本發(fā)明涉及miR-192作為特異性生物標志物在糖尿病腎病早期診斷中的應(yīng)用。

技術(shù)背景

糖尿病腎臟疾病(diabetic kidney disease，DKD)即糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)，是糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者常見的一種微血管并發(fā)癥。其造成的腎臟損害不僅累及血管、腎小球、腎小管，也累及了腎間質(zhì)部分及足細胞等幾乎所有的腎臟結(jié)構(gòu)。

目前DKD診斷的主要標準為測定24小時尿蛋白定量或者過夜時段尿微量白蛋白排泄率，然而臨床上一旦檢測到微量白蛋白尿時，腎臟實質(zhì)性損害已存在，腎小球功能將呈進行性不可逆轉(zhuǎn)的下降；并且臨床上一部分尿白蛋白處于正常范圍內(nèi)的DM患者其實已經(jīng)出現(xiàn)了腎小球濾過率的下降，腎臟病理也會發(fā)現(xiàn)DKD相關(guān)的特征性改變；臨床上現(xiàn)有的治療只能夠減慢DKD向腎功能衰竭的進程，遠遠無法逆轉(zhuǎn)其病程。因此，24小時尿微量白蛋白(24h urine microalbumin，24hUMA)對于DKD患者并非最優(yōu)選擇。目前迫切需要探尋到對于DKD早期診斷有特異性的生物標志物，這對DKD進行早期的風險評估以及對病情進展的檢測、預(yù)后的判斷有重大意義。

miRNAs是一類長度約為22個核苷酸的單鏈內(nèi)源性非編碼小分子RNA，主要在轉(zhuǎn)錄后水平對基因的表達起抑制作用。隨著其在腫瘤學(xué)界研究的深入，研究者們也逐漸將領(lǐng)域擴展至多學(xué)科、多方向，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)并證明了miRNAs參與了糖尿病及其并發(fā)癥，尤其是微血管并發(fā)癥DKD的病理生理過程中。當然目前主要的研究趨勢集中于miRNAs在腎臟組織的表達，不僅在DKD，更有一些非糖尿病腎病的腎病患者體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了其表達的變化。通過對基因表達的調(diào)控，miRNAs在自然免疫應(yīng)答及大量的細胞生物活動中如細胞周期、生長、增殖分化、凋亡中有著關(guān)鍵性的作用。此外，其在腎臟的穩(wěn)態(tài)中也同樣至關(guān)重要。在腎臟中已發(fā)現(xiàn)了大量的在其他器官中不表達或微弱表達的特異性miRNAs。有研究發(fā)現(xiàn)miR-192、miR-204、miR-215及miR-216等在腎臟中明顯高表達。這些miRNAs表達的失控使得它們在作為腎臟疾病的理解、診斷以及治療輔助上成為可貴的輔助工具。

miRNA的表達檢測技術(shù)近年來發(fā)展迅速，不僅僅有傳統(tǒng)的表達文庫克隆、Northern blot和實時熒光定量PCR(quantitativev real-time PCR，qRT-PCR)，還包括了新時代的克隆、基因芯片技術(shù)、測序法等等。研究者們最常用也是目前較為有效的便是RT-PCR，RT-PCR指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號的積聚從而實時監(jiān)測整個PCR的進程，反應(yīng)結(jié)束后通過標準曲線對位置模板進行定量分析的方法。這種方法便捷且相對準確，因此使得miRNA作為疾病的特異性生物標志物成為一種可能，且具有實際臨床意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供血清中miR-192在糖尿病腎病的早期特異性臨床診斷的應(yīng)用。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種尿液中miR-192在糖尿病腎病的早期特異性臨床診斷的應(yīng)用。

本發(fā)明的第三個目的是提供miRNA-192在診斷早期糖尿病腎病中的臨界點。

本發(fā)明的第四個目的是提供聯(lián)合血清和尿液中miRNA-192在早期糖尿病腎病特異性臨床診斷的應(yīng)用。

本發(fā)明的第五個目的是提供miR-192標志物的用途。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

