專利名稱：一種人心肌肌鈣蛋白i合成肽段s的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可用于產(chǎn)生和篩選針對(duì)人心肌肌鈣蛋白I某一特殊抗原決定簇抗原表位的高效抗血清和高度特異性單克隆抗體的多肽，以及該多肽的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
心肌缺血性損傷，特別是急性心肌梗塞(AMI)是威脅人類生命的主要疾病之一，人們一直在努力尋找對(duì)AMI診斷特異性好、靈敏度高的指標(biāo)。隨著對(duì)心肌標(biāo)志物的深入研究，生化標(biāo)志物已從早先的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、血清乳酸脫氫酶(LD)及同工酶、肌酸激酶(CK)及同工酶發(fā)展到目前的多種早期標(biāo)志物(如肌紅蛋白等)和特異性標(biāo)志物(心肌肌鈣蛋白)，診斷的敏感性、特異性更趨增強(qiáng)。
心肌肌鈣蛋白I(cTnI)是心肌僅有的的特異抗原，作為心肌細(xì)胞損傷的標(biāo)志，在血循環(huán)中的高度特異性和和敏感性，越未越受到人們的關(guān)注。1994～1995年cTnT、cTnI分別被美國FDA批準(zhǔn)用于臨床AMI診斷。cTnI已用于急診室對(duì)胸痛的鑒別診斷，它的釋放形式與CK-MB(胸痛4～6小時(shí))相似，但cTnI水平升高持續(xù)時(shí)間(6～10天)比CK-MB明顯要長，特別是那些在出現(xiàn)AMI癥狀后沒有立即就診的病人更為有用。
cTnI為一具有209個(gè)氨基酸的多肽，相對(duì)分子量為24000，預(yù)測的pI約為10。兩種骨骼肌肌鈣蛋白(ssTnI和fsTnI)的分子量約為20KD。利用計(jì)算機(jī)程序?qū)TnI蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測的結(jié)果顯示，cTnI是一種含5個(gè)a螺旋的蛋白質(zhì)。結(jié)合抗原表位實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以推測cTnI不是球蛋白，其蛋白質(zhì)肽鏈可能采取一種更為伸展的構(gòu)想，這種結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子，其大部分序列都具有抗原性，可以被免疫系統(tǒng)識(shí)別。cTnI全蛋白的免疫原性很弱，增加了利用cTnI蛋白制備多克隆和單克隆抗體的難度，而且利用全蛋白制備的單克隆抗體可以是針對(duì)很多表位的。cTnI本身生化性質(zhì)的復(fù)雜性和在患者外周血的存在形式，使得cTnI檢測試劑的測定值之間存在著差異，不同的cTnI分析方法對(duì)同一份標(biāo)本的檢測值最大可相差20余倍。美國臨床病理學(xué)會(huì)(CAP)在1997年對(duì)檢測cTnI的Access、OpusPlus和Stratus三個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)平均cTnI濃度由于使用的分析系統(tǒng)差異而有實(shí)質(zhì)性的不同。Access的測定值最低，有些甚至比OpusPlus結(jié)果低20倍。造成對(duì)同一份樣品測量差異的原因之一是試劑盒中提供的抗體識(shí)別不同的決定簇，另一個(gè)更重要的因素就是試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)抗原存在很大的差異。Stratus和Opus抗體識(shí)別cTnI的N末端部分，而ACCESS的抗體識(shí)別cTnI的C末端部分。應(yīng)用對(duì)cTnI的N末端部分和C末端部分特異的單抗，對(duì)加有重組cTnI的正常人血清和加有重組cTnI復(fù)合物的正常人血清，在37℃分別孵育2、4、6、24和48小時(shí)后，進(jìn)行westerm blot分析的結(jié)果表明，cTnI的C末端部分更易被降解。這也可能是造成這三種測定方法之間變異的主要原因之一。美國臨床化學(xué)學(xué)會(huì)最近研究分析了10種cTnI標(biāo)準(zhǔn)品，但是它們都不令人滿意。這使得各種方法的參考范圍、分析干擾、分析變異、診斷窗口期以及診斷和預(yù)后的臨界值等出現(xiàn)不同程度的差別，給臨床應(yīng)用和評(píng)價(jià)帶來一定困擾。在使用商品cTnI檢測試劑盒時(shí)，必須研究商品試劑的特性。所以cTnI缺乏測定標(biāo)準(zhǔn)化是一個(gè)很重要問題。cTnI蛋白質(zhì)大部分序列均具有抗原性，其中N末端和C末端的抗原性最強(qiáng)。cTnI與sTnI的氨基酸序列約有40％不同。另外人cTnI氨基末端有32個(gè)氨基酸殘基為骨骼肌肌鈣蛋白(sTnI)所不具有，因此抗原性有較大差異，有利于獲得特異性cTnI抗體。
