本發(fā)明屬于有益微生物篩選技術領域，具體涉及一種高產褐藻膠裂解酶的海洋弧菌及其應用

背景技術：

褐藻膠是由α-L-古洛糖醛酸(G)和β-D-甘露糖醛酸(M)通過1,4-糖苷鍵，按照不同的組合方式構成的非均聚線性分子。褐藻膠裂解酶通過β-消除反應，催化單體間的1,4-糖苷鍵，在非還原端的C4、C5之間形成不飽和雙鍵，該雙鍵在235nm處有最大吸光值。在酶活測定中，主要通過OD₂₃₅紫外吸收法檢測不飽和雙鍵的產生和薄層層析法(TLC)測定降解產物的均一性。

目前褐藻膠裂解酶，尤其是內切型褐藻膠裂解酶，已經被廣泛應用于生產褐藻膠寡聚糖、研究褐藻膠的精細結構以及制備紅藻和褐藻的原生質體。此外，褐藻膠裂解酶通過降解細菌生物膜上的多糖，在治療囊性纖維化方面有巨大的潛在應用價值。褐藻膠裂解酶還可應用于褐藻膠發(fā)酵生產生物乙醇，但目前所使用的褐藻膠裂解酶存在著產物均一性差的問題。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一株高產褐藻膠裂解酶的菌株，其降解褐藻膠的產物均一性高，從而推動褐藻膠寡糖的制備及應用，以彌補現(xiàn)有技術的不足。

本發(fā)明的第一個目的在于提供一株高產褐藻膠裂解酶的海洋燦爛弧菌(Vibrio splendidus)OU02株，該微生物保存在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.13478，保藏日期為2016年12月22日。

本發(fā)明所篩選的燦爛弧菌(Vibiro splendidus)OU02株用于生產制備褐藻膠裂解酶；

本發(fā)明還提供了一種用于誘導上述海洋弧菌表達產生褐藻膠裂解酶的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的基本碳源為褐藻膠；

作為實施例的一種具體記載，一種培養(yǎng)基的具體配比如下：褐藻膠2g/L，酵母粉0.5g/L，蛋白胨2.5g/L，海水溶解并調節(jié)pH 7.6-7.8。

本發(fā)明再一個方面提供一種制備褐藻膠裂解酶的方法。

本發(fā)明所篩選的燦爛弧菌OU02株還用來發(fā)酵生產褐藻寡糖。

本發(fā)明所篩選的燦爛弧菌OU02株所產生的褐藻膠裂解酶可以降解褐藻膠產生具有潛在生物學活性的褐藻寡糖，該微生物發(fā)酵周期短，酶活性高，且多數(shù)活性為胞內酶活，有利于樣品的收集及保存，為后續(xù)的工業(yè)化應用奠定了基礎。

附圖說明

圖1：TLC檢測細胞裂解物酶活測定圖，其中1.未加胞內酶對照樣品；2.加酶樣品；3.未加膜上提取酶對照；4.加酶；

圖2：本發(fā)明篩選的菌株的生長曲線圖。

具體實施方式

本發(fā)明從具有產生高活性褐藻膠裂解酶的海洋無脊椎動物的消化腺來源的共生微生物中進行篩選，獲得了一株能夠產生專一性的褐藻膠裂解酶的微生物菌株，從而促成了本發(fā)明。

下面結合實施例對本發(fā)明進行詳細的描述

實施例1：微生物的篩選及鑒定

1、微生物的篩選

在無菌條件下對新鮮活扇貝及鮑魚進行解剖，分離出二者的消化腺。在提取的消化腺組織中加入無菌生理鹽水，浸提后獲得扇貝、鮑魚消化腺組織的懸濁液。用無菌生理鹽水將懸濁液按照，10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6的梯度進行稀釋。分別取稀釋后的液體100-200 μL涂布到2216E褐藻膠固體選擇培養(yǎng)基上。將培養(yǎng)板置于25℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。從平板上挑取生長狀態(tài)良好的菌落接種于2216E褐藻膠液體選擇培養(yǎng)基中，于搖床中振蕩培養(yǎng)。24h后對各菌株的產褐藻膠裂解酶活性進行測定，選擇活性高的菌株進行后續(xù)篩選。

