專利名稱：一種檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼rna-hotairm1的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種人長(zhǎng)鏈非編碼RNA-H0TAIRM1檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
長(zhǎng)鏈非編碼RNA (IncRNA)是一類長(zhǎng)度大于200核苷酸的RNA分子，不具備編碼蛋白質(zhì)的功能的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；最初被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物， 不具有任何生物學(xué)功能。然而哺乳動(dòng)物整個(gè)基因組普遍轉(zhuǎn)錄成轉(zhuǎn)錄本，但這些轉(zhuǎn)錄本中僅有很小一部分為編碼蛋白質(zhì)的mRNA，大部分為非編碼RNA。非編碼RNA包括結(jié)構(gòu)RNA (如 tRNA、rRNA和snRNA)、近年來(lái)成為研究熱點(diǎn)的調(diào)節(jié)RNA (microRNA和siRNA)，以及最近科學(xué)界關(guān)注的IncRNA ；在這些非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本中IncRNA占近80%，而且許多IncRNA具有 mRNA樣結(jié)構(gòu)，經(jīng)過(guò)剪切加工具有PolyA尾樣結(jié)構(gòu)，分化過(guò)程中出現(xiàn)動(dòng)態(tài)表達(dá)和不同的剪切形式，呈現(xiàn)出時(shí)間特異和空間特異的表達(dá)方式，這些現(xiàn)象表明IncRNA的表達(dá)與降解在生物體內(nèi)有著精細(xì)的調(diào)控機(jī)制。因此，IncRNA作為轉(zhuǎn)錄“噪音”和副產(chǎn)物的假說(shuō)應(yīng)該重新思考， IncRNA表達(dá)不僅在胚胎干細(xì)胞分化過(guò)程中特征性表達(dá)，而且在腦細(xì)胞中存在特定的亞細(xì)胞定位，同時(shí)這些IncRNA表達(dá)存在組織器官特異性。盡管僅有一小部分長(zhǎng)鏈非編碼RNA功能被闡釋，但可以推測(cè)IncRNA通過(guò)某種機(jī)制參與了各種生物學(xué)功能，通過(guò)表觀遺傳學(xué)修飾、 轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控以及剪切拼接控制細(xì)胞周期、分化和凋亡等發(fā)揮生物學(xué)作用。顯而易見(jiàn)， IncRNA必定與疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制密切相關(guān)，目前已經(jīng)有報(bào)道表明腫瘤中存在差異表達(dá)的IncRNA，例如乳腺癌中HOTA^表達(dá)升高，MALAT在肺癌和結(jié)直腸癌中過(guò)表達(dá)以及肝癌中 HULC水平上升等。H0TAIRM1是最近發(fā)現(xiàn)的位于HOXAl和H0XA2基因間的長(zhǎng)鏈非編碼RNA， 可能與造血系統(tǒng)中髓系細(xì)胞的發(fā)育和分化有關(guān)，而且在胎腦中也檢測(cè)除其表達(dá)，并參與神經(jīng)分化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA-H0TAIRM1的方法，是根據(jù)長(zhǎng)鏈非編碼RNA-H0TAIRM1的基因序列以及內(nèi)參基因GAPDH的基因序列設(shè)計(jì)并合成外側(cè)引物、內(nèi)側(cè)引物和熒光探針，并利用這兩套引物和探針特異性檢測(cè)H0TAIRM1在血漿中的相對(duì)表達(dá)。本發(fā)明采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA-H0TAIRM1，主要包括特異性外側(cè)引物、內(nèi)側(cè)引物和熒光探針、逆轉(zhuǎn)錄試劑和熒光PCR試劑，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)
(1)采用RNA抽提試劑提取組織和血漿中總RNA，DNaseI去除基因組DNA后采用逆轉(zhuǎn)錄試劑進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA ；
(2)分別以H0TAIRM1和GAPDH的外側(cè)引物按照以下PCR反應(yīng)體系配制反應(yīng)液1XPCR buffer,0. 1 μ M的外側(cè)上下游引物引物、IU的DNA聚合酶、0. 2mM的dNTPs，取2 μ L的cDNA 模板，反應(yīng)體積為20yL ；按照95°C變性5分鐘，95°C 30秒、55°C 30秒，72°C 30秒進(jìn)行15 個(gè)循環(huán)預(yù)擴(kuò)增。(3)取2. 0 μ L預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物加入如下PCR反應(yīng)液中1 XTaqMan通用PCR緩沖液，0. 2 μ M的內(nèi)側(cè)上下游引物引物和0. 1 μ M的熒光探針，反應(yīng)體積為10 μ L ；按照95°C變性2 分鐘，95°C 15秒、60°C 1分鐘，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；
