一種光合作用調(diào)控蛋白LPE1及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào)：12399289閱讀：1179來(lái)源：國(guó)知局

導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>有機(jī)化合物處理,合成應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種光合作用調(diào)控蛋白LPE1及其應(yīng)用

背景技術(shù)：

隨著全球人口增長(zhǎng)，耕地面積減少，氣候變化導(dǎo)致的異常天氣及生物能源的消耗，使全球糧食危機(jī)日益嚴(yán)峻。植物和細(xì)菌通過(guò)吸收光能，利用二氧化碳和水等無(wú)機(jī)物合成糖類等有機(jī)物質(zhì)同時(shí)釋放出氧的過(guò)程稱為光合作用。光合作用被認(rèn)為是地球上最重要的化學(xué)反應(yīng)，是生物界賴以生存的基礎(chǔ)，90％～95％的植物干重來(lái)自光合作用，光合作用效率的高低直接影響作物的產(chǎn)量。因此，提高光合作用效率已成為增加作物產(chǎn)量的重要途徑，為解決糧食短缺問(wèn)題找到了新出路。

目前，提高光合作用效率的方法有：①植物光合作用促進(jìn)劑，一般利用促進(jìn)劑中營(yíng)養(yǎng)物促進(jìn)植物光合作用。如專利CN101913951A公開了的一種植物光合作用促進(jìn)劑，能夠在弱光、低溫、干熱等逆境條件下顯著提高植物光合作用效率，保證植株正常生長(zhǎng)。②通過(guò)基因改造的技術(shù)，調(diào)控光合作用系統(tǒng)中的關(guān)鍵基因。葉綠體是綠色植物和藻類進(jìn)行光合作用的主要場(chǎng)所，其上的基質(zhì)和基粒片層結(jié)構(gòu)是光合作用發(fā)生的主要位點(diǎn)，在這類片層膜上集聚了進(jìn)行光合作用電子傳遞的四大復(fù)合體，即光系統(tǒng)II，光系統(tǒng)I，細(xì)胞色素b6f和ATP酶復(fù)合體，通過(guò)調(diào)控這些參與影響光合作用電子傳遞的因子對(duì)提高光合作用具有重要的意義。例如Miyagawa等通過(guò)過(guò)表達(dá)光合作用暗反應(yīng)SBPase酶，有效增加了光合作用暗反應(yīng)速率；再如Lin等通過(guò)基因工程方法向煙草中轉(zhuǎn)入外源藍(lán)細(xì)菌Rubisco，從而使得光合作用碳固定更加高效。

盡管如此，到目前為止，有效提高光合作用效率的方法還非常有限，因此尋找一種光合作用調(diào)控因子，應(yīng)用于高光效植物的培育和篩選，具有現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種光合作用調(diào)控蛋白LPE1及其應(yīng)用。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

光合作用調(diào)控蛋白LPE1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

編碼光合作用調(diào)控蛋白LPE1的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示或?yàn)槠渫幢Ｊ匦蛄小?/p>

一種提高植物光合作用效率的方法，包括將植物的光合作用調(diào)控基因LPE1上調(diào)或使光合作用調(diào)控蛋白LPE1過(guò)表達(dá)。

其中，所述的植物為禾本科作物、豆科作物、茄科作物、薔薇科作物。

一種快速篩查高光合作用效率植物的方法，包括檢測(cè)植物的光合作用調(diào)控基因LPE1的表達(dá)情況，光合作用調(diào)控基因LPE1上調(diào)則判定植物的光合作用效率更高。

其中，所述的植物為禾本科作物、豆科作物、茄科作物、薔薇科作物。

一種獲得高光合作用效率植物的轉(zhuǎn)基因方法，包括將植物的光合作用調(diào)控基因LPE1上調(diào)。

其中，所述的植物為禾本科作物、豆科作物、茄科作物、薔薇科作物。

本發(fā)明的有益效果是：

發(fā)明人利用正向遺傳學(xué)方法從擬南芥突變體庫(kù)中篩選到一個(gè)光合作用調(diào)控蛋白突變體lpe1，通過(guò)分子鑒定，克隆到了一個(gè)編碼含PPR結(jié)構(gòu)域葉綠體蛋白的基因LPE1(AT3G46610)，并證實(shí)了其編碼基因LPE1參與擬南芥光效調(diào)控，是一種重要的調(diào)控植物光合效率的功能基因，利用正向遺傳學(xué)方法，獲得兩個(gè)LPE1的干涉株系(lpe1-1、lpe1-2)及一個(gè)純合缺失突變體株系(lpe1-3)，發(fā)現(xiàn)LPE1基因的功能缺失導(dǎo)致植株發(fā)育遲緩，最大光合效率降低。這為利用基因工程手段調(diào)控LPE1以增加光合速率打下基礎(chǔ)。