一種血清中miR-192對于糖尿病腎病的早期特異性臨床診斷的應(yīng)用。

使用qRT-PCR來檢測血清中miRNA-192以診斷糖尿病腎病。

一種尿液中miR-192對于糖尿病腎病的早期特異性臨床診斷的應(yīng)用。

使用qRT-PCR來檢測尿液中miRNA-192以診斷糖尿病腎病。

提供miRNA-192診斷早期糖尿病腎病中的臨界點。

一種聯(lián)合血清和尿液中miRNA-192對于糖尿病腎病的早期特異性臨床診斷的應(yīng)用。

如上所述的miRNA標志物的用途，用于制備檢測糖尿病腎病早期診斷試劑或試劑盒。

所述診斷試劑或試劑盒包括：對miR-192具有檢測特異性的探針、基因芯片，或PCR引物。

本研究在臨床上實驗證明個體血清及尿miR-192的變化對于DKD的診斷均有較高的靈敏度及特異性。本研究同時找出miRNA-192在診斷早期DKD中的臨界點。證明了血尿聯(lián)合檢測miR-192的綜合準確率較高并顯著降低了誤診率。本發(fā)明將為臨床診斷糖尿病腎病提供一種新的診斷手段，在輔助DKD的治療以及病程監(jiān)測上有一定的潛在臨床價值。

附圖說明

圖1為miR-192在不同分組研究對象血清中表達變化。

圖2為各組血清miR-192作為糖尿病腎病診斷標準的ROC曲線。

圖3為24hUMA及miR-192分別及聯(lián)合作為腎功能損傷診斷標志物的ROC曲線。

圖4為尿液中miR-192的相對表達量變化。

圖5為尿沉渣中miR-192表達變化與血清中其變化之間的散點圖。

圖6為尿液miR-192作為檢驗變量對DKD及早期DKD的診斷。

圖7為尿miR-192與24hUMA診斷輕度腎功能損傷對比。

具體實施方案

下面結(jié)合具體實施方式，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明記載的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

我們通過隨機選取230名2型糖尿病住院患者，分組為單純DM組(n＝92，確診的T2DM患者，不合并任一糖尿病并發(fā)癥)，早期DKD組(n＝87，mogensen分期II期)，臨床DKD組(n＝51，mogensen分期III期)，設(shè)健康對照組(n＝53)，留取血清及晨尿，利用qRT-PCR分別檢測各標本miR-192的表達變化，分析其相對表達量與臨床指標關(guān)系，驗證miR192是否可以作為DKD早期診斷的特異性生物標志物。分析同一個體血清及尿液miRNA相關(guān)性以及其診斷的特異性和靈敏度，比較其與24hUMA在診斷腎功能損傷時的靈敏度以及特異性，比較單項檢測以及血尿聯(lián)合檢測腎功能損傷的診斷性能。探測其作為檢測和預(yù)后的參考價值。

我們的結(jié)果顯示血清及尿中miR-192在DKD的進程中有著顯著的變化趨勢，血清及尿液miR-192均可以作為糖尿病腎病早期診斷的特異性生物標志物，且對于腎功能損傷的診斷優(yōu)于24hUMA，尿液miR-192單項檢測可降低漏診率，血尿聯(lián)合檢測可降低誤診率。

實施例1不同分期糖尿病腎病患者血清中microRNA192的表達與臨床意義

材料與方法

1試劑

1.1病例來源

所有試驗組對象均來自于2015年7月至2016年3月在天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院就診的確診T2DM住院患者，共計230例；健康對照組對象來自于天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院空港醫(yī)院健康查體中心。單純糖尿病92例，早期腎病87例，臨床腎病51例，健康對照者53例。

1.2實驗材料

Trizol LS Reagent，氯仿(CHCl3)，焦炭酸二乙酯(DEPC)，無水乙醇，異丙醇(分析純)，Mir-X miRNA First-stand Synthesis Kit，Mir-X miRNA qRT-PCR SYBR kit，無RNA酶水(將DEPC原液用雙蒸水按照1:1000的比例進行稀釋，振搖混勻后于37℃下過夜，后高溫高壓密封備用)，75％乙醇(無水乙醇：無RNA酶水按照3:1的比例混合配制而成)。

引物設(shè)計

miRNA192序列為：5’-CUGACCUAUGAAUUGACAGCC-3’