所用到的培養(yǎng)基的配方如下：

2216E褐藻膠選擇液體培養(yǎng)基：褐藻膠2g/L，酵母粉0.5g/L，蛋白胨2.5g/L，海水溶解并調節(jié)pH 7.6-7.8。

2216E褐藻膠選擇固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基的基礎上，補加瓊脂(15g/L)。

將待篩選的菌株用提取的胞內粗酶對褐藻膠進行降解，以加入同體積滅活酶作為對照，反應結束后采用TLC法對降解產物進行分析，來篩選產物均一性高的菌株。

最終篩選獲得了高產褐藻膠裂解酶的海洋燦爛弧菌(Vibiro splendidus)OU02株，該微生物保存在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.13478，保藏日期為2016年12月22日。

燦爛弧菌(Vibiro splendidus)OU02株的16S rRNA基因的擴增、序列測定及分析

采用細菌基因組提取試劑盒(Tiangen)提取已篩選到的高活性菌株的基因組，以此為模板，擴增該菌株的16S rRNA基因。采用以下引物：

27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

1492R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’

PCR反應按照以下條件進行：95℃預變性3min；95℃變性30s，50℃退火30s，68℃延伸90s共進行35個循環(huán)，之后68℃延伸10min。

獲得的RCR產物經膠回收試劑盒(Omega)純化后，與pMD19-T 載體(Takara)連接，轉化E.coli Top 10感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆進行DNA測序，進化樹分析顯示其與Vibrionales Bacterium SWAT-3的親緣關系最近。

實施例2：燦爛弧菌(Vibiro splendidus)OU02株的發(fā)酵研究

1、菌株發(fā)酵培養(yǎng)

將篩選得到的高活性菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得該微生物在褐藻膠培養(yǎng)基中的生長曲線。

按1-3％的接種量，將種子液接入褐藻膠液體培養(yǎng)基中，25℃，150rpm搖床中培養(yǎng)，在不同時間收集發(fā)酵液，以未接菌的培養(yǎng)基作為空白對照，測定菌液600nm處吸光值，繪制該菌的生長曲線(圖1)。結果發(fā)現(xiàn)該菌在褐藻膠培養(yǎng)基中，大約在6-10小時內達到生長的平臺期，此時OD₆₀₀＝2.5左右。這作為將來菌體收集的最佳時間。

2、不同部位酶的提取及活性測定(以下操作均在4℃條件下進行)

①胞外酶：將發(fā)酵液在12,000rpm條件下離心15min。將離心后的上清透析到50mM Tris-HCl pH7.5，200mM NaCl緩沖液中。

②胞內酶：上一步中發(fā)酵液離心后的菌體用50mM

Tris-HClpH7.5，200mM NaCl緩沖液重懸，之后進行超聲破碎(超聲3s，間隔5s，總時間15min)，超聲破碎后的液體在20,000g條件下離心20min，收集離心后的上清即為提取的胞內酶。

③膜結合酶：第二步中細菌經超聲破碎、離心后的沉淀被認為是包括難以溶解的膜結構。在50mM Tris-HClpH7.5，200mM NaCl緩沖液中按0.1％(v/v)的比例加入吐溫20，配成膜結合蛋白浸提液。用該浸提液，重懸第二步中細菌經超聲破碎、離心后的沉淀，之后過夜反應提取膜結合酶。最后，反應液經20000g，離心20min后的上清即為膜結合酶。

采用235nm處檢測不飽和雙鍵的吸光值的方法對提取的酶組份進行活性測定。結果表明該菌的褐藻膠裂解酶主要來源于細胞內和細胞膜上，其中胞內酶所占比例較高。

3、酶解產物的TLC分析

用提取的胞內粗酶對褐藻膠進行降解，以加入同體積滅活酶作為對照，反應結束后采用TLC法對降解產物進行分析。分別取2μL降解后的溶液和對照組溶液點樣于硅膠板上(Silica gel 60F 254，Merck)。吹干后將硅膠板置于展開劑中開始層析，展開劑按以下比例配置：正丁醇/甲酸/水(v/v)＝4:6:1。層析結束后，取出硅膠板并吹干，在硅膠板上噴灑顯色劑(苯胺-二苯胺顯色劑)，吹干，再將硅膠板置于高溫條件下顯色，直至出現(xiàn)明顯的斑點。

TLC結果見圖2，TLC結果顯示該微生物胞內酶的降解產物主要有三種組份，均一性較好，適應用于規(guī)?；苽渚恍怨烟恰?/p>