些研究。ChiuRW通過(guò)使用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)父源codons41/424bp缺失的有效檢測(cè)，還有科研工作者發(fā)展了針對(duì)其他β地貧點(diǎn)突變的檢測(cè)方法，但由于檢測(cè)突變多為點(diǎn)突變，方法的特異性有待提高。對(duì)于α地貧突變的研究也有報(bào)道，WaruneeTungwiwat等人，建立了基于熒光定量PCR檢測(cè)α0缺失的方法，然而該方法的靈敏度有待提高。此外，多種高靈敏度的技術(shù)方法也被嘗試用于無(wú)創(chuàng)地貧檢測(cè)，如質(zhì)譜、數(shù)字PCR、COLD-PCR等。但這些基于單一位點(diǎn)的PCR技術(shù)的檢測(cè)方法存在一定的局限性，如血漿DNA低含量及高度片段化的特點(diǎn)，很可能會(huì)帶來(lái)PCR的假陰性。這種方法只能夠檢測(cè)與母親不同的特異性父源突變是否存在，而無(wú)法進(jìn)一步確定母源突變的存在與否?；诟咄繙y(cè)序技術(shù)的孕婦血漿游離DNA的全基因組測(cè)序或者目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序可以更加準(zhǔn)確的實(shí)現(xiàn)對(duì)胎兒地貧基因的檢測(cè)，但全基因組測(cè)序的成本以及分析方法的復(fù)雜性和需要父母單體型等限制了在臨床上的應(yīng)用；目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序由于其目標(biāo)區(qū)域捕獲效率低，僅能實(shí)現(xiàn)對(duì)胎兒αSEA缺失純雜合型的區(qū)分，并且還存在分型錯(cuò)誤的可能。鑒于此，需要提供一種高精確度的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前胎兒地貧基因突變檢測(cè)方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前胎兒α型地貧基因突變檢測(cè)文庫(kù)構(gòu)建方法、檢測(cè)方法和試劑盒，能夠準(zhǔn)確、高效地檢測(cè)α型地貧基因突變，其結(jié)果與羊水穿刺檢測(cè)分型一致，但安全性、無(wú)創(chuàng)性和高效性方面明顯優(yōu)于羊水穿刺檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一種無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前胎兒α型地貧基因突變檢測(cè)文庫(kù)構(gòu)建方法，上述文庫(kù)用于通過(guò)高通量測(cè)序進(jìn)行無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前胎兒α型地貧基因突變的檢測(cè)，上述方法包括：(a)對(duì)母體外周血游離DNA連接帶有特異標(biāo)簽序列和任選的樣本標(biāo)簽序列的接頭序列；(b)使用預(yù)文庫(kù)擴(kuò)增引物序列對(duì)上一步的連接產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)文庫(kù)擴(kuò)增，其中上述預(yù)文庫(kù)擴(kuò)增引物序列與上述接頭序列互補(bǔ)結(jié)合；(c)將上一步得到的預(yù)文庫(kù)分為上游預(yù)文庫(kù)和下游預(yù)文庫(kù)，分別使用上游特異性引物組1和下游特異性引物組1對(duì)上述上游預(yù)文庫(kù)和下游預(yù)文庫(kù)進(jìn)行特異性擴(kuò)增，分別得到上游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物1和下游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物1，其中，上述上游特異性引物組1包括用于擴(kuò)增α型地貧基因的上游引物組1以及用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的上游引物組1；上述下游特異性引物組1包括用于擴(kuò)增α型地貧基因的下游引物組1以及用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的下游引物組1；(d)對(duì)上述上游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物1和下游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物1，分別使用上游特異性引物組2和下游特異性引物組2進(jìn)行特異性擴(kuò)增，分別得到上游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物2和下游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物2，其中，上述上游特異性引物組2包括用于擴(kuò)增α型地貧基因的上游引物組2以及用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的上游引物組2；上述下游特異性引物組2包括用于擴(kuò)增α型地貧基因的下游引物組2以及用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的下游引物組2；并且，上述上游特異性引物組2相比上述上游特異性引物組1更靠近對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增目標(biāo)位點(diǎn)，上述下游特異性引物組2相比上述下游特異性引物組1更靠近對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增目標(biāo)位點(diǎn)；上述上游特異性引物組2和上述下游特異性引物組2的5’端含有用于高通量測(cè)序文庫(kù)的接頭序列；(e)將上述上游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物2和下游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物2混合后，使用兩端的通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到可上機(jī)測(cè)序的文庫(kù)。進(jìn)一步地，上述上游特異性引物組1和下游特異性引物組1的5'端帶有用于分離擴(kuò)增產(chǎn)物的修飾，優(yōu)選帶有生物素修飾。進(jìn)一步地，上述上游特異性引物組1中針對(duì)特定目標(biāo)位點(diǎn)的引物的3’端，與上述上游特異性引物組2中針對(duì)該目標(biāo)位點(diǎn)的引物的5’端有10-15個(gè)堿基的重合；上述下游特異性引物組1中針對(duì)特定目標(biāo)位點(diǎn)的引物的3’端，與上述下游特異性引物組2中針對(duì)該目標(biāo)位點(diǎn)的引物的5’端有10-15個(gè)堿基的重合。