本發(fā)明涉及一種2,4-二乙酰基間苯三酚(2,4-diacetylphloroglucinol,DAPG)的合成，特別是利用2,4-二乙酰基間苯三酚為原料，經(jīng)過(guò)DCC縮合制備2,4-二乙?；g苯三酚酯類化合物與應(yīng)用，屬于生物抗生素2,4-二乙酰基間苯三酚酯基衍生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
2,4-二乙?；g苯三酚(2,4-diacetylphloroglucinol,DAPG)，也稱2,4-二乙?；冱S酚，是一種由生防熒光假單胞桿菌(Pseuodomonas fluorescens)產(chǎn)生的酚類抗生素，該化合物具有廣泛的生物活性，如抗植物病原真菌、細(xì)菌和對(duì)線蟲、蠕蟲的強(qiáng)烈殺傷作用等，在農(nóng)業(yè)上多用于植物病蟲害的生物防治。在赤背蠑螈(redback salamanders)皮膚上的溶桿菌gummosus也能代謝生成2,4-二乙?；g苯三酚。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是，提供一種2,4-二乙?；g苯三酚酯類化合物，該化合物是以2,4-二乙?；g苯三酚為原料加以結(jié)構(gòu)改造而制成，并將得到的2,4-二乙酰基間苯三酚酯類化合物作為一種新型生物抗生素。
本發(fā)明的2,4-二乙?；g苯三酚酯類化合物結(jié)構(gòu)式為：
其中，R＝乙基、正丙基、正丁基、異丁基、正戊基、特戊基、正己基、正庚基、甲基丙烯基、丙烯基或環(huán)丙甲基。
本發(fā)明2,4-二乙?；g苯三酚酯類化合物的制備方法包括：冰浴條件下將反應(yīng)量的脂肪酸加入2,4-二乙?；g苯三酚和4-二甲氨基吡啶的無(wú)水二氯甲烷溶液中反應(yīng)后，加入反應(yīng)量的二環(huán)己基碳二亞胺，冰浴條件下反應(yīng)后反應(yīng)物經(jīng)洗滌、干燥、純化得2,4-二乙酰基間苯三酚酯類化合物。
本發(fā)明還涉及2,4-二乙?；g苯三酚酯類化合物用于水稻稻瘟病、番茄灰霉病、番茄早疫病、蘋果腐爛病、蘋果炭疽病和馬鈴薯干腐病防治的應(yīng)用。
本發(fā)明對(duì)2,4-二乙酰基間苯三酚及其酯類化合物進(jìn)行NMR(核磁共振)分析，生物活性等測(cè)試。根據(jù)NMR數(shù)據(jù)，對(duì)所制備的2,4-二乙?；g苯三酚酯類化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，確定化合物的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明對(duì)2,4-二乙酰基間苯三酚酯類化合物的生物活性測(cè)定，利用生長(zhǎng)速率抑制法(參見文獻(xiàn):Shi Wei et al.,Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2016,26(9):2156-2158.)測(cè)定化合物的抗植物病原真菌活性，發(fā)現(xiàn)2,4-二乙?；g苯三酚酯類化合物對(duì)水稻稻瘟病、番茄灰霉病、番茄早疫病、蘋果腐爛病、蘋果炭疽病和馬鈴薯干腐病六種植物病原菌有很強(qiáng)的抑制作用，且IC50值較低。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明所用的2,4-二乙?；g苯三酚(1)，其結(jié)構(gòu)通式為：
其可采用現(xiàn)有的方法制備或在市場(chǎng)上購(gòu)買所得，其中一種制備方法是：
