本發(fā)明屬于分子生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種長鏈非編碼RNA lnc-DIF的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

非編碼RNA(Non-coding RNA)是指不編碼蛋白質(zhì)的RNA。其中包括microRNA(miRNA)和長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,簡稱lncRNA)等。這些RNA的共同特點是都能從基因組上轉(zhuǎn)錄，但是不編碼蛋白，在RNA水平上行使各自的生物學(xué)功能。其中l(wèi)ncRNA是一種長大于200nt的真核內(nèi)源型RNA，廣泛分布于真核生物體內(nèi)，在細(xì)胞分化、器官發(fā)育和疾病發(fā)生等多種生理和病理過程中起重要的調(diào)控作用。而成骨細(xì)胞是骨形成的主要功能細(xì)胞。隨著人年齡的增長，骨的發(fā)育也發(fā)生著動態(tài)的變化，其中由成骨細(xì)胞引導(dǎo)的骨形成和由破骨細(xì)胞引導(dǎo)的骨吸收構(gòu)成了骨重建的動態(tài)平衡。當(dāng)成骨細(xì)胞分化異常時，會導(dǎo)致相應(yīng)骨代謝疾病的發(fā)生，如骨質(zhì)增生、骨質(zhì)疏松、股骨頭壞死、關(guān)節(jié)退行性變、脊柱側(cè)彎等。

1ncRNA可在細(xì)胞分化，個體發(fā)育和疾病中發(fā)揮重要作用，如lnc-DC可以調(diào)控神經(jīng)樹突狀細(xì)胞分化，lncRNA-DIGIT可以調(diào)控胚胎內(nèi)胚層形成，lncRNA-CLMAT1可以誘導(dǎo)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移等；這些研究主要集中于神經(jīng)、發(fā)育、腫瘤等領(lǐng)域，有關(guān)lncRNA參與骨質(zhì)疏松癥等骨代謝疾病的研究報道較少。

紐約大學(xué)西奈山醫(yī)學(xué)院的DF Lee等人在李-佛美尼綜合癥(LFS)患者iPSC來源的成骨細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)lncRNA H19的表達(dá)降低，經(jīng)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在恢復(fù)成骨細(xì)胞中H19的表達(dá)后，能促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，同時抑制骨肉瘤的成瘤能力。提示了lncRNA可以對成骨細(xì)胞分化發(fā)揮作用，也說明可以利用lncRNA來作為治療骨質(zhì)疏松等骨骼系統(tǒng)疾病的藥物。但該研究僅局限于李-佛美尼綜合癥患者iPSC來源的成骨細(xì)胞中，未做對于正常非病理現(xiàn)象(如衰老，長期臥床等)情況下的成骨細(xì)胞研究(Lee DF,et al.Modeling familial cancer with induced pluripotent stem cells,Cell.2015 Apr 9；161(2):240-254)。

lnc-DIF作為一種lncRNA，位于小鼠19號染色體chr19:38207571-38208896，Genebank ID AK138929.1，長1326bp，最早發(fā)現(xiàn)于1999年(Carninci,P.&Hayashizaki,Y.High-efficiency full-length cDNA cloning,JOURNAL Meth.Enzymol.1999(303), 19-44)，對于其在成骨細(xì)胞分化和骨形成過程中的作用，以及其在人骨質(zhì)疏松癥等骨骼系統(tǒng)疾病的診斷和治療中的作用能尚未見研究和報道。