進(jìn)一步地，上述用于擴(kuò)增α型地貧基因的上游引物組1序列如SEQIDNO：1-7所示；上述用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的上游引物組1序列如SEQIDNO：8-17所示；上述用于擴(kuò)增α型地貧基因的下游引物組1序列如SEQIDNO：18-23所示；上述用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的下游引物組1序列如SEQIDNO：24-33所示；上述用于擴(kuò)增α型地貧基因的上游引物組2序列如SEQIDNO：34-40所示；上述用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的上游引物組2序列如SEQIDNO：41-50所示；上述用于擴(kuò)增α型地貧基因的下游引物組2序列如SEQIDNO：51-56所示；上述用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的下游引物組2序列如SEQIDNO：57-66所示。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供一種無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前胎兒α型地貧基因突變檢測(cè)方法，包括對(duì)第一方面的方法構(gòu)建的文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序得到測(cè)序讀長(zhǎng)(reads)；然后，根據(jù)位點(diǎn)的唯一的特異標(biāo)簽序列的總深度和突變等位基因(allele)的深度，計(jì)算胎源DNA含量并對(duì)地貧相關(guān)的突變進(jìn)行分型以分析α型地貧基因突變情況。根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供一種無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前胎兒α型地貧基因突變檢測(cè)文庫(kù)構(gòu)建試劑盒，上述文庫(kù)用于通過(guò)高通量測(cè)序進(jìn)行無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前胎兒α型地貧基因突變的檢測(cè)，上述試劑盒包括：(a)上游特異性引物組1和下游特異性引物組1，分別用于對(duì)上游預(yù)文庫(kù)和下游預(yù)文庫(kù)進(jìn)行特異性擴(kuò)增，以分別得到上游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物1和下游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物1，其中，上述上游特異性引物組1包括用于擴(kuò)增α型地貧基因的上游引物組1以及用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的上游引物組1；上述下游特異性引物組1包括用于擴(kuò)增α型地貧基因的下游引物組1以及用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的下游引物組1；(b)上游特異性引物組2和下游特異性引物組2，分別用于對(duì)上述上游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物1和下游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物1進(jìn)行特異性擴(kuò)增，以分別得到上游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物2和下游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物2，其中，上述上游特異性引物組2包括用于擴(kuò)增α型地貧基因的上游引物組2以及用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的上游引物組2；上述下游特異性引物組2包括用于擴(kuò)增α型地貧基因的下游引物組2以及用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的下游引物組2；并且，上述上游特異性引物組2相比上述上游特異性引物組1更靠近對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增目標(biāo)位點(diǎn)，上述下游特異性引物組2相比上述下游特異性引物組1更靠近對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增目標(biāo)位點(diǎn)；上述上游特異性引物組2和上述下游特異性引物組2的5’端含有用于高通量測(cè)序文庫(kù)的接頭序列。進(jìn)一步地，上述上游特異性引物組1和下游特異性引物組1的5'端帶有用于分離擴(kuò)增產(chǎn)物的修飾，優(yōu)選帶有生物素修飾。進(jìn)一步地，上述上游特異性引物組1中針對(duì)特定目標(biāo)位點(diǎn)的引物的3’端，與上述上游特異性引物組2中針對(duì)該目標(biāo)位點(diǎn)的引物的5’端有10-15個(gè)堿基的重合；上述下游特異性引物組1中針對(duì)特定目標(biāo)位點(diǎn)的引物的3’端，與上述下游特異性引物組2中針對(duì)該目標(biāo)位點(diǎn)的引物的5’端有10-15個(gè)堿基的重合。進(jìn)一步地，上述用于擴(kuò)增α型地貧基因的上游引物組1序列如SEQIDNO：1-7所示；上述用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的上游引物組1序列如SEQIDNO：8-17所示；上述用于擴(kuò)增α型地貧基因的下游引物組1序列如SEQIDNO：18-23所示；上述用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的下游引物組1序列如SEQIDNO：24-33所示；上述用于擴(kuò)增α型地貧基因的上游引物組2序列如SEQIDNO：34-40所示；上述用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的上游引物組2序列如SEQIDNO：41-50所示；上述用于擴(kuò)增α型地貧基因的下游引物組2序列如SEQIDNO：51-56所示；上述用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的下游引物組2序列如SEQIDNO：57-66所示。進(jìn)一步地，上述試劑盒還包括：(c)接頭序列，其帶有特異標(biāo)簽序列和任選的樣本標(biāo)簽序列，用于連接母體外周血游離DNA，以得到連接產(chǎn)物；(d)預(yù)文庫(kù)擴(kuò)增引物序列，其與上述接頭序列互補(bǔ)結(jié)合，用于對(duì)上述連接產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)文庫(kù)擴(kuò)增；(e)通用引物，用于在上述上游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物2和下游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物2混合后，對(duì)混合產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，以得到可上機(jī)測(cè)序的文庫(kù)；優(yōu)選地，上述接頭序列如SEQIDNO：67-68所示；上述預(yù)文庫(kù)擴(kuò)增引物序列如SEQIDNO：69-70所示；上述通用引物如SEQIDNO：71-72所示。