本發(fā)明涉及一種多重基因檢測試劑盒及其應(yīng)用，尤其是涉及一種黑腹果蠅中胰島素樣肽ILP系列基因表達(dá)水平檢測的引物組合物、試劑盒及其使用方法。

背景技術(shù)：

在人類和哺乳動物中，胰島素是由胰臟內(nèi)的胰島β細(xì)胞分泌的一種重要激素。胰島素是機體內(nèi)唯一降低血糖的激素，也是唯一同時促進(jìn)糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成的激素。胰島素還可以促進(jìn)鉀離子和鎂離子穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；并促進(jìn)脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)及三磷酸腺苷(ATP)的合成。由于胰島素在代謝調(diào)節(jié)中的重要作用，胰島素信號通路在各種生理和病理過程(例如癌癥、衰老)中的作用日益得到人們的重視。

黑腹果蠅是科學(xué)家們最為青睞的模式生物之一。之前發(fā)達(dá)的遺傳學(xué)研究已經(jīng)讓科學(xué)家能自由“改造”果蠅的基因和神經(jīng)元，用來探究生命機制。在果蠅中，存在類似人類胰島素的胰島素樣肽(insulin-like peptide)，包括Insulin-like peptide 1(Dilp1)，Insulin-like peptide 2(Dilp2),Insulin-like peptide 3(Dilp3),Insulin-like peptide 4(Dilp4),Insulin-like peptide 5(Dilp5),Insulin-like peptide 6(Dilp6),Insulin-like peptide 7(Dilp7)。黑腹果蠅中的胰島素樣肽表達(dá)水平成為研究關(guān)注的熱點。

目前已有的檢測黑腹果蠅中胰島素樣肽ILP系列基因表達(dá)水平的方法包括實時熒光定量PCR,熒光原位雜交、基因芯片,RNA測序等技術(shù)。

(1)目前采用最多的方法是實時熒光定量PCR。熒光定量PCR技術(shù)的優(yōu)點：靈敏性高，并可精確定量，但也存在如下缺點：1)通量低：如果只用一種熒光標(biāo)記，一次只能檢測一個基因。當(dāng)一個樣品同時需要檢測多種基因時，必須一個一個檢測，成本相對增高，效率低，周期長，對大批量的樣品更是無從下手。2)成本相對較高：如需要同時檢測多個基因，就需要采用多種熒光標(biāo)記；目前最多共同使用4到5種熒光標(biāo)記，用于標(biāo)記每個待檢測基因片段，因此采用多種熒光標(biāo)記成本相對較高。

(2)熒光原位雜交方法是將熒光標(biāo)記的基因探針原位雜交到細(xì)胞內(nèi)核酸上，通過熒光顯微鏡來檢測亮度定量基因表達(dá)水平，存在通量低、靈敏度較低、成本高的缺點。

(3)基因芯片是通過微加工技術(shù)，將數(shù)以萬計、乃至百萬計的特定序列的DNA片段(基因探針)，有規(guī)律地排列固定于芯片，利用這類芯片與標(biāo)記的生物樣品進(jìn)行雜交，可對樣品的基因表達(dá)譜生物信息進(jìn)行快速定性和定量分析。具有高通量的優(yōu)點，但是技術(shù)成本昂貴、復(fù)雜，探針的合成與固定比較復(fù)雜，不能精確定量，重復(fù)性差，靈敏度較低。

