本發(fā)明涉及一種殺蟲蛋白組合及其管理昆蟲抗性的方法，特別是涉及組合使用Cry1Ac蛋白和Cry2Ab蛋白以管理亞洲玉米螟抗性的方法。

背景技術(shù)：

昆蟲害蟲使全球農(nóng)作物生產(chǎn)遭受著巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并且農(nóng)民每年都會(huì)面臨由于蟲害造成產(chǎn)量損失的威脅。亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)俗名鉆心蟲，屬鱗翅目螟蛾科，是我國玉米生產(chǎn)中的主要害蟲，該類昆蟲取食玉米葉片，蛀入玉米主莖或果穗內(nèi)，降低光合作用，影響?zhàn)B分運(yùn)輸，還會(huì)導(dǎo)致各種次級(jí)病害的產(chǎn)生，致使玉米減產(chǎn)降質(zhì)。近年來，隨著氣候條件的變化、耕作制度的改變、玉米種植密度的加大、肥水條件的提高，亞洲玉米螟的危害日益加重。

通過轉(zhuǎn)化Bt(Bacillus thuringiensis)殺蟲蛋白基因產(chǎn)生昆蟲抗性植物的能力給現(xiàn)代農(nóng)業(yè)帶來了革命，并提高了殺蟲蛋白及其基因的重要性和價(jià)值。已有數(shù)種Bt蛋白用于產(chǎn)生昆蟲抗性的轉(zhuǎn)基因植物中，包括Cry1Ab蛋白、Cry1Ac蛋白、Cry1F蛋白、Cry2Ab蛋白、Cry3Bb蛋白和Vip3A蛋白等。然而隨著轉(zhuǎn)基因作物的推廣應(yīng)用，昆蟲在持續(xù)的選擇壓力下將進(jìn)化出針對(duì)轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的Bt蛋白的抗性，這樣的抗性一旦產(chǎn)生并且不能被有效控制的話，無疑將限制含有Bt蛋白的轉(zhuǎn)基因作物品種的商業(yè)價(jià)值。只有實(shí)施合理的抗性管理策略，才能使這一現(xiàn)代化技術(shù)成果得以持久的利用。

生產(chǎn)上為了減少昆蟲抗性的產(chǎn)生主要采用以下幾種抗性管理策略：

1)田間設(shè)置庇護(hù)所。設(shè)置庇護(hù)所的目的在于保持一定比例非抗性的等位基因，以延緩耐受高劑量抗蟲蛋白的昆蟲的產(chǎn)生，但此種策略會(huì)使得農(nóng)民在實(shí)際操作上較為繁瑣，并且在一定程度上降低總產(chǎn)量。

2)提高單一抗蟲蛋白的使用劑量，此種策略可持續(xù)性較差，昆蟲在持續(xù)的選擇壓力下將對(duì)單一蛋白產(chǎn)生更高的抗性。

3)不同抗蟲蛋白交替使用或共使用。鑒于Bt蛋白特異地結(jié)合敏感昆蟲的受體，因此疊加使用抗蟲蛋白需評(píng)估昆蟲對(duì)不同抗蟲蛋白是否存在交互抗性，即是否共享或競爭結(jié)合位點(diǎn)，具有較高的不確定性，故至今尚無關(guān)于Cry2Ab蛋白針對(duì)亞洲玉米螟與Cry1Ac蛋白是否具有交互抗性的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種殺蟲蛋白組合及其管理昆蟲抗性的方法，不僅首次提出了通過Cry2Ab蛋白和Cry1Ac蛋白組合控制抗性亞洲玉米螟的方法，而且有效延緩了亞洲玉米螟對(duì)單一蛋白產(chǎn)生抗性。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種管理昆蟲抗性的方法，所述方法包括將亞洲玉米螟至少與Cry2Ab蛋白和Cry1Ac蛋白接觸。

進(jìn)一步地，所述Cry2Ab蛋白和Cry1Ac蛋白存在于至少產(chǎn)生所述Cry2Ab蛋白和Cry1Ac蛋白的細(xì)菌或轉(zhuǎn)基因植物中，所述亞洲玉米螟通過攝食所述細(xì)菌或所述轉(zhuǎn)基因植物的組織至少與所述Cry2Ab蛋白和Cry1Ac蛋白接觸，接觸后所述亞洲玉米螟生長受到抑制和/或?qū)е滤劳?，以?shí)現(xiàn)管理亞洲玉米螟的抗性。

更進(jìn)一步地，將對(duì)Cry1Ac蛋白產(chǎn)生抗性的亞洲玉米螟至少與所述Cry2Ab蛋白接觸，所述Cry2Ab蛋白存在于至少產(chǎn)生所述Cry2Ab蛋白的細(xì)菌或轉(zhuǎn)基因植物中，所述對(duì)Cry1Ac蛋白產(chǎn)生抗性的亞洲玉米螟通過攝食所述細(xì)菌或所述轉(zhuǎn)基因植物的組織至少與所述Cry2Ab蛋白接觸，接觸后所述對(duì)Cry1Ac蛋白產(chǎn)生抗性的亞洲玉米螟生長受到抑制和/或?qū)е滤劳?，以?shí)現(xiàn)管理所述對(duì)Cry1Ac蛋白產(chǎn)生抗性的亞洲玉米螟的抗性。

再進(jìn)一步地，將對(duì)Cry2Ab蛋白產(chǎn)生抗性的亞洲玉米螟至少與所述Cry1Ac蛋白接觸，所述Cry1Ac蛋白存在于至少產(chǎn)生所述Cry1Ac蛋白的細(xì)菌或轉(zhuǎn)基因植物中，所述對(duì)Cry2Ab蛋白產(chǎn)生抗性的亞洲玉米螟通過攝食所述細(xì)菌或所述轉(zhuǎn)基因植物的組織至少與所述Cry1Ac蛋白接觸，接觸后所述對(duì)Cry2Ab蛋白產(chǎn)生抗性的亞洲玉米螟生長受到抑制和/或?qū)е滤劳?，以?shí)現(xiàn)管理所述對(duì)Cry2Ab蛋白產(chǎn)生抗性的亞洲玉米螟的抗性。

在上述技術(shù)方案中，所述轉(zhuǎn)基因植物處于任意生育期。

進(jìn)一步地，所述轉(zhuǎn)基因植物的組織為根、葉片、莖稈、果實(shí)、雄穗、雌穗、花藥或花絲。

更進(jìn)一步地，所述對(duì)亞洲玉米螟危害植物的控制不因種植地點(diǎn)和/或種植時(shí)間的改變而改變。

可選擇地，所述植物為玉米、小麥、高粱、谷子、水稻或大豆。

在上述技術(shù)方案中，所述Cry2Ab蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

進(jìn)一步地，所述Cry2Ab蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

優(yōu)選地，所述Cry1Ac蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

進(jìn)一步地，所述Cry1Ac蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種控制亞洲玉米螟的方法，所述方法包括將亞洲玉米螟至少與Cry2Ab蛋白和Cry1Ac蛋白接觸，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)亞洲玉米螟的控制。

進(jìn)一步地，所述Cry2Ab蛋白和Cry1Ac蛋白存在于至少產(chǎn)生所述Cry2Ab蛋白和Cry1Ac蛋白的細(xì)菌或轉(zhuǎn)基因植物中，所述亞洲玉米螟通過攝食所述細(xì)菌或所述轉(zhuǎn)基因植物的組織至少與所述Cry2Ab蛋白和Cry1Ac蛋白接觸，接觸后所述亞洲玉米螟生長受到抑制和/或?qū)е滤劳?，以?shí)現(xiàn)對(duì)亞洲玉米螟危害植物的控制。