本發(fā)明的方法和試劑盒，能夠通過(guò)以母體游離血漿DNA為原始材料，構(gòu)建α型地貧基因突變檢測(cè)的文庫(kù)，并通過(guò)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序而實(shí)現(xiàn)α型地貧基因突變檢測(cè)(包括-αSEA、-α3.7、-α4.2、αCS、αQS、αWS突變檢測(cè))。關(guān)鍵在于，在文庫(kù)構(gòu)建中，對(duì)母體外周血游離DNA片段連接特異性的接頭，然后創(chuàng)造性地將接頭連接產(chǎn)物預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物分成兩部分，分別獨(dú)立地使用針對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)(如α型地貧基因)的上、下游引物進(jìn)行兩輪特異性擴(kuò)增，能夠高特異性地富集目標(biāo)位點(diǎn)，顯著提高引物擴(kuò)增特異性。并且在擴(kuò)增過(guò)程中，分別使用用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的上游引物組和下游引物組進(jìn)行擴(kuò)增，具體地，針對(duì)SNP位點(diǎn)也使用不同的引物進(jìn)行兩輪特異性擴(kuò)增，能夠高效、準(zhǔn)確的計(jì)算胎源DNA含量。從而，在高通量測(cè)序之后，能夠依據(jù)測(cè)序讀長(zhǎng)計(jì)算胎源DNA含量并對(duì)地貧相關(guān)的突變進(jìn)行分型，有效區(qū)分胚胎基因的突變。進(jìn)一步地，發(fā)明人特別針對(duì)地貧基因設(shè)計(jì)了高效的引物，以及計(jì)算胎兒DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的引物。使用本發(fā)明的文庫(kù)構(gòu)建方法，優(yōu)選地在使用本發(fā)明提供的引物序列組的情況下，能夠準(zhǔn)確、高效地檢測(cè)α型地貧基因突變(包括-αSEA、-α3.7、-α4.2、αCS、αQS、αWS突變檢測(cè))，其結(jié)果與羊水穿刺檢測(cè)分型一致，但安全性、無(wú)創(chuàng)性和高效性方面明顯優(yōu)于羊水穿刺檢測(cè)。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明實(shí)施例的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前胎兒α型地貧基因突變檢測(cè)文庫(kù)構(gòu)建方法和突變檢測(cè)方法的流程示意圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例的上下游特異性引物、通用引物與模板結(jié)合的相對(duì)位置關(guān)系示意圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前胎兒α型地貧基因突變檢測(cè)的預(yù)文庫(kù)(a)和終文庫(kù)(b)的2％凝膠電泳檢測(cè)圖譜，M表示Marker，A1-A6表示6個(gè)示例性的樣本。具體實(shí)施方式下面通過(guò)具體實(shí)施方式結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前胎兒α型地貧基因突變檢測(cè)文庫(kù)構(gòu)建方法包括步驟：S1：對(duì)母體外周血游離DNA連接帶有特異標(biāo)簽序列和任選的樣本標(biāo)簽序列的接頭序列。母體外周血游離DNA，即孕婦的外周血游離DNA，其中包括母源血游離DNA和胎源游離DNA。接頭序列帶有特異標(biāo)簽序，該特異標(biāo)簽序可以是一段n個(gè)(例如8或10個(gè))堿基長(zhǎng)度的隨機(jī)序列，使得每一接頭序列均不同于其它接頭序列，也就是說(shuō)，接頭序列用于區(qū)分其連接的母體外周血游離DNA，使得每一母體外周血游離DNA片段都帶有特異性的接頭序列，便于后續(xù)測(cè)序之后的序列信息分析中能夠區(qū)分不同母體外周血游離DNA片段。由于在高通量測(cè)序中，每次都能產(chǎn)生海量的測(cè)序數(shù)據(jù)，因此往往將不同來(lái)源(例如來(lái)源于不同母體的外周血游離DNA)的樣本混庫(kù)(pooling)進(jìn)行測(cè)序，因此接頭序列還可以帶有一段樣本標(biāo)簽序列(index)，其用于區(qū)分不同來(lái)源的樣本。S2：使用預(yù)文庫(kù)擴(kuò)增引物序列對(duì)上一步的連接產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)文庫(kù)擴(kuò)增，其中預(yù)文庫(kù)擴(kuò)增引物序列與接頭序列互補(bǔ)結(jié)合。進(jìn)行預(yù)文庫(kù)擴(kuò)增(或稱“預(yù)擴(kuò)增”)是為了增加接頭連接產(chǎn)物的量，因?yàn)榻宇^連接產(chǎn)物中有些分子的拷貝數(shù)可能偏低，在后續(xù)分成上、下游兩部分進(jìn)行特異性擴(kuò)增時(shí)，這些拷貝數(shù)偏低的分子可能不能得到有效擴(kuò)增，而預(yù)擴(kuò)增增加接頭連接產(chǎn)物的量，使得各種拷貝數(shù)的分子都能得到有效擴(kuò)增。S3：將上一步得到的預(yù)文庫(kù)分為上游預(yù)文庫(kù)和下游預(yù)文庫(kù)，分別使用上游特異性引物組1和下游特異性引物組1對(duì)上游預(yù)文庫(kù)和下游預(yù)文庫(kù)進(jìn)行特異性擴(kuò)增，分別得到上游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物1和下游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物1。本發(fā)明將預(yù)文庫(kù)分為上游預(yù)文庫(kù)和下游預(yù)文庫(kù)分別進(jìn)行兩輪特異性擴(kuò)增，能夠顯著提高引物擴(kuò)增特異性。上、下游分開(kāi)獨(dú)立擴(kuò)增的有益效果包括：一方面，由于二代高通量測(cè)序讀長(zhǎng)(reads)短的原因，上游特異性引物與下游特異性引物需要比較靠近擴(kuò)增目標(biāo)位點(diǎn)(或目標(biāo)區(qū)域)，不分開(kāi)難以有效擴(kuò)增到目標(biāo)片段，而上、下游分開(kāi)獨(dú)立擴(kuò)增能夠有效擴(kuò)增到目標(biāo)片段；另一方面，上、下游分開(kāi)獨(dú)立擴(kuò)增能夠在序列的一端保留接頭序列，便于后續(xù)高通量測(cè)序的進(jìn)行。