miR-489-3p作為一種microRNA(一類長約22～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，可通過堿基互補配對的方式結(jié)合靶基因的3’非編碼區(qū)，從而抑制翻譯或降解靶基因)，在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化中起重要作用。本發(fā)明利用生物信息學(xué)軟件分析及qPCR實驗發(fā)現(xiàn)并驗證了lnc-DIF可以特異性結(jié)合miR-489-3p，并通過體內(nèi)動物水平實驗、體外細(xì)胞水平實驗，發(fā)現(xiàn)lnc-DIF特異性結(jié)合miR-489-3p在制備人骨質(zhì)疏松癥的診斷和治療藥物中的應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種長鏈非編碼RNA lnc-DIF的應(yīng)用。該應(yīng)用首先檢測老齡骨質(zhì)疏松小鼠模型股骨樣本和后肢去負(fù)荷骨質(zhì)疏松小鼠模型股骨樣本，發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA lnc-DIF在老齡和后肢去負(fù)荷骨質(zhì)疏松小鼠的骨組織中高表達(dá)。進(jìn)而設(shè)計制備長鏈非編碼RNA lnc-DIF的RNA干擾序列，進(jìn)行成骨分化功能實驗發(fā)現(xiàn)：長鏈非編碼RNA lnc-DIF抑制成骨細(xì)胞分化，并且lnc-DIF能夠特異性結(jié)合成骨相關(guān)miR-489-3p。這表明長鏈非編碼RNA lnc-DIF能夠用于制備治療各種因素引起的骨質(zhì)疏松以及骨骼系統(tǒng)其他疾病的藥物。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案：一種長鏈非編碼RNAlnc-DIF的應(yīng)用，其特點是包括以下步驟：

首先設(shè)計lnc-DIF特異性引物序列，構(gòu)建老齡小鼠骨質(zhì)疏松模型和后肢去負(fù)荷骨質(zhì)疏松小鼠模型；并檢測lnc-DIF在骨組織中表達(dá)量，證實lnc-DIF在小鼠骨質(zhì)疏松骨組織樣本中高表達(dá)。

設(shè)計、制備并進(jìn)行化學(xué)修飾，獲得lnc-DIF的RNA干擾序列；利用體外轉(zhuǎn)染方法將RNA干擾序列轉(zhuǎn)染到小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1中，進(jìn)行qPCR檢測，以及ALP染色實驗、礦化-茜素紅s染色實驗，證明長鏈非編碼RNA lnc-DIF通過特異性結(jié)合miR-489-3p抑制成骨細(xì)胞分化。

獲得的lnc-DIF干擾序列能夠用于制備治療骨骼系統(tǒng)疾病的藥物及藥物組合物，骨骼系統(tǒng)疾病包括人骨質(zhì)疏松、股骨頭壞死、關(guān)節(jié)退行性變、脊柱側(cè)彎以及其它骨骼系統(tǒng)疾病。所述藥物及藥物組合物包括藥學(xué)上能夠接受的一種或多種載體，包括但不限于稀釋劑、粘合劑、吸附載體、填充劑和崩解劑；并能夠用不同添加劑制備藥物組合物，包括穩(wěn)定劑、殺菌劑、緩沖劑、等滲劑、螯合劑、PH控制劑及表面活性劑。

所述lnc-DIF特異性引物序列如下：

lnc-DIF上游引物：CCTGTGGAGGAAGGAAGATG。

lnc-DIF下游引物：TCAGAAGGCTGGAGAGATGG。

所述lnc-DIF的RNA干擾序列如下：

lnc-DIF siRNA：GGCAUGUAAUCUCUAGACATT。

UGUCUAGAGAUUACAUGCCTT。

本發(fā)明的有益效果是：該應(yīng)用首先檢測老齡骨質(zhì)疏松小鼠模型股骨樣本和后肢去負(fù)荷骨質(zhì)疏松小鼠模型股骨樣本，發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA lnc-DIF在老齡和后肢去負(fù)荷骨質(zhì)疏松小鼠的骨組織中高表達(dá)。進(jìn)而設(shè)計制備長鏈非編碼RNA lnc-DIF的RNA干擾序列，進(jìn)行成骨分化功能實驗發(fā)現(xiàn)：長鏈非編碼RNA lnc-DIF抑制成骨細(xì)胞分化，并且lnc-DIF能夠特異性結(jié)合成骨相關(guān)miR-489-3p。這表明長鏈非編碼RNA lnc-DIF能夠用于制備治療各種因素引起的骨質(zhì)疏松以及骨骼系統(tǒng)其他疾病的藥物。