結(jié)合生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)LPE1蛋白在其他作物中具有序列保守性，提示LPE1在其他作物中的功能可能存在保守性?？梢灶A(yù)見，通過(guò)對(duì)LPE1基因進(jìn)行上調(diào)或蛋白LPE1過(guò)表達(dá)，有望獲得高光效的植物，

附圖說(shuō)明

圖1：擬南芥LPE1突變體LPE1基因表達(dá)、光合作用效率和植株生長(zhǎng)情況圖；

圖2：擬南芥LPE1突變體葉綠素?zé)晒鈪?shù)圖；

圖3：LPE1蛋白特異性定位于葉綠體圖；

圖4：LPE1蛋白序列在作物中的保守性分析圖。

具體實(shí)施方式

發(fā)明人通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一種光合作用調(diào)控蛋白LPE1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，存在有葉綠體信號(hào)肽(Chloroplast Transit Peptide,CTP)結(jié)構(gòu)域和PPR結(jié)構(gòu)域(pentatricopeptide repeat，PPR)(如圖3所示)。

一種編碼光合作用調(diào)控蛋白LPE1的基因(如SEQ ID NO：2所示)，位于擬南芥3號(hào)染色體上，基因座位號(hào)為L(zhǎng)OC_AT3G46610(TAIR登錄號(hào))。其全長(zhǎng)基因組序列約為2471bp，包括1個(gè)外顯子。其cDNA(如SEQ ID NO：3所示)全長(zhǎng)2471bp，編碼665個(gè)氨基酸。

發(fā)明人通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，光合作用調(diào)控蛋白LPE1定位于葉綠體，其編碼基因LPE1參與擬南芥光效調(diào)控，是一種重要的調(diào)控植物光合效率的功能基因。利用正向遺傳學(xué)方法，獲得三個(gè)LPE1的純合缺失突變體株系，發(fā)現(xiàn)LPE1基因的功能缺失會(huì)導(dǎo)致植株發(fā)育遲緩，最大光合效率降低。

鑒于LPE1基因在植物中具有較高的保守性，可以預(yù)見在其他陸生植物中同樣具有相同或相近的功能，例如楊樹，葡萄，黃瓜，蓖麻，大豆，草莓，茄子，玉米，水稻，大麥，苔蘚等，但不僅限于此。因此，通過(guò)對(duì)LPE1基因進(jìn)行上調(diào)或蛋白LPE1過(guò)表達(dá)，有望獲得高光效的植物，

下面結(jié)合試驗(yàn)，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，其中未詳細(xì)說(shuō)明的方法為本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法。

一.擬南芥LPE1突變體的純合性鑒定

1.擬南芥總DNA的提?。?/p>

稱取0.5～1.0g的三周齡擬南芥野生型(Col-0)和LPE1(lpe1-1，lpe1-2,lpe1-3)突變體嫩葉，液氮速凍后研磨，加入600μL 2×CTAB提取液，植物組織破碎儀上破碎20s，重復(fù)兩次，將破碎后的植物材料，放入65℃金屬浴中溫浴30min，每隔十分鐘翻轉(zhuǎn)一次；室溫冷卻5min后，加入等體積的預(yù)冷的氯仿/異戊醇(24:1)，振蕩混勻后室溫靜置10min；8000g/min離心10min；離心后液面分上下兩層，小心取出離心管，輕輕吸取上清400μL轉(zhuǎn)至新的1.5mL EP管中，注意不要吸到沉淀；加入預(yù)冷的300μL異丙醇，輕輕上下?lián)u動(dòng)離心管，緩慢混合上清與異丙醇，放置-20℃，20min；隨后12000g/min，離心10min；棄上清，加入1mL無(wú)水乙醇洗滌沉淀，輕微振蕩，12 000g/min離心去上清，重復(fù)此步驟一次；DNA沉淀于室溫晾干，在見到無(wú)色膠狀物附在管壁時(shí)，加入30μL無(wú)菌蒸餾水溶解沉淀的DNA，存放于-20℃?zhèn)溆?。其中所?×CTAB提取液(500mL)的配方為：10g CTAB、6.05g Tris、3.722g EDTA-Na₂、40.95g NaCl(1.4M)。

