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黑腹果蠅中胰島素樣肽ILP系列基因表達水平檢測的引物組合物、試劑盒及其使用方法與流程

文檔序號:11899437閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.黑腹果蠅中胰島素樣肽ILP系列基因表達水平檢測的引物組合物,其特征在于包括胰島素樣肽與RNA內(nèi)參的RT擴增引物和PCR擴增引物;其中RT擴增引物為SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15;PCR擴增引物為SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16。

2.如權(quán)利要求1所述的黑腹果蠅中胰島素樣肽ILP系列基因表達水平檢測的引物組合物,其特征在于胰島素樣肽包括Insulin-like peptide 1(Dilp1),Insulin-like peptide 2(Dilp2),Insulin-like peptide 3(Dilp3),Insulin-like peptide 4(Dilp4),Insulin-like peptide 5(Dilp5),Insulin-like peptide 6(Dilp6),Insulin-like peptide 7(Dilp7)。

3.黑腹果蠅中胰島素樣肽ILP系列基因表達水平檢測的試劑盒,其特征在于包括DEPC水、5×RT緩沖液、反轉(zhuǎn)錄引物、反轉(zhuǎn)錄酶、Z溶液、10×PCR緩沖液、PCR引物、25mM氯化鎂溶液、DNA聚合酶和陽性對照品;

所述的反轉(zhuǎn)錄引物包括如權(quán)利要求1所述的RT擴增引物;

所述的PCR引物包括如權(quán)利要求1所述的的PCR擴增引物。

4.如權(quán)利要求3所述的黑腹果蠅中胰島素樣肽ILP系列基因表達水平檢測的試劑盒,其特征在于所述的Z溶液包括三磷酸脫氧核苷酸(dNTPs)和通用引物,所述的通用引物正向擴增引物序列為AGGTGACACTATAGAATA,如SEQ ID NO.17;反向擴增引物序列為GTACGACTCACTATAGGGA,如SEQ ID NO.18;其中通用引物正向擴增引物帶熒光標記。

5.如權(quán)利要求3所述的試劑盒的使用方法,其特征在于該方法包括以下步驟:

步驟(1)、采集黑腹果蠅的組織樣本,分離提取核酸;

步驟(2)、以核酸為模板進行RT反應(yīng)

取5-30ng/ul的核酸樣品RNA5μL,DEPC水8μL,5×RT緩沖液4μL,RT引物溶液2μL,RT酶1μL混勻后加入到96孔樣品板上進行反轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)條件:48℃1分鐘,42℃60分鐘,95℃5分鐘,4℃直至收取RT產(chǎn)物,其中反轉(zhuǎn)錄引物溶液中各RT引物濃度均為300nM,RT引物為如權(quán)利要求1所述的RT擴增引物;

步驟(3)、以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行PCR反應(yīng)

取RT產(chǎn)物8.6μL,10×PCR緩沖液2μL,25mM的氯化鎂4μL,PCR引物溶液2μL,DNA聚合酶1.4μL,Z溶液2μL混勻后加入到96孔樣品板上進行PCR反應(yīng),反應(yīng)條件:95℃2分鐘;94℃30秒鐘,60℃30秒鐘,70℃1分鐘,循環(huán)35次;70℃1分鐘;4℃直至收取PCR產(chǎn)物;其中PCR引物溶液中各PCR引物濃度均為250nM,PCR引物為如權(quán)利要求1所述的PCR擴增引物;

步驟(4)、GeXP遺傳分析儀毛細電泳分離樣品

取PCR產(chǎn)物0.2-1μL,GeXP遺傳分析儀配套的上樣緩沖液38.75μL,DNA標準品0.5μL,礦物油一滴混合均勻后加入到96孔分離液板上進行毛細電泳分離樣品,將GeXP遺傳分析儀的軟件獲得的實驗組圖譜與對照組圖譜對比,判斷基因表達的變化,并通過軟件得到表達增加或者減少的百分比。

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