下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明作詳細(xì)說明。

附圖說明

圖1是本發(fā)明應(yīng)用lnc-DIF的干擾序列可有效抑制lnc-DIF在前成骨細(xì)胞MC3T3-E1中的表達(dá)結(jié)果圖；證明本發(fā)明設(shè)計的lnc-DIF干擾序列可以有效降低前成骨細(xì)胞中l(wèi)nc-DIF表達(dá)水平。(數(shù)值以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，兩組間的顯著性采用students't檢驗，***P<0.001)。

圖2是本發(fā)明利用qPCR技術(shù)檢測長鏈非編碼RNA lnc-DIF在老齡骨質(zhì)疏松小鼠模型和HLU后肢去負(fù)荷骨質(zhì)疏松小鼠模型骨組織中低表達(dá)的結(jié)果圖；證明lnc-DIF在骨組織中的表達(dá)量與骨質(zhì)疏松具有相關(guān)性。(數(shù)值以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，兩組間的顯著性采用students't檢驗，***P<0.001)。

圖3是本發(fā)明利用qPCR技術(shù)檢測lnc-DIF的干擾序列可有效促進(jìn)成骨分化標(biāo)志基因ALP和ColI表達(dá)結(jié)果圖；證明在前成骨細(xì)胞中，當(dāng)lnc-DIF的表達(dá)量下降時，其成骨分化標(biāo)志因子的表達(dá)量降低。(數(shù)值以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，兩組間的顯著性采用students't檢驗，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。

圖4是本發(fā)明利用ALP染色和茜素紅染色技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染lnc-DIF的干擾序列對成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成的促進(jìn)結(jié)果圖；證明在前成骨細(xì)胞中，當(dāng)lnc-DIF的表達(dá)量下降時，其成骨分化能力降低。

圖5是本發(fā)明應(yīng)用lnc-DIF的RNA干擾序列發(fā)現(xiàn)lnc-DIF與miR-489-3p有靶向作用關(guān)系，并且lnc-DIF的RNA干擾序列促進(jìn)miR-489-3p表達(dá)的結(jié)果圖；證明lnc-DIF對成骨細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)機制，即通過特異性結(jié)合miR-489-3p抑制成骨細(xì)胞分化。

具體實施方式

參照圖2：利用qPCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，lnc-DIF在老齡骨質(zhì)疏松小鼠模型和HLU后肢去負(fù)荷骨質(zhì)疏松小鼠模型的骨組織樣品中高表達(dá)。

(1)設(shè)計并制備lnc-DIF的特異性引物，序列見表1；

(2)建立老齡骨質(zhì)疏松小鼠模型：

選用C57BL/6實驗小鼠，飼養(yǎng)至15月齡、18月齡，處死小鼠，收集脛骨樣本。

(3)建立HLU后肢去負(fù)荷骨質(zhì)疏松小鼠模型：

選用C57BL/6實驗小鼠，用回形針將小鼠懸掛于尾懸吊裝置吊環(huán)上，小鼠脊柱與地面呈30°進(jìn)行尾懸吊后肢去負(fù)荷。實驗期間動物自由進(jìn)食、飲水，28天后處死小鼠，收集脛骨樣本。

(4)提取小鼠骨組織樣本RNA：

取骨組織樣品，將肌肉剝離干凈，用液氮研磨骨組織，待研磨充分后，轉(zhuǎn)移到1.5ml EP管，加入1ml TRIzol(Invitrogen公司)，之后震蕩儀混勻。4℃，12000g離心20min。取上清，轉(zhuǎn)移到新的1.5ml EP管。每1ml TRIzol加入200μl的氯仿，用手上下震蕩15s，室溫放置2-3min。4℃，12000g離心15min。取出EP管，樣品分為三層，將上層的水相轉(zhuǎn)移到新的1.5ml EP管中。加入4℃預(yù)冷的異丙醇(500μL/1mL TRIzol)，輕輕吹打混勻，沉淀RNA。-20℃冰箱靜置30min，沉淀RNA。4℃，12000g離心10min。去除上清，緩慢沿管壁加入1mL 75％乙醇，小心地吹打混勻。4℃，7500g離心10min。去除上清，室溫干燥沉淀10-20min，但不可完全干燥。加入50μl RNase-free的水，吹打混勻，溶解RNA。(可放置在-80℃冰箱保存)用紫外分光光度計檢測RNA在260nm和280nm處的吸光值。根據(jù)A260/A280比值檢測所得RNA的純度，純RNA的A260/A280比值在2.0左右(一般實驗中，這一比值最好控制在1.7以上，2.1以下)。電泳，凝膠成像儀上觀察結(jié)果：28S條帶與18S條帶之比應(yīng)接近2:1，5S條帶不亮。