2.擬南芥LPE1突變體純合性鑒定

利用三引物法鑒定LPE1突變體，設(shè)計(jì)如下三對(duì)引物(引物作用位置如圖1A)：

SALK_059367-L：5′-TGGACTACTTTGCACACGATG-3′(SEQ ID NO：4)；

SALK_059367-R：5′-ACTACCGAAGCAAGCCTGTTC-3′(SEQ ID NO：5)；

SALK_030882-L：5′-TGGACTACTTTGCACACGATG-3′(SEQ ID NO：6)；

SALK_030882-R：5′-ATCCTACCCCAAACGATGATC-3′(SEQ ID NO：7)；

SALK_110539-F：5′-ATCCTACCCCAAACGATGATC-3′(SEQ ID NO：8)；

SALK_110539-R：5′-ATCTTGCTGAGTGCAGCTAGC-3′(SEQ ID NO：9)；

中間引物L(fēng)Ba1：5′-TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG-3′(SEQ ID NO：10)。

PCR反應(yīng)體系為：DNA模板1μL、引物L(fēng) 1μL、引物R 1μL、引物L(fēng)Ba1 1μL、2×PCR Mix 12.5μL、H₂O 8.5μL。

擴(kuò)增條件為：94℃變性5min；94℃30s，60℃30s，72℃60s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖膠中分離并拍照。

結(jié)果如圖1B所示，突變體的擴(kuò)增片段大小明顯小于野生型擬南芥植株，說(shuō)明突變體有T-DNA插入，且突變體沒有也野生型大小一致的條帶，說(shuō)明這些突變體為是純合突變體。

二.擬南芥LPE1突變體LPE1基因表達(dá)分析

1.擬南芥總RNA的提取

取三周齡擬南芥野生型(Col-0)和LPE1(lpe1-1，lpe1-2,lpe1-3)突變體嫩葉，置于1.5mL EP管中液氮速凍后研磨成粉狀，按照每0.1g材料加入1mL提取試劑的比例加入Trizol(Invitrogen公司產(chǎn)RNA專用提取試劑)，充分振蕩混勻后，室溫放置5min；再按照每0.1g材料加入200μL氯仿的比例加入氯仿，快速振蕩后靜置分層，12 000g，4℃離心10min；將上層水相轉(zhuǎn)至新的1.5mL EP管中，加入600μL異丙醇充分混勻，室溫靜置10min；12 000g，4℃離心10min，收集沉淀，加入1mL 75％的乙醇(DEPC處理)洗滌沉淀；12 000g，4℃離心5min，沉淀于超凈工作臺(tái)中吹干，用30～50μL無(wú)RNase水(DEPC處理)溶解RNA，檢測(cè)RNA的完整性及純度符合要求后，于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.LPE1基因的RT-PCR表達(dá)分析：

(1)cDNA第一鏈的合成

RNA需要進(jìn)行去除基因組的處理，體系為5×gDNA Eraser Buffer 2.0μL，gDNA 1μL，RNA 2μg，RNase Free dH₂O補(bǔ)足到10μL，42℃2min進(jìn)行DNA去除試驗(yàn)并得到反應(yīng)液1。再采用20μL體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，體系為反應(yīng)液1 10μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0μL，Primer Mix 1.0μL，5×PrimeScript Buffer 2 4.0μL，RNase Free dH₂O 4.0μL。按以下程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：37℃15min；85℃5s，生成的cDNA第一鏈保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

(2)cDNA為模板的qPCR

設(shè)計(jì)如下一對(duì)引物：

LPE1-F：5′-GTATTGAACCGAGCGTTGTGAC-3′(SEQ ID NO：11)；

LPE1-R：5′-AGCCTCAATCAACATCTCGTAAGTT-3′(SEQ ID NO：12)；

Real-time PCR反應(yīng)體系為15μL：SYBR Premix Ex TaqTM II 7.5μL、引物L(fēng)PE1-F 0.5μL、引物L(fēng)PE1-R 0.5μL、cDNA模板1μL，dH₂O 5.5μL。

擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，72℃延伸20s，39個(gè)循環(huán)，添加熔解曲線；每個(gè)組織樣品添加3個(gè)重復(fù)。