(4)RNA測序作為一種較新的技術(shù)，具有靈敏性高、通量高的優(yōu)點，但是成本昂貴。

GenomeLab^TMGeXP多重基因表達(dá)遺傳分析系統(tǒng)基于貝克曼公司成熟的毛細(xì)管電泳分離技術(shù)及高靈敏度的激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)研發(fā)而成，一束8道的毛細(xì)管陳列設(shè)計充分利用了96孔板的排列特性，降低了使用更大的陳列帶來的花費和復(fù)雜性。采用多重PCR方法，通過Beckman Coulter染色標(biāo)記，在同一個EP管中同時分析多個基因的表達(dá)，能快速有效地檢測基因的表達(dá)狀況，克服了上述幾種檢測方法存在的缺陷，具有以下優(yōu)點：1、高通量：本系統(tǒng)采用雙(96孔)板、自動加樣和樣品追蹤技術(shù)，可以實現(xiàn)單個反應(yīng)同時檢測多達(dá)30-40個基因，可同時做192個反應(yīng)。2、準(zhǔn)確性強：GeXP采用毛細(xì)管電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離檢測，可將非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物、引物二聚體和特異性擴(kuò)增產(chǎn)物分離，最大程度降低假陽性；3、敏感性高，結(jié)果重復(fù)性好：GeXP系統(tǒng)克服了傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增方法的不均等擴(kuò)增造成的偏差，提高了對一套目的基因進(jìn)行定量的速度和敏感性，采用激光誘導(dǎo)熒光-PMT，具有超高靈敏度；4、方法簡便，使用經(jīng)濟(jì)：GeXP提供從試劑、多重PCR引物設(shè)計、結(jié)果及定量表達(dá)譜分析等全套實驗方案；每個樣品的檢測成本少于￥50，利于大規(guī)模推廣；5、精確定量、靈活性強：可精確定量基因拷貝數(shù)，可隨時根據(jù)需求調(diào)整檢測的靶基因。6、易于實現(xiàn)自動化：就樣品制備而言，Biomek系列自動液體處理儀可以與GeXP分析儀和Ampligrid擴(kuò)增儀完全匹配，集成的條形碼閱讀器保證了準(zhǔn)確的樣品追蹤和結(jié)果報告。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供一種黑腹果蠅中胰島素樣肽ILP系列基因表達(dá)水平檢測的引物組合物，包括胰島素樣肽與RNA內(nèi)參的RT擴(kuò)增引物和PCR擴(kuò)增引物；其中RT擴(kuò)增引物為SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15；PCR擴(kuò)增引物為SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16。

本發(fā)明的另一個目的是提供黑腹果蠅中胰島素樣肽ILP系列基因表達(dá)水平檢測的試劑盒，包括如下：

DEPC水、5×RT緩沖液、反轉(zhuǎn)錄引物、反轉(zhuǎn)錄酶、Z溶液、10×PCR緩沖液、PCR引物、25mM氯化鎂溶液、DNA聚合酶和陽性對照品；

所述的反轉(zhuǎn)錄引物包括以下表1和表2中7種胰島素樣肽與RNA內(nèi)參的RT擴(kuò)增引物；

所述的PCR引物包括表1和表2中7種胰島素樣肽與RNA內(nèi)參的PCR擴(kuò)增引物，基因序列如下表2所示。各胰島素樣肽基因特征峰值見表3。

表1胰島素樣肽與RNA內(nèi)參的擴(kuò)增引物

表2擴(kuò)增引物基因序列

表3胰島素樣肽基因特征峰位置

所述的Z溶液包括三磷酸脫氧核苷酸(dNTPs)和通用引物，所述的通用引物正向擴(kuò)增引物序列為AGGTGACACTATAGAATA，如SEQ ID NO.17；反向擴(kuò)增引物序列為GTACGACTCACTATAGGGA，如SEQ ID NO.18；其中通用引物正向擴(kuò)增引物帶熒光標(biāo)記。

所述的陽性對照品為連接有設(shè)計上述7種基因和RNA內(nèi)參的目標(biāo)檢測序列的USC1.0的克隆載體。

本發(fā)明的又一個目的是提供上述試劑盒的使用方法，該方法基于GeXP多重基因表達(dá)遺傳分析系統(tǒng)，具有特異性強、靈敏度高、通量高、可靠性強、成本低、無假陰性結(jié)果的優(yōu)點，具體包括以下步驟：

步驟(1)、采集樣本并提取核酸

采集黑腹果蠅的組織樣本，分離提取核酸；

步驟(2)、以核酸為模板進(jìn)行RT反應(yīng)

取5-30ng/ul的核酸樣品RNA5μL，DEPC水8μL，5×RT緩沖液4μL，RT引物溶液2μL，RT酶1μL混勻后加入到96孔樣品板上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：48℃1分鐘，42℃60分鐘，95℃5分鐘，4℃直至收取RT產(chǎn)物，其中反轉(zhuǎn)錄引物溶液中各RT引物濃度均為300nM，所述的RT引物包括7種胰島素樣肽與RNA內(nèi)參的RT擴(kuò)增引物，基因序列如表1和表2所示；