2方法

2.1患者資料的收集

一般情況：年齡、性別、身高、體重、體重指數(shù)(body mass index，BMI)、腰圍、臀圍、腰臀比(waist-hip ratio,WHR)、糖尿病病程、收縮壓(systolic blood pressure,SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure,DBP)；

身高：用固定在垂直墻面的測定儀測量身高，并精確到0.1cm；

體重：在經(jīng)校準的磅秤上測量，受試者著室內(nèi)單衣赤腳測量，并精確到0.5kg；

計算BMI：24-27.9kg/m2為超重，≥28為肥胖；

WHR：在呼氣末用非彈性的尺子于水平位在最后一根肋骨和髂嵴之間量取腰圍，并精確到0.1cm，皮尺水平放在前恥骨聯(lián)合和背后臀大肌最凸處取臀圍，并精確到0.1cm，男性腰圍≥85cm，女性≥80cm定義為中心性肥胖；

血壓：受試者于安靜的環(huán)境休息5分鐘，未吸煙飲酒或引用咖啡，使用統(tǒng)一校準的血壓計，測坐位右側(cè)血壓，兩次取平均值，對兩次結(jié)果波動較大者測三次，取平均值。

2.2臨床指標檢測

OGTT胰島素C肽釋放實驗：受試者于采集完空腹血后，5分鐘內(nèi)口服75g葡萄糖的250-300ml糖水，于服糖第一口開始計時，于30min，60min，2h，3h分別檢測血糖、胰島素、C肽值。

腎功能：谷氨酸脫氫酶法測定血尿素氮，酶法測定肌酐；

肝功能：紫外-蘋果酸脫氫酶法測定谷草轉(zhuǎn)氨酶，紫外-乳酸脫氫酶法測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶；

糖化血紅蛋白：采用高效液相色譜層析法；

血脂：采用氧化酶法測定總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-c)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-c)；

尿白蛋白肌酐比值(urine albumin-cretinine ratio,ACR):免疫比濁法測尿微量白蛋白，肌酐酶法檢測尿肌酐，并計算二者比值；

公式計算：HOMA-IS＝1/空腹血糖*空腹胰島素；HOMA-IR＝空腹血糖*空腹胰島素/22.5；HOMA-β＝20*空腹胰島素/(空腹血糖-3.5)％。

2.3血清收集

微量白蛋白尿(早期DKD)組、大量白蛋白尿(臨床DKD)、單純糖尿病組、健康對照組空腹全血各3ml。

血清的制備：

a抽取每一位實驗對象3ml外周靜脈血入分離膠+促凝劑真空采血管，常溫或于37℃水浴箱中靜置30-60min；

b室溫或者4℃下離心1500g，持續(xù)5-10min，離心完畢后分三層，上層淡黃色清亮血清層，中間分離膠層，最底層為暗紅色血細胞層；移至超凈臺進一步操作，從而避免唾液、外界酶等污染標本。

c將取出的血清轉(zhuǎn)移至無酶的Eppendoff管中，12000g離心5分鐘，進一步棄去殘留的細胞或細胞碎片，離心溫度為4℃；移至新的無酶1.5ml凍存管中-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4血清中提取RNA

a取出-80℃凍存樣本置冰上融化，吸取200ul加入到600ulTrizol中，于振蕩器上充分混勻，所得到的勻漿于室溫(15-30℃)靜置10min，使核酸蛋白復(fù)合物充分分離；

b加入1/5體積的氯仿，即120ul氯仿，劇烈漩渦混勻15sec，并于室溫下靜置10min；

c將離心機調(diào)制4℃，12000g離心15min，可見樣品分三層：上層為無色水相(RNA溶解于其中)，中間層為紅色層(DNA溶解于其中)，下層則為有機層(為蛋白質(zhì)等有機物質(zhì))(離心結(jié)束后取樣時不可晃動或顛倒管子，防止離心后三層再次混合)；

d用200ul移液器吸取上層水相(注意避免吸取中間層)移入新的1.5ml無酶eppendoff管中，并加入等體積的異丙醇，充分混勻后，室溫下靜置25min。

e靜置結(jié)束后于4℃，12000g離心10min，棄去上清。

f加入事先配好的75％乙醇600ul，4℃，7500g離心5min。棄去上清，室溫晾干約5min，加入20ulRNAase-free ddH2O，輕輕吹打混勻，充分溶解RNA。