更進(jìn)一步地，將對(duì)Cry1Ac蛋白產(chǎn)生抗性的亞洲玉米螟至少與所述Cry2Ab蛋白接觸，所述Cry2Ab蛋白存在于至少產(chǎn)生所述Cry2Ab蛋白的細(xì)菌或轉(zhuǎn)基因植物中，所述對(duì)Cry1Ac蛋白產(chǎn)生抗性的亞洲玉米螟通過攝食所述細(xì)菌或所述轉(zhuǎn)基因植物的組織至少與所述Cry2Ab蛋白接觸，接觸后所述對(duì)Cry1Ac蛋白產(chǎn)生抗性的亞洲玉米螟生長受到抑制和/或?qū)е滤劳?，以?shí)現(xiàn)對(duì)所述對(duì)Cry1Ac蛋白產(chǎn)生抗性的亞洲玉米螟危害植物的控制。

再進(jìn)一步地，將對(duì)Cry2Ab蛋白產(chǎn)生抗性的亞洲玉米螟至少與所述Cry1Ac蛋白接觸，所述Cry1Ac蛋白存在于至少產(chǎn)生所述Cry1Ac蛋白的細(xì)菌或轉(zhuǎn)基因植物中，所述對(duì)Cry2Ab蛋白產(chǎn)生抗性的亞洲玉米螟通過攝食所述細(xì)菌或所述轉(zhuǎn)基因植物的組織至少與所述Cry1Ac蛋白接觸，接觸后所述對(duì)Cry2Ab蛋白產(chǎn)生抗性的亞洲玉米螟生長受到抑制和/或?qū)е滤劳?，以?shí)現(xiàn)對(duì)所述對(duì)Cry2Ab蛋白產(chǎn)生抗性的亞洲玉米螟危害植物的控制。

在上述技術(shù)方案中，所述轉(zhuǎn)基因植物處于任意生育期。

進(jìn)一步地，所述轉(zhuǎn)基因植物的組織為根、葉片、莖稈、果實(shí)、雄穗、雌穗、花藥或花絲。

優(yōu)選地，所述對(duì)亞洲玉米螟危害植物的控制不因種植地點(diǎn)和/或種植時(shí)間的改變而改變。

可選擇地，所述植物為玉米、小麥、高粱、谷子、水稻或大豆。

在上述技術(shù)方案中，所述Cry2Ab蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

進(jìn)一步地，所述Cry2Ab蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

優(yōu)選地，所述Cry1Ac蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

進(jìn)一步地，所述Cry1Ac蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種Cry2Ab蛋白和Cry1Ac蛋白組合使用以防止或延緩亞洲玉米螟群體對(duì)Cry1Ac蛋白或Cry2Ab蛋白產(chǎn)生抗性的用途。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種Cry2Ab蛋白和Cry1Ac蛋白組合使用以控制對(duì)Cry1Ac蛋白或Cry2Ab蛋白產(chǎn)生抗性的亞洲玉米螟群體的用途。

本發(fā)明中所述的“接觸”，是指昆蟲和/或害蟲觸碰、停留和/或攝食植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞，所述植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞既可以是其體內(nèi)表達(dá)殺蟲蛋白，還可以是所述植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞的表面具有殺蟲蛋白和/或具有產(chǎn)生殺蟲蛋白的微生物。

本發(fā)明所述的“控制”和/或“防治”是指亞洲玉米螟害蟲至少與Cry2Ab蛋白和Cry1Ac蛋白接觸，接觸后亞洲玉米螟害蟲生長受到抑制和/或?qū)е滤劳觥＿M(jìn)一步地，亞洲玉米螟害蟲通過攝食植物組織至少與Cry2Ab蛋白和Cry1Ac蛋白接觸，接觸后全部或部分亞洲玉米螟害蟲生長受到抑制和/或?qū)е滤劳觥Ｒ种剖侵竵喼滤?，即尚未致死但能引起生長發(fā)育、行為、生理、生化和組織等方面的某種效應(yīng)，如生長發(fā)育緩慢和/或停止。同時(shí)，植物在形態(tài)上應(yīng)是正常的，且可在常規(guī)方法下培養(yǎng)以用于產(chǎn)物的消耗和/或生成。此外，含有編碼Cry2Ab蛋白和Cry1Ac蛋白的多核苷酸序列的控制亞洲玉米螟害蟲的植物和/或植物種子，在人工接種亞洲玉米螟害蟲和/或亞洲玉米螟害蟲自然發(fā)生危害的條件下，與非轉(zhuǎn)基因的野生型植株相比具有減弱的植物損傷，具體表現(xiàn)包括但不限于改善的莖稈抗性、和/或提高的籽粒重量、和/或增產(chǎn)等。Cry2Ab蛋白和Cry1Ac蛋白對(duì)亞洲玉米螟的“控制”和/或“防治”作用是可以獨(dú)立存在的，不因其它可“控制”和/或“防治”亞洲玉米螟害蟲的物質(zhì)的存在而減弱和/或消失。具體地，轉(zhuǎn)基因植物(含有編碼Cry2Ab蛋白和Cry1Ac蛋白的多核苷酸序列)的任何組織同時(shí)和/或不同步地，存在和/或產(chǎn)生，Cry2Ab蛋白和Cry1Ac蛋白和/或可控制亞洲玉米螟害蟲的另一種物質(zhì)，則所述另一種物質(zhì)的存在既不影響Cry2Ab蛋白和Cry1Ac蛋白對(duì)亞洲玉米螟的“控制”和/或“防治”作用，也不能導(dǎo)致所述“控制”和/或“防治”作用完全和/或部分由所述另一種物質(zhì)實(shí)現(xiàn)，而與Cry2Ab蛋白和Cry1Ac蛋白無關(guān)。通常情況下，在大田，亞洲玉米螟害蟲攝食植物組織的過程短暫且很難用肉眼觀察到，因此，在人工接種亞洲玉米螟害蟲和/或亞洲玉米螟害蟲自然發(fā)生危害的條件下，如轉(zhuǎn)基因植物(含有編碼Cry2Ab蛋白和Cry1Ac蛋白的多核苷酸序列)的任何組織存在死亡的亞洲玉米螟害蟲、和/或在其上停留生長受到抑制的亞洲玉米螟害蟲、和/或與非轉(zhuǎn)基因的野生型植株相比具有減弱的植物損傷，即為實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的方法和/或用途，即通過亞洲玉米螟害蟲至少與Cry2Ab蛋白和Cry1Ac蛋白接觸以實(shí)現(xiàn)控制亞洲玉米螟害蟲的方法和/或用途。

術(shù)語“植物”包括整株植物、植物細(xì)胞、植物器官、植物原生質(zhì)體、植物可以從中再生的植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織、植物叢(plant clumps)和植物或植物部分中完整的植物細(xì)胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果實(shí)、莖稈、根、根尖、花藥等。

本發(fā)明中所述的植物、植物組織或植物細(xì)胞的基因組，是指植物、植物組織或植物細(xì)胞內(nèi)的任何遺傳物質(zhì)，且包括細(xì)胞核和質(zhì)體和線粒體基因組。

本發(fā)明中所述的“重組”是指通常不能在自然界中發(fā)現(xiàn)并且因此通過人工干預(yù)產(chǎn)生的DNA和/或蛋白和/或生物體的形式。這種人工干預(yù)可產(chǎn)生重組DNA分子和/或重組植物。所述“重組DNA分子”是通過人工組合兩種在其它情況下是分離的序列區(qū)段而獲得的，例如通過化學(xué)合成或通過遺傳工程技術(shù)操作分離的核酸區(qū)段。進(jìn)行核酸操作的技術(shù)是眾所周知的。

