發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及結(jié)合人類april的分離的抗體，包括其片段；編碼此類抗體的多核苷酸；以及產(chǎn)生所述抗體的宿主細胞。所述抗體可以用于治療癌癥并抑制免疫細胞增殖和可能得益于此類免疫細胞增殖抑制的病癥，如自身免疫性疾病、炎癥性疾病或與免疫球蛋白過量產(chǎn)生有關(guān)的疾病。此外，所述抗體還可以用作診斷工具及用于抑制免疫細胞增殖和/或存活的體外試劑。發(fā)明背景april是作為ii型跨膜蛋白表達，但與大多數(shù)其它tnf家族成員不同，它主要作為分泌蛋白加工并在高爾基體中裂解，在高爾基體中，它被弗林轉(zhuǎn)化酶裂解而釋放可溶性活性形式(lopez-fraga等人，2001，emborep2：945-51)。april與多個其它tnf家族配體組裝成在蛋白質(zhì)折疊中具有類似結(jié)構(gòu)同源性的非共價連接的同三聚體(wallweber等人，2004，molbiol343，283-90)。april結(jié)合兩種tnf受體：b細胞成熟抗原(bcma)及跨膜活化物和鈣調(diào)親環(huán)素配體相互作用因子(taci)(綜述于kimberley等人，2009，jcellphysiol.218(1)：1-8中)。此外，近期還顯示april結(jié)合硫酸類肝素蛋白聚糖(hspg)(hendriks等人，2005，celldeathdiffer12,637-48)。已顯示，april在b細胞信號傳導(dǎo)中起作用并且在體外驅(qū)動人類和鼠類b細胞增殖和存活(綜述于kimberley等人，2009，jcellphysiol.218(1)：1-8中)。april主要由免疫細胞亞群，如單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、嗜中性粒細胞、b細胞及t細胞表達，其中有許多還表達baff。此外，april還可以由非免疫細胞，如破骨細胞、上皮細胞及多個腫瘤組織表達(綜述于kimberley等人，2009，jcellphysiol.218(1)：1-8中)。事實上，april最初是基于其在癌細胞中的表達鑒別(hahne等人，1998，jexpmed188，1185-90)。在一組腫瘤細胞系以及如結(jié)腸癌和淋巴癌等人類原發(fā)腫瘤中發(fā)現(xiàn)較高的aprilmrna表達水平。基于95名慢性淋巴細胞性白血病(cll)cll患者的回顧性研究顯示血清中april含量增加，這與疾病進展和總體患者存活率相關(guān)，并且april血清含量較高的患者預(yù)后較差(planelles等人，2007，haematologica92，1284-5)。類似地，已顯示在霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)及多發(fā)性骨髓瘤(mm)中表達(較高水平的)april(綜述于kimberley等人，2009，jcellphysiol.218(1)：1-8中)。在dlbcl患者(nhl)中進行的回顧性研究顯示，癌癥病變中april的表達與較差存活率相關(guān)(schwaller等人，2007，blood109，331-8)。近來，已顯示來自結(jié)腸直腸癌患者的血清中的april血清含量具有積極的診斷價值(ding等人，2013，clin.biochemistry，http：//dx.doi.org/10.1016/j.clinbiochem.2013.06.008)。由于april在b細胞生物學中的作用，它還在許多自身免疫性疾病中起到作用。在許多sle患者中都報告april血清含量增加(koyama等人，2005，annrheumdis64，1065-7)?；仡櫺苑治雠?，april血清含量往往與抗dsdna抗體滴度相關(guān)。另外，還檢測到在患有炎癥性關(guān)節(jié)炎患者的滑膜液中april含量相較于患有如骨關(guān)節(jié)炎等非炎癥性關(guān)節(jié)炎的患者的april含量明顯增加(stohl等人，2006，endocrmetabimmunedisorddrugtargets6，351-8；tan等人，2003，arthritisrheum48，982-92)。若干研究集中在患有多種全身免疫類風濕性疾病(斯耶格倫氏綜合癥(syndrome)、瑞特氏綜合癥(reiter′ssyndrome)、銀屑病關(guān)節(jié)炎、多肌炎及強直性脊柱炎現(xiàn)也包括在內(nèi))的患者的血清中april的存在，并且發(fā)現(xiàn)在這些患者中april水平明顯增加，表明april在這些疾病中也具有重要作用(jonsson等人，1986，scandjrheumatol增刊61，166-9；roschke等人，2002，jimmunol169，4314-21)。此外，還在特應(yīng)性皮膚炎患者的血清中檢測到april血清含量增加(matsushita等人，2007，exp.dermatology17，197-202)。在敗血病中血清april含量也升高并且預(yù)示垂?；颊叩乃劳?roderburg等人，j.criticalcare，2013，http：//dx.doi.org/10.1016/j.jcrc.2012.11.007)。另外發(fā)現(xiàn)，在iga腎病患者中april血清含量增加(mccarthy等人，2011，j.clin.invest.121(10)：3991-4002)。最后，april表達增加也已經(jīng)與多發(fā)性硬化(ms)相關(guān)聯(lián)。在ms患者的星形細胞中發(fā)現(xiàn)april表達相較于正常對照有所增加。這與所描述的在成膠質(zhì)細胞瘤中以及成膠質(zhì)細胞瘤患者的血清中april的表達情況相符(deshayes等人，2004，oncogene23，3005-12；roth等人，2001，celldeathdiffer8，403-10)。april在若干b細胞惡性疾病以及可能的一些實體腫瘤的存活和增殖能力方面起到重要作用。april還在炎癥性疾病或自身免疫性方面起到關(guān)鍵作用。因此，拮抗april的策略是多種此類疾病的治療目標。實際上，當前正在進行用taci-fc(atacicept)靶向april的臨床研究，旨在治療若干自身免疫性疾病。不過，taci-fc也靶向baff，該因子也涉及到正常b細胞維持。wo9614328、wo2001/60397、wo2002/94192、wo9912965、wo2001/196528、wo9900518及wo2010/100056中描述了針對april的抗體。wo2010/100056描述了特異性靶向april的抗體。wo2010/100056的抗體完全阻斷april與taci的結(jié)合，并且至少部分阻斷april與bcma的結(jié)合?？贵whapril.01a完全阻斷與bcma和taci兩者的結(jié)合。hapril.01a抗體在體外和體內(nèi)抑制b細胞增殖、存活及抗原特異性免疫球蛋白分泌(guadagnoli等人，2011，blood117(25)：6856-65)。此外，hapril.01a在體外和體內(nèi)抑制人類cll和mm疾病特有的惡性細胞的增殖和存活(guadagnoli等人，2011，blood117(25)：6856-65；lascano等人，2013，blood122(24)：3960-3；tai等人，2014，ashposter2098)。最后，hapril.01a抑制抗原特異性iga的分泌(guadagnoli等人，2011，blood117(25)：6856-65)。鑒于這些獨特的結(jié)合特征，這一鼠類抗體具有獨特的藥學效用。然而，由于這一抗體是鼠類來源的，故該抗體在人類醫(yī)學中的藥學效用還存在某些缺點。因此，本發(fā)明旨在提供更適用于人類醫(yī)學的改良型hapril.01a抗體。發(fā)明概述本發(fā)明提供了在vh和vl結(jié)構(gòu)域框架區(qū)包含某些取代的hapril.01a類似物。已意外地發(fā)現(xiàn)，當在hapril.01a的抗原結(jié)合位點中，hapril.01a的vh結(jié)構(gòu)域框架區(qū)被選自seqidno12、14、16或18的vh氨基酸序列框架區(qū)取代，并且hapril.01a的vl結(jié)構(gòu)域框架區(qū)被選自seqidno30的vl氨基酸序列框架區(qū)取代時，獲得功能性hapril.01a類似物。這一意外發(fā)現(xiàn)歸于以下事實：本發(fā)明的發(fā)明人研究顯示，僅有限的替代性人類來源vh和vl框架序列的組合可以支持hapril.01acdr與人類april的適當結(jié)合并由此可以產(chǎn)生功能性hapril.01a類似物。此外，本發(fā)明的發(fā)明人還顯示，通過引入某些特定氨基酸取代可以進一步改進hapril.01類似物。具體地說，所選擇的vh氨基酸序列中的氨基酸取代r72s和/或雙取代r67k加v68a。因此，根據(jù)第一方面，本發(fā)明涉及一種april結(jié)合抗體，該抗體與具有hapril.01a抗原結(jié)合位點的抗體，如wo2010/100056中公開的單克隆抗體hapril.01a結(jié)合至相同的人類april表位，所述人類april接惡化抗體包括含vh和vl結(jié)構(gòu)域的多個抗原結(jié)合位點，其中在抗原結(jié)合位點中，vh結(jié)構(gòu)域的框架序列與選自seqidno：12、14、16或18，優(yōu)選與seqidno：14或18，最優(yōu)選與seqidno：18的vh氨基酸序列的框架序列具有至少70％序列相似性，并且vl結(jié)構(gòu)域的框架序列與選自seqidno：30的vl氨基酸序列的框架序列具有至少70％序列相似性。本發(fā)明另一方面涉及編碼本發(fā)明抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的呈分離形式的多核苷酸；包含多個所述多核苷酸的表達單元；以及包含所述表達單元和/或多個所述多核苷酸的宿主細胞。本發(fā)明又另一方面涉及一種產(chǎn)生本發(fā)明抗體的方法，該方法包括：a)在培養(yǎng)基中，在表達所述多個多核苷酸的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細胞，由此產(chǎn)生包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的多肽；和b)從所述宿主細胞或培養(yǎng)基回收所述多肽。本發(fā)明另一方面的主題是一種組合物，該組合物包含本發(fā)明的抗體和藥學上可接受的載劑或稀釋劑，以及任選使用的多種其它活性化合物。本發(fā)明又另一方面是本發(fā)明抗體的治療和診斷用途。序列簡述序列表中呈現(xiàn)的序列涉及vh和vl結(jié)構(gòu)域以及重鏈和輕鏈的氨基酸序列和編碼dna序列，來自所述重鏈和輕鏈的框架序列可以用于根據(jù)本發(fā)明的抗體中。另外，還呈現(xiàn)了hapril.01a中vh和vl結(jié)構(gòu)域的cdr以及重鏈和輕鏈的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，hapril.01a的cdr被用于本發(fā)明的抗體中。下表1將序列id與其對應(yīng)序列相關(guān)聯(lián)。表1：序列表seqidno：11-52涉及工程改造的所述免疫球蛋白vh、vl、重鏈或輕鏈序列。附圖簡述圖1顯示在針對不依賴t細胞的b細胞反應(yīng)的體內(nèi)測試中用hapril.01a或類似物14_1g.15靶向april的結(jié)果。用250μgnp-ficoll(第0天)激發(fā)轉(zhuǎn)基因小鼠(april-tg)，并在第-1天和第3天用hapril.01a或14_1g.15治療。使用pbs和野生型小鼠(wt)作為陰性對照。利用elisa測量免疫球蛋白滴度(iga1(圖a)和iga2(圖b)、igg(圖c)及igm(圖d)。14_1g.15抑制針對np-ficoll的不依賴t細胞的免疫反應(yīng)的有效性高于其hapril.01a類似物。詳述因此，本發(fā)明涉及與具有hapril.01a抗原結(jié)合位點的抗體，包括抗體類似物，如抗體片段結(jié)合至相同的人類april表位的抗體。wo2010/100056中公開了抗體hapril.01a以及vh和vl結(jié)構(gòu)域及cdr的序列。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，不太可能用人類替代物取代hapril.01a的vh和vl結(jié)構(gòu)域的小鼠框架區(qū)。此外，所選擇的替代性框架序列產(chǎn)生具有意外的特征的替代性抗人類april抗體。據(jù)信，所選擇的框架序列在結(jié)合至hapril.01a的人類april表位的情況下表現(xiàn)其特有特征，并因此在這一情況下具有廣泛效用。因此，本發(fā)明旨在與hapril.01a結(jié)合至相同表位并且在vh和vl結(jié)構(gòu)域內(nèi)包含所選擇的框架序列的任何抗體(包括片段和/或衍生物和/或類似物)。在某些實施方案中，此類抗體將包含與hapril.01a的cdr不同的替代性cdr。不過，根據(jù)其它實施方案，該抗體將包含與hapril.01a的cdr類似或甚至相同的cdr。根據(jù)某些實施方案，包含hapril.01a的vh結(jié)構(gòu)域cdr1、cdr2及cdr3以及vl結(jié)構(gòu)域cdr1、cdr2及cdr3，或者所述序列中任一個的變體的抗體被認為是與單克隆抗體hapril.01a結(jié)合至相同人類april表位的抗體。