本發(fā)明實(shí)施例中，擴(kuò)增目標(biāo)位點(diǎn)(或目標(biāo)區(qū)域)包括α型地貧基因和用于計(jì)算胎兒DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)兩種，相應(yīng)的，上游特異性引物組1和下游特異性引物組1也均分別包括兩種引物，即上游特異性引物組1包括：用于擴(kuò)增α型地貧基因的上游引物組1以及用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的上游引物組1；下游特異性引物組1包括：用于擴(kuò)增α型地貧基因的下游引物組1以及用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的下游引物組1。如圖2示出了本發(fā)明實(shí)施例中用于擴(kuò)增α型地貧基因的上游引物組1(USP1)和用于擴(kuò)增α型地貧基因的下游引物組1(DSP1)與模板結(jié)合的相對(duì)位置關(guān)系?？梢钥闯?，USP1和DSP1分別位于擴(kuò)增目標(biāo)位點(diǎn)——或稱檢測(cè)點(diǎn)(即α型地貧基因突變)的左右兩側(cè)，一般而言USP1和DSP1的3’端距離檢測(cè)點(diǎn)較近，例如幾個(gè)堿基、十幾個(gè)堿基的距離，其中一個(gè)原因是，二代高通量測(cè)序的讀長(zhǎng)序列(reads)較短，例如100bp左右，如果USP1和DSP1的3’端距離檢測(cè)點(diǎn)較遠(yuǎn)的話，可能二代高通量測(cè)序不能有效地測(cè)到檢測(cè)點(diǎn)。用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的上、下游特異性引物與模板結(jié)合的相對(duì)位置關(guān)系與圖2的示意圖相同。為了能夠分離上游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物1和下游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物1，上游特異性引物組1和下游特異性引物組1的5'端可以帶有用于分離擴(kuò)增產(chǎn)物的修飾，優(yōu)選帶有生物素修飾，生物素能夠與親和素結(jié)合，因此上游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物1和下游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物1可以通過(guò)生物素-親和素親和結(jié)合從反應(yīng)體系中分離出來(lái)。S4：對(duì)上游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物1和下游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物1，分別使用上游特異性引物組2和下游特異性引物組2進(jìn)行特異性擴(kuò)增，分別得到上游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物2和下游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物2。只有一輪特異性引物擴(kuò)增的情況下，可能會(huì)有非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的存在。因此，需要進(jìn)行第二輪特異性引物擴(kuò)增，該第二輪的特異性引物擴(kuò)增使用的特異性引物也包括上游特異性引物和下游特異性引物。在本發(fā)明實(shí)施例中，類似于第一輪特異性引物擴(kuò)增，第二輪特異性引物擴(kuò)增使用的上游特異性引物組2包括：用于擴(kuò)增α型地貧基因的上游引物組2以及用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的上游引物組2；下游特異性引物組2包括：用于擴(kuò)增α型地貧基因的下游引物組2以及用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的下游引物組2。如圖2示出了本發(fā)明實(shí)施例中用于擴(kuò)增α型地貧基因的上游引物組2(USP2)和用于擴(kuò)增α型地貧基因的下游引物組2(DSP2)與模板結(jié)合的相對(duì)位置關(guān)系?？梢钥闯觯琔SP2相比USP1更靠近α型地貧基因突變位點(diǎn)，DSP2相比DSP1更靠近α型地貧基因突變位點(diǎn)。用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的上、下游引物組2與模板結(jié)合的相對(duì)位置關(guān)系與圖2的示意圖相同。總之，上游特異性引物組2相比上游特異性引物組1更靠近對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增目標(biāo)位點(diǎn)，下游特異性引物組2相比下游特異性引物組1更靠近對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增目標(biāo)位點(diǎn)。在具體實(shí)施例中，上游特異性引物組1中針對(duì)特定目標(biāo)位點(diǎn)的引物(例如針對(duì)α型地貧基因的USP1)的3’端，與上游特異性引物組2中針對(duì)該目標(biāo)位點(diǎn)的引物(例如針對(duì)α型地貧基因的USP2)的5’端有10-15個(gè)堿基的重合；類似地，下游特異性引物組1中針對(duì)特定目標(biāo)位點(diǎn)的引物(例如針對(duì)α型地貧基因的DSP1)的3’端，與下游特異性引物組2中針對(duì)該目標(biāo)位點(diǎn)的引物(例如針對(duì)α型地貧基因的DSP2)的5’端有10-15個(gè)堿基的重合。此處“3’端”和“5’端”，分別是指靠近3’末端和5’末端的一段序列。這種重合，主要是考慮USP1和DSP1原本距離檢測(cè)點(diǎn)(例如α型地貧基因突變位點(diǎn))較近，堿基的重合能夠在進(jìn)一步提高擴(kuò)增特異性的同時(shí)，充分有效利用結(jié)合空間。為了便于高通量測(cè)序的進(jìn)行，上游特異性引物組2和下游特異性引物組2的5’端可以含有用于高通量測(cè)序文庫(kù)的接頭序列。具體的，使用何種高通量測(cè)序平臺(tái)，則采用該平臺(tái)對(duì)應(yīng)的接頭序列。S5：將上游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物2和下游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物2混合后，使用兩端的通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到可上機(jī)測(cè)序的文庫(kù)。如圖2所示，通用引物(UNP)能夠結(jié)合接頭序列，通過(guò)通用引物擴(kuò)增即可得到上機(jī)測(cè)序的文庫(kù)。上機(jī)測(cè)序通過(guò)高通量測(cè)序?qū)崿F(xiàn)。高通量測(cè)序技術(shù)可以選自Illumina/GenomeAnalyzer/Hiseq/Miseq/NEXTseqCN500、AppliedBiosystemsSOLID和lifeTechnologies/IonTorrent。