本發(fā)明術(shù)語“原毒素”或“毒素”或“殺蟲毒素”指在中腸中發(fā)生任何斷裂之前編碼殺蟲蛋白的全長基因的最初翻譯產(chǎn)物。本發(fā)明術(shù)語“毒素”或“最小毒性片段”應(yīng)理解為殺蟲蛋白例如Cry2Ab或Cry1Ac蛋白的部分，其可以通過胰蛋白酶消化或通過在(目標(biāo)昆蟲，例如亞洲玉米螟)中腸液中水解而獲得、且仍具有殺昆蟲活性。通常在SDS-PAGE凝膠上，Cry1毒素具有約60-65kD的分子量，Cry2A毒素具有約50-58kD的分子量。

在本發(fā)明中，Cry2Ab蛋白和Cry1Ac蛋白在一種轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)。這種超過一種的殺蟲毒素在同一株轉(zhuǎn)基因植物中共同表達(dá)可以通過遺傳工程使植物包含并表達(dá)所需的基因來實(shí)現(xiàn)。另外，一種植物(第1親本)可以通過遺傳工程操作表達(dá)Cry2Ab蛋白質(zhì)，第二種植物(第2親本)可以通過遺傳工程操作表達(dá)Cry1Ac蛋白質(zhì)。通過第1親本和第2親本雜交獲得表達(dá)引入第1親本和第2親本的所有基因的后代植物。

在本發(fā)明中，產(chǎn)生所述Cry1Ac蛋白的轉(zhuǎn)基因植物包括但不限于TT51轉(zhuǎn)基因水稻事件和/或包含TT51轉(zhuǎn)基因水稻事件的植物材料(如在CN100582223C和CN101302520B所描述的)、223F-S21轉(zhuǎn)基因水稻品系和/或包含223F-S21轉(zhuǎn)基因水稻品系的植物材料(如在CN103773759A所描述的)、Mon15985轉(zhuǎn)基因棉花事件和/或包含Mon15985轉(zhuǎn)基因棉花事件的植物材料(如在CN101413028B所描述的)、MON531轉(zhuǎn)基因棉花事件和/或包含MON531轉(zhuǎn)基因棉花事件的植物材料(如在USDA APHIS非管制狀態(tài)申請(qǐng)00-342-01p所描述的)、COT67B轉(zhuǎn)基因棉花事件和/或包含COT67B轉(zhuǎn)基因棉花事件的植物材料(如在USDA APHIS非管制狀態(tài)申請(qǐng)07-108-01p所描述的)或者3006-210-23轉(zhuǎn)基因棉花事件和/或包含3006-210-23轉(zhuǎn)基因棉花事件的植物材料(如在USDA APHIS非管制狀態(tài)申請(qǐng)03-036-02p所描述的)。

在本發(fā)明中，產(chǎn)生所述Cry2Ab蛋白的轉(zhuǎn)基因植物包括但不限于Mon89034轉(zhuǎn)基因玉米事件和/或包含Mon89034轉(zhuǎn)基因玉米事件的植物材料(如在CN101495635A所描述的)、MON87751轉(zhuǎn)基因大豆事件和/或包含MON87751轉(zhuǎn)基因大豆事件的植物材料(如在USDA APHIS非管制狀態(tài)申請(qǐng)13-337-01p所描述的)、或者M(jìn)on15985轉(zhuǎn)基因棉花事件和/或包含Mon15985轉(zhuǎn)基因棉花事件的植物材料(如在CN101413028B所描述的)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，DNA典型的以雙鏈形式存在。在這種排列中，一條鏈與另一條鏈互補(bǔ)，反之亦然。由于DNA在植物中復(fù)制產(chǎn)生了DNA的其它互補(bǔ)鏈。這樣，本發(fā)明包括對(duì)序列表中示例的多核苷酸及其互補(bǔ)鏈的使用。本領(lǐng)域常使用的“編碼鏈”指與反義鏈結(jié)合的鏈。為了在體內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)，典型將DNA的一條鏈轉(zhuǎn)錄為一條mRNA的互補(bǔ)鏈，它作為模板翻譯出蛋白質(zhì)。mRNA實(shí)際上是從DNA的“反義”鏈轉(zhuǎn)錄的。“有義”或“編碼”鏈有一系列密碼子(密碼子是三個(gè)核苷酸，一次讀三個(gè)可以產(chǎn)生特定氨基酸)，其可作為開放閱讀框(ORF)閱讀來形成目的蛋白質(zhì)或肽。本發(fā)明還包括與示例的DNA有相當(dāng)功能的RNA。

任何常規(guī)的核酸雜交或擴(kuò)增方法都可以用于鑒定本發(fā)明殺蟲基因的存在。核酸分子或其片段在一定情況下能夠與其他核酸分子進(jìn)行特異性雜交。本發(fā)明中，如果兩個(gè)核酸分子能形成反平行的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，就可以說這兩個(gè)核酸分子彼此間能夠進(jìn)行特異性雜交。如果兩個(gè)核酸分子顯示出完全的互補(bǔ)性，則稱其中一個(gè)核酸分子是另一個(gè)核酸分子的“互補(bǔ)物”。本發(fā)明中，當(dāng)一個(gè)核酸分子的每一個(gè)核苷酸都與另一個(gè)核酸分子的對(duì)應(yīng)核苷酸互補(bǔ)時(shí)，則稱這兩個(gè)核酸分子顯示出“完全互補(bǔ)性”。如果兩個(gè)核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們在至少常規(guī)的“低度嚴(yán)格”條件下退火且彼此結(jié)合，則稱這兩個(gè)核酸分子為“最低程度互補(bǔ)”。類似地，如果兩個(gè)核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們在常規(guī)的“高度嚴(yán)格”條件下退火且彼此結(jié)合，則稱這兩個(gè)核酸分子具有“互補(bǔ)性”。從完全互補(bǔ)性中偏離是可以允許的，只要這種偏離不完全阻止兩個(gè)分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)。為了使一個(gè)核酸分子能夠作為引物或探針，僅需保證其在序列上具有充分的互補(bǔ)性，以使得在所采用的特定溶劑和鹽濃度下能形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明中，基本同源的序列是一段核酸分子，該核酸分子在高度嚴(yán)格條件下能夠和相匹配的另一段核酸分子的互補(bǔ)鏈發(fā)生特異性雜交。促進(jìn)DNA雜交的適合的嚴(yán)格條件，例如，大約在45℃條件下用6.0×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)處理，然后在50℃條件下用2.0×SSC洗滌，這些條件對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。例如，在洗滌步驟中的鹽濃度可以選自低度嚴(yán)格條件的約2.0×SSC、50℃到高度嚴(yán)格條件的約0.2×SSC、50℃。此外，洗滌步驟中的溫度條件可以從低度嚴(yán)格條件的室溫約22℃，升高到高度嚴(yán)格條件的約65℃。溫度條件和鹽濃度可以都發(fā)生改變，也可以其中一個(gè)保持不變而另一個(gè)變量發(fā)生改變。優(yōu)選地，本發(fā)明所述嚴(yán)格條件可為在6×SSC、0.5％SDS溶液中，在65℃下與SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4發(fā)生特異性雜交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜1次。

因此，具有抗蟲活性并在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4雜交的序列包括在本發(fā)明中。這些序列與本發(fā)明序列至少大約40％-50％同源，大約60％、65％或70％同源，甚至至少大約75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同源性。

