本發(fā)明涉及一種生物檢測(cè)技術(shù)，具體涉及一種檢測(cè)兔出血癥病毒(RHDV)的特異性引物和重組聚合酶等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

兔出血癥是由兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)引起的一種高度接觸性、急性、致死性傳染病，常呈暴發(fā)性流行，對(duì)家兔飼養(yǎng)行業(yè)造成毀滅性的損失。RHDV的基因組為一條單股正鏈的RNA分子，由約7437個(gè)核苷酸組成，基因組含有2個(gè)開放閱讀框架，衣殼蛋白VP60是主要的結(jié)構(gòu)蛋白。RHDV的常用檢測(cè)方法有血凝試驗(yàn)(HA)、反向間接血凝(IHA)、免疫擴(kuò)散法、熒光抗體法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、電鏡觀察法、RT-PCR法等。HA、IHA、免疫擴(kuò)散法等方便快捷，但敏感性較低,不適宜于微量病毒的檢測(cè)。ELISA、熒光抗體法較為成熟，但不及RT-PCR方法敏感。常規(guī)RT-PCR必須經(jīng)過變性、退火、延伸三個(gè)步驟，需要特殊的基因擴(kuò)增儀器。

重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，被稱為是可以替代PCR的核酸檢測(cè)技術(shù)。英國(guó)公司TwistDx Inc以此為基礎(chǔ)開發(fā)的核酸擴(kuò)增產(chǎn)品，能夠在15分鐘內(nèi)進(jìn)行常溫下的單分子核酸檢測(cè)。該技術(shù)對(duì)硬件設(shè)備的要求很低，特別適合用于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。RPA反應(yīng)的最適溫度在37℃～42℃，無需變性，在常溫下即可進(jìn)行，這無疑能大大加快基因擴(kuò)增的速度。此外，由于不需要特殊的溫控設(shè)備，RPA可以真正實(shí)現(xiàn)便攜式的快速核酸檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)兔出血癥病毒(RHDV)的特異性引物，以及重組聚合酶等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，該方法具有簡(jiǎn)便、快速、敏感性高、特異性好等優(yōu)勢(shì)，完全能夠滿足快速檢測(cè)RHDV的需要。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種檢測(cè)兔出血癥病毒(RHDV)的特異性引物，包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列為：

上游引物F：5’-TgTTATggAgggCAAAACCCgCACAgCgCCgCAA-3’；如SEQ.ID.NO.1所示；

下游引物R：5’–CggCTgTgAATgggTTgTTCTgTggAgAgTgTT-3’；如SEQ.ID.NO.2所示。

所述引物所對(duì)應(yīng)的特異性擴(kuò)增片段位于RHDV參照基因(Genbank DQ205345)的第5301-5617位點(diǎn)之間，大小為317bp，其核苷酸序列為：

5’-TgTTATggAgggCAAAACCCgCACAgCgCCgCAAggCgAAgCAgCAggCACTgCTACCACAgCATCAgTTCCCggAACCACgACCgACggCATggATCCTggCgTggTggCCgCAACTAgTgTggTCACTgCAgAAAATTCATCCgCATCggTTgCAACggCggggATTggCggCCCACCCCAACAggTggACCAACAAgAAACATggAggACTAACTTTTACTACAATgATgTTTTCACTTggTCCgTCgCggATgCgCCCggCAgCATTCTCTACACTgTCCAACACTCTCCACAgAACAACCCATTCACAgCCg-3’，如SEQ.ID.NO.4所示。

一種兔出血癥病毒(RHDV)重組聚合酶等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，為：提取肝臟組織的RNA，利用上述特異性引物進(jìn)行重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增，并檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，若能擴(kuò)增出317bp的條帶，則判斷為RHDV陽性，反之則為陰性。