特別是當該抗體以約100nm或更低kd結(jié)合人類april和/或以約100nm或更低ic50阻斷熱內(nèi)april與人類bcma和taci的結(jié)合時更是如此。在本發(fā)明內(nèi)，優(yōu)選抗體以約100nm或更低，如在選自100-0.001nm，例如100-0.010、100-0.050、100-0.100、100-0.150、100-0.200、100-0.250、100-0.300、100-0.350、100-0.400、100-0.450、90-0.500、80-0.550、70-0.600、60-0.650、50-0.700、40-0.750、30-0.800、20-0.850、10-0.900或1.0-0.950nm的區(qū)間內(nèi)的kd值結(jié)合人類april。技術(shù)人員應(yīng)了解，優(yōu)選較小的kd值，如低于50、20、10、1.00nm的值。kd值在此類區(qū)間內(nèi)的抗體適于臨床應(yīng)用(參見例如，presta等人，2001，thromb.haemost.85：379-389；yang等人，2001，crit.rev.oncol.hematol.38：17-23；carnahan等人，2003，clin.cancerres.(增刊)9：3982s-3990s)?？贵w親和力可以使用技術(shù)人員已知的標準分析，例如實驗部分中例示的分析法測定。更優(yōu)選本發(fā)明的抗體以約100nm或更低，如在選自100-0.001nm，例如100-0.010、100-0.050、100-0.100、100-0.150、100-0.200、100-0.250、100-0.300、100-0.350、100-0.400，100-0.450、90-0.500、80-0.550、70-0.600、60-0.650、50-0.700、40-0.750、30-0.800、20-0.850、10-0.900或1.0-0.950nm的區(qū)間內(nèi)的ic50值阻斷人類april與人類bcma和taci的結(jié)合。技術(shù)人員應(yīng)了解，優(yōu)選較小的ic50值，如低于50、20、10、1.00nm的值?？贵w與hapril.01a結(jié)合相同的表位可以根據(jù)wo2010/100056實施例2或5中呈現(xiàn)的方法，通過評估本發(fā)明抗體和具有hapril.01a抗原結(jié)合位點的參考抗體競爭結(jié)合人類april，或利用以下所論述的技術(shù)人員已知的其它交叉阻斷或表位定位技術(shù)來評價。hapril.01a的抗原結(jié)合位點是由seqidno：3和4中所呈現(xiàn)的vh和vl結(jié)構(gòu)域界定。因此，包含seqidno：3和4中所呈現(xiàn)的vh和vl結(jié)構(gòu)域的任何抗體，包括抗體類似物，如抗體片段，都可以用作參考抗體以評價與hapril.01a結(jié)合至相同人類april表位。wo2010/100056中公開的抗體hapril.01a是具有hapril.01a抗原結(jié)合位點的抗體的一個例子，并且在本發(fā)明的情況下是適合的參考抗體。不過，來源于hapril.01a的抗體片段，如fab、f(ab)2或fv片段也可以用作參考抗體。基于seqidno：1和2的dna序列以及seqidno：3和4的氨基酸序列，技術(shù)人員將能夠構(gòu)造并產(chǎn)生這些來源于hapril.01a的抗體片段?；谒峁┑男蛄?，技術(shù)人員還能夠通過將seqidno：3的重鏈可變區(qū)氨基酸序列(由seqidno：1編碼)與igg1恒定區(qū)(來自小鼠或來自不同物種，優(yōu)選來自小鼠)接合并且將seqidno：4的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列(由seqidno：2編碼)與k恒定區(qū)(來自小鼠或來自不同物種，優(yōu)選來自小鼠)結(jié)合而產(chǎn)生用作參考抗體的hapril.01a類似物。當用所述方法評價時，與hapril.01a結(jié)合至相同的人類april表位的抗體可以阻斷具有hapril.01a抗原結(jié)合位點的參考抗體與人類april的結(jié)合，其ic50值是約100nm或更低，如在選自100-0.001nm，例如100-0.010、100-0.050、100-0.100、100-0.150、100-0.200、100-0.250、100-0.300、100-0.350、100-0.400、100-0.450、90-0.500、80-0.550、70-0.600、60-0.650、50-0.700、40-0.750、30-0.800、20-0.850、10-0.900或1.0-0.950nm的區(qū)間內(nèi)。技術(shù)人員應(yīng)了解，優(yōu)選較小的ic50值，如低于50、20、10、1.00nm的值。因此，本發(fā)明抗體具有以下特征中的一個或多個：(i)以約100nm或更低kd結(jié)合人類april；(ii)以約100nm或更低ic50阻斷人類april與人類bcma和人類taci的結(jié)合；(iii)以約100nm或更低ic50阻斷hapril.01a與人類april的結(jié)合。這些特征可以組合成以下組合：(i)或(ii)或(iii)；(i)和(ii)；(i)和(iii)；(ii)和(iii)；(i)和(ii)及(iii)。根據(jù)本發(fā)明，選擇該抗體的抗原結(jié)合位點中vh結(jié)構(gòu)域框架序列使得其與選自seqidno.12、14、16或18的vh氨基酸序列的框架序列具有至少70％序列相似性。根據(jù)一個優(yōu)選實施方案，選擇該抗體的vh結(jié)構(gòu)域框架序列使得其與選自seqidno.14或18，最優(yōu)選seqidno：18的vh氨基酸序列的框架序列具有至少70％序列相似性。選擇該抗體的抗原結(jié)合位點中vl結(jié)構(gòu)域框架序列使得其與選自seqidno.30的vl氨基酸序列的框架序列具有至少70％序列相似性。選自seqidno.12、14、16或18的vh氨基酸序列以及選自seqidno.30的vl氨基酸序列同時包含框架序列和cdr序列。并入這些vh和vl氨基酸序列中的cdr序列是hapril.01a的那些序列，并且對應(yīng)于seqidno.5(hapril.01avhcdr1)、6(hapril.01avhcdr2)、7(hapril.01avhcdr3)、8(hapril.01avlcdr1)、9(hapril.01avlcdr2)、10(hapril.01avlcdr3)。不過，如上文所述，使用如本發(fā)明內(nèi)選擇的vh和vl框架序列不局限于與hapril.01a的特定cdr組合。因此，根據(jù)某些實施方案，至少70％的序列相似性應(yīng)僅認為針對框架序列，而不是針對如選自seqidno.12、14、16或18的完整vh氨基酸序列或如選自seqidno.30的完整vl氨基酸序列。在seqidno.12、14、16或18中呈現(xiàn)的vh氨基酸序列的框架序列是這些序列中除vhcdr外的部分，即，除與seqidno.5(hapril.01avhcdr1)、6(hapril.01avhcdr2)、7(hapril.01avhcdr3)相同的序列部分外的部分。在seqidno.30中呈現(xiàn)的vl氨基酸序列的框架序列是這一序列中除vlcdr外的部分，即，除與seqidno.8(hapril.01avlcdr1)、9(hapril.01avlcdr2)、10(hapril.01avlcdr3)相同的序列部分外的部分。根據(jù)替代性實施方案，至少70％的序列相似性應(yīng)認為是針對選自seqidno.12、14、16或18的完整vh氨基酸序列及選自seqidno.30的完整vl氨基酸序列。在本發(fā)明的說明中，至少70％序列相似性應(yīng)理解為是指至少80％，如至少85％，優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％，如至少99％序列相似性。技術(shù)人員應(yīng)了解，“序列相似性”是指個別核苷酸或肽序列相似的程度。兩個序列之間的相似程度是基于一致性程度加上保守變化的程度。“序列相似性”百分比是相同或保守變化的氨基酸或核苷酸的百分比，即“序列相似性”＝(％序列一致性)+(％保守變化)。出于本發(fā)明的目的，“保守變化”和“一致性”被視為范圍較寬的術(shù)語“相似性”的種類。因此，在使用術(shù)語序列“相似性”時，它包含序列“一致性”和“保守變化”。根據(jù)某些實施方案，不考慮保守變化并且％序列相似性是指％序列一致性。術(shù)語“序列一致性”是技術(shù)人員所知的。為了測定兩個氨基酸序列或兩個核酸的序列一致性程度，出于最佳比較的目的，將這些序列對準(例如，可以在第一個氨基酸序列或核酸序列中引入空位，以便與第二個氨基酸或核酸序列達到最佳對準)。此類對準可以在所比較序列的全長內(nèi)進行?；蛘?，該對準可以在較短比較長度內(nèi)進行，例如在約20、約50、約100或更多個核酸/堿基或氨基酸內(nèi)進行。接著比較在對應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置處的氨基酸或核苷酸。當?shù)谝粋€序列中的某一位置被與第二個序列中對應(yīng)位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時，則分子在該位置處一致。序列間共有的一致性程度典型地以兩個序列之間的一致性百分比表示并且隨著這些序列中一致殘基所共有的一致位置的數(shù)量變化(即，％一致性＝對應(yīng)位置處一致殘基的數(shù)量/位置總數(shù)×100)。優(yōu)選的是，比較的兩個序列具有相同或大體上相同的長度。“保守變化”百分比可以按與序列一致性百分比類似的方式測定。不過，在這一情況下，在氨基酸或核苷酸序列的特定位置處可能保留原始殘基的功能特性的變化根據(jù)是否未發(fā)生變化進行評分。對于氨基酸序列，相關(guān)功能特性是氨基酸的物理-化學特性。本發(fā)明多肽中氨基酸的保守取代可以選自該氨基酸所屬類別其它成員。舉例來說，蛋白質(zhì)生物化學領(lǐng)域中眾所周知，屬于具有特定大小或特征(如電荷、疏水性及親水性)的一組氨基酸的氨基酸可以被另一氨基酸取代，而基本上不改變蛋白質(zhì)特性，特別是在蛋白質(zhì)與生物活性不直接相關(guān)的區(qū)域中(參見例如，watson等人，molecularbiologyofthegene，thebenjamin/cummingspub.co.，第224頁(第4版，1987))。舉例來說，非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺及谷氨酰胺。帶正電(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸及組氨酸。帶負電(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。保守取代包括例如，lys被arg取代及arg被lys取代，由此保持正電荷；glu被asp取代及asp被glu取代，由此保持負電荷；ser被thr取代及thr被ser取代，由此保持游離-oh；以及gln被asn取代及asn被gln取代，由此保持游離-nh2。本發(fā)明的cd70結(jié)合肽的氨基酸序列中的示例性保守取代可以根據(jù)以下陳述的那些進行：表2：示例性保守氨基酸取代對于核苷酸序列，相關(guān)功能特性主要是在與轉(zhuǎn)錄和/或翻譯機器有關(guān)序列的開放閱讀框內(nèi)某一核苷酸所攜帶的生物信息。眾所周知，遺傳密碼具有簡并性(或冗余)并且多個密碼子關(guān)于其編碼的氨基酸可以攜帶相同的信息。舉例來說，在某些物種中，氨基酸亮氨酸是由uua、uug、cuu、cuc、cua、cug密碼子(或?qū)τ赿na是tta、ttg、ctt、ctc、cta、ctg)編碼，并且氨基酸絲氨酸是由uca、ucg、ucc、ucu、agu、agc(或?qū)τ赿na是tca、tcg、tcc、tct、agt、agc)指明。不改變翻譯的信息的核苷酸變化被視為保守變化。技術(shù)人員應(yīng)意識到以下事實：使用不同的數(shù)學算法的若干不同計算機程序可用于測定兩個序列之間的一致性。舉例來說，可以使用采用了needleman和wunsch算法的計算機程序(needleman等人(1970))。根據(jù)一個實施方案，計算機程序是accelrysgcg軟件包(accelrysinc.，sandiegou.s.a)中的gap程序?？梢允褂玫娜〈仃囀抢鏱losum62矩陣或pam250矩陣，其中空位權(quán)重是16、14、12、10、8、6或4并且長度權(quán)重是1、2、3、4、5或6。技術(shù)人員應(yīng)理解，所有這些不同參數(shù)將得到略有不同的結(jié)果，而且當使用不同算法時，兩個序列的總體一致性百分比無明顯改變。根據(jù)一個實施方案，使用accelrysgcg軟件包(accelrysinc.，sandiegou.s.a)中的gap程序測定兩個核苷酸序列之間的一致性百分比。使用nwsgapdnacmp矩陣以及40、50、60、70或80的空位權(quán)重和1、2、3、4、5或6的長度權(quán)重。