本發(fā)明中所述的基因和蛋白質(zhì)不但包括特定的示例序列，還包括保存了所述特定示例的蛋白質(zhì)的殺蟲活性特征的部分和/片段(包括與全長蛋白質(zhì)相比在內(nèi)和/或末端缺失)、變體、突變體、取代物(有替代氨基酸的蛋白質(zhì))、嵌合體和融合蛋白。所述“變體”或“變異”是指編碼同一蛋白或編碼有殺蟲活性的等價(jià)蛋白的核苷酸序列。所述“等價(jià)蛋白”是指與權(quán)利要求的蛋白具有相同或基本相同的抗鱗翅目昆蟲害蟲的生物活性的蛋白。

本發(fā)明中所述的DNA分子或蛋白序列的“片段”或“截短”是指涉及的原始DNA或蛋白序列(核苷酸或氨基酸)的一部分或其人工改造形式(例如適合植物表達(dá)的序列)，前述序列的長度可存在變化，但長度足以確保(編碼)蛋白質(zhì)為昆蟲毒素。

使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以修飾基因和容易的構(gòu)建基因變異體。例如，本領(lǐng)域熟知制造點(diǎn)突變的技術(shù)。又例如美國專利號(hào)5605793描述了在隨機(jī)斷裂后使用DNA重裝配產(chǎn)生其它分子多樣性的方法。可以使用商業(yè)化核酸內(nèi)切酶制造全長基因的片段，并且可以按照標(biāo)準(zhǔn)程序使用核酸外切酶。例如，可以使用酶諸如Bal31或定點(diǎn)誘變從這些基因的末端系統(tǒng)地切除核苷酸。還可以使用多種限制性內(nèi)切酶獲取編碼活性片段的基因?？梢允褂玫鞍酌钢苯荧@得這些毒素的活性片段。

本發(fā)明可以從B.t.分離物和/或DNA文庫衍生出等價(jià)蛋白和/或編碼這些等價(jià)蛋白的基因。有多種方法獲取本發(fā)明的殺蟲蛋白。例如，可以使用本發(fā)明公開和要求保護(hù)的殺蟲蛋白的抗體從蛋白質(zhì)混合物鑒定和分離其它蛋白。特別地，抗體可能是由蛋白最恒定和與其它Bt蛋白最不同的蛋白部分引起的。然后可以通過免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)或western印跡方法使用這些抗體專一地鑒定有特征活性的等價(jià)蛋白?？墒褂帽绢I(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)程序容易的制備本發(fā)明中公開的蛋白或等價(jià)蛋白或這類蛋白的片段的抗體。然后可以從微生物中獲得編碼這些蛋白的基因。

由于遺傳密碼子的豐余性，多種不同的DNA序列可以編碼相同的氨基酸序列。產(chǎn)生這些編碼相同或基本相同的蛋白的可替代DNA序列正在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)水平內(nèi)。這些不同的DNA序列包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。所述“基本上相同的”序列是指有氨基酸取代、缺失、添加或插入但實(shí)質(zhì)上不影響殺蟲活性的序列，亦包括保留殺蟲活性的片段。

本發(fā)明中氨基酸序列的取代、缺失或添加是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，優(yōu)選這種氨基酸變化為：小的特性改變，即不顯著影響蛋白的折疊和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，通常約1-30個(gè)氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端延伸一個(gè)甲硫氨酸殘基；小的連接肽，例如約20-25個(gè)殘基長。

保守取代的實(shí)例是在下列氨基酸組內(nèi)發(fā)生的取代：堿性氨基酸(如精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變特定活性的那些氨基酸取代在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的，并且已由，例如，N.Neurath和R.L.Hill在1979年紐約學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)出版的《Protein》中進(jìn)行了描述。最常見的互換有Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thu/Ser，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu和Asp/Gly，以及它們相反的互換。

對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言顯而易見地，這種取代可以在對(duì)分子功能起重要作用的區(qū)域之外發(fā)生，而且仍產(chǎn)生活性多肽。對(duì)于由本發(fā)明的多肽，其活性必需的并因此選擇不被取代的氨基酸殘基，可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變進(jìn)行鑒定(如參見，Cunningham和Wells，1989，Science 244：1081-1085)。后一技術(shù)是在分子中每一個(gè)帶正電荷的殘基處引入突變，檢測所得突變分子的抗蟲活性，從而確定對(duì)該分子活性而言重要的氨基酸殘基。底物-酶相互作用位點(diǎn)也可以通過其三維結(jié)構(gòu)的分析來測定，這種三維結(jié)構(gòu)可由核磁共振分析、結(jié)晶學(xué)或光親和標(biāo)記等技術(shù)測定(參見，如de Vos等，1992，Science 255：306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol 224:899-904；Wlodaver等，1992，F(xiàn)EBS Letters 309：59-64)。

因此，與SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有一定同源性的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中。這些序列與本發(fā)明序列類似性/相同性典型的大于78％，優(yōu)選的大于85％，更優(yōu)選的大于90％，甚至更優(yōu)選的大于95％，并且可以大于99％。也可以根據(jù)更特定的相同性和/或類似性范圍定義本發(fā)明的優(yōu)選的多核苷酸和蛋白質(zhì)。例如與本發(fā)明示例的序列有78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性和/或類似性。

本發(fā)明術(shù)語“交互抗性”是指昆蟲的一個(gè)品系由于相同抗性機(jī)理或相似作用機(jī)理或類似化學(xué)結(jié)構(gòu)，對(duì)于選擇藥劑以外的其它從未使用過的一種藥劑或一類藥劑也產(chǎn)生抗藥性的現(xiàn)象。特別的，本發(fā)明中“交互抗性”指對(duì)選擇的殺蟲蛋白以外的其它從未使用過的一種殺蟲蛋白或一類殺蟲蛋白也產(chǎn)生抗性的現(xiàn)象。被選擇用于昆蟲抗性管理的蛋白質(zhì)需要獨(dú)立地發(fā)揮其殺蟲效果，從而對(duì)一種蛋白質(zhì)產(chǎn)生的抗性不會(huì)賦予對(duì)第二種蛋白質(zhì)的抗性(即對(duì)于第二種蛋白質(zhì)無交叉抗性或有較低的交叉抗性)。例如對(duì)“蛋白A”有抗性的昆蟲群體對(duì)“蛋白B”敏感，則人們可以得出結(jié)論，蛋白A和蛋白B無交叉抗性并且它們的組合可有效延遲對(duì)單一蛋白A的抗性。

本發(fā)明術(shù)語“抗性比例”是指同一種殺蟲蛋白在昆蟲的Bt抗性群體相對(duì)Bt敏感群體的LC50值提高的倍數(shù)，即抗性比例＝Bt抗性株LC50值/Bt敏感株LC50值。

本發(fā)明中所使用的，昆蟲物種群體對(duì)殺昆蟲蛋白和/或表達(dá)殺昆蟲蛋白植物(該植物以前控制或殺死所述昆蟲群體)“產(chǎn)生抗性”、“已經(jīng)產(chǎn)生抗性”或“已成為抗性的”是指，與首次引入該殺蟲蛋白和/或該植物時(shí)對(duì)相同昆蟲物種造成的控制效果和/或由相同昆蟲物種造成的該植物的產(chǎn)量損失水平相比，在該植物中檢測到由該昆蟲群體控制效果減弱和/或造成的重復(fù)的且顯著的產(chǎn)量損失。

亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)與棉鈴蟲(HelicoverpaarmigeraHubner)雖然同屬鱗翅目，但是亞洲玉米螟與棉鈴蟲在生物學(xué)上是清晰的、截然不同的兩個(gè)物種，至少存在以下主要區(qū)別：1)亞洲玉米螟屬螟蛾科，棉鈴蟲屬夜蛾科。2)食性不同。亞洲玉米螟最常危害玉米，可危害玉米植株地上的各個(gè)部位，包括葉片、雄穗、莖稈、穗柄、穗軸，對(duì)各地的春、夏、秋播玉米都有不同程度危害，尤以夏播玉米最重；棉鈴蟲是危害棉花蕾鈴期的重要鉆蛀性害蟲，主要蛀食蕾、花、鈴，也取食嫩葉。3)分布區(qū)域不同。亞洲玉米螟分布在中國東部及西南主要玉米、高粱產(chǎn)區(qū)；而棉鈴蟲廣泛分布在中國及世界各地，中國棉區(qū)和蔬菜種植區(qū)均有發(fā)生，黃河流域棉區(qū)、長江流域棉區(qū)受害較重；近年來，新疆棉區(qū)也時(shí)有發(fā)生。4)形態(tài)特征不同。亞洲玉米螟與棉鈴蟲的卵、幼蟲、蛹、成蟲的形態(tài)特征均有較大差異。5)生長習(xí)性和發(fā)生規(guī)律不同。玉米螟的發(fā)生代數(shù)隨緯度而有顯著的差異：在中國，北緯45°以北1代，45°-40°2代，40°-30°3代，30°-25°4代，25°-20°5-6代。海拔越高，發(fā)生代數(shù)越少；在四川省一年發(fā)生2-4代，溫度高、海拔低，發(fā)生代數(shù)較多，通常以老熟幼蟲在玉米莖稈、穗軸內(nèi)或高粱、向日葵的秸稈中越冬，次年4-5月化蛹，蛹經(jīng)過10天左右羽化。成蟲夜間活動(dòng)，飛翔力強(qiáng)，有趨光性，壽命5～10天，喜歡在離地50厘米以上、生長較茂盛的玉米葉背面中脈兩側(cè)產(chǎn)卵，一個(gè)雌蛾可產(chǎn)卵350-700粒，卵期3-5天；玉米螟適合在高溫、高濕條件下發(fā)育，冬季氣溫較高，天敵寄生量少，有利于玉米螟的繁殖，危害較重；卵期干旱，玉米葉片卷曲，卵塊易從葉背面脫落而死亡，危害較輕。而棉鈴蟲發(fā)生的代數(shù)因年份因地區(qū)而異，在山東省萊州市每年發(fā)生4代，九月下旬成長幼蟲陸續(xù)下樹入土，在苗木附近或雜草下5-10cm深的土中化蛹越冬；立春氣溫回升15℃以上時(shí)開始羽化，4月下旬至5月上旬為羽化盛期，成蟲出現(xiàn)第一代在6月中下旬，第二代在7月中下旬，第三代在8月中下旬至9月上旬至10月上旬尚有棉鈴蟲出現(xiàn)，成蟲有趨光性，羽化后即在夜間閃配產(chǎn)卵，卵散產(chǎn)，較分散，一頭雌蛾一生可產(chǎn)卵500-1000粒，最高可達(dá)2700粒，卵多產(chǎn)在葉背面，也有產(chǎn)在正面、頂芯、葉柄、嫩莖上或農(nóng)作的、雜草等其它植物上；幼蟲孵化后有取食卵殼習(xí)性，初孵幼蟲有群集限食習(xí)性，二三頭、三五頭在葉片正面或背面，頭向葉緣排列、自葉緣向內(nèi)取食，結(jié)果葉片被吃光，只剩主脈和葉柄，或成網(wǎng)狀枯萎，造成干葉；1-2齡幼蟲沿柄下行至銀杏苗頂芽處自一側(cè)蛀食或沿頂芽處下蛀入嫩枝，造成頂梢或頂部簇生葉死亡，危害十分嚴(yán)重；3齡前的幼蟲食量較少，較集中，隨著幼蟲生長而逐漸分散，進(jìn)入4齡食量大增，可食光葉片，只剩葉柄；幼蟲7-8月份為害最盛；棉鈴蟲有轉(zhuǎn)移危害的習(xí)性，一只幼蟲可危害多株苗木；各齡幼蟲均有食掉蛻下舊皮留頭殼的習(xí)性，給鑒別蟲齡造成一定困難，蟲齡不整齊；棉鈴蟲發(fā)生的最適宜溫度為25-28℃，相對(duì)濕度70-90％；第二代、第三代為害最為嚴(yán)重，嚴(yán)重地片蟲口密度達(dá)98頭/百葉，蟲株率60-70％，個(gè)別地片達(dá)100％，受害葉片達(dá)1/3以上，影響葉產(chǎn)量20％，質(zhì)量下降至少1個(gè)等級(jí)，苗木生長量影響很大。

綜合上述，亞洲玉米螟與棉鈴蟲雖然同屬鱗翅目，但是僅在形態(tài)特征和為害習(xí)性上就存在諸多方面的不同，且二者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，無法交配產(chǎn)生后代。因此，二者中腸上皮細(xì)胞膜上表面上與Bt毒素結(jié)合的受體也是不同的。

昆蟲對(duì)Bt蛋白的抗性機(jī)制不是單一的，Heckel(1994)等分析了昆蟲對(duì)Bt蛋白產(chǎn)生抗性的潛在機(jī)理，認(rèn)為抗性的產(chǎn)生主要和以下因素有關(guān)：1)Bt殺蟲蛋白的溶解性：原毒素不能溶解或溶解性降低；2)Bt原毒素的蛋白水解性：水解不充分或過度水解；3)Bt蛋白與細(xì)胞膜上受體的結(jié)合：Bt蛋白與受體的結(jié)合由于競爭性抑制而受阻、受體的一級(jí)結(jié)構(gòu)或二級(jí)結(jié)構(gòu)的修飾作用發(fā)生改變，導(dǎo)致Bt蛋白與受體的結(jié)合位點(diǎn)減少；4)細(xì)胞膜上空洞的形成：空洞形成受阻或阻塞；5)中腸上皮的修復(fù)作用；6)行為機(jī)理等。其中毒素與細(xì)胞膜上受體結(jié)合能力的改變是主要抗性機(jī)理。

當(dāng)兩種或以上不同的Bt蛋白在昆蟲中共享結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，它們不能夠提供用于昆蟲抗性管理目的的良好組合。實(shí)際情況下，針對(duì)不同的昆蟲采取何種抗性管理策略具有較高的不確定性。氨基酸序列差異較大的兩個(gè)Bt蛋白也可能在某一昆蟲物種中以高親和力結(jié)合共同的結(jié)合位點(diǎn)，例如Cry1Ab和Cry1F蛋白在菜蛾(Plutella xylostella)中。而且，已發(fā)現(xiàn)在一個(gè)昆蟲物種中不具有共享的結(jié)合位點(diǎn)的兩種蛋白可以在另一個(gè)昆蟲物種中共享結(jié)合位點(diǎn)，例如Fiuza等人(1996)發(fā)現(xiàn)Cry1Ac和Cry1Ba蛋白在二化螟(Chilo suppressalis)中共享結(jié)合位點(diǎn)，而Ballester等人(1999)發(fā)現(xiàn)以上兩種蛋白在菜蛾中結(jié)合不同的結(jié)合位點(diǎn)。

本發(fā)明中，所述Cry2Ab蛋白可以具有序列表中SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述Cry1Ac蛋白可以具有序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。除了包含Cry2Ab蛋白和Cry1Ac蛋白的編碼區(qū)外，也可包含其他元件，例如編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的編碼區(qū)或編碼選擇性標(biāo)記的蛋白質(zhì)，本發(fā)明提供的Cry2Ab蛋白和Cry1Ac蛋白的核苷酸序列可以通過常規(guī)手段形成構(gòu)建體。