2.5RNA濃度和純度檢測

取提取的RNA 1ul，打開紫外分光光度計，獲取在260nm和280nm波長下的吸光度，計算二者比值，若260/280OD值處于1.8-2.1范圍，則RNA濃度大約在25-50ng/ul，則可以進行下一步實驗。

2.6cDNA的合成及實時熒光PCR

采用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis and SYBR qRT-PCR kit進行血清的miRNART-qPCR檢測：

a逆轉(zhuǎn)錄：逆轉(zhuǎn)錄體系10ul,所有操作均在冰上進行

取一0.2mlRNAase-free離心管，加入以下試劑

b逆轉(zhuǎn)錄程序

37℃ 60min

85℃ 5min

4℃ 60min

c將逆轉(zhuǎn)錄的cDNA放入-80℃存放或加入RNAase-free H2O稀釋至100ul進行下一步；

d PCR反應(yīng)體系25ul

樣本反應(yīng)

②內(nèi)參反應(yīng)

e將上述體系加入八聯(lián)管中，按下一個程序進行PCR擴增，RT-PCR程序

變性：95℃ 10sec

qPCRx40循環(huán)：95℃ 5sec

54℃ 20sec

溶解曲線：95℃ 60sec

55℃ 30sec

95℃ 30sec

每個樣本設(shè)定三個副孔，分別記錄內(nèi)參及樣本反應(yīng)的Cq值。

2.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析

根據(jù)實驗對象的臨床資料整理，所有的分類變量進行數(shù)量化賦值，并且當變量中頻數(shù)過少時，可以適當據(jù)實際情況將選項進行合并(表1)；各組miRNA的相對表達量呈偏態(tài)分布，方差不齊，因此以△Ct來衡量，進行2-△△Ct轉(zhuǎn)換，經(jīng)K-S檢驗、levene檢驗，數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布且具有方差齊性。進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)用于比較miRNA在大量蛋白尿組，微量白蛋白尿組，單純糖尿病組及正常對照組之間的表達差異。利用多元線性逐步回歸的統(tǒng)計學(xué)方法找出影響實驗指標的獨立因素，miRNAs與臨床指標或者是臨床特征之間的聯(lián)系在排除了相關(guān)因素干擾后選用Pearson相關(guān)分析計量資料，spearman相關(guān)分析計數(shù)資料，并繪制受試者工作曲線(Received Operating Characteristic Curve，ROC)，采用二元logistics回歸構(gòu)建聯(lián)合模型。檢測方法的分析采用配對Х2檢驗。所有的數(shù)據(jù)均采用SPSS21.0和GraphPad Prism5軟件進行數(shù)據(jù)分析以及圖像處理，所有統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)概率檢驗，P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)差異，P<0.01為差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。計量資料以均數(shù)±標準差或中位數(shù)表示，計數(shù)資料以百分率表示。

表1分類變量量化賦值表

2.8結(jié)果

2.8.1各組一般臨床資料的比較

四組研究對象間年齡、性別分布、BMI、SBP、UA、HDL-c、LDL-c等指標間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；隨著DKD的進展，病程、UMA、BUN、sCR、FIns、HOMA-IS、HOMA-IR呈梯度增高趨勢(P<0.05)；而HOMA-β呈逐漸下降趨勢；WHR、FBG、HbA1C、TG、ACR在研究組3組中相對于正常對照組均增高，但在臨床DKD組以及早期DKD組之間差異并無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；TC在DM組及早期DKD組中升高明顯，而相較于臨床DKD組患者，并無差異(見表2)。

表2各組間一般臨床資料檢查結(jié)果比較(x±s)

(注：^＊p<0.05，^＊＊p<0.01，VS健康對照組；^△p<0.05，^△△p<0.01，VS DM組；^#p<0.05，^##p<0.01，VS早期DKD組。)