(4)根據(jù)熒光曲線讀取Ct值，按照下述公式計(jì)算H0TAIRM1的相對(duì)表達(dá)量H0TAIRM1相對(duì)表達(dá)量=2 ( Δ Ct=Ct hotaieu — Ct GAPDH)o所述特異性內(nèi)外側(cè)引物和熒光探針的序列分別如下 H0TAIRM1外側(cè)引物
outer-hotiarml-F GCTGGAGCGAAGAAGAGCAA, outer-hotiarml-R CAAACACCCACATTTCAACCC ； H0TAIRM1內(nèi)側(cè)引物
inner-hotiarml-F GAACTGGCGAGAGGTCTGTTTT, inner-hotiarml-R CCCCATAAATCCCTCCACATT ； H0TAIRM1熒光探針
hotiarml-probe FAM-CCTGAACCCATCAACAGCTGGGAGA-TAMRA。GAPDH外側(cè)引物 outer-gapdh-F GGCGCTGAGTACGTCGTGGA, outer-gapdh-R GTGGTGCAGGAGGCATTGCTGAT ； GAPDH內(nèi)側(cè)引物
inner-gapdh-F GCGTCTTCACCACCATGGA, inner-gapdh-R TGGTTCACACCCATGACGAA ； GAPDH熒光探針為
hotiarml-probe FAM-CCTGAACCCATCAACAGCTGGGAGA-TAMRA。其中FAM為熒光報(bào)告基團(tuán)，TAMRA為熒光淬滅基團(tuán)。為了證實(shí)本發(fā)明建立的檢測(cè)血漿H0TAIRM1相對(duì)表達(dá)方法的有效性和實(shí)用性， 本發(fā)明檢測(cè)了結(jié)直腸癌患者腫瘤組織和血漿中H0TAIRM1相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明該方法能夠有效地檢測(cè)組織和血漿中H0TAIRM1的相對(duì)表達(dá)水平；而且在結(jié)直腸癌腫瘤組織中 H0TAIRM1水平明顯低于正常對(duì)照組織；結(jié)直腸癌患者血漿H0TAIRM1水平也明顯低于正常對(duì)照組，將血漿中H0TAIRM1水平的cutoff值定在0. 003，則其診斷結(jié)直腸癌的靈敏度為 61. 46%，特異性為80. 30%, ROC曲線分析后AUC值為0. 780。以上結(jié)果表明在組織中的低表達(dá)以及血漿中的低水平H0TAIRM1可能成為新的結(jié)直腸癌診斷標(biāo)志物。本發(fā)明關(guān)鍵在于特異性內(nèi)側(cè)引物和熒光探針序列的設(shè)計(jì)，該檢測(cè)方法中其他組成均為本領(lǐng)域常規(guī)試劑，采用該方法對(duì)血漿中H0TAIRM1進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)。本發(fā)明提供的方法，通過(guò)設(shè)計(jì)H0TAIRM1特異性內(nèi)側(cè)引物和熒光探針序列，建立了檢測(cè)血漿H0TAIRM1相對(duì)表達(dá)方法，經(jīng)過(guò)研究，結(jié)果表明H0TAIRM1在正常結(jié)直腸粘膜組織中呈陽(yáng)性表達(dá)，而且在胃癌組織和胃癌患者血漿中卻表現(xiàn)為低表達(dá)，這些現(xiàn)象表明H0TAIRM1 可能做為結(jié)直腸癌診斷的新的腫瘤標(biāo)志物，證實(shí)該方法具有實(shí)用性和有效性，對(duì)進(jìn)一步研究H0TAIRM1在腫瘤中的表達(dá)和建立準(zhǔn)確特異檢測(cè)方法具有重要的意義。


圖1為使用該方法檢測(cè)組織中GAPDH的熒光曲線。
圖2為使用該方法檢測(cè)組織中H0TAIRM1的熒光曲線。圖3為使用該方法檢測(cè)血漿中GAPDH的熒光曲線。圖4為使用該方法檢測(cè)血漿中H0TAIRM1的熒光曲線。圖5為在109例結(jié)直腸癌組織中H0TAIRM1的表達(dá)明顯低于配對(duì)正常組織， P=Q. (^67。圖6為55例結(jié)腸癌中有43例癌組織H0TAIRM1低表達(dá)，54例直腸癌中有41例癌組織H0TAIRM1低表達(dá)。圖7為結(jié)直腸癌患者血漿中H0TAIRM1水平，在150例結(jié)直腸癌患者血漿H0TAIRM1 水平也明顯低于和101例健康者的水平，/X0. 001。圖8為150例結(jié)直腸癌患者和101例健康者血漿H0TAIRM1水平的ROC曲線分析， AUC值為0. 780，臨界值設(shè)定為0. 003。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。本發(fā)明中，以上所述和以下的實(shí)施例中，所使用的技術(shù)如PCR、RNA提取技術(shù)，除特殊說(shuō)明外均為本領(lǐng)域研究技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)；所使用的儀器設(shè)備、試劑等除特殊說(shuō)明外均為本領(lǐng)域的研究技術(shù)人員可以通過(guò)公共途徑獲得。實(shí)施例一