在另一實施方案中，使用被合并于align程序(2.0版)(使用genestream服務(wù)器ighmontpellierfrancehttp：//xylian.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi的序列數(shù)據(jù)，在alignquery獲得)中的e.meyers和w.miller(meyers等人(1989))算法，使用pam120殘基權(quán)重表、12分的空位長度罰分及4分的空位罰分，測定兩個氨基酸或核苷酸序列之間的一致性百分比。對于本發(fā)明，最優(yōu)選使用blast(基本局部比對工具)測定核苷酸或氨基酸序列之間的一致性和/或相似性百分比。使用altschul等人(1990)的blastn、blastp、blastx、tblastn及tblastx程序的查詢可以登錄http://www.ncbi.nlm.nih.gov，經(jīng)由blast的線上版本發(fā)布?；蛘?，可以使用經(jīng)ncbi互聯(lián)網(wǎng)站下載的單機版blast(例如2.2.29版(2014年1月3日發(fā)布))。優(yōu)選用以下參數(shù)進行blast查詢。為了測定氨基酸序列之間的一致性和/或相似性百分比：算法：blastp；字長：3；評分矩陣：blosum62；空位罰分：存在：11；延伸：1；組成調(diào)整：條件性組成評分矩陣調(diào)整；過濾器：關(guān)；掩碼：關(guān)。為了測定核苷酸序列之間的一致性和/或相似性百分比：算法：blastn；字長：11；查詢范圍內(nèi)的最大匹配數(shù)：0；匹配/錯配評分：2，-3；空位罰分：存在：5；延伸：2；過濾器：低復(fù)雜度區(qū)域；掩碼：僅針對查詢表的掩碼。“保守變化”百分比可以按與序列一致性百分比類似的方式，借助于指定算法和計算機程序測定。一些計算機程序，例如blastp，呈現(xiàn)正值(＝相似性)的數(shù)量/百分比和一致性數(shù)量/百分比。保守變化的百分比可以通過用正值/相似性百分比減去一致性百分比得到(保守變化百分比＝相似性百分比-一致性百分比)。技術(shù)人員應(yīng)了解，本發(fā)明的抗體將包含多個抗原結(jié)合位點。所選擇的vh和vl結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列框架序列連同cdr序列組合于抗原結(jié)合位點中。來自本發(fā)明所設(shè)想的vh和vl結(jié)構(gòu)域的框架序列的具體組合如下表3中所示，其中“x”存在于所設(shè)想的vh和vl結(jié)構(gòu)域組合的位置處。表3：vh和vl的框架序列組合.來自這些vh和vl結(jié)構(gòu)域的框架序列的組合產(chǎn)生能夠結(jié)合至人類april的抗體。應(yīng)注意的是，如在實驗部分中進一步呈現(xiàn)，在本發(fā)明的發(fā)明人所進行的測試中，當將本發(fā)明的vh序列與seqidno：30(vl15)的vl序列組合時，僅獲得具有april結(jié)合功能的抗體。在所測試的所選vh序列與其它vl序列(vl10-vl14)的組合中，所得抗體不具有功能性april結(jié)合特性。如在實驗部分中所呈現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明使用的vh與vl序列的組合的另一意外作用是，使(熱)穩(wěn)定性相較于具有hapril.01avh與vl序列的抗體有所改善。優(yōu)選將seqidno：30的vl框架序列與來自seqidno：18或其衍生序列，如seqidno32、34、36、38、40的vh框架序列的vh框架序列組合。這些優(yōu)選組合在表3中以加下劃線的“x”呈現(xiàn)。來自seqidno：30的vl框架序列與來自seqidno：40的vh框架序列的最優(yōu)選組合在表3中以粗體字(并加下劃線)顯示的“x”呈現(xiàn)。已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)，這些vh與vl框架序列組合產(chǎn)生的抗體具有額外的有益特征，包括有益的穩(wěn)定性特征和/或改善的與人類april靶的結(jié)合。根據(jù)某些實施方案，在vh結(jié)構(gòu)域中，cdr1、cdr2、cdr3中至少一個是選自分別由seqno5、6、7或所述序列中任一個的變體組成的組。優(yōu)選在vh結(jié)構(gòu)域中，cdr1、cdr2及cdr3分別選自seqno5、6、7或所述序列中任一個的變體。這些vh結(jié)構(gòu)域cdr序列對應(yīng)于hapril.01a的vh結(jié)構(gòu)域cdr。根據(jù)某些實施方案，在vl結(jié)構(gòu)域中，cdr1、cdr2、cdr3中至少一個是選自分別由seqno8、9、10或所述序列中任一個的變體組成的組。優(yōu)選在vl結(jié)構(gòu)域中，cdr1、cdr2及cdr3分別選自seqno8、9、10或所述序列中任一個的變體。這些vl結(jié)構(gòu)域cdr序列對應(yīng)于hapril.01a的vl結(jié)構(gòu)域cdr。根據(jù)某些實施方案，在抗體的抗原結(jié)合位點中，vh結(jié)構(gòu)域cdr1、cdr2及cdr3分別選自seqno5、6、7或所述序列中任一個的變體，并且vl結(jié)構(gòu)域cdr1、cdr2及cdr3分別選自seqno8、9、10或所述序列中任一個的變體。本發(fā)明的發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，組合了本發(fā)明中所使用的vh和vl框架序列的抗體可以作進一步改善。具體地說，vh氨基酸序列中的取代r72s改善與人類april的結(jié)合。此外，vh氨基酸序列中的組合取代r67k-v68a也改善與人類april的結(jié)合。因此，根據(jù)某些實施方案，本發(fā)明涉及vh氨基酸序列中的72位氨基酸是s的抗體。seqidno.32、34、36、38、40的vh氨基酸序列是此類在72位具有s殘基的vh氨基酸序列的實例。根據(jù)其它實施方案，本發(fā)明涉及vh氨基酸序列中的67位氨基酸是k并且68位氨基酸是a的抗體。預(yù)計全部三個氨基酸取代r72s、r67k及v68a的組合也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，根據(jù)其它實施方案，本發(fā)明涉及vh氨基酸序列中的72位氨基酸是s，67位氨基酸是k并且68位氨基酸是a的抗體。除vh和vl結(jié)構(gòu)域外，該抗體還可以包含額外的結(jié)構(gòu)域，如適量的ch結(jié)構(gòu)域及適量的cl結(jié)構(gòu)域。ch結(jié)構(gòu)域和cl結(jié)構(gòu)域可以是人類來源的。這些結(jié)構(gòu)域還包括向抗體提供經(jīng)過修飾(或阻斷的)fc區(qū)以提供改變的效應(yīng)功能的結(jié)構(gòu)域。參見例如，美國專利號5,624,821；wo2003/086310；wo2005/120571；wo2006/0057702；presta，2006，adv.drugdeliveryrev.58：640-656；vincent和zurini，biotechnol.j.，2012，7：1444-50；kaneko和niwa，biodrugs，2011，25：1-11。此類修飾可以用于增強或抑制免疫系統(tǒng)的各種反應(yīng)，而且可能在診斷和療法中具有有益作用。fc區(qū)的變化包括氨基酸變化(取代、缺失及插入)、糖基化或去糖基化，以及添加多個fc。根據(jù)某些實施方案，優(yōu)選使用展示較低fc效應(yīng)功能的fc區(qū)。根據(jù)某些實施方案，本發(fā)明的抗體也可以具有源自于人類igg4的fc區(qū)和/或帶有n297q糖基化缺陷型突變的fc區(qū)。cl結(jié)構(gòu)域可以選自人類κ或λ恒定結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選使用人類κcl結(jié)構(gòu)域。根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，提供了包含fc和cl結(jié)構(gòu)域的抗體，其中vh結(jié)構(gòu)域氨基酸序列是在與選自seqidno：42、44、46、48、52，優(yōu)選seqidno：48或52，最優(yōu)選seqidno：52的氨基酸序列具有至少70％序列相似性的重鏈氨基酸序列中，并且vl結(jié)構(gòu)域氨基酸序列是在與選自seqidno：50的氨基酸序列具有至少70％序列相似性的輕鏈氨基酸序列中。本發(fā)明所設(shè)想的這些重鏈和輕鏈的特定組合的具體組合如下表4中所示，其中“x”存在于所設(shè)想的重鏈和輕鏈組合的位置處。表4優(yōu)選的組合以帶下劃線的“x”指示。更優(yōu)選的組合是以粗體(并且加下劃線)“x”指示。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及分離的多核苷酸，該多核苷酸編碼根據(jù)本發(fā)明的抗體的vh結(jié)構(gòu)域和/或vl結(jié)構(gòu)域。編碼vh結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列優(yōu)選是與選自seqidno：11、13、15、17、31、39、41、43、45、47、51，優(yōu)選地選自seqidno：17、31、39、47或51，更優(yōu)選seqidno：51的多核苷酸序列具有至少70％序列相似性的多核苷酸序列。編碼vl結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列優(yōu)選是與選自seqidno：29或49，優(yōu)選seqidno：49的多核苷酸序列具有至少70％序列相似性的多核苷酸序列.本發(fā)明還涉及一種包含多個表達載體的表達單元，這些表達載體包含處于適合調(diào)控序列控制下的多個根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸，其中所述多個多核苷酸編碼根據(jù)本發(fā)明的抗體的vh結(jié)構(gòu)域和vl結(jié)構(gòu)域。所述表達單元可以被設(shè)計成使得編碼vh結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列和編碼vl結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列能在同一表達載體上。因此，該表達單元可以包含單一載體?；蛘?，編碼vh結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列和編碼vl結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列可以在不同表達載體上。在此類實施方案中，該表達單元將包含多個，如2個表達載體。本發(fā)明另一方面涉及一種宿主細胞，該宿主細胞包含多個本發(fā)明的多核苷酸和/或本發(fā)明的表達單元。該表達單元優(yōu)選是包括了同時包含編碼vh結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列和編碼vl結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列的表達載體的表達單元。本發(fā)明的抗體可以是以下任一種：-嵌合抗體或其片段；-人源化抗體或其片段；或-選自由fab、fab′、fab′-sh、fv、scfv、f(ab′)2、雙特異性單克隆抗體及雙抗體。優(yōu)選包含多個基于hapril.01a的cdr的抗原結(jié)合位點的人源化抗體。應(yīng)注意，根據(jù)本發(fā)明選擇的框架區(qū)是來自人類來源并因此適用于獲得人源化抗體，特別是當與來自人類來源的恒定區(qū)組合時。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生本發(fā)明的抗體的方法，該方法包括：a)在培養(yǎng)基中，在表達本發(fā)明的多核苷酸的條件下，培養(yǎng)包含多個所述多核苷酸的宿主細胞和/或本發(fā)明的表達單元，由此產(chǎn)生包含輕鏈和重鏈可變區(qū)的多肽；以及b)從所述宿主細胞或培養(yǎng)基回收所述多肽。本發(fā)明另外涉及一種組合物，該組合物包含本發(fā)明的抗體以及藥學上可接受的載劑或稀釋劑。在一個實施方案中，此類組合物可以包含超過一種抗體。在一個實施方案中，該組合物除包含一種或多種本發(fā)明的抗體外，還包含一種或多種其它活性化合物。此類組合性組合物可以用于組合療法中，例如用于治療癌癥。在此情況下，所述抗體可以與一種或多種常用抗癌藥組合。對于其它組合療法，可以使用其它額外的活性化合物。對于組合療法，不一定要在同一組合物中具有兩種或更多種活性化合物。因此，所述抗體和其它活性化合物的組合或后續(xù)用途也是本發(fā)明的一部分，其中該抗體和該其它活性化合物是同時或依序施用。從以上說明可知，本發(fā)明的抗體可以用于療法和診斷中并且用于其它非治療目的。因此，本發(fā)明另外涉及在療法和診斷中以及其它非治療目的中使用所述抗體的方法。在一個實施方案中，該療法包括抑制免疫細胞增殖和/或免疫細胞存活。在另一實施方案中，治療旨在治療癌癥。在一個實施方案中，該療法包括治療自身免疫性疾病。在一個實施方案中，該療法包括治療炎癥性疾病。