此外，包含編碼本發(fā)明Cry2Ab蛋白和Cry1Ac蛋白的構(gòu)建體在植物中還可以與至少一種編碼除草劑抗性基因的蛋白質(zhì)一起表達(dá)，所述除草劑抗性基因包括但不限于，草胺膦抗性基因(如bar基因、pat基因)、苯敵草抗性基因(如pmph基因)、草甘膦抗性基因(如EPSPS基因)、溴苯腈(bromoxynil)抗性基因、磺酰脲抗性基因、對(duì)除草劑茅草枯的抗性基因、對(duì)氨腈的抗性基因或谷氨酰胺合成酶抑制劑(如PPT)的抗性基因，從而獲得既具有高殺蟲活性、又具有除草劑抗性的轉(zhuǎn)基因植物。

本發(fā)明中所述調(diào)控序列包括但不限于啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)運(yùn)肽、終止子、增強(qiáng)子、前導(dǎo)序列、內(nèi)含子以及其它可操作地連接到所述Cry2Ab蛋白或所述Cry1Ac蛋白的調(diào)節(jié)序列。

所述啟動(dòng)子為植物中可表達(dá)的啟動(dòng)子，所述的“植物中可表達(dá)的啟動(dòng)子”是指確保與其連接的編碼序列在植物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)的啟動(dòng)子。植物中可表達(dá)的啟動(dòng)子可為組成型啟動(dòng)子。指導(dǎo)植物內(nèi)組成型表達(dá)的啟動(dòng)子的示例包括但不限于，來源于花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子、玉米Ubi啟動(dòng)子、水稻GOS2基因的啟動(dòng)子等。備選地，植物中可表達(dá)的啟動(dòng)子可為組織特異的啟動(dòng)子，即該啟動(dòng)子在植物的一些組織內(nèi)如在綠色組織中指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)水平高于植物的其他組織(可通過常規(guī)RNA試驗(yàn)進(jìn)行測定)，如PEP羧化酶啟動(dòng)子。備選地，植物中可表達(dá)的啟動(dòng)子可為創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動(dòng)子。創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動(dòng)子或指導(dǎo)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的表達(dá)模式的啟動(dòng)子是指當(dāng)植物經(jīng)受機(jī)械或由昆蟲啃食引起的創(chuàng)傷時(shí)，啟動(dòng)子調(diào)控下的編碼序列的表達(dá)較正常生長條件下有顯著提高。創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動(dòng)子的示例包括但不限于，馬鈴薯和西紅柿的蛋白酶抑制基因(pinⅠ和pinⅡ)和玉米蛋白酶抑制基因(MPI)的啟動(dòng)子。

所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽(又稱分泌信號(hào)序列或?qū)蛐蛄?是指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物到特定的細(xì)胞器或細(xì)胞區(qū)室，對(duì)受體蛋白質(zhì)來說，所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽可以是異源的，例如，利用編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列靶向葉綠體，或者利用‘KDEL’保留序列靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，或者利用大麥植物凝集素基因的CTPP靶向液泡。

所述前導(dǎo)序列包含但不限于，小RNA病毒前導(dǎo)序列，如EMCV前導(dǎo)序列(腦心肌炎病毒5’非編碼區(qū))；馬鈴薯Y病毒組前導(dǎo)序列，如MDMV(玉米矮縮花葉病毒)前導(dǎo)序列；人類免疫球蛋白質(zhì)重鏈結(jié)合蛋白質(zhì)(BiP)；苜?；ㄈ~病毒的外殼蛋白質(zhì)mRNA的不翻譯前導(dǎo)序列(AMV RNA4)；煙草花葉病毒(TMV)前導(dǎo)序列。

所述增強(qiáng)子包含但不限于，花椰菜花葉病毒(CaMV)增強(qiáng)子、玄參花葉病毒(FMV)增強(qiáng)子、康乃馨風(fēng)化環(huán)病毒(CERV)增強(qiáng)子、木薯脈花葉病毒(CsVMV)增強(qiáng)子、紫茉莉花葉病毒(MMV)增強(qiáng)子、夜香樹黃化曲葉病毒(CmYLCV)增強(qiáng)子、木爾坦棉花曲葉病毒(CLCuMV)、鴨跖草黃斑駁病毒(CoYMV)和花生褪綠線條花葉病毒(PCLSV)增強(qiáng)子。

對(duì)于單子葉植物應(yīng)用而言，所述內(nèi)含子包含但不限于，玉米hsp70內(nèi)含子、玉米泛素內(nèi)含子、Adh內(nèi)含子1、蔗糖合酶內(nèi)含子或水稻Act1內(nèi)含子。對(duì)于雙子葉植物應(yīng)用而言，所述內(nèi)含子包含但不限于，CAT-1內(nèi)含子、pKANNIBAL內(nèi)含子、PIV2內(nèi)含子和“超級(jí)泛素”內(nèi)含子。

所述終止子可以為在植物中起作用的適合多聚腺苷酸化信號(hào)序列，包括但不限于，來源于農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂堿合成酶(NOS)基因的多聚腺苷酸化信號(hào)序列、來源于蛋白酶抑制劑Ⅱ(pinⅡ)基因的多聚腺苷酸化信號(hào)序列、來源于豌豆ssRUBISCO E9基因的多聚腺苷酸化信號(hào)序列和來源于α-微管蛋白(α-tubulin)基因的多聚腺苷酸化信號(hào)序列。

本發(fā)明中所述“有效連接”表示核酸序列的聯(lián)結(jié)，所述聯(lián)結(jié)使得一條序列可提供對(duì)相連序列來說需要的功能。在本發(fā)明中所述“有效連接”可以為將啟動(dòng)子與感興趣的序列相連，使得該感興趣的序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動(dòng)子控制和調(diào)控。當(dāng)感興趣的序列編碼蛋白并且想要獲得該蛋白的表達(dá)時(shí)“有效連接”表示：啟動(dòng)子與所述序列相連，相連的方式使得得到的轉(zhuǎn)錄物高效翻譯。如果啟動(dòng)子與編碼序列的連接是轉(zhuǎn)錄物融合并且想要實(shí)現(xiàn)編碼的蛋白的表達(dá)時(shí)，制造這樣的連接，使得得到的轉(zhuǎn)錄物中第一翻譯起始密碼子是編碼序列的起始密碼子。備選地，如果啟動(dòng)子與編碼序列的連接是翻譯融合并且想要實(shí)現(xiàn)編碼的蛋白的表達(dá)時(shí)，制造這樣的連接，使得5’非翻譯序列中含有的第一翻譯起始密碼子與啟動(dòng)子相連結(jié)，并且連接方式使得得到的翻譯產(chǎn)物與編碼想要的蛋白的翻譯開放讀碼框的關(guān)系是符合讀碼框的?？梢浴坝行нB接”的核酸序列包括但不限于：提供基因表達(dá)功能的序列(即基因表達(dá)元件，例如啟動(dòng)子、5’非翻譯區(qū)域、內(nèi)含子、蛋白編碼區(qū)域、3’非翻譯區(qū)域、聚腺苷化位點(diǎn)和/或轉(zhuǎn)錄終止子)、提供DNA轉(zhuǎn)移和/或整合功能的序列(即T-DNA邊界序列、位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別位點(diǎn)、整合酶識(shí)別位點(diǎn))、提供選擇性功能的序列(即抗生素抗性標(biāo)記物、生物合成基因)、提供可計(jì)分標(biāo)記物功能的序列、體外或體內(nèi)協(xié)助序列操作的序列(即多接頭序列、位點(diǎn)特異性重組序列)和提供復(fù)制功能的序列(即細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)、自主復(fù)制序列、著絲粒序列)。