采用Pfaffl method，以野生型中基因表達(dá)量為對(duì)照，計(jì)算LPE1基因在其他各突變株系的相對(duì)表達(dá)量，同時(shí)應(yīng)用SPASS 18.0軟件計(jì)算重復(fù)樣品之間Ct均值以及標(biāo)準(zhǔn)偏差，最后使用Excel制圖功能繪制出基因在各突變株系中的相對(duì)表達(dá)柱狀圖。

結(jié)果如圖1C所示，突變體的LPE1基因的相對(duì)表達(dá)量顯著低于野生型擬南芥植株。

三.擬南芥LPE1突變體葉綠素?zé)晒鈪?shù)及含量分析

植株暗適應(yīng)20min后，利用M系列葉綠素?zé)晒鈨xIMAGING-PAM MAXI版(Heinz-Walz)，測(cè)定響應(yīng)的葉綠素?zé)晒鈪?shù)。

(1)最小熒光(F₀)、最大熒光(F_m)以及最大光合作用效率(F_v/F_m)的測(cè)定：

打開葉綠素?zé)晒鈨xIMAGING-PAM飽和脈沖(2800μmol photons m^-2s^-1)測(cè)定F₀、F_m以及F_v/F_m。

結(jié)果如圖1D所示，突變體的最大光合作用效率F_v/F_m顯著低于野生型擬南芥植株。

(2)光響應(yīng)曲線測(cè)定：

F₀和F_m測(cè)定后，設(shè)置光強(qiáng)參數(shù)以及時(shí)間間隔，測(cè)定實(shí)際光合作用效率(ФPSII)和電子傳遞速率(ETR)和1-qP的光響應(yīng)曲線。光強(qiáng)設(shè)置為0，81，145，186，281，335，461，701，以及926μmol photons m^-2s^-1。每隔3min打開飽和脈沖(2800μmol photons m^-2s^-1)記錄一次數(shù)值。

結(jié)果如圖2所示，突變體的實(shí)際光合作用效率和電子傳遞速率均低于野生型擬南芥植株，而1-qP的光響應(yīng)曲線均高于野生型擬南芥植株。

(3)動(dòng)力學(xué)曲線測(cè)定

F₀和F_m測(cè)定后，打開光化光(531μmol photons m^-2s^-1)，測(cè)定715s，每隔20s記錄一次數(shù)值，共測(cè)定36個(gè)飽和脈沖。光化光以后，F(xiàn)_m’的恢復(fù)測(cè)定如“Non-Photochemical Quenching.A Response to Excess Light Energy.Muller,Plant Physiology,2001”所述，測(cè)定16個(gè)飽和脈沖。根據(jù)Fm′＝Fm′36，F(xiàn)m^r＝Fm′52，qE＝Fm/fm′–fm/Fm^r，qI＝(fm-fm^r)/fm^r分別算出qE和qI，并記錄相應(yīng)的qN及Y(NO)(結(jié)果見表1)。

(4)葉綠素含量測(cè)定

利用分光光度法分別對(duì)野生型(Col-0)及突變體(lpe1-1，lpe1-2，lpe1-3)中葉綠素a(Chl a)和葉綠素b(Chl b)的含量進(jìn)行檢測(cè)(結(jié)果見表1)。具體步驟如下：

葉片用80％丙酮4℃抽提過(guò)夜，10000g，離心5min，棄沉淀。測(cè)定OD₆₄₅及OD₆₆₃值，Chl a和Chl b含量按照如下公式計(jì)算，單位mg/g FW：

Chl a＝(12.7×A₆₆₃–2.69×A₆₄₅)×稀釋倍數(shù)/1000

Chl b＝(22.9×A₆₄₅–4.48×A₆₆₃)×稀釋倍數(shù)/1000

表1野生型(Col-0)和lpe1突變體葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)

從表1可以看出，突變體的Chl a、Chl b和qE均顯著降低。葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的主要色素，葉綠素含量降低提示光系統(tǒng)可能發(fā)育異常。F₀、Fm、qN、Y(NO)、qI均顯著提高。qI代表光抑制依賴的非光化學(xué)淬滅，lpe1突變體中qI明顯增加，提示植株受到了明顯的光抑制。F₀代表最小熒光值，F(xiàn)m代表最大熒光值，Y(NO)代表除了熱擴(kuò)散以外的熒光淬滅部分，qN代表非光化學(xué)猝滅，這些參數(shù)升高，提示實(shí)際參與光合作用的效率降低。