在一個實施方案中，該療法包括治療ig分泌介導(dǎo)的疾病，特別是iga分泌介導(dǎo)的疾病。下文將更詳細地論述本發(fā)明抗體的治療應(yīng)用。本發(fā)明的抗體當用于非治療性應(yīng)用中時，可以例如在體外或離體技術(shù)中應(yīng)用，如流式細胞術(shù)、蛋白質(zhì)印跡、酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)及免疫組織化學分析。療法鑒于本發(fā)明抗體與hapril.01a類似，也結(jié)合至人類april的事實，本發(fā)明的抗體適用于與hapril.01a類似的療法中，并且其改良之處在以上及實驗部分中予以論述。因此，本發(fā)明的抗體適于治療已知或預(yù)期通過阻斷人類april與bcma和/或taci的相互作用可以得到改善的病癥。如本領(lǐng)域中所知，阻斷人類april與bcma和/或taci的相互作用可抑制免疫細胞增殖和/或存活，并因此可以用于治療得益于此類免疫細胞增殖和/或存活阻斷的病癥，如炎癥性疾病、由ig分泌介導(dǎo)的疾病和/或自身免疫性疾病。阻斷人類april與bcma和/或taci的相互作用也有益于治療癌癥。可能得益于本發(fā)明抗體的自身免疫性病癥可以選自多發(fā)性硬化、類風濕性關(guān)節(jié)炎、1型糖尿病、銀屑病、克羅恩氏病(crohn′sdisease)，以及其它炎癥性腸病如潰瘍性結(jié)腸炎、全身性紅斑狼瘡(sle)、自身免疫性腦脊髓炎、重癥肌無力(mg)、橋本氏甲狀腺炎(hashimoto′sthyroiditis)、古帕斯捷氏綜合征(goodpasture′ssyndrome)、天皰瘡、格雷夫斯氏病(gravesdisease)、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血小板減少性紫癜、含抗膠原蛋白抗體的硬皮病、混合性結(jié)締組織病、多肌炎、惡性貧血、特發(fā)性阿狄森病(idiopathicaddison′sdisease)、自身免疫相關(guān)性不孕、腎小球性腎炎、新月體性腎小球腎炎、增生性腎小球腎炎、大皰性類天皰瘡、斯耶格倫氏綜合癥、銀屑病關(guān)節(jié)炎、胰島素抵抗、自身免疫性糖尿病、自身免疫性肝炎、自身免疫性血友病、自身免疫性淋巴細胞增生綜合癥(alps)、自身免疫性肝炎、自身免疫性血友病、自身免疫性細胞增生綜合癥、自身免疫性葡萄膜炎、格林-巴利綜合癥(guillain-baresyndrome)、動脈硬化及阿爾茨海默氏病(alzheimer′sdisease)。此外，本發(fā)明的抗體還可以有利地治療得益于免疫反應(yīng)降低的其它相關(guān)病癥，如移植物(移植)排斥反應(yīng)或過敏性病癥。另外，本發(fā)明的抗體可以有利地治療得益于免疫球蛋白水平，如iga(包括iga1或iga2)、igg、igm水平降低的其它病癥，如與ig分泌，特別是iga分泌；ig過量產(chǎn)生，如iga(包括iga1或iga2)、igg、igm過量產(chǎn)生，特別是iga過量產(chǎn)生；或ig沉積，特別是iga沉積有關(guān)的病癥。此類病癥的實例包括但不限于，iga腎病及其它形式腎小球腎炎、脂瀉病、類天皰瘡疾病、亨諾-許蘭二氏紫癜(henloch-purpura)，以及與ig沉積有關(guān)的其它自身免疫疾病。在本發(fā)明范圍內(nèi)，“病癥”的治療包括抗人類april抗體的任何治療用途，包括預(yù)防性和治療性用途。因此，術(shù)語“病癥”可以指疾病狀態(tài)，而且在不使生理變化至有害狀態(tài)的預(yù)防情況下還指生理狀態(tài)。在本發(fā)明范圍內(nèi)的癌癥包括但不限于，白血病、急性淋巴細胞白血病、急性髓細胞白血病、成髓細胞早幼粒細胞、髓單核細胞性單核細胞紅白血病、慢性白血病、慢性髓細胞(粒細胞)白血病、慢性淋巴細胞白血病、套細胞淋巴瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(burkitt′slymphoma)及邊緣區(qū)b細胞淋巴瘤、真性紅細胞增多癥淋巴瘤、霍奇金氏病(hodgkin′sdisease)、非霍奇金氏病、多發(fā)性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥(waldenstrom′smacroglobulinemia)、重鏈疾病、實體腫瘤、肉瘤及癌瘤，纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏腫瘤(ewing′stumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸肉瘤、結(jié)腸直腸癌瘤、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝細胞瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎性癌、維爾姆斯氏腫瘤(wilm′stumor)、子宮頸癌、子宮癌、睪丸癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮細胞癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、寡樹突膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、黑色素瘤、成神經(jīng)細胞瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、鼻咽癌、食管癌、基底細胞癌、膽管癌、膀胱癌、骨癌、腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)癌癥、子宮頸癌、絨毛膜癌、結(jié)腸直腸癌、結(jié)締組織癌、消化系統(tǒng)癌癥、子宮內(nèi)膜癌、食管癌、眼癌、頭頸癌、胃癌、上皮內(nèi)贅瘤、腎癌、喉癌、肝癌、肺癌(小細胞肺癌、大細胞肺癌)、黑色素瘤、成神經(jīng)細胞瘤；口腔癌(例如唇癌、舌癌、口癌及咽癌)、卵巢癌、胰腺癌、視網(wǎng)膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、直腸癌；呼吸系統(tǒng)癌癥、肉瘤、皮膚癌、胃癌、睪丸癌、甲狀腺癌、子宮癌及泌尿系統(tǒng)癌癥。特別值得關(guān)注的癌癥是具有表達april的細胞，如b細胞源性惡性疾病、淋巴癌或結(jié)腸癌或肺癌，或多發(fā)性骨髓瘤(mm)，或慢性淋巴細胞白血病(cll)b細胞的癌癥。為了治療以上提到的任何病癥，可以將本發(fā)明的抗體單獨或與其它治療劑組合直接給與受試者。因此，根據(jù)本發(fā)明某些實施方案，本發(fā)明的抗體可以與多種化學治療劑組合于其應(yīng)用中和/或組合物中，所述化學治療劑被用于治療多發(fā)性骨髓瘤(mm)、骨髓增生異常綜合癥(mds)、waldenstroms巨球蛋白血癥、b-cll、彌漫性大細胞b細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤，以及韋格納氏肉芽腫(wegenersgranulomatosis)，如美法侖(melphalan)、長春新堿(vincristine)、氟達拉濱(fludarabine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、苯達莫司汀(bendamustine)、依托泊苷(etoposide)、多柔比星(doxorubicin)、環(huán)磷酰胺、順鉑(cisplatin)。此外，本發(fā)明的抗體可以與多種免疫調(diào)節(jié)劑組合于其應(yīng)用中和/或組合物中，如皮質(zhì)類固醇(地塞米松(dexamethasone)、潑尼松龍(prednisolone))、沙利度胺類似物(thalidomideanalog)(沙利度胺、來那度胺(lenalidomide)、泊馬度胺(pomalidomide))。本發(fā)明的抗體還可以與多種靶向激酶抑制劑組合于其應(yīng)用中和/或組合物中，例如依魯替尼(ibrutinib)、艾達拉里斯(idelalisib)。另外，本發(fā)明的抗體還可以與多種靶向cd20的抗體療法，如利妥昔單抗(rituximab)、奧法木單抗(ofatumumab)、奧奴珠單抗(obinotuzumab)；或靶向cd52的抗體療法，如阿侖珠單抗(alemtuzumab)；靶向cd38的抗體療法，如達雷木單抗(daratumumab)；靶向il-6或il-6受體的抗體療法(如薩利奴單抗(sarilumab)、托珠單抗(tocilizumab))；靶向cs-1的抗體療法(如埃羅妥珠單抗(elotuzumab)；靶向bcma的抗體療法(如gsk2857916)；或靶向baff或blyss的抗體療法(如他貝魯單抗(tabalumab))組合于其應(yīng)用中和/或組合物中。此外，本發(fā)明的抗體還可以與多種雙膦酸鹽(如帕米膦酸鹽(pamidronate)、唑來膦酸(zolendronicacid))組合于其應(yīng)用中和/或組合物中。先前已描述，april保護mm細胞免受il-6損失、地塞米松及硼替佐米(bortezomib)治療影響(moreaux等人，2004，blood103(8)：3148-57；li等人，2010，medoncol.27：439-45)。經(jīng)顯示，hapril.01a在來那度胺和地塞米松治療中逆轉(zhuǎn)april介導(dǎo)的mm細胞存活(tai等人，2014，ashposter2098)。鑒于本領(lǐng)域中的這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的抗體可以與選自以下的另外的治療劑組合于其應(yīng)用中和/或組合物中：皮質(zhì)類固醇，例如地塞米松、潑尼松龍，優(yōu)選地塞米松；或沙利度胺類似物，例如沙利度胺、來那度胺、泊馬度胺，特別是來那度胺；或硼替佐米。診斷利用代表疾病，如但不限于自身免疫性疾病、炎癥性疾病及惡性疾病的重要標記物的april，檢測人類受試者血清和/或組織中的april極為重要。對于診斷應(yīng)用，抗體典型地將用可檢測部分標記(直接或間接地)。多種標記是可用的，這些標記一般可以歸為以下類別：生物素、熒光染料、放射性核苷酸、酶、碘及生物合成標記。經(jīng)顯示，眾多不同患者的血清和其它體液和/或組織中存在的適合april與患者疾病的嚴重程度相關(guān)。舉例來說，患有慢性淋巴細胞白血病(cll)、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)及多發(fā)性骨髓瘤(mm)、dlbcl患者(nhl)、結(jié)腸直腸癌、sle、多種全身免疫類風濕性疾病(斯耶格倫氏綜合癥、瑞特氏綜合癥、銀屑病關(guān)節(jié)炎、多肌炎及強直性脊柱炎現(xiàn)也包括在內(nèi))及特應(yīng)性皮膚炎的患者展示血清可溶性april水平增加。另外，在iga腎病患者中血清april含量升高(mccarthy等人，2011，j.clin.invest.121(10)：3991-4002)。在敗血病中血清april含量也升高并且預(yù)示垂?；颊叩乃劳?jonsson等人，1986，scandjrheumatol增刊61，166-9；roschke等人，2002，jimmunol169，4314-21)?；趆april.01a所展示的結(jié)合特征，根據(jù)本發(fā)明的抗體可以用作診斷工具以檢測體液和/或組織中的可溶性april。本發(fā)明的抗體可以用于任何已知的測定方法中，如競爭性結(jié)合測定、直接和間接夾心測定，以及免疫沉淀測定。zola，monoclonalantibodies.amanualoftechniques，第147-158頁(crcpress，inc.1987)。本發(fā)明的抗體還可以用于體內(nèi)診斷測定中。一般說來，該抗體用放射性核素標記，由此可以使用免疫閃爍法或正電子發(fā)射計算機斷層攝影定位抗原或表達該抗原的細胞。非治療性用途根據(jù)本發(fā)明其它方面，所述抗體具有其它非治療性用途。本發(fā)明抗體的非治療性用途包括流式細胞術(shù)、蛋白質(zhì)印跡、酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)及免疫組織化學分析。本發(fā)明抗體可以例如經(jīng)由固定至蛋白質(zhì)a-瓊脂糖凝膠柱而作為親和純化試劑使用。通用定義術(shù)語“抗體”是指展現(xiàn)所希望的生物活性，如抑制配體與其受體的結(jié)合，或抑制配體誘導(dǎo)的受體信號傳導(dǎo)的任何形式的抗體。在本發(fā)明中，生物活性包含阻斷april與其受體bcma和/或taci的結(jié)合。因此，“抗體”是以其最廣泛意義使用并且特別涵蓋但不限于，單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)和多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，如基于技術(shù)(genmab)或技術(shù)(genmab)，或抗體片段?！翱贵w片段”和“抗體結(jié)合片段”意思指抗體的抗原結(jié)合片段和類似物，典型地包括親本抗體的抗原結(jié)合或可變區(qū)(例如一個或多個cdr)的至少一部分?？贵w片段保留親本抗體的至少一部分結(jié)合特異性。典型地，當以摩爾濃度表示活性時，抗體片段保持至少10％的親本結(jié)合活性。