(5)利用qPCR技術(shù)檢測lnc-DIF在老齡骨質(zhì)疏松小鼠骨組織樣本中的表達(dá)變化：

使用TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，先將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄條件為：37℃ 15min；85℃ 15s。取各組的cDNA為模板，以GAPDH為內(nèi)參，采用qPCR檢測lnc-DIF基因在老齡骨質(zhì)疏松小鼠骨組織樣本中的表達(dá)量。qPCR反應(yīng)條件為：95℃30s，變性；95℃10s；60℃30s，44個循環(huán)。所用lnc-DIF與GAPDH引物序列如下：

表1 引物序列

結(jié)果表明，lnc-DIF在老齡骨質(zhì)疏松小鼠骨組織樣本中高表達(dá)，說明lnc-DIF在骨組織中的表達(dá)量與骨質(zhì)疏松相關(guān)。

參照圖1：lnc-DIF的RNA干擾序列可有效抑制lnc-DIF在前成骨細(xì)胞MC3T3-E1中的表達(dá)。

(1)制備lnc-DIF的RNA干擾序列：

從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得lnc-DIF的核苷酸序列，根據(jù)lnc-DIF的核苷酸序列合成寡核苷酸單鏈以及互補的雙鏈，經(jīng)高效液相色譜法純化，并進(jìn)行前后2’-4’位點硫代磷酸化骨架修飾以及3’末端膽固醇標(biāo)記，最終獲得lnc-DIF的RNA干擾序列si-lnc-DIF。接著，合成陰性對照干擾序列。使用RNase free水將合成的寡核苷酸稀釋為20uM的存儲液，分裝后于-80℃凍存。lnc-DIF的RNA干擾序列如下：

表2 lnc-DIF的RNA干擾序列

(2)用lnc-DIF的RNA干擾序列轉(zhuǎn)染前成骨細(xì)胞MC3T3-E1：

實驗分組：轉(zhuǎn)染干擾序列組：轉(zhuǎn)染lnc-DIF siRNA；干擾序列對照組：轉(zhuǎn)染siRNA-NC。每孔的配置，取前成骨細(xì)胞MC3T3-E1，以1×10⁶/孔的細(xì)胞數(shù)接種于6孔板中，2mL含10％FBS、100μg/ml鏈霉素與100μg/ml青霉素10％FBS，1％L-谷氨酰胺的α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)基；24小時內(nèi)細(xì)胞匯合達(dá)到70-90％；在250μl的α-MEM無血清培養(yǎng)基加入20pmol siRNA 5ul柔和混勻；用250μl無血清的α-MEM稀釋5μl lipofectamin 2000試劑，輕輕混勻，室溫放置5分鐘；將稀釋好的siRNA和lipofectamin 2000試劑混合，輕柔混勻，室溫放置20分鐘，以便形成siRNA/lipofectamin復(fù)合物；將500μl復(fù)合物加到含有細(xì)胞的培養(yǎng)板孔內(nèi)，補加1.5ml的α-MEM無血清培養(yǎng)基，來回輕柔搖晃細(xì)胞培養(yǎng)板。將細(xì)胞在CO₂培養(yǎng)箱中37℃孵育6小時后，更換培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育。待48h后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的其它檢測步驟。

(3)提取轉(zhuǎn)染后MC3T3-E1細(xì)胞的RNA：

在含有轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)板每孔中加入TRIzol(Invitrogen公司)，待細(xì)胞充分裂解后，轉(zhuǎn)移到新的1.5ml EP管，其余提取步驟同上。

(4)qPCR檢測lnc-DIF表達(dá)量(步驟同上)，所用lnc-DIF與GAPDH引物序列同表1所示。

結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染了干擾序列后，lnc-DIF的表達(dá)水平明顯下降。說明設(shè)計制備的lnc-DIF干擾序列可有效抑制lnc-DIF在前成骨細(xì)胞MC3T3-E1中的表達(dá)。