優(yōu)選的，所述提取肝臟組織的RNA的具體方法如下：

將肝臟組織用PBS以1∶10(w/v)研磨成懸液,裝入高壓滅菌處理過的1.5mL EP管中，于-80℃反復(fù)凍融3次，凍融后以9000×g離心10min，取上清液300μL于2mL離心管中，加入900μL TRIZOL試劑，劇烈顛倒6～10次，室溫靜置10min；加入200μL氯仿，上下顛倒60～100次，室溫靜置5min；4℃10000×g離心10min；取上清移入1.5mL離心管中，加等體積的異丙醇，輕輕搖勻，-20℃放置30min，4℃10000×g離心10min，倒掉上清；加入1mL 75％乙醇溶液，4℃10000×g離心5min，去掉上清，在超凈工作臺(tái)中干燥5min，用適量0.1％DEPC水溶液溶解RNA，-20℃凍存。

優(yōu)選的，進(jìn)行重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增時(shí)，按照TwistAmp DNA Amplification Kits試劑盒操作說明進(jìn)行，反應(yīng)體系為：上、下游引物(20μmol/μL)各1.2μL，RT Buffer 29.5μL，Template 10μL，ddH2O 5.6μL；漩渦混勻，離心；加入2.5μL 280mM MgAc，混勻。

優(yōu)選的，進(jìn)行重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增參數(shù)為：40℃15min后取出，冷卻至室溫；混勻后，離心，40℃35min。

優(yōu)選的，所述檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的方法為電泳：取5μL PCR產(chǎn)物加入2℅瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳觀察。

本發(fā)明的檢測(cè)RHDV的特異性引物，是根據(jù)RHDV的VP60基因序列設(shè)計(jì)的引物，并基于該特異性引物的性質(zhì)，本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)化建立了適宜于快速準(zhǔn)確進(jìn)行RHDV檢測(cè)的等溫?cái)U(kuò)增基因方法，最低檢出病毒量為0.1LD₅₀，靈敏度與傳統(tǒng)RT-PCR一致。該方法操作簡(jiǎn)單、快速，適用于臨床生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)室的快速診斷。

附圖說明

圖1：兔出血癥病毒重組酶聚合酶擴(kuò)增引物的優(yōu)化；其中，M-標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量2000；1-EQ.ID.NO.1/SEQ.ID.NO.3；2-EQ.ID.NO.1/SEQ.ID.NO.2。

圖2：兔出血癥病毒重組酶聚合酶等溫檢測(cè)特異性結(jié)果；其中，M-標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量2000；1-兔出血癥病毒；2-巴氏桿菌；3-波氏桿菌；4-大腸桿菌；5-葡萄球菌；6-魏氏梭菌；7-兔肝臟。

圖3：兔出血癥病毒重組酶聚合酶等溫檢測(cè)靈敏度結(jié)果；其中，M-標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量2000；1-10³LD₅₀；2-10²LD₅₀；3-10LD₅₀；4-1LD₅₀；5-0.1LD₅₀；6-0.01LD₅₀。

圖4：兔出血癥病毒RT-PCR檢測(cè)靈敏度結(jié)果；其中，M-標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量2000；1-10³LD₅₀；2-10²LD₅₀；3-10LD₅₀；4-1LD₅₀；5-0.1LD₅₀；6-0.01LD₅₀。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

下述實(shí)施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)儀器、試劑、材料等，可通過正規(guī)商業(yè)途徑獲得。下述實(shí)施例中所涉及的實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)方法等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)方法等。

實(shí)施例一

1、引物設(shè)計(jì)

常規(guī)RT-PCR所用引物長(zhǎng)度一般18-25個(gè)，而RP引物的長(zhǎng)度一般為30-35個(gè)核苷酸，引物過短會(huì)嚴(yán)重影響重組酶的活性，依據(jù)重組酶聚合酶的擴(kuò)增特性。通過對(duì)已有的大量RHDV基因序列進(jìn)行比對(duì)，參照RHDV基因序列(Genbank DQ205345)設(shè)計(jì)了3條保守引物，如下：