2.8.2各組miR-192表達水平比較

與健康對照組相比較，血清miR-192的表達水平在臨床DKD組、早期DKD組、DM組中均下降，且臨床DKD組相較于早期DKD組及DM組下降尤為明顯，以及早期DKD組較DM組表達的降低，均具統(tǒng)計學(xué)意義(均p<0.05)(結(jié)果見表3，圖1)。

表3血清miR-192的檢測結(jié)果(x±s)

(注：p^＊<0.05，vs健康對照組；p^△<0.05，vs DM組；p^#<0.05，vs早期DKD組。)

2.8.3miR-192與臨床指標的相關(guān)性分析

利用Pearson及Spearman相關(guān)分析得到，miR-192的表達水平與DKD組患者年齡、性別、吸煙、BMI、TC、HDL-c、LDL-c、HOMA-IS無相關(guān)關(guān)系；與HOMA-IS呈正相關(guān)(r＝0.264,p<0.01)；與飲酒、病程、WHR、HbA1C、SBP、TG、Fins、HOMA-IR、HOMA-β呈負相關(guān)(r＝-0.045，-0.364，-0.118，-0.249，-0.390，-0.376，-0.155，-0.404，-0.233，-0.360，均p<0.01)。在腎功能評估相關(guān)指標中，miR-192與sCR、BUN、ACR及UMA均呈負相關(guān)(r＝-0.163，-0.159，-0.242，-0.233，均p<0.05)。(結(jié)果見表4)

表4 miR-192與一般資料及糖、脂代謝的偏相關(guān)分析

(注：#Spearman相關(guān)性分析，其他指標采用Pearson相關(guān)分析；ACR＝尿蛋白/尿肌酐(ug/mg)*P<0.05，**P<0.01。)

2.8.4多元線性逐步回歸分析探討影響DKD患者miR-192的相關(guān)因素

以miR-192作為因變量，并且將體內(nèi)與其相關(guān)因素：病程、WHR、SBP、TG、FIns、HbA1C、HOMA-IR、sCR、BUN、ACR及UMA作為自變量作多元逐步回歸分析，經(jīng)分析SBP、FIns最后進入方程(r²＝0.152,0.282,P<0.01),是影響miR-192在體內(nèi)表達量的獨立危險因素。(見表5)

表5多元線性逐步回歸分析miR-192的相關(guān)因素

(注：因變量：miR-192)

2.8.5血清miR-192對于早期糖尿病腎病患者的診斷價值

在臨床工作中，患者的實際情況遠遠比理論上復(fù)雜，即便是24hUMA正常的患者仍然無法排除DKD的可能，并且糖尿病前期患者也有發(fā)生DKD的概率，而從眾多DKD或非DKD中挑選出DKD早期的患者更加困難。因此，亟待一種更有效更靈敏的檢測手段。本研究該部分則將四組研究對象重新分組為A組：T2DM組+健康對照組，B組：DKD+非DKD組，C組：臨床DKD組+非臨床DKD組，D組：早期DKD組+無DKD組，E組：臨床DKD組+早期DKD組。通過這五種組合模擬實際工作中的臨床環(huán)境，建立Logistics回歸模型后進行ROC曲線的擬合。

縱坐標為敏感性，而橫坐標為假陽性率(1-特異性)，分別繪制miR-192的ROC曲線，通過ROC曲線下面積(ROC-AUC)大小判斷血清miR-192的診斷效果，其面積一般在0.5-1.0之間。AUC≤0.7時表明診斷價值較低；0.7<AUC≤0.9時則診斷價值中等，當AUC>0.9時則診斷價值較高。并根據(jù)約登指數(shù)找出miR-192達到靈敏度及特異性最高的截斷點。根據(jù)建立的logistics回歸模型計算血清miR-192診斷DKD時的AUC，在A組從所有研究人群中為診斷出T2DM的AUC-ROC為0.939(95％CI：0.886-0.993)；B組從研究對象中診斷出DKD的AUC-ROC為0.765(95％CI：0.695-0.836)；C組，從人群中發(fā)現(xiàn)臨床DKD患者的AUC-ROC為：0.784(95％CI：0.701-0.867)；當去除臨床DKD患者，在人群中篩選早期DKD的D組AUC-ROC結(jié)果顯示：0.716(95％CI：0.627-0.804)，并且在臨床DKD及早期DKD鑒別出兩者的E組ROC曲線結(jié)果顯示為0.661(95％CI：0.539-0.783)。(見圖2，表6)