參照圖3：lnc-DIF干擾序列可有效促進(jìn)前成骨細(xì)胞中成骨分化標(biāo)志基因ALP和ColI的表達(dá)水平。

轉(zhuǎn)染及RNA提取參照實施例3，接著取各組的cDNA為模板，以GAPDH作為內(nèi)參，采用qPCR檢測成骨分化標(biāo)志基因ALP和ColI的表達(dá)。所用ALP、ColI引物序列如下：

表3 成骨標(biāo)志基因及內(nèi)參引物序列

結(jié)果表明，lnc-DIF干擾序列可有效促進(jìn)成骨分化標(biāo)志基因ALP和ColI的表達(dá)，說明lnc-DIF干擾序列可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。

參照圖4：lnc-DIF干擾序列可有效促進(jìn)前成骨細(xì)胞ALP活性和礦化結(jié)節(jié)數(shù)量。

(1)ALP染色實驗：

取前成骨細(xì)胞MC3T3-E1，以5×10⁴/孔的細(xì)胞數(shù)接種于24孔板中，每組設(shè)3個復(fù)孔，轉(zhuǎn)染48h后(步驟同上)，用PBS洗滌3次，每次5分鐘。采用10％中性甲醛固定細(xì)胞，室溫15min，用PBS洗滌3次，每次5分鐘；去除洗滌液，加入適量BCIP/NBT染色工作液，確保能充分覆蓋樣品；室溫避光孵育24小時；去除BCIP/NBT染色工作液，用三蒸水洗滌1-2次即可終止顯色反應(yīng)，對染色結(jié)果進(jìn)行掃描，觀察。

(2)礦化-茜素紅S染色實驗：

取前成骨細(xì)胞MC3T3-E1，以5×10⁴/孔的細(xì)胞數(shù)接種于24孔板中，每組設(shè)3個復(fù)孔，轉(zhuǎn)染48h后(步驟同上)，將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為誘導(dǎo)成骨分化培養(yǎng)基(α-MEM添加10％FBS、50μg/ml維生素C與10mMβ甘油磷酸鈉誘導(dǎo)細(xì)胞成骨分化，每2d更換培養(yǎng)基，誘導(dǎo)分化21d時取出細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞，采用10％中性甲醛固定細(xì)胞，室溫15min，PBS清洗細(xì)胞1次，加入0.5％茜素紅S染液(pH4.2)，室溫染色15min，使用自來水對細(xì)胞震蕩清洗4次，5min/次，掃描儀對著色礦化結(jié)節(jié)進(jìn)行掃描獲取圖片分析。

結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染lnc-DIF干擾序列可有效提高ALP活性，以及促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的形成，說明lnc-DIF可抑制成骨細(xì)胞分化，提示lnc-DIF可作為診斷和治療骨質(zhì)疏松等骨骼系統(tǒng)相關(guān)疾病藥物作用的靶點。

參照圖5：lnc-DIF可以特異性結(jié)合miR-489-3p。

(1)生物信息學(xué)驗證

通過RNA22數(shù)據(jù)庫分析(https://cm.jefferson.edu/rna22/Interactive/)，預(yù)測得到的lnc-DIF與miR-489-3p的結(jié)合位點如下：

表4 通過RNA22預(yù)測得到的lnc-DIF與miR-489-3p的結(jié)合位點

(2)設(shè)計并制備miR-489-3p引物，序列見表5；

表5 小鼠miR-489-3p引物序列

(3)qPCR檢測miR-489-3p的表達(dá)(以U6為內(nèi)參)：實驗分組：轉(zhuǎn)染干擾序列組：轉(zhuǎn)染lnc-DIF siRNA；干擾序列對照組：轉(zhuǎn)染siRNA-NC。

結(jié)果表明，lnc-DIF可以特異性結(jié)合miR-489-3p，lnc-DIF的RNA干擾序列可以促進(jìn)miR-489-3p表達(dá)，lnc-DIF是miR-489-3p的競爭性內(nèi)源RNA。