特異性引物和熒光探針的設(shè)計(jì)與合成
根據(jù)H0TAIRM1的核苷酸序列，采用I^rimer Express (V3. 0，美國(guó)ABI公司)軟件分析 TaqMan引物和探針位點(diǎn)，從中選擇最佳組合。檢測(cè)用PCR引物和探針序列如下 H0TAIRM1外側(cè)引物
outer-hotiarml-F GCTGGAGCGAAGAAGAGCAA, outer-hotiarml-R CAAACACCCACATTTCAACCC ； H0TAIRM1內(nèi)側(cè)引物
inner-hotiarml-F GAACTGGCGAGAGGTCTGTTTT, inner-hotiarml-R CCCCATAAATCCCTCCACATT ； H0TAIRM1熒光探針
hotiarml-probe FAM-CCTGAACCCATCAACAGCTGGGAGA-TAMRA。GAPDH外側(cè)引物 outer-gapdh-F GGCGCTGAGTACGTCGTGGA, outer-gapdh-R GTGGTGCAGGAGGCATTGCTGAT ； GAPDH內(nèi)側(cè)引物
inner-gapdh-F GCGTCTTCACCACCATGGA, inner-gapdh-R TGGTTCACACCCATGACGAA ； GAPDH熒光探針為
hotiarml-probe FAM-CCTGAACCCATCAACAGCTGGGAGA-TAMRA。其中FAM為熒光報(bào)告基團(tuán)，TAMRA為熒光淬滅基團(tuán)。以上所有寡核苷酸均有 Invitrogen公司合成。
實(shí)施例二
組織和血漿中RNA提取及去除DNA
1.組織RNA提取組織RNA提取采用hvitrogen公司提供TRIzol試劑，完全按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作。取200mg左右組織加入Iml TRIzol試劑，使用勻漿器研磨后氯仿萃取和異丙醇沉淀后備用。2.血漿RNA提取血漿RNA提取采用hvitrogen公司提供TRIzol-LS試劑，完全按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作。取600 μ L血漿加入1. 8ml TRIzol-LS試劑，氯仿萃取和異丙醇沉淀后備用。3. DNA去除提取的總RNA采用QIAGEN公司提供的RNase-Free DNase Set去除基因組DNA，完全按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。實(shí)施例三
長(zhǎng)鏈非編碼RNA -H0TAIRM1的檢測(cè)
1.逆轉(zhuǎn)錄分別取IOOng總RNA采用TAKARA公司提供的PrimeScript RT Reagent Kit 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，5 X RT buffer, 4. 0 μ L ；PrimeScript RT Enzyme Mix I,1.0yL ；Oligo dT (50uM)，1· 0 μ L ；Random 6 mers( 100 μ M)，1· 0 μ L，水補(bǔ)足至 20 μ L。37°C，15 分鐘；85°C， 5分鐘后取2. 0 μ L cDNA用于檢測(cè)H0TAIRM1。2.組織和血漿中H0TAIRM1水平的檢測(cè)采用TAKARA公司提供的PCR試劑按照下述配制PCR反應(yīng)液=IXPCR buffer,0. 1 μ M的外側(cè)上下游引物引物(GAPDH或H0TAIRM1 )、 IU的DNA聚合酶、0. 2mM的dNTPs，取2. 0 μ L的cDNA模板，反應(yīng)體積為20 μ L ；在ΑΒΙ2720 (ABI公司)PCR儀按照95°C變性5分鐘，95°C 30秒、55°C 30秒，72°C 30秒進(jìn)行15個(gè)循環(huán)預(yù)擴(kuò)增。取2. 0 μ L預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物加入ABI公司提供的如下PCR反應(yīng)液中1 X TaqMan Universal Master PCR Mix，0· 2 μ M的內(nèi)側(cè)上下游引物引物(GAPDH或H0TAIRM1)禾口 0. 1 μ M的熒光探針(GAPDH或H0TAIRM1 )，反應(yīng)體積為10 μ L ；在ΑΒΙ7900熒光PCR儀(ABI公司)上按照95°C 變性2分鐘，95°C 15秒、60°C 1分鐘，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。結(jié)果如圖1和圖2所示在組織中該方法能有效檢測(cè)組織中的H0TAITRM1和GAPDH的表達(dá)，圖1代表檢測(cè)組織中GAPDH的熒光擴(kuò)增曲線，圖2代表檢測(cè)組織中H0TAITRM1的熒光擴(kuò)增曲線；如圖3和圖4所示該方法同樣也能檢測(cè)血漿中H0TAITRM1和GAPDH水平，圖3代表檢測(cè)血漿中GAPDH的熒光擴(kuò)增曲線，圖 4代表檢測(cè)血漿中H0TAITRM1的熒光擴(kuò)增曲線。