優(yōu)選抗體片段保留至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更高的親本抗體對靶的結(jié)合親和力?？贵w片段的實例包括但不限于，fab、fab′、f(ab′)2及fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子，例如sc-fv；單抗體(來自genmab的技術(shù))；納米抗體(來自ablynx的技術(shù))；結(jié)構(gòu)域抗體(來自domantis的抗體)；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。工程改造的抗體變體綜述于holliger和hudson，2005，nat.biotechnol.23：1126-1136中。“fab片段”由一條輕鏈以及一條重鏈的ch1和可變區(qū)構(gòu)成。fab分子的重鏈無法與另一重鏈分子形成二硫鍵。“fc”區(qū)含有兩個重鏈片段，包含抗體的ch1和ch2結(jié)構(gòu)域。這兩個重鏈片段通過兩個或更多個二硫鍵及與ch3結(jié)構(gòu)域的疏水相互作用保持在一起?！癴ab′片段”含有一條輕鏈以及一條重鏈的一部分，所述重鏈的一部分含有vh結(jié)構(gòu)域和ch1結(jié)構(gòu)域以及在ch1與ch2結(jié)構(gòu)域之間的區(qū)域，由此可以在兩個fab′片段的兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵，從而形成f(ab′)2分子?！癴(ab′)2片段”含有兩條輕鏈以及兩條重鏈，所述兩條重鏈含有在ch1與ch2結(jié)構(gòu)域之間的恒定區(qū)的一部分，由此在該兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵。因此，f(ab′)2片段是由通過兩條重鏈之間的二硫鍵保持在一起的兩個fab′片段構(gòu)成?！癴v區(qū)”包含來自重鏈和輕鏈的可變區(qū)，但缺乏恒定區(qū)?！皢捂渇v抗體”(或“scfv抗體”)是指包含抗體的vh和vl結(jié)構(gòu)域的抗體片段，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單一多肽鏈中。一般來說，fv多肽另外包含在vh與vl結(jié)構(gòu)域之間的多肽連接子，所述連接子使scfv能夠形成抗原結(jié)合所希望的結(jié)構(gòu)。有關(guān)scfv的綜述，參見pluckthun，1994，thepharmacologyofmonoclonalantibodies，第113卷，rosenburg和moore編，springer-verlag，newyork，第269-315頁。另參見國際專利申請公布號wo88/01649以及美國專利號4,946,778和5,260,203?！半p抗體”是具有兩個抗原結(jié)合位點的小抗體片段。這些片段包含在同一多肽鏈(vh-vl或vl-vh)中連接至輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl)的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)。通過使用太短而無法使同一鏈中的兩個結(jié)構(gòu)域之間配對的連接子，迫使這些結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對并產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點。雙抗體更完整地描述于例如ep404,097；wo93/11161；以及hollinger等人(1993)proc.natl.acad.sci.usa90：6444-6448中?！癲uobody”是具有正常igg結(jié)構(gòu)的雙特異性抗體(labrijn等人，2013，proc.natl.acad.sci.usa110(13)：5145-5150)。“hexabody”是盡管保持常規(guī)結(jié)構(gòu)和特異性但殺滅能力增加的抗體(diebolder等人，2014，science343(6176)：1260-3)?！敖Y(jié)構(gòu)域抗體片段”是僅含有重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的具有免疫功能的免疫球蛋白片段。在一些情況下，兩個或更多個vh區(qū)與肽連接子共價接合以產(chǎn)生二價結(jié)構(gòu)域抗體片段。二價結(jié)構(gòu)域抗體片段的兩個vh區(qū)可以靶向相同或不同的抗原。如本文所使用，抗體hapril.01a是重鏈具有氨基酸序列seqidno：55并且輕鏈具有氨基酸序列seqidno：56的小鼠抗體。本發(fā)明的抗體片段可以包含足夠部分的恒定區(qū)以允許具有還原的二硫鍵性能，例如其中通常涉及重鏈間二硫鍵的至少一個鉸鏈半胱氨酸如本文所描述而改變的重鏈二聚化(或多聚化)。在另一實施方案中，抗體片段，例如包含fc區(qū)的抗體片段，保持通常至少一種與完整抗體中存在的fc區(qū)有關(guān)的生物功能，如fcrn結(jié)合、抗體半衰期調(diào)節(jié)、抗體依賴性細胞毒性(adcc)功能和/或補體結(jié)合(例如，其中抗體具有adcc功能或補體結(jié)合所需的糖基化特征)。術(shù)語“嵌合”抗體是指這樣一類抗體，在這些抗體中，一部分重鏈及/或輕鏈與源自于特定物種或?qū)儆谔囟贵w種類或亞類的抗體中的相應(yīng)序列一致或同源，而這些鏈的其余部分與源自于另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w種類或亞類的抗體中的相應(yīng)序列一致或同源；以及此類抗體的片段，只要其展現(xiàn)出所希望的生物活性(參見例如，美國專利號4,816,567；以及morrison等人，1984，proc.natl.acad.sci.usa81：6851-6855)。如本文所使用，術(shù)語“人源化抗體”是指含有來自非人類(例如鼠類)抗體以及人類抗體的序列的抗體形式。此類抗體含有源自非人類免疫球蛋白的最小序列。一般來說，人源化抗體將包含至少一個且典型地兩個可變結(jié)構(gòu)域的基本上全部，其中所有或基本上所有高變環(huán)與非人類免疫球蛋白的高變環(huán)對應(yīng)并且所有或基本上所有fr區(qū)都是人類免疫球蛋白序列的fr區(qū)。人源化抗體任選還將包含免疫球蛋白恒定區(qū)(fc)的至少一部分，典型地是人類免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。嚙齒動物抗體的人源化形式基本上包含與親本嚙齒動物抗體的相同cdr序列，不過可以包括某些氨基酸取代以增加人源化抗體的親和力，增加穩(wěn)定性或用于其它目的。本發(fā)明的抗體還包括fc區(qū)被修飾(或阻斷)以提供改變的效應(yīng)功能的抗體。參見例如，美國專利號5,624,821；wo2003/086310；wo2005/120571；wo2006/0057702；presta，2006，adv.drugdeliveryrev.58：640-656。此類修飾可以用于增強或抑制免疫系統(tǒng)的各種反應(yīng)，而且可能在診斷和療法中具有有益作用。fc區(qū)的變化包括氨基酸變化(取代、缺失及插入)、糖基化或去糖基化，以及添加多個fc。使fc變化還可以改變治療性抗體的抗體半衰期，并且較長的半衰期將降低給藥頻率，同時增加便利性并減少材料的使用。參見presta，2005，j.allergyclin.immunol.116：731，第734-35頁。本發(fā)明的抗體還包括具有完整fc區(qū)以提供完整效應(yīng)功能的抗體，例如同種型igg1抗體，這些抗體在靶細胞中誘導(dǎo)補體依賴性細胞毒性(cdc)或抗體依賴性細胞的細胞毒性(adcc)。這些抗體還可以與改善抗體在儲存期間的穩(wěn)定性或增加抗體的體內(nèi)半衰期的分子偶聯(lián)(例如共價連接)。增加半衰期的分子的實例有白蛋白(例如，人血清白蛋白)及聚乙二醇(peg)?？贵w的白蛋白連接衍生物及聚乙二醇化衍生物可以使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)制備。參見例如，chapman，2002，adv.drugdeliv.rev.54：531-545；anderson和tomasi，1988，j.immunol.methods109：37-42；suzuki等人，1984，biochim.biophys.acta788：248-255；以及brekke和sandlie，2003，naturerev.2：52-62。如本文所使用，術(shù)語“高變區(qū)”是指抗體中負責抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)包含通過序列比對確定的來自“互補決定區(qū)”或“cdr”的氨基酸殘基，例如輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基24-34(l1)、50-56(l2)及89-97(l3)，以及重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基31-35(h1)、50-65(h2)及95-102(h3)(參見rabat等人，1991，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版，publichealthservice，nationalinstitutesofhealth，bethesda，md.)，和/或通過結(jié)構(gòu)確定的來自“高變環(huán)”(hvl)的氨基殘基，例如輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基26-32(l1)、50-52(l2)及91-96(l3)，以及重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基26-32(h1)、53-55(h2)及96-101(h3)(參見chothia和leskl，1987，j.mol.biol.196：901-917)?！翱蚣堋被颉癴r”殘基是除如本文中所定義的cdr殘基以外的那些可變結(jié)構(gòu)域殘基或序列。根據(jù)某些實施方案，本發(fā)明的抗體可以是分離的抗體。“分離的”抗體是從其天然環(huán)境的組分鑒別并且分離和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染組分是典型地干擾該多肽的診斷或治療用途的物質(zhì)，并且可以包括酶、激素及其它蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)溶質(zhì)。在一些實施方案中，抗體將純化：(1)通過例如lowry法測定達到以重量計超過95％，并且最優(yōu)選達到以重量計超過99％的抗體；(2)達到利用轉(zhuǎn)杯式測序儀足以獲得n末端或內(nèi)部氨基酸序列的至少15個殘基的程度；或(3)使用考馬斯藍(coomassieblue)或優(yōu)選銀染色，在非還原或還原條件下通過sds-page達到均質(zhì)。分離的抗體包括在重組細胞內(nèi)原位產(chǎn)生的抗體，因為該抗體天然環(huán)境中的至少一種組分將不存在。不過，分離的多肽通常是通過至少一個純化步驟制備。“分離的”核酸分子是經(jīng)過鑒別且從在多肽核酸的天然來源中通常與其締合的至少一種污染核酸分子分離的核酸分子。分離的核酸分子不處于其在自然界中所呈現(xiàn)的形式或環(huán)境中。因此，分離的核酸分子與核酸分子的區(qū)別之處在于，所述核酸分子存在于天然細胞中。然而，分離的核酸分子包括通常表達抗體的細胞中所含的核酸分子，其中例如，該核酸分子是在與天然細胞核酸分子不同的染色體位置中。如本文所使用，術(shù)語“單克隆抗體”是指從基本上同源的抗體群獲得的一種抗體，即，構(gòu)成該群體的個別抗體除以微量存在的可能的天然存在的突變外是一致的。單克隆抗體針對單一抗原位點具有高度特異性。此外，與典型地包括針對不同決定基(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制劑相對，每一單克隆抗體是針對抗原上單個決定基。修飾語“單克隆”指示如從基本上同源的抗體群獲得的抗體的特征，且不應(yīng)理解為需要通過任何特定方法產(chǎn)生該抗體。舉例來說，根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過kohler等人，1975，nature256：495最先描述的雜交瘤法制備，或者可以通過重組dna法制備(參見例如，美國專利號4,816,567)?！皢慰寺】贵w”還可以使用例如clackson等人，1991，nature352：624-628；以及marks等人，1991，j.mol.biol.222：581-597中所描述的技術(shù)，從噬菌體抗體文庫分離。本文中的單克隆抗體特別包括“嵌合”抗體。如本文所使用，術(shù)語“免疫細胞”包括造血來源并且在免疫反應(yīng)中起作用的細胞。免疫細胞包括淋巴細胞，如b細胞和t細胞；自然殺手細胞；骨髓細胞，如單核細胞、巨噬細胞、嗜酸性細胞、肥大細胞、嗜堿性細胞及粒細胞。如本文所使用，“免疫偶聯(lián)物”是指與治療部分，如細菌毒素、細胞毒性藥物或放射性毒素偶聯(lián)的抗人類april抗體，或其片段。