綜上，LPE1基因的缺失會(huì)降低擬南芥植株的光合作用效率和葉綠體功能。

四.擬南芥LPE1突變體蓮座葉長(zhǎng)度及鮮重測(cè)定

對(duì)野生型(Col-0)及突變體(lpe1-1，lpe1-2，lpe1-3)中蓮座葉的長(zhǎng)度及鮮重進(jìn)行檢測(cè)。取生長(zhǎng)4周齡的擬南芥野生型(Col-0)及突變體(lpe1-1，lpe1-2，lpe1-3)植株，用游標(biāo)卡尺測(cè)量蓮座葉的長(zhǎng)度并用電子天平測(cè)定除根以外的整株植株的鮮重。各實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次。

結(jié)果如圖1E所示，突變體的蓮座葉的長(zhǎng)度和除根以外的整株植株的鮮重均明顯小于野生型擬南芥植株，說(shuō)明LPE1基因的缺失會(huì)導(dǎo)致植株發(fā)育遲緩。

五.LPE1蛋白亞細(xì)胞定位分析

1.LPE1基因的克隆

設(shè)計(jì)如下兩條引物：

LPE1-F：5′-GTATTGAACCGAGCGTTGTGAC-3′(SEQ ID NO：11)；

LPE1-R：5′-CAGGTACCAGGTCTATTCTTTTTGTCTGGT-3(SEQ ID NO：12)′。

PCR反應(yīng)體系為：cDNA模板1μL、引物L(fēng)PE1-F 1μL、引物L(fēng)PE1-R 1μL、2×PCR Mix 12.5μL、H₂O 9.5μL。

擴(kuò)增條件為：94℃變性5min；94℃30s，60℃30s，72℃120s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖膠中分離并拍照。

2.LPE1-GFP融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建

以Columbia-0(Col-0)cDNA為模板，PCR得到的DNA片段先連接至pMD 19-T載體中，挑取單克隆進(jìn)行鑒定，鑒定的陽(yáng)性克隆送至英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測(cè)序。將經(jīng)測(cè)序正確的pMD19-LPE1載體用XbaI和Kpn I雙酶切；原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)載體pUC-GFP分別用XbaI和Kpn I雙酶切，回收并純化。將回收得到的目的片段用T₄DNA連接酶連接入原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)載體pUC-GFP的相應(yīng)位點(diǎn)中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行酶切鑒定，最后得到在35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的LPE1-GFP融合蛋白表達(dá)載體。

3.利用擬南芥原生質(zhì)體系統(tǒng)瞬時(shí)表達(dá)LPE1-GFP融合蛋白

(1)試劑配置

1)酶解液

總體系20mL：蔗糖0.5mol/L、0.2M的MES(pH 5.7)1mL、1M的CaCl₂ 0.4mL、2M的KCl 0.4mL、1％Cellose(R10)0.2g、1％Macerozyme(R10)0.2g、H₂O 18.4mL。

5～10mL酶解液能酶解10～20片葉子，最終能分離出0.5～1×10⁶個(gè)原生質(zhì)體，每個(gè)樣品需要1～2×10⁴個(gè)原生質(zhì)體。

2)TVL溶液

總體系15mL：山梨醇0.3mol/L、1M的CaCl₂ 0.75mL、H₂O 14.25mL。

3)W5溶液

總體系300mL：葡萄糖0.3g、KCl 0.24g、NaCl 2.7g、CaCl₂ 5.52g、0.2M的MES 3mL、H₂O補(bǔ)齊至300mL

4)Mmg溶液

總體系20mL：0.2M的MES 0.4mL、0.8M的Mannitol 10mL、1M的MgCl₂ 0.3mL、H₂O 9.3mL。

5)PEG/Ca²⁺溶液

總體系20mL：PEG4000 8g、0.8M的Mannitol 5mL、1M的CaCl₂ 2mL、H₂O 7mL。

(2)原生質(zhì)體分離

1)用新的刀片在含有15mL過(guò)濾的無(wú)菌TVL溶液中切割2g培養(yǎng)14d的擬南芥幼苗(注意勤換刀片)，切成0.5～1mm的細(xì)條，均勻分散在無(wú)菌的培養(yǎng)皿中；

2)切割完成后，將含TVL溶液的擬南芥細(xì)條轉(zhuǎn)移到200mL燒杯中，再添加20mL過(guò)濾的無(wú)菌酶解液，使組織和酶解液充分混合，用封口膜和鋁箔封閉；