稱取1.26g(10mmol)間苯三酚于裝有攪拌子和冷凝回流的50mL三口瓶中，加入15mL三氟化硼乙醚溶液，置于冰浴中，緩慢滴加2.4mL(25mmol)乙酸酐，滴加完畢，逐步升溫至100℃，反應(yīng)4h，TLC檢測(cè)原料點(diǎn)基本消失。反應(yīng)液冷卻至室溫，倒入20mL冰水混合液中，攪拌15min，用乙酸乙酯(15mL)萃取三次。收集有機(jī)相，乙酸乙酯層依次用飽和碳酸鈉溶液，飽和氯化鈉溶液洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾除去溶劑，得白色固體，經(jīng)硅膠柱(200～300,石油醚：乙酸乙酯＝5:1,V/V)柱層析得到淡黃色固體1.72g，產(chǎn)率82％，熔點(diǎn)：163.2～164.1℃。
本發(fā)明的2,4-二乙酰基間苯三酚酯類化合物，其結(jié)構(gòu)通式為：
式中，R＝乙基、正丙基、正丁基、異丁基、正戊基、特戊基、正己基、正庚基、甲基丙烯基、丙烯基或環(huán)丙甲基。
其制備方法是：
在冰浴條件下將反應(yīng)量的脂肪酸加入2,4-二乙酰基間苯三酚和4-二甲氨基吡啶(DMAP)的無(wú)水二氯甲烷溶液中反應(yīng)一定時(shí)間后，加入反應(yīng)量的二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，冰浴條件下反應(yīng)一定時(shí)間后反應(yīng)物經(jīng)洗滌、干燥、純化得2,4-二乙?；g苯三酚酯類化合物。
本發(fā)明可采用TLC檢測(cè)原料點(diǎn)基本消失，以確定反應(yīng)的終點(diǎn)。
本發(fā)明的洗滌、干燥和純化可采用減壓蒸餾除去溶劑，得白色固體，經(jīng)硅膠柱(200～300,石油醚：乙酸乙酯＝5:1,V/V)柱層析得到淡黃色固體232mg，產(chǎn)率92％，熔點(diǎn)：111.7～113.1℃。
本發(fā)明的洗滌、干燥和純化還可采用反應(yīng)液依次用飽和碳酸鈉溶液，飽和氯化鈉溶液洗滌，無(wú)水硫酸鎂干燥，減壓濃縮，其殘余物以石油醚和乙酸乙酯(體積比5:1)的混合溶液為洗脫劑，通過(guò)硅膠柱層析分離純化。
以下是發(fā)明人給出的實(shí)施例，以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步解釋。
實(shí)施例1：2,4-二乙酰基間苯三酚的制備(1)
1.26g(10mmol)間苯三酚于裝有攪拌子和冷凝回流的50mL三口瓶中，加入15mL三氟化硼乙醚溶液，置于冰浴中，緩慢滴加2.4mL(25mmol)乙酸酐滴加完畢，逐步升溫至100℃，反應(yīng)4h，TLC檢測(cè)原料點(diǎn)基本消失。反應(yīng)液冷卻至室溫，倒入20mL冰水混合液中，攪拌15min，用乙酸乙酯(15mL)萃取三次。收集有機(jī)相，乙酸乙酯層依次用飽和碳酸鈉溶液，飽和氯化鈉溶液洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾除去溶劑，得白色固體，經(jīng)硅膠柱(200～300,石油醚：乙酸乙酯＝5:1,V/V)柱層析得到淡黃色固體1.72g，產(chǎn)率82％，熔點(diǎn)：163.2～164.1℃。
分子式：C10H10O5,1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ5.94(s,1arom.H),2.64(s,6H,2CH3).
13C NMR(100MHz,Acetone-d6)δ204.7,172.1,172.0,104.6,95.6,33.0.ESI-MS:m/z[M+H]+211.05.