毒素部分可以使用本領(lǐng)域中可用的方法與本發(fā)明抗體偶聯(lián)。如本文所使用，序列“變體”或“變體序列”是指與所公開的序列在一個或多個氨基酸殘基處不同但保留親本分子的生物活性的序列。本發(fā)明包括通過各種序列清楚地公開的抗體變體。對于vh結(jié)構(gòu)域cdr1、cdr2及cdr3序列，根據(jù)一些實施方案，變體序列可以在cdr1、cdr2及cdr3序列中總計包含至多6個氨基酸取代，如1、2、3、4、5或6個氨基酸取代。類似地，對于vl結(jié)構(gòu)域cdr1、cdr2及cdr3序列，根據(jù)一些實施方案，變體序列可以在cdr1、cdr2及cdr3序列中總計包含至多6個氨基酸取代，如1、2、3、4、5或6個氨基酸取代?！氨Ｊ匦揎椀淖凅w”或“保守氨基酸取代”是指氨基酸取代是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且一般可以在不改變所得分子的生物活性情況下進行。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認識到，一般說來，多肽非必需區(qū)中的單一氨基酸取代基本上不會改變生物活性(參見例如，watson等人，molecularbiologyofthegene，thebenjamin/cummingspub.co.，第224頁(第4版，1987))。此類示例性取代優(yōu)選是根據(jù)以上表2中所陳述的那些進行。如本文所使用，術(shù)語“約”是指一個值是在由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所測定的特定值的可接受的誤差范圍內(nèi)，這將部分取決于該值的測量或測定方法，即，測量系統(tǒng)的限制。舉例來說，“約”可以指根據(jù)本領(lǐng)域中的實踐，在1或超過1個標準差范圍內(nèi)?；蛘撸凹s”或“基本上包含”可以指在至多20％范圍內(nèi)。另外，特別是就生物系統(tǒng)或方法來說，這些術(shù)語可以指一個值的至多一個數(shù)量級或至多5倍。當在申請和權(quán)利要求書中提供特定值時，除非另作陳述，否則“約”或“基本上包含”的含義應(yīng)視為在該特定值的可接受的誤差范圍內(nèi)。術(shù)語“多個(種)”應(yīng)理解為表示一個(種)或多個(種)。取決于其使用環(huán)境，“多個(種)”可以指選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10的任何適合數(shù)字。根據(jù)某些實施方案，“多個(種)”可以指“多數(shù)(aplurality)”。取決于其使用環(huán)境，“多數(shù)”可以指選自2、3、4、5、6、78、9、10的任何適合數(shù)字。當提到配體/受體、抗體/抗原，或其它結(jié)合對時，“特異性”結(jié)合表示在蛋白質(zhì)和/或其它生物異質(zhì)群中決定蛋白質(zhì)(例如april)的存在的結(jié)合反應(yīng)。因此，在指定條件下，指定配體/抗原結(jié)合至特定受體/抗體并且不會大量結(jié)合至樣品中存在的其它蛋白質(zhì)?！笆┯谩?、“療法”及“治療”當用于動物、人類、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源藥物、治療劑、診斷劑或組合物與該動物、人類、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“施用”、“療法”及“治療”可以指例如治療方法、藥物動力學方法、診斷方法、研究方法及實驗方法。細胞的治療包含一種試劑與該細胞接觸，以及一種試劑與一種流體接觸，其中該流體與該細胞接觸?！笆┯谩?、“療法”及“治療”還指一種試劑、診斷劑、結(jié)合組合物和/或細胞對另一細胞的體外和離體治療。在本發(fā)明的本說明內(nèi)，術(shù)語“體外”和“離體”具有類似含義并且可以互換使用。也可以例如通過用人類重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的編碼序列取代同源鼠類序列(美國專利號4,816,567；morrison等人，1984，proc.natlacad.sci.usa，81：6851)，或通過將非免疫球蛋白物質(zhì)(例如蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域)的全部或一部分編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價接合來修飾抗體dna。典型地，用所述非免疫球蛋白材料取代抗體的恒定結(jié)構(gòu)域，或者用其取代抗體一個抗原組合位點的可變結(jié)構(gòu)域，由此產(chǎn)生一個抗原組合位點對一種抗原具有特異性并且另一個抗原組合位點對不同抗原具有特異性的嵌合二價抗體。本發(fā)明的抗人類april抗體的氨基酸序列變體是通過將適當核苷酸變化引入編碼dna中或通過肽合成制備。此類變體包括例如所示抗april抗體的氨基酸序列內(nèi)殘基的缺失，和/或插入，和/或取代?？蛇M行缺失、插入及取代的任何組合以獲得最終構(gòu)建體，只要最終構(gòu)建體具有所希望的特征。氨基酸變化也可以改變抗april抗體的翻譯后加工，如改變糖基化位點的數(shù)目或位置。用于鑒別抗april抗體中作為優(yōu)選誘變位置的某些殘基或區(qū)域的一種有用方法稱為“丙氨酸掃描誘變”，如cunningham及wells，1989，science244：1081-1085所述。此處，鑒別一個殘基或一組靶殘基(例如，帶電殘基，如arg、asp、his、lys及glu)并用呈中性或帶負電的氨基酸(最優(yōu)選丙氨酸或聚丙氨酸)置換來影響抗體與april抗原的相互作用。然后，通過將另外或其它變體引入取代位點處或用于取代位點來改進對取代展示功能性敏感性的氨基酸殘基。因此，盡管引入氨基酸序列變異的位點是預(yù)定的，但突變本身的性質(zhì)不必是預(yù)定的。舉例來說，為了分析給定位點處突變的性能，在靶密碼子或區(qū)域處進行ala掃描或隨機誘變并針對所希望的活性篩選所表達的抗april抗體的變體。通常，抗april抗體的氨基酸序列變體將具有與初始抗體的重鏈或輕鏈氨基酸序列具有至少75％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，并且最優(yōu)選至少95％、98％或99％序列相似性的氨基酸序列。關(guān)于這一序列的相似性或同源性如上文所定義?？梢葬槍w外生物活性增加或適合結(jié)合親和力篩選具有本文標識為合乎需要的特征的抗體。為了篩選與hapril.01a結(jié)合至人類april上相同表位的抗體，可以進行常規(guī)交叉阻斷測定，如antibodies，alaboratorymanual，coldspringharborlaboratory，harlow和davidlane編(1988)中所述的測定。結(jié)合至該相同表位的抗體可能在此類測定中交叉阻斷，但并非所有交叉阻斷抗體都必定精確地結(jié)合該相同表位，因為交叉阻斷可能是由在重疊表位處或甚至是非重疊表位附近的抗體結(jié)合對抗體結(jié)合的空間阻礙引起。或者，可以進行表位定位，例如champe等人，1995，j.biol.chem.270：1388-1394中所描述，以確定抗體是否結(jié)合至所關(guān)注表位。還可以使用cunningham和wells，1989，science244：1081-1085所描述的“丙氨酸掃描誘變”，或針對人類april中氨基酸殘基的一些其它形式的點誘變確定本發(fā)明抗april抗體的功能表位。如slootstra等人(slootstra等人，1996，mol.diversity1：87-96)和timmerman等人(timmerman等人，2007，j.mol.recognit.20：283-299)所描述，定位抗體表位的另一方法是研究抗體與合成線性clips肽的結(jié)合，這些肽可以使用信用卡形式的小型pepscan卡篩選。所述抗體與每種肽的結(jié)合是在基于pepscan的酶聯(lián)免疫測定(elisa)中測定。與hapril.01a結(jié)合至相同表位的額外抗體可以例如通過關(guān)于與該表位的結(jié)合來篩選針對april的抗體，或通過用包括含所述表位序列的人類april片段的肽對動物進行免疫來獲得。預(yù)期結(jié)合至該相同功能表位的抗體可能展現(xiàn)類似的生物活性，如類似的april結(jié)合以及bcma和taci阻斷活性，并且此類活性可以通過抗體功能測定來確定。所述抗體可以選自任何種類的免疫球蛋白，包括igm、igg、igd、iga及ige。優(yōu)選該抗體是igg抗體?？梢允褂萌魏蝘gg同種型，包括igg1、igg2、igg3及igg4。也涵蓋igg同種型的變體。該抗體可以包含來自超過一種類別或同種型的序列。通過在實施例中所描述的生物測定中篩選抗體，易于優(yōu)化必要的恒定結(jié)構(gòu)域序列以產(chǎn)生所希望的生物活性。同樣，在本文中的組合物和方法中可以使用任一類別的輕鏈。具體地說，κ、λ或其變體可用于本發(fā)明組合物和方法中。本發(fā)明的抗體和抗體片段還可以與如細胞毒性劑等細胞毒性有效負載，或如99tc、90y、111in、32p、14c、125i、3h、131i、11c、15o、13n、18f、35s、51cr、57to、226ra、60co、59fe、57se、152eu、67cu、217ci、211at、212pb、47sc、109pd、234th和40k、157gd、55mn、52tr及56fe等放射性核苷酸偶聯(lián)。此類抗體偶聯(lián)物可以用于免疫療法中以選擇性靶向并殺滅表達在表面上表達靶(該抗體的抗原)的細胞。示例性細胞毒性劑包括蓖麻毒素、長春生物堿、甲氨蝶呤(methotrexate)、假單胞菌內(nèi)毒素、皂草素、白喉毒素、順鉑、多柔比星、相思豆毒素、白樹毒蘇及美洲商路抗病毒蛋白。本發(fā)明的抗體和抗體片段還可以與熒光或化學發(fā)光標記偶聯(lián)，包括熒光團，如稀土螯合物、熒光素和其衍生物、羅丹明(rhodamine)和其衍生物、異硫氰酸酯、藻紅素、藻藍蛋白、別藻藍蛋白、鄰苯二甲醛、熒光胺、152eu、丹磺?；阈瓮?、蟲熒光素、魯米那標記(1uminallabel)、異魯米那標記、芳香族吖啶酯標記、咪唑標記、吖啶鹽標記、草酸酯標記、水母蛋白標記、2，3-二氫酞嗪二酮、生物素/抗生物素蛋白、自旋標記及穩(wěn)定自由基。本領(lǐng)域已知用于將本發(fā)明的抗體分子或蛋白質(zhì)分子與各種部分偶聯(lián)的任何方法都可以使用，包括hunter等人，1962，nature144：945；david等人，1974，biochemistry13：1014；pain等人，1981，j.immunol.meth.40：219；以及nygren，j.，1982，histochem.andcytochem.30：407眾所描的那些方法。用于偶聯(lián)抗體和蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域中的常規(guī)方法并且是眾所周知的。抗體純化當使用重組技術(shù)時，可以在細胞內(nèi)，在周質(zhì)空間中產(chǎn)生抗體，或?qū)⒖贵w直接分泌至培養(yǎng)基中。如果是在細胞內(nèi)產(chǎn)生抗體，那么作為第一個步驟，通過例如離心或超濾來去除宿主細胞或溶解的片段的顆粒狀碎片。carter等人，1992，bio/technology10：163-167描述了用于分離抗體的程序，這些抗體被分泌至大腸桿菌的周質(zhì)空間中。簡而言之，在乙酸鈉(ph3.5)、edta及苯甲基磺酰氟(pmsf)存在下經(jīng)約30分鐘解凍細胞糊。細胞碎片可以通過離心去除。在將抗體分泌到培養(yǎng)基中的情況下，一般首先使用可商購的蛋白質(zhì)濃縮過濾器，例如amicon或milliporepellicon超濾單元，對來自這些表達系統(tǒng)的上清液進行濃縮。在任一前述步驟中可以包括蛋白酶抑制劑，如pmsf，以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素以防止外來污染物的生長。由細胞制備的抗體組合物可以使用例如羥磷灰石色譜法、凝膠電泳、透析及親和色譜法純化，其中親和色譜法是優(yōu)選的純化技術(shù)。蛋白質(zhì)a作為親和配體的適合性取決于抗體中存在的任何免疫球蛋白fc區(qū)的物種和同種型。蛋白質(zhì)a可以用于純化基于人類igγ1、igγ2或igγ4重鏈的抗體(lindmark等人，1983，j.immunol.meth.62：1-13)。蛋白質(zhì)g被推薦用于所有小鼠同種型和人類γ3(guss等人，1986，emboj5：1567-1575)。親和配體所附接的基質(zhì)最常見是瓊脂糖，但其它基質(zhì)也是可用的。相較于用瓊脂糖可以達到的速率和時間，機械穩(wěn)定的基質(zhì)，如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允許較快的流動速率及較短的加工時間。在抗體包含ch3結(jié)構(gòu)域的情況下，bakerbondabxtm樹脂(j.t.baker，phillipsburg，n.j.)可用于純化。取決于有待回收的抗體，用于蛋白質(zhì)純化的其它技術(shù)，如在離子交換柱上分級分離、乙醇沉淀、反相hplc、在二氧化硅上進行的色譜法、在肝素上進行的色譜法、在陰離子或陽離子交換樹脂(如聚天冬氨酸柱)上進行的sepharosetm色譜法、色譜聚焦、sds-page及硫酸銨沉淀也可使用。