而且如圖5所示在109例結(jié)直腸癌腫瘤組織中H0TAIRM1水平明顯低于配對(duì)正常組織，/M). 0267 ；如圖6所示55例結(jié)腸癌中有43例在癌組織中低表達(dá)，討例直腸癌中有41例在癌組織中低表達(dá)。另外如圖7所示在150例結(jié)直腸癌患者血漿H0TAIRM1水平也明顯低于和101例健康者的水平，P<Q. 001 ；將血漿中 H0TAIRM1水平的臨界值如圖8所示設(shè)定為0. 003，則其診斷結(jié)直腸癌的靈敏度為61. 46%，特異性為80. 30%, ROC曲線分析后AUC值為0. 780。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA-H0TAIRM1的方法，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)采用RNA抽提試劑提取組織和血漿中總RNA，DNaseI去除基因組DNA后采用逆轉(zhuǎn)錄試劑進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA ；(2)分別以H0TAIRM1和GAPDH的外側(cè)引物按照以下PCR反應(yīng)體系配制反應(yīng)液1XPCR buffer,0. 1 μ M的外側(cè)上下游引物引物、IU的DNA聚合酶、0. 2mM的dNTPs，取2 μ L的cDNA 模板，反應(yīng)體積為20yL ；按照95°C變性5分鐘，95°C 30秒、55°C 30秒，72°C 30秒進(jìn)行15 個(gè)循環(huán)預(yù)擴(kuò)增；(3)取2.OyL預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物加入如下PCR反應(yīng)液中=IXTaqMan通用PCR緩沖液， 0. 2 μ M的內(nèi)側(cè)上下游引物引物和0. 1 μ M的熒光探針，反應(yīng)體積為10 μ L，按照95°C變性2 分鐘，95°C 15秒、60°C 1分鐘，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；(4)根據(jù)熒光曲線讀取Ct值，按照下述公式計(jì)算H0TAIRM1的相對(duì)表達(dá)量H0TAIRM1相對(duì)表達(dá)量=2 ( Δ Ct=Ct hotaieu — Ct GAPDH)；所述特異性內(nèi)外側(cè)引物和熒光探針的序列分別如下 H0TAIRM1外側(cè)引物outer-hotiarml-F GCTGGAGCGAAGAAGAGCAA, outer-hotiarml-R CAAACACCCACATTTCAACCC ； H0TAIRM1內(nèi)側(cè)引物inner-hotiarml-F GAACTGGCGAGAGGTCTGTTTT, inner-hotiarml-R CCCCATAAATCCCTCCACATT ； H0TAIRM1熒光探針hotiarml-probe FAM-CCTGAACCCATCAACAGCTGGGAGA-TAMRA GAPDH外側(cè)引物outer-gapdh-F :GGCGCTGAGTACGTCGTGGA, outer-gapdh-R :GTGGTGCAGGAGGCATTGCTGAT ； GAPDH內(nèi)側(cè)引物inner-gapdh-F :GCGTCTTCACCACCATGGA， inner-gapdh-R TGGTTCACACCCATGACGAA ； GAPDH熒光探針為hotiarml-probe: FAM-CCTGAACCCATCAACAGCTGGGAGA-TAMRA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA-H0TAIRM1的方法，其特征在于， FAM為熒光報(bào)告基團(tuán)，TAMRA為熒光淬滅基團(tuán)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA-HOTAIRM1的方法，根據(jù)長(zhǎng)鏈非編碼RNA-HOTAIRM1的基因序列以及內(nèi)參基因GAPDH的基因序列設(shè)計(jì)并合成外側(cè)引物、內(nèi)側(cè)引物和熒光探針，并利用這兩套引物和探針特異性檢測(cè)HOTAIRM1在血漿中的相對(duì)表達(dá)。經(jīng)過(guò)研究，結(jié)果表明HOTAIRM1在正常結(jié)直腸粘膜組織中呈陽(yáng)性表達(dá)，而且在胃癌組織和胃癌患者血漿中卻表現(xiàn)為低表達(dá)，本發(fā)明對(duì)進(jìn)一步研究HOTAIRM1在腫瘤中的表達(dá)和建立準(zhǔn)確特異檢測(cè)方法具有指導(dǎo)意義。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102399889SQ20111039302
公開(kāi)日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2011年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月1日
發(fā)明者張紅河, 來(lái)茂德 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)