實(shí)施例2：乙酰2,4-二乙?；g苯三酚酯化合物制備(2)
于裝有攪拌子的50mL梨形瓶中加入210mg(1.0mmol)2,4-二乙?；g苯三酚和DMAP(0.1mmol)，置于冰浴下，加入10mL無(wú)水二氯甲烷，攪拌條件下加入0.15mL(1.5mmol)乙酸，滴加完畢，繼續(xù)攪拌15min，然后加入412mg DCC(2mmol)。反應(yīng)4h，TLC檢測(cè)原料點(diǎn)基本消失。減壓蒸餾除去溶劑，得白色固體，經(jīng)硅膠柱(200～300,石油醚：乙酸乙酯＝5:1,V/V)柱層析得到淡黃色固體232mg，產(chǎn)率92％，熔點(diǎn)：111.7～113.1℃。
分子式：C12H12O6，1H NMR(500MHz,CDCl3)δ15.59(s,1H,OH),14.46(s,1H,OH),6.20(s,1arom.H),2.75(s,3H,CH3),2.59(s,3H,CH3),2.38(s,3H,CH3).
13C NMR(125MHz,CDCl3)δ205.3,202.0,170.8,170.5,167.7,157.3,108.6,106.9,104.6,33.5,31.8,21.8.,ESI-MS:m/z[M+H]+252.22.
實(shí)施例3：丙酰2,4-二乙?；g苯三酚酯化合物制備(3)
合成方法同實(shí)施例2，所用酸是丙酸；得白色固體，熔點(diǎn)：96.9–98.3℃，產(chǎn)率90％。
分子式：C13H14O6,.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ15.59(s,1H,OH),14.44(s,1H,OH),6.18(s,1arom.H),2.74(s,3H,CH3),2.65(q,J＝7.5Hz,2H,CH2CH3),2.56(s,3H,CH3),1.28(t,J＝7.5Hz,3H,CH2CH3).
13C NMR(125MHz,CDCl3)δ205.3,202.1,171.4,170.8,170.5,157.6,108.55,106.94,104.44,33.52,31.83,28.44,8.85.ESI-MS:m/z[M+H]+266.24.
實(shí)施例4：正丁酰2,4-二乙?；g苯三酚酯化合物制備(4)
合成方法同實(shí)施例2，所用酸是正丁酸；得白色固體，熔點(diǎn)：76.7–78.6℃，產(chǎn)率91％。
分子式：C14H16O6,1H NMR(500MHz,CDCl3)δ15.59(s,1H,OH),14.45(s,1H,OH),6.17(s,1arom.H),2.74(s,3H,CH3),2.60(t,J＝7.4Hz,2H,COCH2),2.57(s,3H,CH3),1.80(dd,J＝14.8,7.4Hz,2H,CH2CH3),1.05(t,J＝7.4Hz,3H,CH2CH3).
13C NMR(125MHz,CDCl3)δ205.3,202.1,170.7,170.6,170.5,157.6,108.6,107.0,104.5,36.8,33.5,31.9,18.2,13.7.ESI-MS:m/z[M+H]+280.27.
實(shí)施例5：異丁酰2,4-二乙酰基間苯三酚酯化合物制備(5)
合成方法同實(shí)施例2，所用酸是異丁酸；得白色固體，熔點(diǎn)：72.5–73.9℃，產(chǎn)率80％。
分子式：C14H16O6,1H NMR(500MHz,CDCl3)δ15.61(s,1H,OH),14.46(s,1H,OH),6.12(s,1arom.H),2.81(dt,1H,CH(Me)2),2.73(s,3H,CH3),2.54(s,3H,CH3),1.33(s,3H,CH(Me)2),1.31(s,3H,CH(Me)2).
13C NMR(125MHz,CDCl3)δ205.3,202.1,174.4,170.8,170.6,158.1,108.6,107.2,104.3,34.9,33.6,31.9,18.8(2CH3).ESI-MS:m/z[M+H]+280.24.