表6血清miR-192對不同組別中糖尿病腎病的診斷效能(％)

(注：YI：約登指數(shù)(Youden index)＝靈敏度+特異度-1。)

2.8.6miR-192在腎功能受損不同程度的表達變化

將研究對象按eGFR分組，即腎不顯損傷組(eGFR>90ml/min/1.73m²)-A組、腎功能輕度受損組(60ml/min/1.73m²<eGFR≤90ml/min/1.73m²)-B組、腎功能中度受損組(eGFR<60ml/min/1.73m²)-C組。發(fā)現(xiàn)血清miR-192的檢測量隨著eGFR的下降而顯著降低，呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r＝0.423,p<0.01)，而24hUMA與GFR的相關(guān)性結(jié)果分析顯示其呈負相關(guān)關(guān)系(r＝-0.406,p<0.01)。(見表7)

表7 24小時尿蛋白及血清miR-192在腎功能損傷不同組別中的比較

(注：aP<0.01，vs A組；bP<0.01，vs B組。)

以eGFR<90ml/min/1.73m²作為腎功能損傷的診斷標準，縱坐標為敏感性，而橫坐標為1-特異性,分別建立二者對于腎功能損傷診斷的ROC曲線，結(jié)果表明miR-192和24hUMA的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.780(95％CI：0.712-0.847)和0.730(95％CI：0.651-0.809)，miR-192的診斷價值高于24hUMA，并且當分別作為腎功能輕度受損檢驗指標時，miR-192的敏感性為55.8％、特異性為88.7％，而24hUMA的敏感性與特異性分別為64.5％及77.9％，miR-192的準確性要高于24hUMA，證明其在對于腎功能損傷的診斷中價值高于24hUMA。為增加指標的診斷準確性，我們采用二元logistic回歸模型來評估兩者聯(lián)合診斷腎功能受損的能力，結(jié)果顯示AUC得到面積為0.804(95％CI：0.739-0.870)。診斷效能高于二者單獨作為診斷指標。(見圖3)

實施例2不同時期糖尿病腎病患者尿液中miRNA-192表達情況及其在同一個體與血液中表達相關(guān)性

1試劑

1.1病例來源

所有試驗組對象均來自于2015年7月至2016年3月在天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院就診的確診T2DM住院患者共計230例；健康對照組對象來自于天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院空港醫(yī)院健康查體中心。

觀察組、對照組的分組同第一部分。

1.2實驗材料

miRcute miRNA isolution kit，miRcute miRNA first-stand cDKDA synthesis kit，miRcute miRNA qPCR detection kit(SYBR Green)

其余試劑及儀器設(shè)備、引物設(shè)計均同實施例1。

2方法

2.1患者資料的收集

一般情況：性別、年齡、身高、體重、BMI、腰圍、臀圍、WHR、糖尿病病程、SBP、DBP；臨床指標的檢測同實施例1。

2.2患者尿液及血液收集

取臨床DKD組、早期DKD組、DM組、健康對照組空腹晨起第一次尿液中段尿30ml(空腹為至少8小時以上未任何有熱量我的食物或飲料)。

尿沉渣的獲?。?/p>

a取實驗對象30ml晨起第一次中段尿于50ml離心管中；

b室溫或者4℃下3000g，離心5-10min，棄去上清；

c 4℃12000離心5min，棄上清，獲得尿沉渣。

血清的制備：

a抽取每一位實驗對象3ml外周靜脈血入分離膠+促凝劑真空采血管，常溫或于37℃水浴箱中靜置30-60min；

b室溫或者4℃下離心1500g，持續(xù)5-10min，離心完畢后分三層，上層淡黃色清亮血清層，中間分離膠層，最底層為暗紅色血細胞層；移至超凈臺進一步操作，從而避免唾液、外界酶等污染標本。

c將取出的血清轉(zhuǎn)移至無酶的Eppendoff管中，12000g離心5分鐘，進一步棄去殘留的細胞或細胞碎片，離心溫度為4℃；移至新的無酶1.5ml凍存管中-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3尿沉渣中提取總RNA