3)在黑暗的室溫條件下，35rpm搖晃培養(yǎng)植物組織16～18h；

4)用8層紗布收集釋放的原生質(zhì)體至50mL尖底離心管中，紗布事先用W5溶液濕潤(rùn)；

5)用W5溶液清洗紗布上所殘留的原生質(zhì)體，清洗的次數(shù)根據(jù)所需要的原生質(zhì)體的含量來(lái)確定；

6)用W5溶液稀釋收集的原生質(zhì)體至100mL，隨后100g離心7min(注意一定要用水平的離心機(jī))；

7)去上清，用W5溶液洗滌原生質(zhì)體，隨后60g離心5min，重復(fù)2～3次；

8)去上清，用W5溶液重懸原生質(zhì)體，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板鏡檢計(jì)數(shù)；

9)將重懸的原生質(zhì)體其置于冰上30min，隨后60g離心5min；

10)去上清，再M(fèi)MG溶液重懸原生質(zhì)體，定量至2×10⁵個(gè)/mL。

(3)PEG轉(zhuǎn)化

1)在一個(gè)2mL的圓底EP管加入10μL DNA(5kb大小的質(zhì)粒DNA 10～20ug)，如果是雙轉(zhuǎn)，則每種質(zhì)粒都需要加入10μL；

2)加入100μL原生質(zhì)體(2×10⁴個(gè)原生質(zhì)體)，混勻；

3)加入110μL PEG/Ca溶液，混勻；

4)從第一個(gè)開始計(jì)時(shí)，黑暗放置15min；

5)用440μL W5溶液稀釋，并輕輕混勻；

6)800rmp離心2min，去上清；

7)加入500μL的W5溶液，分散原生質(zhì)體，平鋪于6/12/24孔板中培養(yǎng)；

8)過(guò)夜培養(yǎng)8-～12h。

4.激光共聚焦觀察LPE1-GFP融合蛋白

熒光蛋白標(biāo)記的目的蛋白在原生質(zhì)體細(xì)胞中表達(dá)后，利用激光掃描共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。GFP使用433nm激發(fā)，并使用500～530nm波長(zhǎng)收集GFP信號(hào)；葉綠素自發(fā)熒光用488或514nm波長(zhǎng)的激光激發(fā)，并用650-750nm收集。

結(jié)果如圖3所示，LPE1-GFP融合蛋白熒光特異性和葉綠素自發(fā)熒光重合，證實(shí)LPE1在葉綠體中的特異性定位。

六.LPE1的生物信息學(xué)分析

利用ClustalX進(jìn)行擬南芥LPE1蛋白在其他陸生植物中的同源性分析(www.clustal.org)，包括楊樹，葡萄，黃瓜，蓖麻，大豆，草莓，茄子，玉米，水稻，大麥，山羊草，苔蘚等。

結(jié)果如圖4所示，LPE1蛋白序列在其他陸生植物中有較高的保守性，可以預(yù)見，LPE1基因在其他陸生植物中極有可能存在相同的作用，通過(guò)調(diào)控LPE1基因，可以獲得相應(yīng)的高光效植物。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大學(xué)