實(shí)施例6：正戊酰2,4-二乙?；g苯三酚酯化合物制備(6)
合成方法同實(shí)施例2，所用酸是正戊酸；得黃色蠟狀物，熔點(diǎn)：57.2–58.1℃，產(chǎn)率88％。
分子式：C15H18O6,1H NMR(500MHz,CDCl3)δ15.60(s,1H,OH),14.46(s,1H,OH),6.17(s,1arom.H),2.75(s,3H,CH3),2.62(t,J＝7.5Hz,2H,COCH2),2.57(s,3H,CH3),1.75(dt,J＝15.2,7.5Hz,2H,CH2),1.45(dd,J＝15.0,7.5Hz,2H,CH2),0.97(t,J＝7.4Hz,3H,CH2CH3).
13C NMR(125MHz,CDCl3)δ205.3,202.1,170.8,170.7,170.6,157.6,108.6,107.0,104.5,34.7,33.8,31.9,26.7,22.3,13.8.ESI-MS:m/z[M+H]+294.30.
實(shí)施例7：特戊酰2,4-二乙?；g苯三酚酯化合物制備(7)
合成方法同實(shí)施例2，所用酸是特戊酸；得白色固體，熔點(diǎn)：93.6–94.7℃，產(chǎn)率78％。
分子式：C15H18O6,1H NMR(500MHz,CDCl3)δ15.61(s,1H,OH),14.44(s,1H,OH),6.92(s,1arom.H),2.44(s,6H,2CH3),1.30(s,9H,3CH3).
13C NMR(125MHz,CDCl3)δ205.3,202.2,175.8,175.7,170.7,158.9,109.0,107.9,104.0,39.3,31.4(2CH3),27.1(3CH3).ESI-MS:m/z[M+H]+294.29.
實(shí)施例8：己酰2,4-二乙?；g苯三酚酯化合物制備(8)
合成方法同實(shí)施例2，所用酸是己酸；得黃色膏狀物，產(chǎn)率86％。
分子式：C16H20O6,1H NMR(500MHz,CDCl3)δ15.60(s,1H,OH),14.46(s,1H,OH),6.18(s,1arom.H),2.75(s,3H,CH3),2.61(t,J＝7.5Hz,2H,COCH2),2.57(s,3H,CH3),1.79-1.74(m,2H,CH2),1.39-1.36(m,4H,2CH2),0.94-0.92(m,3H,CH2CH3).
13C NMR(125MHz,CDCl3)δ205.3,202.1,170.8,170.8,157.6,148.6,108.6,107.0,104.5,34.9,33.6,31.9,31.3,24.3,22.4,14.0.ESI-MS:m/z[M+H]+308.32.
實(shí)施例9：庚酰2,4-二乙?；g苯三酚酯化合物制備(9)
合成方法同實(shí)施例2，所用酸是庚酸；得黃色膏狀物，產(chǎn)率85％。
分子式：C17H22O6,1H NMR(500MHz,CDCl3)δ15.60(s,1H,OH),14.46(s,1H,OH),6.17(s,1arom.H),2.74(s,3H,CH3),2.61(t,J＝7.5Hz,2H,CH2),2.57(s,3H,CH3),1.75(dt,J＝15.2,7.5Hz,2H,CH2),1.32(dd,J＝8.6,5.5Hz,6H,3CH2),0.90(d,J＝3.4Hz,3H,CH2CH3).
13C NMR(125MHz,CDCl3)δ205.2,202.1,170.7,170.5,157.6,148.6,108.5,107.0,104.4,35.0,33.5,31.9,31.5,28.8,25.0,22.6,14.1.ESI-MS:m/z[M+H]+322.35.
實(shí)施例10：甲基丙烯酰2,4-二乙?；g苯三酚酯化合物制備(10)
合成方法同實(shí)施例2；所用酸是甲基丙烯酸；得白色固體，熔點(diǎn)：59.8–61.7℃，產(chǎn)率83％。
分子式：C14H14O6,1H NMR(500MHz,CDCl3)δ15.60(s,1H,OH),14.46(s,1H,OH),6.40-6.37(m,1H,C＝CH2),6.15(s,1arom.H),5.92-5.89(m,1H,C＝CH2),2.76(s,3H,CH3),2.53(s,3H,CH3),2.08(s,3H,CH3).