具體的，使用何種高通量測(cè)序技術(shù)，則通用引物也采用該高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)應(yīng)的引物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，用于擴(kuò)增α型地貧基因的上游引物組1序列如SEQIDNO：1-7所示；用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的上游引物組1序列如SEQIDNO：8-17所示；用于擴(kuò)增α型地貧基因的下游引物組1序列如SEQIDNO：18-23所示；用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的下游引物組1序列如SEQIDNO：24-33所示；用于擴(kuò)增α型地貧基因的上游引物組2序列如SEQIDNO：34-40所示；用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的上游引物組2序列如SEQIDNO：41-50所示；用于擴(kuò)增α型地貧基因的下游引物組2序列如SEQIDNO：51-56所示；用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的下游引物組2序列如SEQIDNO：57-66所示。本發(fā)明實(shí)施例還提供一種無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前胎兒α型地貧基因突變檢測(cè)方法，包括對(duì)本發(fā)明實(shí)施例構(gòu)建的文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序得到測(cè)序讀長(zhǎng)(reads)；然后，根據(jù)位點(diǎn)的唯一的特異標(biāo)簽序列的總深度和突變等位基因(allele)的深度，計(jì)算胎源DNA含量并對(duì)地貧相關(guān)的突變進(jìn)行分型以分析α型地貧基因突變情況。本發(fā)明實(shí)施例還提供一種無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前胎兒α型地貧基因突變檢測(cè)文庫(kù)構(gòu)建試劑盒，上述文庫(kù)用于通過(guò)高通量測(cè)序進(jìn)行無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前胎兒α型地貧基因突變的檢測(cè)，上述試劑盒包括：(R1)上游特異性引物組1和下游特異性引物組1，分別用于對(duì)上游預(yù)文庫(kù)和下游預(yù)文庫(kù)進(jìn)行特異性擴(kuò)增，以分別得到上游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物1和下游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物1，其中，上游特異性引物組1包括用于擴(kuò)增α型地貧基因的上游引物組1以及用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的上游引物組1；下游特異性引物組1包括用于擴(kuò)增α型地貧基因的下游引物組1以及用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的下游引物組1；(R2)上游特異性引物組2和下游特異性引物組2，分別用于對(duì)上游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物1和下游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物1進(jìn)行特異性擴(kuò)增，以分別得到上游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物2和下游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物2，其中，上游特異性引物組2包括用于擴(kuò)增α型地貧基因的上游引物組2以及用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的上游引物組2；下游特異性引物組2包括用于擴(kuò)增α型地貧基因的下游引物組2以及用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的下游引物組2。其中，上游特異性引物組2相比上游特異性引物組1更靠近對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增目標(biāo)位點(diǎn)，下游特異性引物組2相比下游特異性引物組1更靠近對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增目標(biāo)位點(diǎn)；上游特異性引物組2和下游特異性引物組2的5’端含有用于高通量測(cè)序文庫(kù)的接頭序列。在優(yōu)選的實(shí)施例中，上游特異性引物組1和下游特異性引物組1的5'端帶有用于分離擴(kuò)增產(chǎn)物的修飾，優(yōu)選帶有生物素修飾，以便從體系中分離上游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物1和下游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物1。在優(yōu)選的實(shí)施例中，上游特異性引物組1中針對(duì)特定目標(biāo)位點(diǎn)的引物的3’端，與上游特異性引物組2中針對(duì)該目標(biāo)位點(diǎn)的引物的5’端有10-15個(gè)堿基的重合；下游特異性引物組1中針對(duì)特定目標(biāo)位點(diǎn)的引物的3’端，與下游特異性引物組2中針對(duì)該目標(biāo)位點(diǎn)的引物的5’端有10-15個(gè)堿基的重合。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，用于擴(kuò)增α型地貧基因的上游引物組1序列如SEQIDNO：1-7所示；用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的上游引物組1序列如SEQIDNO：8-17所示；用于擴(kuò)增α型地貧基因的下游引物組1序列如SEQIDNO：18-23所示；用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的下游引物組1序列如SEQIDNO：24-33所示；用于擴(kuò)增α型地貧基因的上游引物組2序列如SEQIDNO：34-40所示；用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的上游引物組2序列如SEQIDNO：41-50所示；用于擴(kuò)增α型地貧基因的下游引物組2序列如SEQIDNO：51-56所示；用于計(jì)算胎兒游離DNA比例的多個(gè)SNP位點(diǎn)的下游引物組2序列如SEQIDNO：57-66所示。在優(yōu)選的實(shí)施例中，試劑盒還包括：(R3)接頭序列，其帶有特異標(biāo)簽序列和任選的樣本標(biāo)簽序列，用于連接母體外周血游離DNA，以得到連接產(chǎn)物；(R4)預(yù)文庫(kù)擴(kuò)增引物序列，其與上述接頭序列互補(bǔ)結(jié)合，用于對(duì)上述連接產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)文庫(kù)擴(kuò)增；(R5)通用引物，用于在上述上游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物2和下游特異性擴(kuò)增產(chǎn)物2混合后，對(duì)混合產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，以得到可上機(jī)測(cè)序的文庫(kù)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，接頭序列如SEQIDNO：67-68所示；預(yù)文庫(kù)擴(kuò)增引物序列如SEQIDNO：69-70所示；通用引物如SEQIDNO：71-72所示。