SEQ.ID.NO.1：5’-TgTTATggAgggCAAAACCCgCACAgCgCCgCAA-3’(34nt)；

SEQ.ID.NO.2:5’-CggCTgTgAATgggTTgTTCTgTggAgAgTgTT-3’(位于33nt)；

SEQ.ID.NO.3:5’-AACTgCATgCCACCAgCCCAgCCAgCgTACAT-3’(32nt)。

其中，SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為317bp(第5301-5617位)。

5’-TgTTATggAgggCAAAACCCgCACAgCgCCgCAAggCgAAgCAgCAggCACTgCTACCACAgCATCAgTTCCCggAACCACgACCgACggCATggATCCTggCgTggTggCCgCAACTAgTgTggTCACTgCAgAAAATTCATCCgCATCggTTgCAACggCggggATTggCggCCCACCCCAACAggTggACCAACAAgAAACATggAggACTAACTTTTACTACAATgATgTTTTCACTTggTCCgTCgCggATgCgCCCggCAgCATTCTCTACACTgTCCAACACTCTCCACAgAACAACCCATTCACAgCCg-3’，如SEQ.ID.NO.4所示。

SEQ.ID.NO.1SEQ.ID.NO.3的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為360bp(第5301-5660位)。

5’-TgTTATggAgggCAAAACCCgCACAgCgCCgCAAggCgAAgCAgCAggCACTgCTACCACAgCATCAgTTCCCggAACCACgACCgACggCATggATCCTggCgTggTggCCgCAACTAgTgTggTCACTgCAgAAAATTCATCCgCATCggTTgCAACggCggggATTggCggCCCACCCCAACAggTggACCAACAAgAAACATggAggACTAACTTTTACTACAATgATgTTTTCACTTggTCCgTCgCggATgCgCCCggCAgCATTCTCTACACTgTCCAACACTCTCCACAgAACAACCCATTCACAgCCgTgCTgAgCCAgATgTACgCTggCTgggCTggTggCATgCAgTT-3’，如SEQ.ID.NO.5所示。

2、核酸提取

將肝臟組織用PBS以1∶10(w/v)研磨成懸液,裝入高壓滅菌處理過的1.5mL EP管中，于-80℃反復(fù)凍融3次，凍融后以9000×g離心10min，取上清液300μL于2mL離心管中，加入900μL TRIZOL試劑，劇烈顛倒6～10次，室溫靜置10min；加入200μL氯仿，上下顛倒60～100次，室溫靜置5min；4℃10000×g離心10min；取上清移入1.5mL離心管中，加等體積的異丙醇，輕輕搖勻，-20℃放置30min，4℃10000×g離心10min，倒掉上清；加入1mL 75％乙醇溶液，4℃10000×離心5min，去掉上清，在超凈工作臺(tái)中干燥5min，用適量0.1％DEPC水溶液溶解RNA，-20℃凍存。

3、重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增

按照Twistamp DNA AmplifiCATion KiTs試劑盒操作說明進(jìn)行,PCR反應(yīng)體系：上、下游引物(20μmol/μL)各1.2μL,Rehydration Buffer 29.5μL,模板RNA 10μL,ddH2O 5.6μL。漩渦混勻，離心。加入2.5μL 280mM MgAC,混勻。放入PCR儀，40℃15min后取出，冷卻至室溫，混勻后，離心，放入PCR儀，40℃35min。

常規(guī)RT-PCR按照HiscripIIOne Step RT-PCR Kit說明書進(jìn)行，50μl反應(yīng)體系如下：2×onestep RT-PCR Mix 25μl，上、下游引物(20μmol/μL)各1.2μL,模板RNA 10μL，ddH2O 12.6μl。擴(kuò)增參數(shù)如下：50℃30min，95℃5min。然后95℃20s，50℃20s，72℃30s，黃35個(gè)遁環(huán)；最后72℃延伸10min。