步驟(3)、以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)

取RT產(chǎn)物8.6μL，10×PCR緩沖液2μL，25mM的氯化鎂4μL，PCR引物溶液2μL，DNA聚合酶1.4μL，Z溶液2μL混勻后加入到96孔樣品板上進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃2分鐘；94℃30秒鐘，60℃30秒鐘，70℃1分鐘，循環(huán)35次；70℃1分鐘；4℃直至收取PCR產(chǎn)物；其中PCR引物溶液中各PCR引物濃度均為250nM，PCR引物包括7種胰島素樣肽與RNA內(nèi)參的PCR擴(kuò)增引物，基因序列如表1和表2所示。

步驟(4)、GeXP遺傳分析儀毛細(xì)電泳分離樣品

取PCR產(chǎn)物0.2-1μL，GeXP遺傳分析儀配套的上樣緩沖液38.75μL，DNA標(biāo)準(zhǔn)品0.5μL，礦物油一滴混合均勻后加入到96孔分離液板上進(jìn)行毛細(xì)電泳分離樣品，將GeXP遺傳分析儀的軟件獲得的實驗組圖譜與對照組圖譜對比，判斷基因表達(dá)的變化，并通過軟件得到表達(dá)增加或者減少的百分比。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：

本發(fā)明所設(shè)計的特異性擴(kuò)增引物，可以同時針對黑腹果蠅7種胰島素樣肽進(jìn)行檢測，一天之內(nèi)可完成192個樣品的檢測，既節(jié)約了生產(chǎn)成本和檢測成本，又提高了檢測效率及縮短了時間；RNA內(nèi)參，提供了樣品RNA完整性的對照內(nèi)參，確保在檢驗過程中對樣品質(zhì)量的判斷，避免假陰性，并監(jiān)控反應(yīng)效率，使得檢測具有更好的靈敏度和特異性，從而避免了其他檢測方法特異性不高的問題。

綜上所述，本發(fā)明基于GeXP多重基因表達(dá)遺傳分析系統(tǒng)的同步檢測黑腹果蠅中7種胰島素樣肽(ILP)系列基因表達(dá)水平的試劑盒及其檢測方法，可以同時針對7種胰島素樣肽基因進(jìn)行檢測，檢測敏感性高，特異性好，降低了常規(guī)PCR擴(kuò)增的假陽性率，還能夠有效解決常規(guī)PCR的易污染問題；具有非競爭性內(nèi)對照體系，可靠性強，無假陰性結(jié)果，利用GeXP遺傳分析系統(tǒng)靈敏、準(zhǔn)確定量、快速、高通量的技術(shù)優(yōu)勢，將為研究機構(gòu)提供一種靈敏、準(zhǔn)確、快速且低成本的多重基因檢測方案。

附圖說明

圖1為GeXP遺傳分析儀的毛細(xì)電泳分離樣品結(jié)果對照組圖譜；

圖2為GeXP遺傳分析儀的毛細(xì)電泳分離樣品結(jié)果實驗組組圖譜。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。

實施1：

本發(fā)明為一種黑腹果蠅中胰島素樣肽ILP系列基因表達(dá)水平檢測的試劑盒，該試劑盒中包括以下試劑：

1)DEPC水

2)5×RT緩沖液

3)反轉(zhuǎn)錄引物(RT primer mix)

4)RT酶(全稱反轉(zhuǎn)錄酶)

5)溶液Z

6)10×PCR緩沖液

7)PCR引物

8)25mM氯化鎂溶液

9)DNA聚合酶

10)陽性對照

上述的反轉(zhuǎn)錄引物包括表1和表2中7種胰島素樣肽與RNA內(nèi)參的RT擴(kuò)增引物，所述的PCR引物包括表1和表2中7種胰島素樣肽與RNA內(nèi)參的PCR擴(kuò)增引物，基因序列如下表2所示。

上述Z溶液包括三磷酸脫氧核苷酸(dNTPs)和通用引物，通用引物正向擴(kuò)增引物序列為AGGTGACACTATAGAATA，反向擴(kuò)增引物序列為GTACGACTCACTATAGGGA，通用引物正向擴(kuò)增引物帶熒光標(biāo)記。