以下通過(guò)實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案和技術(shù)效果，應(yīng)當(dāng)理解，實(shí)施例僅是示例性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。實(shí)施例1、針對(duì)α地中海貧血基因-αSEA、-α3.7、-α4.2、αCS、αQS、αWS突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成引物：上游引物和下游引物分別位于檢測(cè)點(diǎn)左側(cè)和右側(cè)。同側(cè)的特異性引物1的3’端和特異性引物2的5’端有10-15個(gè)堿基的重合。特異性引物1的5'端有生物素修飾。特異性引物2的5’端含有用于高通量測(cè)序文庫(kù)的接頭序列。具體的，引物序列如表1所示。表12、帶有特異標(biāo)簽序列和樣本標(biāo)簽序列(index)的接頭序列：ADT-F：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNATTAAGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQIDNO：67)；ADT-R：pGATCGGAAGAGC(SEQIDNO：68)。其中，NNNNNNNN是特異標(biāo)簽序列，ATTAAGG是樣本標(biāo)簽序列(index)，以上接頭序列需要退火成雙鏈。3、預(yù)文庫(kù)擴(kuò)增引物序列：pre-lib-primer-F:CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQIDNO：69)；pre-lib-primer-R:GCTCTTCCGATCT(SEQIDNO：70)。4、終文庫(kù)擴(kuò)增引物序列(通用引物)：Seq-lib-primer-F:CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQIDNO：71)；Seq-lib-primer-R:ATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC(SEQIDNO：72)。5、本發(fā)明實(shí)施例的檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒，具體建庫(kù)步驟為：1)提取2ml孕婦血漿游離DNA。2)游離DNA末端修復(fù)，配置反應(yīng)體系(反應(yīng)一)如表2所示。表2充分混勻，瞬時(shí)離心，在熱循環(huán)儀上進(jìn)行如下反應(yīng)：37℃，20min；72℃，20min；4℃保存。3)DNA片段連接帶有特異標(biāo)簽序列和樣本標(biāo)簽序列的接頭序列，配置反應(yīng)體系(反應(yīng)二)如表3所示。表3試劑體積(μL)反應(yīng)一50DNA連接酶緩沖液27DNA連接酶(Enzymatics公司)1接頭序列(SEQIDNO：67-68)2總體積80充分混勻，瞬時(shí)離心，在熱循環(huán)儀上進(jìn)行如下反應(yīng)：20℃，15min；65℃，10min；4℃保存。4)反應(yīng)結(jié)束后，立即使用30μLXPbeads純化，26μL超純水或者洗脫液中洗脫。5)PCR預(yù)擴(kuò)增在冰上配置如下反應(yīng)體系，如表4所示。表4充分混勻，瞬時(shí)離心，在熱循環(huán)儀上進(jìn)行如下反應(yīng)：95℃，3min，1循環(huán)；(95℃，15s，62℃，30s，72℃，30s)10循環(huán)；72℃，5min，1循環(huán)；4℃保存。6)反應(yīng)終產(chǎn)物使用50μLXPbeads回收純化，使用Qubit定量，5μL反應(yīng)產(chǎn)物2％凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3a所示，表明預(yù)文庫(kù)構(gòu)建成功。取兩等份預(yù)文庫(kù)，分別命名為上游預(yù)文庫(kù)和下游預(yù)文庫(kù)，每份100ng，進(jìn)行下一步擴(kuò)增。7)特異性擴(kuò)增1每份樣品預(yù)文庫(kù)為上游預(yù)文庫(kù)和下游預(yù)文庫(kù)，分別使用對(duì)應(yīng)的上、下游特異性引物1和特異性引物2，直到使用通用引物擴(kuò)增時(shí)將每份樣品上、下游引物擴(kuò)增產(chǎn)物合并，再使用通用引物擴(kuò)增。在冰上配置如下反應(yīng)體系，如表5所示。表5PCR反應(yīng)程序如下：95℃，10min，1循環(huán)；(95℃，30s，62℃，30s，72℃，1min)20循環(huán)；72℃，7min，1循環(huán)；4℃保存。8)5μL反應(yīng)產(chǎn)物2％瓊脂糖凝膠電泳，剩余產(chǎn)物1.2XXP回收，24μL超純水或者洗脫液洗脫，洗脫液進(jìn)行下一步擴(kuò)增。9)特異性擴(kuò)增2在冰上配置如下反應(yīng)體系，如表6所示。表6PCR反應(yīng)程序如下：95℃，10min，1循環(huán)；(95℃，30s，62℃，30s，72℃，1min)15循環(huán)；72℃，7min，1循環(huán)；4℃保存。10)5μL反應(yīng)產(chǎn)物2％瓊脂糖凝膠電泳，剩余產(chǎn)物1.2XXP回收，每一個(gè)樣品的上下游擴(kuò)增產(chǎn)物可以合并回收，最終26μL超純水或者洗脫液洗脫，洗脫液進(jìn)行通用引物擴(kuò)增。11)通用引物擴(kuò)增在冰上配置如下反應(yīng)體系，如表7所示。表7PCR反應(yīng)程序如下：98℃，45s，1循環(huán)；(98℃，15s，60℃，30s，72℃，30s)10循環(huán)；72℃，1min，1循環(huán)；4℃保存。12)5μL反應(yīng)產(chǎn)物2％凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3b所示，表明終文庫(kù)構(gòu)建成功。剩余產(chǎn)物1.0XXP回收，最后使用30ul洗脫液洗脫，即為最終上機(jī)文庫(kù)。13)文庫(kù)質(zhì)控后，IlluminaNEXTseqCN500進(jìn)行75PE測(cè)序。14)測(cè)序數(shù)據(jù)信息分析過(guò)濾掉低質(zhì)量測(cè)序讀長(zhǎng)(reads)后，對(duì)于每一對(duì)pair-endreads根據(jù)所連接的分子標(biāo)簽序列和擴(kuò)增引物序列歸類，當(dāng)reads起始部分序列與實(shí)驗(yàn)加入的引物序列和分子標(biāo)簽序列不一致時(shí)，reads將被過(guò)濾掉。