<120> 一種光合作用調(diào)控蛋白LPE1及其應(yīng)用

<130>

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 665

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 1

Met Gln Ala Leu Ser Ile Leu Pro Leu Lys Ser Gly Leu Leu Val Gly

1 5 10 15

Ser Arg Leu Glu Phe Glu Leu Asp Cys Ser Cys Phe Val Val Ser Pro

20 25 30

Lys Thr Thr Arg Lys Arg Leu Cys Phe Leu Glu Gln Ala Cys Phe Gly

35 40 45

Ser Ser Ser Ser Ile Ser Ser Phe Ile Phe Val Ser Ser Asn Arg Lys

50 55 60

Val Leu Phe Leu Cys Glu Pro Lys Arg Ser Leu Leu Gly Ser Ser Phe

65 70 75 80

Gly Val Gly Trp Ala Thr Glu Gln Arg Glu Leu Glu Leu Gly Glu Glu

85 90 95

Glu Val Ser Thr Glu Asp Leu Ser Ser Ala Asn Gly Gly Glu Lys Asn

100 105 110

Asn Leu Arg Val Asp Val Arg Glu Leu Ala Phe Ser Leu Arg Ala Ala

115 120 125

Lys Thr Ala Asp Asp Val Asp Ala Val Leu Lys Asp Lys Gly Glu Leu

130 135 140

Pro Leu Gln Val Phe Cys Ala Met Ile Lys Gly Phe Gly Lys Asp Lys

145 150 155 160

Arg Leu Lys Pro Ala Val Ala Val Val Asp Trp Leu Lys Arg Lys Lys

165 170 175

Ser Glu Ser Gly Gly Val Ile Gly Pro Asn Leu Phe Ile Tyr Asn Ser

180 185 190

Leu Leu Gly Ala Met Arg Gly Phe Gly Glu Ala Glu Lys Ile Leu Lys

195 200 205

Asp Met Glu Glu Glu Gly Ile Val Pro Asn Ile Val Thr Tyr Asn Thr

210 215 220

Leu Met Val Ile Tyr Met Glu Glu Gly Glu Phe Leu Lys Ala Leu Gly

225 230 235 240

Ile Leu Asp Leu Thr Lys Glu Lys Gly Phe Glu Pro Asn Pro Ile Thr

245 250 255

Tyr Ser Thr Ala Leu Leu Val Tyr Arg Arg Met Glu Asp Gly Met Gly

260 265 270

Ala Leu Glu Phe Phe Val Glu Leu Arg Glu Lys Tyr Ala Lys Arg Glu

275 280 285

Ile Gly Asn Asp Val Gly Tyr Asp Trp Glu Phe Glu Phe Val Lys Leu

290 295 300

Glu Asn Phe Ile Gly Arg Ile Cys Tyr Gln Val Met Arg Arg Trp Leu

305 310 315 320

Val Lys Asp Asp Asn Trp Thr Thr Arg Val Leu Lys Leu Leu Asn Ala

325 330 335

Met Asp Ser Ala Gly Val Arg Pro Ser Arg Glu Glu His Glu Arg Leu

340 345 350

Ile Trp Ala Cys Thr Arg Glu Glu His Tyr Ile Val Gly Lys Glu Leu

355 360 365

Tyr Lys Arg Ile Arg Glu Arg Phe Ser Glu Ile Ser Leu Ser Val Cys

370 375 380

Asn His Leu Ile Trp Leu Met Gly Lys Ala Lys Lys Trp Trp Ala Ala

385 390 395 400

Leu Glu Ile Tyr Glu Asp Leu Leu Asp Glu Gly Pro Glu Pro Asn Asn

405 410 415

Leu Ser Tyr Glu Leu Val Val Ser His Phe Asn Ile Leu Leu Ser Ala

420 425 430

Ala Ser Lys Arg Gly Ile Trp Arg Trp Gly Val Arg Leu Leu Asn Lys

435 440 445

Met Glu Asp Lys Gly Leu Lys Pro Gln Arg Arg His Trp Asn Ala Val

450 455 460

Leu Val Ala Cys Ser Lys Ala Ser Glu Thr Thr Ala Ala Ile Gln Ile

465 470 475 480

Phe Lys Ala Met Val Asp Asn Gly Glu Lys Pro Thr Val Ile Ser Tyr

485 490 495

Gly Ala Leu Leu Ser Ala Leu Glu Lys Gly Lys Leu Tyr Asp Glu Ala

500 505 510

Phe Arg Val Trp Asn His Met Ile Lys Val Gly Ile Glu Pro Asn Leu

515 520 525

Tyr Ala Tyr Thr Thr Met Ala Ser Val Leu Thr Gly Gln Gln Lys Phe

530 535 540

Asn Leu Leu Asp Thr Leu Leu Lys Glu Met Ala Ser Lys Gly Ile Glu

545 550 555 560

Pro Ser Val Val Thr Phe Asn Ala Val Ile Ser Gly Cys Ala Arg Asn

565 570 575

Gly Leu Ser Gly Val Ala Tyr Glu Trp Phe His Arg Met Lys Ser Glu

580 585 590

Asn Val Glu Pro Asn Glu Ile Thr Tyr Glu Met Leu Ile Glu Ala Leu

595 600 605

Ala Asn Asp Ala Lys Pro Arg Leu Ala Tyr Glu Leu His Val Lys Ala

610 615 620

Gln Asn Glu Gly Leu Lys Leu Ser Ser Lys Pro Tyr Asp Ala Val Val