在一個實施方案中，可以通過吸附至凝集素基質(zhì)(例如凝集素親和柱)上以去除制劑中含果糖的糖蛋白并由此富集無果糖的糖蛋白，從而純化得到糖蛋白。藥物配制物本發(fā)明包含抗人類arpil抗體的藥物配制物。為了制備藥物組合物或無菌組合物，將抗體，特別是抗體或其片段與藥學上可接受的載劑或賦形劑混合，參見例如，remington′spharmaceuticalsciencesandu.s.pharmacopeia：nationalformulary，mackpublishingcompany，easton，pa(1984)。的配制物可以通過將治療劑和診斷劑與生理學上可接受的載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑混合來制備呈例如凍干粉、漿液、水溶液或懸浮液形式的配制物(參見例如，hardman等人，2001，goodmanandgilman′sthepharmacologicalbasisoftherapeutics，mcgraw-hill，newyork，ny；gennaro，2000，remington：thescienceandpracticeofpharmacy，lippincott，williams，及wilkins，newyork，ny；avis等人(編)，1993，pharmaceuticaldosageforms：parenteralmedications，marceldekker，ny；lieberman等人(編)，1990，pharmaceuticaldosageforms：tablets，marceldekker，ny；lieberman等人(編)，1990，pharmaceuticaldosageforms：dispersesystems，marceldekker，ny；weiner及kotkoskie，2000，excipienttoxicityandsafety，marceldekker，inc.，newyork，ny)。單獨或與另一藥劑，如常用抗癌藥組合施用的抗體組合物的毒性和治療功效可以通過例如用于測定ld50(使群體的50％死亡的劑量)和ed50(在群體的50％中治療有效的劑量)的標準藥物程序，在細胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀯游镏袦y定。有毒作用與治療作用之間的劑量比率是治療指數(shù)并且其可以表示為ld50與ed50之間的比率。由這些細胞培養(yǎng)物測定和動物研究得到的數(shù)據(jù)可以用于配制用于人類的一系列劑量。此類化合物的劑量優(yōu)選在包括ed50在內(nèi)并具有極少或無毒性的一系列循環(huán)濃度范圍內(nèi)。取決于所用劑型和所用施用途徑，該劑量可以在此范圍內(nèi)變化。適合施用途徑包括腸胃外施用，如肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下施用；以及口服施用。施用本發(fā)明的藥物組合物中使用的抗體或施用抗體以實踐本發(fā)明的方法可以按多種常規(guī)方式進行，如口服攝取、吸入、外敷或皮膚、皮下、腹膜內(nèi)、腸胃外、動脈內(nèi)或靜脈內(nèi)注射。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體是靜脈內(nèi)施用的。在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗體是皮下施用的?；蛘撸梢酝ㄟ^局部而非全身方式，例如經(jīng)由將抗體直接注射至作用部位中來施用抗體，該抗體通常呈積存式或持續(xù)釋放配制物形式。另外，可以通過靶向藥物遞送系統(tǒng)來施用抗體。有關(guān)選擇抗體、細胞因子及小分子的適合劑量的指導(dǎo)是易于得到的(參見例如，wawrzynczak，1996，antibodytherapy，biosscientificpub.ltd，oxfordshire，uk；kresina(編)，1991，monoclonalantibodies，cytokinesandarthritis，marceldekker，newyork，ny；bach(編)，1993，monoclonalantibodiesandpeptidetherapyinautoimmunediseases，marceldekker，newyork，ny；baert等人，2003，newengl.j.med.348：601-608；milgrom等人，1999，newengl.j.med.341：1966-1973；slamon等人，2001，newengl.j.med.344：783-792；beniaminovitz等人，2000，newengl.j.med.342：613-619；ghosh等人，2003，newengl.j.med.348：24-32；lipsky等人，2000，newengl.j.med.343：1594-1602)。適當劑量是由臨床醫(yī)師，例如使用本領(lǐng)域中已知或懷疑會影響治療或預(yù)測會影響治療的參數(shù)或因子來決定。一般來說，劑量是以略低于最佳劑量的量開始，并且隨后以較小增量增加，直至相對于任何不良副作用，實現(xiàn)所希望的或最佳的作用。重要的診斷措施包括例如炎癥的癥狀或所產(chǎn)生的炎性細胞因子的含量。優(yōu)選的劑量方案是涉及避免明顯不希望的副作用的最大劑量或劑量頻率的方案?？偯恐軇┝恳话闶侵辽?.05μg/kg體重，更一般是至少0.2μg/kg，最一般是至少0.5μg/kg，典型地是至少1μg/kg，更典型是至少10μg/kg，最典型是至少100μg/kg，優(yōu)選是至少0.2mg/kg，更優(yōu)選是至少1.0mg/kg，最優(yōu)選是至少2.0mg/kg，最佳是至少10mg/kg，更佳是至少25mg/kg，并且最佳是至少50mg/kg(參見例如，yang等人，2003，newengl.j.med.349：427-434；herold等人，2002，newengl.j.med.346：1692-1698；liu等人，1999，j.neurol.neurosurg.psych.67：451-456；portielji等人，2003，cancer.immunol.immunother.52：133-144)。以mol/kg計，小分子治療劑，例如肽模擬物、天然產(chǎn)物或有機化學試劑的所需劑量與抗體或多肽大致相同。如本文所使用，“抑制”或“治療(treat/treatment)”包括疾病相關(guān)癥狀發(fā)生的延緩和/或?qū)殡S所述疾病發(fā)生或預(yù)期會與所述疾病一起發(fā)生的此類癥狀的嚴重程度降低。這些術(shù)語另外包括改善現(xiàn)有癥狀、防止額外癥狀，以及改善或防止此類癥狀的潛在病因。因此，這些術(shù)語表示，使患有疾病的脊椎動物受試者獲得有益結(jié)果。用于治療目的的本發(fā)明抗體是以治療有效量施用。如本文所使用，術(shù)語“治療有效量”或“有效量”是指當單獨或與額外治療劑組合施用至細胞、組織或受試者時有效防止或改善呆治療疾病或病癥的抗arpil抗體或其片段的量。治療有效劑量還指足以引起癥狀改善，例如治療、治愈、預(yù)防或改善相關(guān)醫(yī)學病狀，或使此類病癥的治療、治愈、預(yù)防或改善率增加的化合物的量。當應(yīng)用于單獨施用的個別活性成分時，治療有效劑量僅指所述成分。當應(yīng)用于組合時，治療有效劑量是指引起治療作用的各活性成分的組合量，不管是依序還是同時組合施用。有效量的治療劑將使癥狀典型地減少至少10％；通常減少至少20％；優(yōu)選減少至少約30％；更優(yōu)選至少40％；并且最優(yōu)選至少50％。有關(guān)共施用第二治療劑或用第二治療劑治療的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的，參見例如，hardman等人，(編)，2001，goodmanandgilman′sthepharmacologicalbasisoftherapeutics，第10版，mcgraw-hill，newyork，ny；poole和peterson(編)，2001，pharmacotherapeuticsforadvancedpractice：apracticalapproach，lippincott，williams&wilkins，phila.，pa；chabnerandlongo(編)，2001，cancerchemotherapyandbiotherapy，lippincott，williams&wilkins，phila.，pa。本發(fā)明的藥物組合物還可以含有其它藥劑，包括但不限于，細胞毒性劑、化學治療劑、細胞抑制劑、抗血管生成劑或抗代謝物劑、腫瘤靶向劑、免疫刺激劑或免疫調(diào)節(jié)劑，或與細胞毒性劑、細胞抑制劑或其它毒性劑偶聯(lián)的抗體。該藥物組合物也可以與其它治療方法，如手術(shù)、化學療法及放射一起使用?，F(xiàn)將參照以下非限制性實驗進一步說明并支持本發(fā)明。實驗實驗1抗arpil人源化抗體設(shè)計cdr移植先前已鑒別出結(jié)合人類april的獨特抗體hapril.01a(wo2010/100056)。通過cdr移植技術(shù)使小鼠hapril.01a抗體人源化(參見例如，美國專利號5,225,539；以及williams，d.g.等人，2010，antibodyengineering，第1卷，第21章)。在所設(shè)計的策略中，首先使用igblast鑒別人類生殖系序列(yej.等人，2013，nucleicacidsres.41：w34-40)。對于hapril.01avh，鑒別人類生殖系序列ighv1-3*01(70.4％一致性)，并且對于hapril.01avl，鑒別人類生殖系序列igkv1-16*01(65.3％一致性)。接下來，構(gòu)建含有imgt數(shù)據(jù)庫(發(fā)布201222-4：161905個條目，索引2012-6-04)中可得到的所有人類成熟序列的數(shù)據(jù)庫(lefranc，m.-p.等人，1999，nucleicacidres.27：209-212)，標識出90,401個獨立序列。使用tblastn(2.2.26+)查詢這些序列以鑒別與hapril.01avh和vl序列展示最高一致性的模板序列(分別是seqid3和4)。選擇三個vh序列和七個vl序列，這些序列分別與hapril.01avhcdr1、cdr2、cdr3(seqid.5-7)及vlcdr1、cdr2及cdr3(seqid.8-10)顯示80％或更高的相似性評分并且展示類似，優(yōu)選一致的cdr長度。對于重鏈，選擇由genbank(benson，d.a.等人，2013，nucleicacidsres.41(d1)：d36-42)登記號af022000、ab363149及ab063827編碼的框架用于直接移植hapril.01avhcdr，分別產(chǎn)生以下cdna構(gòu)建體：seqid.11、13及15。對于輕鏈，選擇由genbank登記號ax375917、dd272023、ab363267、aj241396、di152527及dq840975編碼的框架用于直接移植hapril.01avlcdr，分別產(chǎn)生以下cdna構(gòu)建體：seqid.19、21、23、25、27及29?；谕ㄟ^比對來自tblastn結(jié)果的25個最佳匹配序列(e值5e-46至9e-43)得到的共同序列，設(shè)計額外重鏈序列，得到以下cdna構(gòu)建體：seqid17。為了確定框架殘基人源化的結(jié)構(gòu)影響，使用whatif制備hapril.01a抗體同源物模型(kriegere.等人，2003，methodsbiochemanal.44：509-23)。使用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(www.rcsb.org，2012年6月發(fā)布；bermanh.m.等人，2000，nucleicacidsres.28：235-242)，通過blastp搜索(altschul，s.f.等人，1990，j.mol.biol.215：403-410)分別鑒別出vh和vl鏈的模板2gki(kimy.r.等人，2006，j.biol.chem.281：15287-15295)和2aeq(venkatramanil.等人，2006，j.mol.biol.356：651-663)。使用由2aeq模板引導(dǎo)的mustang比對(konagurthua.s.等人，2006，proteins64：559-574)，將vh和vl鏈組合成fab片段形式。使用所構(gòu)建的hapril.01a同源物模型選擇受人源化影響并且能影響人源化構(gòu)建體的功能的殘基并評價是否置換所選殘基：對于六個vl模板(vl15)，決定用較小的s49和f87置換vl殘基y49和y87。信號肽鑒別使用ncbiigblast(blastn)(yej.等人，2013，nucleicacidsres.41(webserverissue)：w34-40)鑒別，匹配小鼠hapril.01avh和vl的人類生殖系譜系并使用其選擇vh和vl的分泌前導(dǎo)序列：vh，基于生殖系ighv1-3*01(ncbi登記號x62107)，以及vl，基于生殖系igkv16*01(ncbi登記號x62109)。使用以下由seqidno：57編碼的vh分泌前導(dǎo)序列“mdwtwrilflvaaatgahs”(seqidno：58)及由seqidno：59編碼的vl分泌前導(dǎo)序列“mdmrvlaqllgllllcfpgarc”(seqidno：60)表達所有人源化vh和vl構(gòu)建體。