保留下來(lái)的pair-endreads用BWAMEM人類參考基因組(hg19)比對(duì)，按同起始、同終止位置且分子標(biāo)簽一致的序列聚類到同一組，得到唯一的分子標(biāo)簽組序列，將唯一的分子標(biāo)簽組序列重新比對(duì)到參考基因組(BWAMEM)，用GATK軟件對(duì)Indel周圍的序列重新比對(duì)，用samtools軟件進(jìn)行SNP和小的插入缺失檢測(cè)，用CNVPanelizerRpackage進(jìn)行alpha1(α1)和alpha2(α2)缺失檢測(cè)。根據(jù)位點(diǎn)的唯一的分子標(biāo)簽組序列的總深度和相關(guān)SNP位點(diǎn)等位基因(allele)的深度，計(jì)算胚胎DNA含量，并對(duì)胎兒地貧相關(guān)的點(diǎn)突變、INDEL進(jìn)行基因分型，對(duì)于alpha1和alpha2型缺失，采用混合高斯模型進(jìn)行胎兒基因分型(fetalgenotyping)。根據(jù)上述實(shí)施例，對(duì)8例地中海貧血攜帶者的孕婦進(jìn)行無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前地中海貧血基因檢測(cè)，結(jié)果如下表8所示。表8結(jié)果顯示，本發(fā)明實(shí)施例對(duì)α地中海貧血基因突變無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)和羊水穿刺檢測(cè)分型一致，表明本發(fā)明的方法能夠準(zhǔn)確、高效地檢測(cè)α型地貧基因突變，其結(jié)果與羊水穿刺檢測(cè)分型一致，但安全性、無(wú)創(chuàng)性和高效性方面明顯優(yōu)于羊水穿刺檢測(cè)。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。SEQUENCELISTING<110>人和未來(lái)生物科技（長(zhǎng)沙）有限公司<120>無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前胎兒α型地貧基因突變檢測(cè)文庫(kù)構(gòu)建方法、檢測(cè)方法和試劑盒<130>17I23914<160>72<170>PatentInversion3.3<210>1<211>30<212>DNA<213>引物序列<400>1cacagctacatctacaactactgccacagg30<210>2<211>26<212>DNA<213>引物序列<400>2cagttcattcagctctgcgccattcc26<210>3<211>22<212>DNA<213>引物序列<400>3tggacacccagggcagggcctg22<210>4<211>30<212>DNA<213>引物序列<400>4ctgatgcactcctcaaagcaagatcttctg30<210>5<211>26<212>DNA<213>引物序列<400>5ggctgttttctcctcagtaccatccc26<210>6<211>30<212>DNA<213>引物序列<400>6gtgaccctggccgcccacctccccgccgag30<210>7<211>30<212>DNA<213>引物序列<400>7ggacaagttcctggcttctgtgagcaccgt30<210>8<211>30<212>DNA<213>引物序列<400>8tgtagagcagaaaggtatgggctcaactag30<210>9<211>33<212>DNA<213>引物序列<400>9ctcttttattctatacttctctaatactcacct33<210>10<211>30<212>DNA<213>引物序列<400>10gttctccctgttccggggacatcaccttcc30<210>11<211>30<212>DNA<213>引物序列<400>11gatttttagggcagtgaaactcctctacag30<210>12<211>30<212>DNA<213>引物序列<400>12ttagtcttactttgcttttttaaattagct30<210>13<211>25<212>DNA<213>引物序列<400>13tgttaggatgtacacacattttaat25<210>14<211>30<212>DNA<213>引物序列<400>14agacattactgctttgaagactttgtgtat30<210>15<211>30<212>DNA<213>引物序列<400>15cctatcgccaagtggtgagacaatcgccga30<210>16<211>30<212>DNA<213>引物序列<400>16tttagtcatgaagttttctgagtgccagtg30<210>17<211>30<212>DNA<213>引物序列<400>17gtaataataacaacactaatggcggtaaac30<210>18<211>28<212>DNA<213>引物序列<400>18gcaggggagacacttcactgagaatagg28<210>19<211>28<212>DNA<213>引物序列<400>19gattttttggggggatcatgatggaaac28<210>20<211>25<212>DNA<213>引物序列<400>20ctgggggtctggcagaagatcttgc25<210>21<211>28<212>DNA<213>引物序列<400>21gtgatgttttttggggggatggtactga28<210>22<211>30<212>DNA<213>引物序列<400>22tttggaggtcagcacggtgctcacagaagc30<210>23<211>30<212>DNA<213>引物序列<400>23aggcccagcgggcaggaggaacggctaccg30<210>24<211>30<212>DNA<213>引物序列<400>24tataatcccacaccactctttgtttgctct30<210>25<211>33<212>DNA<213>引物序列<400>25accctataatgctctgtgaaacacctatttgtt33<210>26<211>30<212>DNA<213>引物序列<400>26aagatggccagggaagtgtgagtgacccta30<210>27<211>30<212>DNA<213>引物序列<400>27cagcgttatatgttctacaggtttagacaa30<210>28<211>25<212>DNA<213>引物序列<400>28tgggaaggctgcatggtgaatataa25<210>29<211>30<212>DNA<213>引物序列<400>29ttcaagcattcactgaaggtcttggaacgt30<210>30<211>25<212>DNA<213>引物序列<400>30tagaaccttttggactagttatgcc25<210>31<211>30<212>DNA<213>引物序列<400>31caagtgaaaggggtccgatggtactcactg30<210>32<211>30<212>DNA<213>引物序列<400>32aatcttcagtggggatgtagcacattttgc30<210>33<211>30<212>DNA<213>引物序列<400>33atcatgttggcaacatgcttggagatcccc30<210>34<211>49<212>DNA<213>引物序列<400>34agatgtgtataagagacagcaactactgccacaggctctctttttggac49<210>35<211>45<212>DNA<213>引物序列<400>35agatgtgtataagagacagctctgcgccattccacagtctcactg45<210>36<211>44<212>DNA<213>引物序列<400>36agatgtgtataagagacagggcctgagtaagggcctggggagac44<210>37<211>44<212>DNA<213>引物序列<400>37agatgtgtataagagacaggcaagatcttctgccagacccccag44<210>38<211>47<212>DNA<213>引物序列<400>38agatgtgtataagagacagtcagtaccatccccccaaaaaacatcac47<210>39<211>49<212>DNA<213>引物序列<400>39agatgtgtataagagacagcacctccccgccgagttcacccctgcggtg49<210>40<211>49<212>DNA<213>引物序列<400>40agatgtgtataagagacagttctgtgagcaccgtgctgacctccaaata49<210>41<211>49<212>DNA<213>引物序列<400>41agatgtgtataagagacagtatgggctcaactagctatgttacaacttc49<210>42<211>52<212>DNA<213>引物序列<400>42agatgtgtataagagacagcttctctaatactcacctgttctaatgagattt52<210>43<211>44<212>DNA<213>引物序列<400>43agatgtgtataagagacaggggacatcaccttccagtctccaag44<210>44<211>49<212>DNA<213>引物序列<400>44agatgtgtataagagacaggaaactcctctacagcatactgtaatgatg49<210>45<211>49<212>DNA<213>引物序列<400>45agatgtgtataagagacaggcttttttaaattagctcttcatgcagcac49<210>46<211>44<212>DNA<213>引物序列<400>46agatgtgtataagagacagcacacattttaatattttggtacca44<210>47<211>49<212>DNA<213>引物序列<400>47agatgtgtataagagacaggaagactttgtgtatactaaatgtgggtaa49<210>48<211>49<212>DNA<213>引物序列<400>48agatgtgtataagagacaggtgagacaatcgccgagcagtgagaccatc49<210>49<211>49<212>DNA<213>引物序列<400>49agatgtgtataagagacagttctgagtgccagtggaactgtcctggttc49<210>50<211>49<212>DNA<213>引物序列<400>50agatgtgtataagagacagctaatggcggtaaacaccatcatcatcttg49<210>51<211>50<212>DNA<213>引物序列<400>51agatgtgtataagagacagcactgagaataggaagttgtacacaggtatc50<210>52<211>47<212>DNA<213>引物序列<400>52agatgtgtataagagacaggattttttggggggatcatgatggaaac47<210>53<211>49<212>DNA<213>引物序列<400>53agatgtgtataagagacagcagaagatcttgctttgaggagtgcatcag49<210>54<211>45<212>DNA<213>引物序列<400>54agatgtgtataagagacaggggatggtactgaggagaaaacagcc45<210>55<211>49<212>DNA<213>引物序列<400>55agatgtgtataagagacagcacggtgctcacagaagccaggaacttgtc49<210>56<211>49<212>DNA<213>引物序列<400>56agatgtgtataagagacagcaggaggaacggctaccgaggctccagctt49<210>57<211>49<212>DNA<213>引物序列<400>57agatgtgtataagagacagccactctttgtttgctctattttggttctc49<210>58<211>52<212>DNA<213>引物序列<400>58agatgtgtataagagacagtctgtgaaacacctatttgttagataaattgat52<210>59<211>49<212>DNA<213>引物序列<400>59agatgtgtataagagacaggaagtgtgagtgaccctaggggttgtgccc49<210>60<211>49<212>DNA<213>引物序列<400>60agatgtgtataagagacagttctacaggtttagacaagtgtatcctaac49<210>61<211>49<212>DNA<213>引物序列<400>61agatgtgtataagagacaggctgcatggtgaatataagaactgaattct49<210>62<211>49<212>DNA<213>引物序列<400>62agatgtgtataagagacagctgaaggtcttggaacgtatcccctgtgga49<210>63<211>49<212>DNA<213>引物序列<400>63agatgtgtataagagacagttttggactagttatgccactcctgaggag49<210>64<211>49<212>DNA<213>引物序列<400>64agatgtgtataagagacaggtccgatggtactcactgctcagcaatagg49<210>65<211>49<212>DNA<213>引物序列<400>65agatgtgtataagagacagggatgtagcacattttgctatttgagatgg49<210>66<211>49<212>DNA<213>引物序列<400>66agatgtgtataagagacagacatgcttggagatccccagatcaaaggtg49<210>67<211>73<212>DNA<213>引物序列<220><221>misc_feature<222>(25)..(32)<223>nisa,c,g,ort<400>67caagcagaagacggcatacgagatnnnnnnnnattaagggtgactggagttcagacgtgt60gctcttccgatct73<210>68<211>12<212>DNA<213>引物序列<400>68gatcggaagagc12<210>69<211>21<212>DNA<213>引物序列<400>69caagcagaagacggcatacga21<210>70<211>13<212>DNA<213>引物序列<400>70gctcttccgatct13<210>71<211>21<212>DNA<213>引物序列<400>71caagcagaagacggcatacga21<210>72<211>43<212>DNA<213>引物序列<400>72aatgatacggcgaccaccgagatctacactcgtcggcagcgtc43當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3