a尿沉渣中加入1ml裂解液MZ，振蕩器震蕩或移液器吹打幾次混勻；

b將勻漿樣品室溫下放置5min，使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離；

c 4℃，12000rpm(約13400g)離心5min，樣品分三層：黃色的有機相，中間層和無色的水相，RNA主要存在于水相中，體積約為所用裂解液MZ試劑的50％；

d取上層水相(注意避免吸取中間層)移入另一干凈的1.5ml無酶EP管中，緩慢加入轉(zhuǎn)移液體積1.5倍的無水乙醇，充分混勻(此時可能出現(xiàn)沉淀)，將得到的溶液以及沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱miRspin中，室溫12000rpm(13400g)離心30sec，棄去廢液；

e向吸附柱miRspin中加入500ul去蛋白液MRD(使用前確保已加入試劑說明量的無水乙醇)，室溫放置2min，室溫12000rpm(13400g)離心30sec，棄廢液；

f向吸附柱miRspin中加入500ul漂洗液(使用前確保已加入試劑說明量的無水乙醇)，室溫靜置2min，室溫12000rpm(13400g)離心30sec，棄廢液；

g重復(fù)操作f；

h將吸附柱miRspin放入2ml收集管中，室溫12000rpm(13400g)離心1min去除殘余液體；

i將吸附柱miRspin轉(zhuǎn)入一個新的RNase-free 1.5ml的EP管中，加入30-100ul RNase-free ddH₂O，室溫放置2min，室溫12000rpm(13400g)離心2min。

2.4RNA濃度和純度檢測

同實施例1。

2.5cDNA的合成及實時熒光PCR

a miRNA3’末端進行加poly(A)處理

a)在冰上預(yù)冷RNase Free的反應(yīng)管內(nèi)加入以下試劑至總體積20ul(最后加入E.coli Poly(A)Polymerase)；

b)移液器輕輕混勻上述配制的反應(yīng)，短暫離心后在37℃反應(yīng)60min。所得到反應(yīng)液可以直接進行下游實驗，也可以放置-20℃短暫保存；

b Poly(A)修飾的miRNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

a)按照下表組分進行反應(yīng)液的配制：

b)移液器輕輕混勻上述配制的反應(yīng)液，短暫離心后在37℃反應(yīng)60min，合成的cDNA反應(yīng)液可放置-20℃保存，也可以直接進行下游熒光定量檢測；

c室溫融化2X miRcute miRNA Premix和Reverse Primer；

d將2X miRcute miRNA Premix上下顛倒輕輕混勻，避免起泡，并輕輕微離心后使用；

e將試劑置于冰上，按照下表配制反應(yīng)體系：

f將上述體系加入八聯(lián)管中，按下一個程序進行PCR擴增，RT-PCR程序

變性：94℃ 2min

qPCRx40循環(huán)：94℃ 20sec

54℃ 34sec

溶解曲線：95℃ 60sec

55℃ 30sec

95℃ 30sec

每個反應(yīng)重復(fù)三次，使用固定的閾值記錄反應(yīng)的Cq值。

2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析

One-Way ANOVA用于比較miRNA在NC組、DM組、早期DKD組及臨床DKD組之間的表達差異。Pearson相關(guān)分析計量資料，spearman相關(guān)分析計數(shù)資料，利用多元線性逐步回歸統(tǒng)計學(xué)方法找出影響實驗指標的獨立因素，繪制ROC曲線比較各指標的診斷準確性，配對Χ²檢驗分析技術(shù)資料。所有的數(shù)據(jù)均采用SPSS21.0和GraphPad Prism5軟件進行數(shù)據(jù)分析以及圖像處理，所有統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)概率檢驗，P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)差異，P<0.01為差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。計量資料以均數(shù)±標準差或中位數(shù)表示，計數(shù)資料以百分率表示。

2.7結(jié)果

2.7.1糖尿病腎病進展中尿miR-192的表達變化分析

隨著DKD的進展，miR-192的表達變化在糖尿病及臨床DKD組(均值＝15.13±1.17)明顯高于正常對照組(均值＝1.21±0.15)，而隨著尿蛋白的逐漸增多，miR-192的檢測表達呈明顯上升趨勢，且具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。(見表8，圖4)

