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一種RHDV重組聚合酶等溫擴增檢測方法與流程

文檔序號:12056674閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種檢測兔出血癥病毒的特異性引物,其特征在于:包括上游引物和下游引物,其核苷酸序列為:

上游引物F:5’-TgTTATggAgggCAAAACCCgCACAgCgCCgCAA-3’;如SEQ.ID.NO.1所示;

下游引物R:5’–CggCTgTgAATgggTTgTTCTgTggAgAgTgTT-3’;如SEQ.ID.NO.2所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測兔出血癥病毒的特異性引物,其特征在于:所述引物所對應(yīng)的特異性擴增片段位于RHDV參照基因的第5301-5617位點之間,大小為317bp,其核苷酸序列為:

5’-TgTTATggAgggCAAAACCCgCACAgCgCCgCAAggCgAAgCAgCAggCACTgCTACCACAgCATCAgTTCCCggAACCACgACCgACggCATggATCCTggCgTggTggCCgCAACTAgTgTggTCACTgCAgAAAATTCATCCgCATCggTTgCAACggCggggATTggCggCCCACCCCAACAggTggACCAACAAgAAACATggAggACTAACTTTTACTACAATgATgTTTTCACTTggTCCgTCgCggATgCgCCCggCAgCATTCTCTACACTgTCCAACACTCTCCACAgAACAACCCATTCACAgCCg-3’,如SEQ.ID.NO.4所示。

3.權(quán)利要求1或2所述的檢測兔出血癥病毒的特異性引物在檢測兔出血癥病毒中的應(yīng)用。

4.一種兔出血癥病毒重組聚合酶等溫擴增檢測方法,其特征在于:提取肝臟組織的RNA,利用權(quán)利要求1所述的特異性引物進行重組酶聚合酶等溫擴增,并檢測擴增產(chǎn)物,若能擴增出317bp的條帶,則判斷為RHDV陽性,反之則為陰性。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的兔出血癥病毒重組聚合酶等溫擴增檢測方法,其特征在于:所述提取肝臟組織的RNA的具體方法如下:

將肝臟組織用PBS以1∶10研磨成懸液,裝入EP管中,于-80℃反復凍融3次,凍融后以9000×g離心10min,取上清液300μL于離心管中,加入900μL TRIZOL試劑,劇烈顛倒6~10次,室溫靜置10min;加入200μL氯仿,上下顛倒60~100次,室溫靜置5min;4℃10000×g離心10min;取上清移入離心管中,加等體積的異丙醇,輕輕搖勻,-20℃放置30min,4℃10000×g離心10min,倒掉上清;加入1mL 75%乙醇溶液,4℃10000×g離心5min,去掉上清,干燥5min,用0.1%DEPC水溶液溶解RNA,-20℃凍存。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的兔出血癥病毒重組聚合酶等溫擴增檢測方法,其特征在于:進行重組酶聚合酶等溫擴增時,按照TwistAmp DNA Amplification Kits試劑盒操作說明進行,反應(yīng)體系為:20μmol/μL的上、下游引物各1.2μL,RT Buffer 29.5μL,Template 10μL,ddH2O 5.6μL;漩渦混勻,離心;加入2.5μL 280mM MgAc,混勻。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的兔出血癥病毒重組聚合酶等溫擴增檢測方法,其特征在于:進行重組酶聚合酶等溫擴增時,擴增參數(shù)為:40℃15min后取出,冷卻至室溫;混勻后,離心,40℃35min。

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