13C NMR(125MHz,CDCl3)δ205.3,202.1,170.8,170.5,164.5,158.0,135.4,129.5,108.7,107.3,104.6,33.6,31.8,18.5.ESI-MS:m/z[M+H]+278.25.
實(shí)施例11：丙烯酰2,4-二乙酰基間苯三酚酯化合物制備(11)
合成方法同實(shí)施例2，所用酸是丙烯酸；得白色固體，89.1–90.8℃，產(chǎn)率85％。
分子式：C13H12O6,1H NMR(500MHz,CDCl3)δ15.61(s,1H,OH),14.48(s,1H,OH),6.69(dd,J＝17.3,0.8Hz,1H,CH＝CH2),6.36(dd,J＝17.3,10.5Hz,1H,CH＝CH2),6.22(s,1arom.H),6.16(dd,J＝10.5,0.8Hz,1H,CH＝CH2),2.76(s,3H,CH3),2.55(s,3H,CH3).
13C NMR(125MHz,CDCl3)δ205.3,202.1,170.8,170.6,163.1,157.3,135.2,127.1,108.7,107.1,104.6,33.6,31.9.ESI-MS:m/z[M+H]+264.23.
實(shí)施例12：環(huán)丙甲酰2,4-二乙?；g苯三酚酯化合物制備(12)
合成方法同實(shí)施例2，所用酸是環(huán)丙甲酸；得白色固體，83.1–84.7℃，產(chǎn)率75％。
分子式：C14H14O6,1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.18(s,1arom.H),2.74(s,3H,CH3),2.61(s,3H,CH3),1.89(tt,J＝7.9,4.6Hz,1H,CH),1.23–1.18(m,2H,CH2),1.14–1.08(m,2H,CH2).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ205.0,202.1,172.0,170.6,170.3,157.5,108.4,107.0,104.40,33.3,31.7,13.2,9.9(2CH2).ESI-MS:m/z[M+H]+278.26.
實(shí)施例13：抑菌活性的測(cè)定
生長(zhǎng)速率抑制法對(duì)所合成的化合物進(jìn)行抑菌活性與IC50(μg/mL)的測(cè)定。測(cè)試的病原菌是從田間常見病害中分離出的六種病原真菌，分別是蘋果腐爛病菌、蘋果炭疽病菌、水稻稻瘟病菌、番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌和馬鈴薯干腐病菌
實(shí)施方法是：在無(wú)菌條件下，將配制好的樣品丙酮溶液摻入融化的PDA培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基中該化合物的濃度達(dá)到100μg/mL，冷凝后接種上述病原菌，每個(gè)處理重復(fù)3次，28℃恒溫培養(yǎng)，每隔24h測(cè)定一次病原菌菌斑直徑，直到空白對(duì)照的菌斑長(zhǎng)滿平板為止。陽(yáng)性對(duì)照為噻菌靈。初篩后對(duì)抑制率達(dá)到80％以上的化合物進(jìn)行IC50的測(cè)試，將化合物依次配成50、25、12.5、6.25、3.125、1.5和0.75μg/mL系列的帶毒培養(yǎng)基，陽(yáng)性對(duì)照為噻菌靈。最后根據(jù)不同濃度的抑制率計(jì)算其IC50值。結(jié)果見表1及表2。
表1.化合物1-12對(duì)六種病原菌的抑制率(100μg/mL)
表2.化合物1-12對(duì)植物病原菌IC50值(μg/mL)
綜上所述，本發(fā)明的方法制備的化合物2,4-二乙?；g苯三酚酯化合物對(duì)供試植物病原菌有很強(qiáng)的抑制活性，能夠用于制備植物病原真菌抗生素的藥物的開發(fā)。