625 630 635 640

Lys Ser Ala Glu Thr Tyr Gly Ala Thr Ile Asp Leu Asn Leu Leu Gly

645 650 655

Pro Arg Pro Asp Lys Lys Asn Arg Pro

660 665

<210> 2

<211> 2471

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 2

caaaaattct atcttcttct tcgcggctct gaatccgcca ttgaagttat tttcaagccc 60

tcctcaattt tcgtttttgt tcaatattaa tttgtaagag atctttacgc ttcagtttct 120

gaaagaactt tgcgcttctg attttgcaaa attggaagag agtgcttccg ttgcgctttt 180

gaagcgtgaa atcgtgtgtc ttttgacgct tccatgctac ataacgctag ttgtgagatt 240

gtgtttggaa aaagatgcaa gctttaagca ttttgccatt aaagtctggt cttttagttg 300

gatcaagatt ggaatttgag ttggattgtt cttgttttgt agttagccct aagactacta 360

gaaagagact ttgctttctt gaacaggctt gcttcggtag tagtagtagt atctctagct 420

tcatcttcgt ttcgagtaac aggaaagttc tgtttttgtg tgagccaaag agaagtttgt 480

tgggatcatc gtttggggta ggatgggcca ctgagcaacg agagctcgag ctcggggaag 540

aagaagtttc cacggaagat ttaagttcag caaatggagg agaaaagaac aatttaagag 600

ttgatgttag agaattagcg tttagtttac gagctgctaa gacagctgat gatgtggatg 660

ctgttctcaa ggacaaggga gagttgcctc tgcaagtctt ttgtgctatg ataaagggtt 720

ttggcaagga caagagattg aagcctgcgg tagctgtagt agattggctt aagaggaaga 780

agagtgaatc aggcggtgtc ataggtccaa atctttttat atataacagc cttttgggtg 840

ctatgagagg gtttggggaa gcagagaaga tactgaaaga tatggaggaa gaagggattg 900

ttccaaacat tgttacttac aatactttga tggttattta catggaggaa ggtgagtttc 960

tcaaggctct tgggattctt gatttaacca aggaaaaggg ttttgagcct aacccgatta 1020

catattcaac ggctttgctt gtttacagaa gaatggaaga cggtatggga gctttagagt 1080

tctttgttga attgagagag aaatacgcaa agagggaaat agggaatgat gttggttacg 1140

attgggaatt tgagtttgtt aagcttgaga actttattgg tagaatatgc taccaagtga 1200

tgaggcggtg gttggtgaaa gatgataatt ggactactag agtgttgaag cttttgaatg 1260

caatggacag tgcaggggtt agaccgagta gggaagagca cgagaggctt atatgggcat 1320

gtactcgtga agagcattat attgttggta aagagttgta taaaagaatc agagagaggt 1380

tttctgagat aagtctgtct gtttgcaacc atttgatttg gctgatgggt aaggctaaga 1440

aatggtgggc agcgttggag atctacgagg atcttcttga cgaaggacct gaacctaaca 1500

atttgtctta tgagttagtg gtctctcatt tcaatatctt gctgagtgca gctagcaaga 1560

gagggatatg gagatgggga gttaggttac ttaacaaaat ggaagataaa ggattgaaac 1620

cgcagaggag acattggaac gcggttcttg tagcatgttc aaaagcctct gagaccacag 1680

ctgcgatcca aatctttaaa gcaatggttg acaatggtga aaagccaacg gtcatctcat 1740

acggtgcact actcagtgct cttgagaaag ggaagctata tgatgaggcg tttcgggttt 1800

ggaaccatat gattaaggta gggattgagc caaatcttta cgcgtacaca acaatggctt 1860

cagttttgac aggacagcaa aagttcaatc ttttggatac ccttctcaag gaaatggctt 1920

caaagggtat tgaaccgagc gttgtgactt tcaacgcggt tataagtggt tgcgcgagga 1980

acgggttaag tggtgtggct tatgagtggt ttcatagaat gaaaagtgag aatgttgagc 2040

ctaacgagat aacttacgag atgttgattg aggctcttgc aaatgatgca aagccaaggc 2100

ttgcttatga gttacatgtg aaggctcaaa acgaagggct taaactctct tctaagccat 2160

atgatgcggt tgttaaatca gctgagactt atggagccac cattgatctt aatcttttgg 2220

gtcctcgacc agacaaaaag aatagacctt agtctgacga aaacacattg tacaaggtta 2280

ccgtggggta aggcgcatcc aaggaccctt aaaggcaaga aaattgccat tacagggaag 2340

aagaaagttt ccaagtaatc actttcttgt tctttaatac tctttttagt ttgtctagtc 2400

tctctgttta tattgtgaat ttttatcttc gtacaacatc tgtattatca tcagacacat 2460

tgatatgcaa a 2471

<210> 3

<211> 2471

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 3