反應(yīng)結(jié)束后于2％瓊脂糖凝膠電泳,120V，30min，觀察結(jié)果。

本實(shí)施例所用RT-PCR反應(yīng)體系是通過常規(guī)商品化試劑盒進(jìn)行組裝，DNA MArker DL-2000、TRIZOL,DEPC,均購(gòu)自TAKARA公司(大連)；HisCripIIOne STep RT-PCR KiT購(gòu)自VAzyme公司；TwisTAmp DNA AmplifiCATion KiTs購(gòu)自TwisTDX公司。

4、結(jié)果

電泳結(jié)果表明，僅SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2這對(duì)引物擴(kuò)增到了約317bp特異片段，而SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.3這對(duì)引物含有多個(gè)條帶，結(jié)果如圖1所示。因此，應(yīng)用SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2這對(duì)引物建立了重組酶聚合酶等溫核酸檢測(cè)方法。

7、特異性驗(yàn)證

分別用兔出血癥病毒、兔巴氏桿菌、兔波氏桿菌、大腸桿菌、葡萄球菌、魏氏梭菌、健康兔肝臟樣品提取DNA或RNA作為模板進(jìn)行RT-PCR，通過凝膠電泳檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，只有兔出血癥病毒為陽性，其他的均為陰性，說明檢測(cè)體系特異性良好。

8、靈敏度驗(yàn)證

選擇標(biāo)準(zhǔn)RHDV毒株肝臟樣品以10倍系列稀釋，用上述建立的重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增方法進(jìn)行檢測(cè)。與傳統(tǒng)的RT-PCR方法的均為0.1LD₅₀，結(jié)果如圖3和圖4所示。

9、臨床樣品檢測(cè)

收集家兔鼻腔拭子，加入0.8mL PBS(0.01mol/L pH7.2)，充分震蕩，取上清提取核酸，用上述建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)與傳統(tǒng)的RT-PCR方法進(jìn)行比較。結(jié)果兩種方法的符合率為100％。

SEQUENCE LISTING

<110> 申請(qǐng)人名稱

<120> 一種RHDV重組聚合酶等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgttatggag ggcaaaaccc gcacagcgcc gcaa 34

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cggctgtgaa tgggttgttc tgtggagagt gtt 33

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aactgcatgc caccagccca gccagcgtac at 32

<210> 4

<211> 317

<212> DNA

<213> 兔出血癥病毒

<400> 4

tgttatggag ggcaaaaccc gcacagcgcc gcaaggcgaa gcagcaggca ctgctaccac 60

agcatcagtt cccggaacca cgaccgacgg catggatcct ggcgtggtgg ccgcaactag 120

tgtggtcact gcagaaaatt catccgcatc ggttgcaacg gcggggattg gcggcccacc 180

ccaacaggtg gaccaacaag aaacatggag gactaacttt tactacaatg atgttttcac 240

ttggtccgtc gcggatgcgc ccggcagcat tctctacact gtccaacact ctccacagaa 300

caacccattc acagccg 317

<210> 5

<211> 360

<212> DNA

<213> 兔出血癥病毒

<400> 5

tgttatggag ggcaaaaccc gcacagcgcc gcaaggcgaa gcagcaggca ctgctaccac 60

agcatcagtt cccggaacca cgaccgacgg catggatcct ggcgtggtgg ccgcaactag 120

tgtggtcact gcagaaaatt catccgcatc ggttgcaacg gcggggattg gcggcccacc 180

ccaacaggtg gaccaacaag aaacatggag gactaacttt tactacaatg atgttttcac 240

ttggtccgtc gcggatgcgc ccggcagcat tctctacact gtccaacact ctccacagaa 300

caacccattc acagccgtgc tgagccagat gtacgctggc tgggctggtg gcatgcagtt 360