cTnI在血清中很不穩(wěn)定，易被蛋白酶降解，在AMI病人中90％cTnI以上以cTnI-TnC復(fù)合物形式存在，并且N-端和C-端則對(duì)蛋白水解酶作用敏感易受蛋白水解酶作用，在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)迅速降解。雖然人cTnl氨基末端和竣基末端是最強(qiáng)的抗原表位區(qū)，但這個(gè)區(qū)域?qū)ρ趸⑦€原和磷酸化也較為敏感，還易被內(nèi)源性蛋白水解酶水解，不同的狀態(tài)具備不同的免疫活性。由于TnC的保護(hù)，最穩(wěn)定區(qū)域在28～110氨基酸殘基之間，能夠識(shí)別這段穩(wěn)定區(qū)的抗體可以提高cTnI檢測的敏感性和可重復(fù)性，有助于提高cTnI檢測的標(biāo)準(zhǔn)化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可提高cTnI檢測的敏感性和可重復(fù)性的心肌肌鈣蛋白的合成肽段。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是篩選針對(duì)該肽段的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，用于制備心肌肌鈣蛋白檢測試劑盒。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的1.多肽序列的選擇利用DNA-Star分析軟件對(duì)cTnI蛋白序列分析其抗原性、疏水性、柔韌性、表面可及性，又結(jié)合cTnI蛋白的生化性質(zhì)及其在血清中的存在狀態(tài)，以及人心肌肌鈣蛋白I(cTnI)與骨骼肌肌鈣蛋白(ssTnI和fsTnI)序列的差異，人心肌肌鈣蛋白I與小鼠的心肌肌鈣蛋白I序列的差異，我們選擇了第28-42AA的一段氨基酸序列，記為SEQ NO.1。序列如下AYATEPHAKKKSKIS2.多肽合成方法
考慮到多肽的穩(wěn)定性，本發(fā)明在合成時(shí)使N-端Ala乙酰化，在C-端Ser后加上一個(gè)Cys，記為S28-42。序列如下CAYATEPHAKKKSKIS-NH2該序列具有如下應(yīng)用1)替代人天然心肌肌鈣蛋白I作為免疫原，并具有比心肌肌鈣蛋白I全抗原更高的免疫原性，有利于針對(duì)cTnI抗原決定簇的高效抗血清的產(chǎn)生。
2)有利于針對(duì)cTnI抗原決定簇的特異性單克隆抗體細(xì)胞株的產(chǎn)生。
3)用于篩選針對(duì)cTnI的單克隆抗體細(xì)胞株。
4)將多肽S28-42與其他蛋白質(zhì)進(jìn)行化學(xué)交連或基因工程表達(dá)而用作抗原，進(jìn)行免疫動(dòng)物以制備抗體以及作為檢測cTnI的對(duì)照物。
本發(fā)明提供的特殊多肽序列S28-42與天然的人心肌肌鈣蛋白I的抗原決定簇結(jié)構(gòu)相似，具有強(qiáng)的免疫原性和免疫反應(yīng)性，用該肽S28-42免疫制備的抗體可檢測到cTnI降解后殘留在血清中相似的肽段，以該肽段制備的試劑對(duì)心肌損傷所釋放出的cTnI的檢出水平更高、重復(fù)性更好，并且該肽段可以代替cTnI蛋白作為抗原，以避免cTnI全蛋白作為免疫原的弱免疫原性。
具體實(shí)施例方式
1.采用合成肽S28-42和載體蛋白偶聯(lián)的MBS(間-馬來酰亞胺苯甲酸-N-羥基琥珀酰亞胺脂)法，由于S28-42與人的骨骼肌肌鈣蛋白以及小鼠心肌肌鈣蛋白序列的差異，免疫BALB/c小鼠后取得較高的免疫效果。具體方法如下1)間-馬來酰亞胺苯甲酸-N-羥基琥珀酰亞胺脂(MBS)配制成5mg/ml的二甲基甲酰胺(DMF)，用前一小時(shí)內(nèi)配制。
2)匙孔戚血藍(lán)蛋白(KLH)10mg溶解于1ml去離子水中。
3)1ml KLH溶液放入小試管中，加入溶有2mg MBS的DMF溶液140ul。室溫?cái)嚢?0min。過G-25柱(PBS，PH7.4)，收集灰色產(chǎn)物。5mg多肽溶于不大于0.5ml的PH7.4的PBS(0.01mol/L)中。二者混合，室溫?cái)嚢?小時(shí)。4℃透析過夜，分裝-20℃保存。用該合成肽S28-42免疫BALB/c小鼠，ELISA檢測，得到的小鼠抗血清效價(jià)高達(dá)106。
2.由于S28-42與人骨骼肌肌鈣蛋白序列的差異，用S28-42篩選得到的針對(duì)該段序列的單克隆抗體在試劑檢測中可以很大程度的避免與骨骼肌肌鈣蛋白的交叉反應(yīng)。
用S28-42篩選得到的針對(duì)該段序列的單克隆抗體通過ELISA方法分別對(duì)心肌肌鈣蛋白I與骨骼肌肌鈣蛋白進(jìn)行檢測，交叉反應(yīng)率小于0.01％。說明由S28-42篩選得到的單克隆抗體可以用于制備心肌肌鈣蛋白檢測試劑盒，在檢測試劑盒的開發(fā)中具有應(yīng)用價(jià)值。
3.用S28-42篩選得到的特異性單克隆抗體能夠識(shí)別病人血清中心肌肌鈣蛋白I穩(wěn)定存在的區(qū)段，可以有助于分析病人發(fā)病階段和程度。
權(quán)利要求
1.一段合成肽序列S28-42，其特征在于選自人心肌肌鈣蛋白I的第28-44的氨基酸片斷，其氨基酸序列為CAYATEPHAKKKSKIS-NH2。
2.按權(quán)利要求1所述的合成肽段S28-42的應(yīng)用，其特征在于用于篩選針對(duì)上述肽段序列的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，并用于制備心肌肌鈣蛋白檢測試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可用于人心肌損傷檢測的合成肽段S
文檔編號(hào)C07K7/00GK1660893SQ20041009346
公開日2005年8月31日 申請(qǐng)日期2004年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月23日
發(fā)明者朱乃碩, 黃應(yīng)峰 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)