表8尿液miR-192的表達變化

(注：^*p<0.05，vs健康對照組；^△p<0.05，vsDM組；^#p<0.05，vs早期DKD組)

2.7.2尿沉渣中miR-192表達變化量的相關(guān)性分析

以性別、年齡作為協(xié)變量，對其進行偏相關(guān)分析得到，尿miR-192的含量變化與病程、糖代謝指標如HbA1C、胰島素作用指標如HOMA-IR呈顯著正相關(guān)(r＝0.552,0.287,0.326,均p<0.05)，并且其與血液中miR-192的表達變化呈負相關(guān)(r＝-0.-0.512,p<0.01)。(見圖5，表9)

表9尿miR-192與一般臨床指標相關(guān)性

2.7.3尿miR-192作為糖尿病腎病早期診斷指標

以尿液中miR-192的含量作為檢測指標時，將入選研究對象分為A組：正常對照及T2DM組；B組：DKD及非DKD組；C組：臨床DKD組及非臨床DKD組；D組：早期腎病及非DKD組，E組：臨床DKD及早期DKD組。在診斷正常對照及糖尿病患者得到AUC-ROC為0.982(95％CI：0.962-1.000)，而在區(qū)分出現(xiàn)蛋白尿的糖尿病患者及無蛋白尿人群時AUC-ROC為：0.884(95％CI：0.812-0.956)，其靈敏度與特異性分別為90.6％及77.3％，截點取其變化倍數(shù)5.5147；在大量蛋白尿組糖尿病患者時其AUC為0.812(95％CI：0.729-0.894)，取9.3778作為診斷截點時，其靈敏度及特異度分別為96.2％和59.8％，在糖尿病患者及正常人群中篩選出微量白蛋白尿患者的AUC-ROC為0.862(95％CI：0.779-0.944)，當取臨界值4.1065時，約登指數(shù)最大為65.6％，靈敏度與特異性分別為97.4％及68.2％。(見圖6，表10)

表10尿液miR-192對不同組別中糖尿病腎病的診斷效能(％)

2.7.4尿miR-192與24hUMA分別作為腎功能損傷診斷指標的效能對比

將研究對象按eGFR分組，即腎不顯損傷組(eGFR>90ml/min/1.73m²)、腎功能輕度受損組(60ml/min/1.73m²<eGFR≤90ml/min/1.73m²)、腎功能中度受損組(eGFR<60ml/min/1.73m²)。發(fā)現(xiàn)尿液miR-192的檢測量隨著eGFR的下降而顯著升高，呈顯著負相關(guān)關(guān)系(r＝-0.637,p<0.01)，24hUMA與GFR的相關(guān)性結(jié)果分析顯示其呈負相關(guān)關(guān)系(r＝-0.537,p<0.01)(見表11)。

表11 24hUMA及尿miR-192在腎功能損傷不同組別中的比較

以eGFR<90ml/min/1.73m²作為腎功能損傷的診斷標準，縱坐標為敏感性，而橫坐標為1-特異性,分別建立二者對于腎功能損傷診斷的ROC曲線，結(jié)果表明miR-192和24hUMA的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.841(95％CI：0.768-0.914)和0.800(95％CI：0.713-0.887)，尿miR-192的診斷效能高于24hUMA。(見圖7)

2.7.5smiR-192、umiR-192單項檢測及聯(lián)合檢測腎功能損傷的診斷性能比較

單項檢測腎功能損傷時，umiR-192敏感性較高，smiR-192特異性較高，綜合兩者診斷性能比較，umiR-192敏感性為97.4％，特異性為49.3％，陽性預(yù)測值為52.1％，陰性預(yù)測值為97.1％，是最佳的腎功能損傷單項診斷指標。而同時聯(lián)合檢測該兩項指標時，可以大大提高特異性81.2％，從而減小假陽性率，提高其陽性預(yù)測值66.7％以及陰性預(yù)測值81.2％，但敏感度有所下降66.7％。各項指標趨于平衡。(見表12)

表12 smiR-192及umiR-192單項及聯(lián)合檢測對腎功能損傷的診斷性能評估(％)

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。