上述陽性對照品為連接有設(shè)計上述7種胰島素樣肽基因和RNA內(nèi)參的目標(biāo)檢測序列的USC1.0的克隆載體。

上述基因靶位點設(shè)計：選擇對黑腹果蠅該基因特異、且針對該基因各個mRNA亞型(transcript variant)之間的保守區(qū)域基因片段設(shè)計引物，即能夠特異性檢測該基因的各個mRNA亞型，而不出現(xiàn)非特異性檢測到其他基因。

(1)黑腹果蠅胰島素樣肽基因1Insulin-like peptide 1(Ilp1)位點：黑腹果蠅Ilp1基因僅有一個mRNA亞型(transcript variant)，可特異性檢測到該mRNA亞型

(2)黑腹果蠅胰島素樣肽基因2Insulin-like peptide 2(Ilp2)位點：黑腹果蠅Ilp2基因僅有一個mRNA亞型(transcript variant)，可特異性檢測到該mRNA亞型

(3)黑腹果蠅胰島素樣肽基因3Insulin-like peptide 3(Ilp3)位點：黑腹果蠅Ilp3基因僅有一個mRNA亞型(transcript variant)，可特異性檢測到該mRNA亞型

(4)黑腹果蠅胰島素樣肽基因4Insulin-like peptide 4(Ilp4)位點：黑腹果蠅Ilp4基因僅有一個mRNA亞型(transcript variant)，可特異性檢測到該mRNA亞型

(5)黑腹果蠅胰島素樣肽基因5Insulin-like peptide 5(Ilp5)位點：黑腹果蠅Ilp5基因僅有一個mRNA亞型(transcript variant)，可特異性檢測到該mRNA亞型

(6)黑腹果蠅胰島素樣肽基因6Insulin-like peptide 6(Ilp6)位點：可特異性檢測到黑腹果蠅Ilp6基因4個mRNA亞型(transcript variant)，且4個mRNA亞型擴(kuò)增區(qū)域片段長度一致。

(7)黑腹果蠅胰島素樣肽基因7Insulin-like peptide 7(Ilp7)位點：黑腹果蠅Ilp7基因僅有一個mRNA亞型(transcript variant)，可特異性檢測到該mRNA亞型

(8)RNA內(nèi)參：選用黑腹果蠅RpL32(ribosomal protein L32)基因，可檢測樣品中RNA的完整性。

實施例2：

本發(fā)明一種黑腹果蠅中胰島素樣肽ILP系列基因表達(dá)水平檢測的試劑盒，檢測的基因包括黑腹果蠅中胰島素樣肽1，胰島素樣肽2，胰島素樣肽3，胰島素樣肽4，胰島素樣肽5，胰島素樣肽6，胰島素樣肽7(見表1)。采集黑腹果蠅樣品，提取核酸，以樣品核酸為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)，最終用毛細(xì)電泳方法分離樣品，具體步驟如下：

1、生產(chǎn)基于GeXP多重基因表達(dá)遺傳分析系統(tǒng)的黑腹果蠅中胰島素樣肽ILP系列基因表達(dá)水平檢測的試劑盒，試劑盒中包括的組分同上述實施例1；

2、采集樣本并提取核酸

采集黑腹果蠅的實驗組及對照組樣本，分離提取核酸；

3、以樣品核酸為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)

1)按以下比例在96孔樣品板上加入試劑和樣品(RT板見表4)：

表4RT反應(yīng)試劑和樣品混合比例

注：在RT反應(yīng)中加入陽性對照品，陽性對照品為由各目標(biāo)基因克隆所得，包含目標(biāo)片段質(zhì)粒，用量為1μL/反應(yīng)。

2)混勻后按以下溫度孵育(見表5)：

表5RT反應(yīng)條件

4、以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)

1)按以下比例在96孔樣品板上加入試劑和樣品(PCR板見表6)：

表6PCR反應(yīng)試劑和樣品混合比例

注：Z溶液包括三磷酸脫氧核苷酸(dNTPs)和通用引物，通用引物正向擴(kuò)增引物序列為AGGTGACACTATAGAATA，反向擴(kuò)增引物序列為GTACGACTCACTATAGGGA，通用引物正向擴(kuò)增引物帶熒光標(biāo)記。