產(chǎn)生具有穩(wěn)定adair突變的igg4形式人源化抗體(angals.等人，1993，molimmunol.30：105-108)，其中絲氨酸241(kabat編號)轉(zhuǎn)變成脯氨酸。實驗2合成、亞克隆、表達、結(jié)合合成使用optgene軟件(2.0.6.0版)對編碼人源化vh和vl構(gòu)建體的cdna，seqid11、13、15、17、21、23、25、27、29進行密碼子優(yōu)化，并由baseclear進行化學合成。接著，使用5′-hindiii和3′-apai(vh)或3′-bsiwi(vl)限制性內(nèi)切核酸酶裂解位點將序列克隆至puc57載體(baseclear)中。亞克隆使用以上提到的限制性內(nèi)切核酸酶裂解位點，將人類vh構(gòu)建體克隆至含有已經(jīng)克隆至ecori和hindiii限制性內(nèi)切核酸酶裂解位點中的人類igg4恒定結(jié)構(gòu)域(ch1-ch3，genbank登記號k01316)的pcdna3.1(+)載體(invitrogen)中。使用以上提到的限制性內(nèi)切核酸酶裂解位點，將人類vl構(gòu)建體克隆至含有已經(jīng)克隆至hindiii和ecori限制性內(nèi)切核酸酶裂解位點中的人類cl(κ)結(jié)構(gòu)域(genbank登記號j00241)的pcdna3.1(+)載體(invitrogen)中。使用制造商的說明，在亞克隆有效dh5α感受態(tài)細胞(invitrogen)中轉(zhuǎn)化構(gòu)建體。根據(jù)制造商的方案，使用qiagenplasmidmidi試劑盒(qiagen)分離質(zhì)粒dna。利用dna測序(macrogen)確定構(gòu)建體的完整性。表達和結(jié)合以1∶3比率(總計4μg)混合編碼vh和vl構(gòu)建體的質(zhì)粒，并通過遵循制造商的說明，使用lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(invitrogen)將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至hek293t人類胚胎腎細胞(hek293t/17，atcc-crl-11268)中來進行短暫表達。5天后收集細胞上清液并使用酶聯(lián)免疫測定(elisa)測試抗體的表達及與april的結(jié)合。在這些elisa中，所有培育步驟之后都是用pbst(含0.01％吐溫20的pbs)洗滌的步驟。用0.5μg/ml抗flag(sigma)或抗igg4(jacksonlaboratories)涂布maxisorb96孔板(nunc)并在4℃下培育過夜。隨后，將涂有抗flag的96孔板與flag標記的人類april一起在室溫下培育1小時。接下來，培育上清液及其稀釋液1小時，隨后將其與小鼠抗人類igghrp偶聯(lián)物(southernbiotechnology)一起培育1小時。用100μltmb穩(wěn)定的生色團(invitrogen)觀測免疫反應(yīng)性。用100μl的0.5mh2so4停止反應(yīng)并在450nm和620nm下測量吸光度。實驗3純化和穩(wěn)定性純化選擇一小組以上描述的人源化抗體進行進一步分析。再次，以1∶3比率(32μg)混合編碼vh和vl構(gòu)建體的質(zhì)粒，并通過遵循制造商的說明，使用lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(invitrogen)將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至(8*106個)hek293t人類胚胎腎細胞(hek293t)中來進行短暫表達。收集上清液(10ml)并根據(jù)制造商的說明，使用mabselectsure蛋白質(zhì)a樹脂(gehealthcare)純化抗體。使用zeba脫鹽柱(thermoscientific)將緩沖液交換成pbs?；趏d280(nanodropnd-1000)測定純化抗體的濃度。使用以上描述的aprilelisa確定純化抗體與april的結(jié)合。在競爭elisa中測試人源化抗體阻斷與bcma和taci受體結(jié)合的能力。在這些elisa中，所有培育步驟之后都是用pbst(含0.01％吐溫20的pbs)洗滌的步驟。用0.5μg/mlfc-bcma(r&dsystems)或fc-taci(r&dsystems)涂布maxisorb96孔板(nunc)并在4℃下培育過夜。隨后，將與flag標記的april預(yù)混合的人源化抗體及其稀釋液培育1小時，接著與抗flaghrp偶聯(lián)物(sigma)一起培育1小時。用100μltmb穩(wěn)定的生色團(invitrogen)觀測免疫反應(yīng)性。用100μl的0.5mh2so4停止反應(yīng)并在450nm和620nm下測量吸光度。代表使得觀察到總結(jié)合信號的50％或阻斷的濃度的ec50和ic50計算值呈現(xiàn)于表5中。表5：ec50值，結(jié)合至arpil。ic50，阻斷arpil與bcma-fc的結(jié)合。在每次elisa中都使用c4-hapril.01a作為實驗參照物。n.c.指示有抑制作用，但由于擬合不當而無法計算出ic50。vh.vl組合ec50(nm)ic50(nm)c4-hapril.01a5.77.6vh11.vl15120.84.3vh12.vl1519.8n.c.vh13.vl15223.4n.c.vh14.vl1548.3n.c.對于阻斷arpil與taci-fc的結(jié)合，觀察到類似的阻斷作用。意外的是，vh11-vh14與vl10-vl14的組合不顯示納摩爾濃度或微摩爾濃度的ec50值，而且只有所選vh框架序列與vl15框架序列的組合才產(chǎn)生具有功能性arpil結(jié)合特性的抗體。穩(wěn)定性為了測定人源化對抗體穩(wěn)定性的影響，使人源化抗體暴露于一系列溫度，保持10分鐘。在pbs中將純化的抗體稀釋至3.16μg/ml并得到其稀釋液。接著，使這些溶液暴露于65℃或70℃，并如先前所述，使用flag標記的aprilelisa測定法測量在熱處理之后抗體的殘基結(jié)合情況(參看表6)。表6：利用elisa測定的(人源化)抗體與flag-april的殘基結(jié)合情況。結(jié)合作用是以三種濃度測量：3.16μg/ml、1μg/ml及0.316μg/ml。在65℃或70℃下的結(jié)合％表示為在室溫下(＝100％)所觀察的每種抗體的結(jié)合％。實驗4通過回復(fù)突變和微調(diào)殘基改善結(jié)合作用、阻斷作用及穩(wěn)定性通過回復(fù)突變改善結(jié)合和阻斷作用對序列和結(jié)構(gòu)水平進行分析以了解有關(guān)結(jié)合和阻斷不同vh/vl組合的差異的分子基礎(chǔ)。如先前所述，制備人源化抗體同源物模型。針對vh和vl選擇的模板是3hc4(jordanj.l.等人，2009，proteins77：832-841)。通過仔細地分析所建立的模型，本發(fā)明的發(fā)明人推斷，所選vh鏈中的殘基s72對于cdr2環(huán)取向至關(guān)重要。為了研究這一推斷，在vh14中引入突變r72s，產(chǎn)生由核苷酸序列seqid31編碼的vh14_1，即seqid32。如先前所述，測試抗體14_1.15的結(jié)合和阻斷作用。如表7中所示，相對于表5中所示的抗體14.15的結(jié)合，抗體14_1.15的結(jié)合和阻斷作用都有所改善。表7：抗體14_1.15結(jié)合至april并阻斷april與bcma-fc的結(jié)合。在每次elisa中都使用hapril.01a和c4-hapril.01a作為實驗參照物。vh.vl組合ec50(nm)ic50(nm)vh14_1.vl151.29±0.162.63±0.55c4-hapril.01a0.35±0.130.77±0.22hapril.01a0.16±0.140.46±0.35對于阻斷arpil與taci-fc的結(jié)合，獲得類似的ic50值。微調(diào)殘基對序列和結(jié)構(gòu)水平進行分析以進一步改善抗體14_1.15的結(jié)合和阻斷作用。如先前所述，制備此人hapril.01a類似物的同源物模型。所選模板對于vh鏈是2gki并且對于vl鏈是4gmt(leep.s.等人，2012，pnas109：17040-17045)，在模板2aeq引導(dǎo)下組合成fab片段形式。對接近于cdr的殘基進行詳細研究，因為這些殘基可能影響環(huán)構(gòu)象。在本分析中，發(fā)明人鑒別出多個潛在相關(guān)的微調(diào)殘基(vernierresidue)(footej.等人，1992，j.mol.biol.224：487-499)。為了評價其相關(guān)性，用小鼠氨基酸對其進行取代。引入突變m70i產(chǎn)生vh14_1c(seqid33、34)，突變t74k存在于vh14_1d(seqid35、36)中，并且突變q1e產(chǎn)生vh14_1e(seqid37、38)。r67k和v68a的組合突變產(chǎn)生vh14_1g，即seqid39、40。如先前所述，測試這些抗體的結(jié)合作用、阻斷作用及穩(wěn)定性。如表8中所示，意外的是，結(jié)合和阻斷作用有2至3倍的改善。具體地說，在抗體vh14_1g.vl15中引入突變意外地呈現(xiàn)相當大的改善。表8：抗體14_1.15和微調(diào)區(qū)突變體的結(jié)合和阻斷作用。在每次elisa中都使用hapril.01a作為實驗參照物。此外，如使用實施例3中所描述的熱穩(wěn)定性研究所測定，被取代的人源化抗體的穩(wěn)定性也有所改善(參見表9)。表9：利用elisa測定的(人源化)抗體與flag-april的殘基結(jié)合情況。結(jié)合作用是以三種濃度測量：3.16μg/ml、1μg/ml及0.316μg/ml。在65℃或70℃下的％結(jié)合表示為在室溫下(＝100％)所觀察的每種抗體的％結(jié)合。實驗5141g.15展示更有效的體內(nèi)抑制作用.為了展示april類似物抗體對april功能的體內(nèi)阻斷作用，對這些抗體阻斷np-ficoll誘導(dǎo)的小鼠體液反應(yīng)的能力進行檢查。所用小鼠是8-10周齡的april轉(zhuǎn)基因(tg)小鼠及野生型(wt)同窩仔畜，都是基于c57bl/6背景。april轉(zhuǎn)基因小鼠中l(wèi)ck遠端啟動子下表達人類april，該啟動子引導(dǎo)轉(zhuǎn)基因表達成為成熟胸腺細胞和周圍t淋巴細胞(stein等人，2002，jclininvest109，1587-98)。小鼠是在academicmedicalcenter的動物設(shè)施中飼養(yǎng)并且實驗得到研究機構(gòu)倫理委員會的批準。將小鼠分成若干組并處理如下：wt小鼠用pbs(200μ1)處理并且3組april轉(zhuǎn)基因小鼠用以下分子處理：hapril.01a或14_1g.15(在第-1天和第3天，含200μg/小鼠的200μlpbs)或pbs。第0天，用np-ficoll對小鼠進行免疫(第0天；100μli.p.，含250μg免疫原)。在第-1天、第3天、第7天、第10天，經(jīng)尾靜脈收集血液。如先前所描述(hardenberg等人，immunolcellbiol，86(6)：530-4，(2008)；guadagnoli等人，2011，blood117(25)：6856-65)，使用稀釋血清，通過elisa測定抗(4-羥基-硝基苯乙?；?(np)特異性抗體(igm、igg及igaa/2)。簡而言之，在4℃下用含5μg/mlnp-bsa(biosearchtechnologies)的碳酸鈉緩沖液(ph9.6)涂布96孔elisa板(greiner)過夜。在37℃下用1％bsa阻斷各孔1小時并將其與稀釋血清在室溫下培育2小時。使用hrp偶聯(lián)的同種型特異性抗體(山羊抗小鼠igg、iga及igm；來自southernbiotech)作為揭示抗體(revealingantibody)。所有稀釋液都在pbs/bsa1％/吐溫200.05％中制備。從圖1可知，hapril.01a和14_1g.15都在體內(nèi)抑制不依賴t細胞的b細胞反應(yīng)。hapril.01a抑制此反應(yīng)的有效性不如14_1g.15。pbs和作為同種型相配的對照的igg1不影響iga、igm及igg抗np反應(yīng)。序列表<110>adurobiotechholdings,europeb.v.<120>改良的april結(jié)合抗體<130>0<160>60<170>bissap1.2<210>1<211>363<212>dna<213>小家鼠<220><221>來源<222>1..363<223>/分子類型="未指定的dna"/生物體="小家鼠"<400>1gaggtccagttgcagcagtctggacctgagctggtaaagcctggggcttcagtgaagatg60tcctgcaaggcttctggatacacattcactagctatgtgatgcactgggtgaagcagaag120cctgggcagggccttgagtggattggatatattaatccttataatgatgctcctaaatac180aatgagaagttcaaaggcaaggccacagtgacttcagacaagtcctccggcacagcctac240atg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