2)混勻后按以下溫度進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)(見表7)：

表7PCR反應(yīng)條件

5、GeXP遺傳分析儀毛細(xì)電泳分離樣品

1)制備GeXP樣品(見表8)：

表8GeXP樣品混合比例

2)毛細(xì)電泳分離樣品

將GeXP樣品加入96孔毛細(xì)管電泳分離板上適當(dāng)數(shù)目的孔中進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離；毛細(xì)管電泳分離是一類以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場為驅(qū)動力的新型液相分離技術(shù)，具體程序為90℃變性120秒，進(jìn)樣電壓2kv，30秒，分離電壓6kv，35分鐘。

6、結(jié)果分析(見GenomeLab GeXP遺傳分析儀說明書)

根據(jù)GeXP遺傳分析儀自有軟件上默認(rèn)的參數(shù)對結(jié)果進(jìn)行片段大小分析，其橫坐標(biāo)表示片段大小，縱坐標(biāo)為信號強弱。將GeXP遺傳分析儀的軟件獲得的實驗組圖譜與對照組圖譜對比，判斷胰島素樣肽基因表達(dá)的變化，并通過軟件得到表達(dá)增加或者減少的百分比(表9)。對照組圖譜如圖1所示，實驗組對照組圖譜如圖2所示。對照組為野生型黑腹果蠅w1118，實驗組為嗅覺基因Or83b突變的黑腹果蠅，嗅覺基因Or83b突變降低了黑腹果蠅的胰島素樣肽基因表達(dá)水平，并延長了黑腹果蠅壽命。其結(jié)果能準(zhǔn)確檢測出7種黑腹果蠅中胰島素樣肽的基因靶標(biāo)的表達(dá)水平，各目標(biāo)片段大小間隔適中，且信號不至于過飽和，各靶標(biāo)間信號相對持平，且沒有寬峰、雙峰等現(xiàn)象。

表9胰島素樣肽基因表達(dá)的變化

實施例3：檢測試劑盒靈敏度、特異性分析

靈敏度分析：將陽性對照按一定拷貝數(shù)倍比稀釋后，經(jīng)PCR擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳檢測直至檢測不到信號，該拷貝數(shù)即為最低檢測線，也就是試劑盒的靈敏度。靈敏度達(dá)45拷貝。

特異性分析：單重PCR擴(kuò)增經(jīng)毛細(xì)管電泳檢測為目標(biāo)片段大小的單峰。

上述說明并非對本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實質(zhì)范圍內(nèi)，做出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州電子科技大學(xué)

<120> 黑腹果蠅中胰島素樣肽ILP系列基因表達(dá)水平檢測的引物組合物、試劑盒及

其使用方法

<130> 1

<160> 18

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gtacgactca ctatagggaa tgtttagcca gcacaacgg 39

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

aggtgacact atagaataca tccatggcat cggacagt 38

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gtacgactca ctatagggac tcgatggtgg ccgtgattt 39

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

aggtgacact atagaatata ctcagcacct cgttgagc 38

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gtacgactca ctatagggag actcgacgtc ttcgggatg 39

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

aggtgacact atagaatatt tacgttctcg gcttggca 38

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

gtacgactca ctatagggag gagcagtgcg tctaaggat 39

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

aggtgacact atagaatatc cgcatccgta tgcttctg 38

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

gtacgactca ctatagggaa ccacttggcg gatttggat 39

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

aggtgacact atagaatata ggagtcgcag tatgccct 38

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

gtacgactca ctatagggat ggttctcaaa gtgccgacg 39

<210> 12

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

aggtgacact atagaatatc tgttcgtatt ccgtgggtg 39

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

gtacgactca ctatagggag caggtgaaac caaccaacc 39

<210> 14

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

aggtgacact atagaatacg ggtcaggacc tctttcac 38

<210> 15

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

gtacgactca ctatagggag cccaagggta tcgacaaca 39

<210> 16

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

aggtgacact atagaatact tgcgcttctt ggaggaga 38

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

aggtgacact atagaata 18

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

gtacgactca ctataggga 19