本發(fā)明中所述的“殺蟲”或“抗蟲”是指對(duì)農(nóng)作物害蟲是有毒的，從而實(shí)現(xiàn)“控制”和/或“防治”農(nóng)作物害蟲。優(yōu)選地，所述“殺蟲”或“抗蟲”是指殺死農(nóng)作物害蟲。更具體地，目標(biāo)昆蟲是亞洲玉米螟害蟲。

本發(fā)明中的植物，特別是玉米，在其基因組中含有外源DNA，所述外源DNA包含編碼Cry1Ac蛋白和Cry2Ab蛋白的核苷酸序列，亞洲玉米螟害蟲通過攝食植物組織與Cry1Ac蛋白和Cry2Ab蛋白接觸，接觸后亞洲玉米螟害蟲生長受到抑制和/或?qū)е滤劳觯瑫r(shí)亞洲玉米螟會(huì)延緩產(chǎn)生對(duì)于Cry1Ac蛋白的抗性。抑制是指致死或亞致死。同時(shí)，植物在形態(tài)上應(yīng)是正常的，且可在常規(guī)方法下培養(yǎng)以用于產(chǎn)物的消耗和/或生成。此外，該植物可基本消除對(duì)化學(xué)或生物殺蟲劑的需要。

本發(fā)明中，將外源DNA導(dǎo)入植物，如將編碼所述Cry2Ab蛋白和/或所述Cry1Ac蛋白的基因或表達(dá)盒或重組載體導(dǎo)入植物細(xì)胞，常規(guī)的轉(zhuǎn)化方法包括但不限于，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微量發(fā)射轟擊、直接將DNA攝入原生質(zhì)體、電穿孔或晶須硅介導(dǎo)的DNA導(dǎo)入。

本發(fā)明提供了一種殺蟲蛋白組合及其管理昆蟲抗性的方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、延緩抗性。昆蟲在持續(xù)的選擇壓力下，會(huì)對(duì)單一Bt蛋白產(chǎn)生抗性，本發(fā)明通過利用兩種殺蟲蛋白Cry1Ac蛋白和Cry2Ab蛋白有效延緩或防止亞洲玉米螟產(chǎn)生抗性，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)亞洲玉米螟的控制或防治。

2、有效控制抗性害蟲。針對(duì)已經(jīng)對(duì)Cry1Ac蛋白產(chǎn)生抗性的亞洲玉米螟施用Cry2Ab蛋白可有效控制抗性亞洲玉米螟為害植物，從而使植物更大限度的獲得保護(hù)并穩(wěn)定產(chǎn)量。

3、本發(fā)明是使Cry1Ac蛋白和Cry2Ab蛋白在植物體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，且只需種植能夠該轉(zhuǎn)基因植物即可，而不需要采用其它措施，從而節(jié)省了大量人力、物力和財(cái)力，同時(shí)效果穩(wěn)定、徹底。

下面通過附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

附圖說明

圖1為本發(fā)明殺蟲蛋白組合及其管理昆蟲抗性的方法的含有Cry2Ab核苷酸序列的重組表達(dá)載體Cry2Ab-pET30的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為本發(fā)明殺蟲蛋白組合及其管理昆蟲抗性的方法的飼喂Cry1Ac蛋白處理的人工飼料的ACB-BtS和ACB-AcR的幼蟲校正死亡率示意圖；

圖3為本發(fā)明殺蟲蛋白組合及其管理昆蟲抗性的方法的飼喂Cry2Ab蛋白處理的人工飼料的ACB-BtS和ACB-AcR的幼蟲校正死亡率示意圖；

圖4為本發(fā)明殺蟲蛋白組合及其管理昆蟲抗性的方法的飼喂Cry1Ac蛋白處理的人工飼料的ACB-BtS和ACB-AcR的幼蟲生長抑制率示意圖；

圖5為本發(fā)明殺蟲蛋白組合及其管理昆蟲抗性的方法的飼喂Cry2Ab蛋白處理的人工飼料的ACB-BtS和ACB-AcR的幼蟲生長抑制率示意圖。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明殺蟲蛋白組合及其管理昆蟲抗性的方法的技術(shù)方案。

第一實(shí)施例、Cry2Ab蛋白的表達(dá)、純化及活化

1、含有Cry2Ab核苷酸序列的重組表達(dá)載體的構(gòu)建

Cry2Ab殺蟲蛋白質(zhì)的氨基酸序列(634個(gè)氨基酸)，如序列表中SEQ ID NO:1所示；根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性對(duì)Cry2Ab殺蟲蛋白質(zhì)的核苷酸序列進(jìn)行優(yōu)化，獲得編碼相應(yīng)于所述Cry2Ab殺蟲蛋白質(zhì)的氨基酸序列的Cry2Ab核苷酸序列(1905個(gè)核苷酸)，如序列表中SEQ ID NO:3所示。

所述Cry2Ab核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:3所示)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，且由其構(gòu)建的重組表達(dá)載體Cry2Ab-pET30的結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示(其中，Kan表示卡那霉素抗性基因；f1表示噬菌體f1的復(fù)制起點(diǎn)；Cry2Ab為Cry2Ab核苷酸序列(SEQ ID NO:3)；Lac I表示操縱子；ori表示復(fù)制起點(diǎn))。

然后將重組表達(dá)載體Cry2Ab-pET30用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1感受態(tài)細(xì)胞(Transgen，Beijing，China，CAT：CD501)，其熱激條件為：50μl大腸桿菌T1感受態(tài)細(xì)胞、10μl質(zhì)粒DNA(重組表達(dá)載體Cry2Ab-pET30)，42℃水浴30秒；37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)(100rpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動(dòng))，在表面涂有IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的氨芐青霉素(100mg/L)的LB平板(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、瓊脂15g/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、氨芐青霉素100mg/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)中于溫度37℃條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質(zhì)粒：將菌液在12000rpm轉(zhuǎn)速下離心1min，去上清液，沉淀菌體用100μl冰預(yù)冷的溶液I(25mM Tris-HCl、10mM EDTA(乙二胺四乙酸)、50mM葡萄糖，pH8.0)懸??；加入150μl新配制的溶液II(0.2M NaOH、1％SDS(十二烷基硫酸鈉))，將管子顛倒4次，混合，置冰上3-5min；加入150μl冰冷的溶液III(4M醋酸鉀、2M醋酸)，立即充分混勻，冰上放置5-10min；于溫度4℃、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，在上清液中加入2倍體積無水乙醇，混勻后室溫放置5min；于溫度4℃、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，棄上清液，沉淀用濃度(V/V)為70％的乙醇洗滌后晾干；加入30μl含RNase(20μg/ml)的TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)溶解沉淀；于溫度37℃下水浴30min，消化RNA；于溫度-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

提取的質(zhì)粒經(jīng)KpnI和HindIII酶切鑒定后，對(duì)陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證，結(jié)果表明重組表達(dá)載體Cry2Ab-pET30中插入的所述Cry2Ab核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，即Cry2Ab核苷酸序列正確插入。

2、Cry2Ab蛋白的表達(dá)

將測序正確的重組表達(dá)載體Cry2Ab-pET30轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)宿主BL21(DE3)(購自北京天根生化科技有限公司)中，具體轉(zhuǎn)化方法為：取50μL冰上融化的BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，加入質(zhì)粒DNA(重組表達(dá)載體Cry2Ab-pET30)并輕輕混勻，于冰上靜置25min；于溫度42℃下水浴90s，然后迅速放回冰上并靜置2min；向離心管中加入800μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)，混勻后在溫度37℃、轉(zhuǎn)速150rpm條件下復(fù)蘇60min；接著在轉(zhuǎn)速4000rpm條件下離心1min，收集菌體，留取100μL左右上清輕輕吹打后重懸并涂布在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、瓊脂15g/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)上生長過夜。獲得表達(dá)菌株后，按照下述步驟進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)：

步驟121、挑取一個(gè)含有重組表達(dá)載體Cry2Ab-pET30的陽性單克隆，在5mL的LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、卡那霉素50μg/mL，用NaOH調(diào)pH至7.5)中于溫度37℃條件下震蕩培養(yǎng)，使其OD₆₀₀值達(dá)到0.5-0.6；

步驟122、取0.5mL上述菌液于轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心10min，分別取上清和沉淀作為未誘導(dǎo)表達(dá)的陰性對(duì)照；

步驟123、在剩余的4.5mL上述菌液中加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為1mM，于轉(zhuǎn)速150rpm、溫度16℃條件下繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)20h；

步驟124、將繼續(xù)誘導(dǎo)后的菌液于轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心10min后收集菌體，并加入10mM Tris(pH 8.0)懸?。?/p>

步驟125、超聲波破碎懸浮后的菌體，于轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心10min，分別收集上清和沉淀并進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳檢測(參考《蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù)(第二版)》)Cry2Ab蛋白的表達(dá)，檢測結(jié)果表明：上清和沉淀中均有Cry2Ab蛋白表達(dá)(72KDa)。

3、Cry2Ab蛋白的純化

根據(jù)上述步驟121-125大量誘導(dǎo)表達(dá)Cry2Ab蛋白，將收集到的粗蛋白過鎳柱純化(His-Trap，F(xiàn)FGE Healthcare)，具體步驟如下：

步驟131、將上述步驟124中收集的菌體溶于結(jié)合緩沖液(50mM NaH₂PO₄、500mM NaCl、20mM咪唑，pH 8.0)中，再置于冰上超聲破碎，于轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心30min后收集上清，將上清過0.45uM濾膜除雜；

步驟132、用所述結(jié)合緩沖液平衡鎳柱，洗5個(gè)柱體積，流速為2mL/min；

步驟133、將過濾后的上清上樣，流速為0.5mL/min；

步驟134、用所述結(jié)合緩沖液再洗5個(gè)柱體積，流速為2mL/min，使Cry2Ab蛋白充分掛柱；

步驟135、用所述結(jié)合緩沖液繼續(xù)沖洗，洗去雜蛋白，流速為2mL/min；

步驟136、用洗脫緩沖液(50mM NaH₂PO₄、500mM NaCl、500mM咪唑，pH 8.0)進(jìn)行梯度洗脫(依次為：濃度百分比為10％的所述洗脫緩沖液洗脫3個(gè)柱體積，濃度百分比為20％的所述洗脫緩沖液洗脫3個(gè)柱體積，濃度百分比為40％的所述洗脫緩沖液洗脫3個(gè)柱體積，濃度百分比為100％的所述洗脫緩沖液洗脫5個(gè)柱體積)，流速為2mL/min，分別收集洗脫峰和洗脫液，經(jīng)過SDS-PAGE蛋白電泳檢測后獲得純化后的Cry2Ab蛋白。

4、Cry2Ab蛋白的活化

將上述純化后的Cry2Ab蛋白溶于50mM碳酸鈉緩沖液(pH 10.0)中；將胰蛋白酶配制成濃度為1mg/mL的水溶液，并按100:1(Cry2Ab蛋白:胰蛋白酶)的質(zhì)量比向Cry2Ab蛋白中加入胰蛋白酶水溶液；混勻后在溫度37℃下消化1-3小時(shí)。對(duì)活化后的Cry2Ab蛋白進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳檢測，結(jié)果表明獲得了酶切活化后的Cry2Ab蛋白。

用于下述實(shí)驗(yàn)的Cry1Ac蛋白購買自北京樂士寧科技有限公司。

第二實(shí)施例、Bt敏感型亞洲玉米螟株系及亞洲玉米螟抗性株系(Cry1Ac蛋白)的生物測定

1、供試?yán)ハx來源

供試?yán)ハx為亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)的Bt敏感株系(下文以ACB-BtS代表亞洲玉米螟Bt敏感株系)和亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)的Bt抗性株系(下文以ACB-AcR代表亞洲玉米螟Bt抗性株系)，上述兩種株系的昆蟲均來自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。

2、亞洲玉米螟生物測定方法

針對(duì)每種Bt蛋白使用不同濃度進(jìn)行生物測定，測定Cry1Ac蛋白的濃度范圍為0μg/g至50μg/g，測定Cry2Ab蛋白的濃度范圍為0μg/g至100μg/g。Bt蛋白溶液的制備方式為：將Cry1Ac蛋白與蒸餾水(或緩沖液)按照一定比例混合制成濃度分別為0μg/g、0.01μg/g、0.05μg/g、0.1μg/g、0.5μg/g、1μg/g、5μg/g、10μg/g和50μg/g的Cry1Ac蛋白溶液。將Cry2Ab蛋白與蒸餾水(或緩沖液)按照一定比例混合制成濃度分別為0μg/g、0.01μg/g、0.05μg/g、0.1μg/g、0.5μg/g、1μg/g、5μg/g、10μg/g、50μg/g和100μg/g的Cry2Ab蛋白溶液。將不同濃度的Bt蛋白溶液(Cry1Ac蛋白溶液或Cry2Ab蛋白溶液)與人工飼料(人工飼料來自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所)按1.5：1分別混合成混合飼料，將混合飼料分散放置于48孔的生物測定板中，每個(gè)孔中放入約0.5g混合飼料，將與Bt蛋白溶液(Cry1Ac蛋白溶液或Cry2Ab蛋白溶液)等量的蒸餾水(或緩沖液)處理的人工飼料作為空白對(duì)照。在生物測定板每個(gè)孔的混合飼料表面上接種1只亞洲玉米螟的新生幼蟲(存活<24h)，用封口膜覆蓋孔。將生物測定板在溫度28℃、相對(duì)濕度80％、光周期(光/暗)16:8的條件下放置6天，接種后第7天開始記錄幼蟲死亡率和幼蟲生長抑制率。昆蟲株系與Bt蛋白溶液(Cry1Ac蛋白溶液或Cry2Ab蛋白溶液)濃度的組合每組重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)包括48只幼蟲。

幼蟲死亡率以“實(shí)際死亡率”(下文簡稱為死亡率)體現(xiàn)，計(jì)算死亡率需考慮實(shí)際死亡的幼蟲和不顯示體重顯著增加(<0.1mg/幼蟲)的存活幼蟲。亞洲玉米螟的死亡率用如下的公式計(jì)算：死亡率(％)＝100×[死亡幼蟲數(shù)目+不顯示體重顯著增加(<0.1mg/幼蟲)的存活幼蟲數(shù)目]/測試?yán)ハx的總數(shù)。每個(gè)幼蟲的死亡率根據(jù)飼喂空白對(duì)照的幼蟲死亡率進(jìn)行校正。然后對(duì)經(jīng)過校正的劑量和死亡率數(shù)據(jù)進(jìn)行機(jī)率分析，應(yīng)用POLO統(tǒng)計(jì)軟件確定導(dǎo)致50％(LC50)死亡率的Bt蛋白濃度(Cry1Ac蛋白溶液或Cry2Ab蛋白溶液)和相應(yīng)的95％置信區(qū)間。通過將ACB-AcR的LC50值除以ACB-BtS的LC50值計(jì)算抗性比例。

飼喂混合飼料的亞洲玉米螟的幼蟲生長抑制率用以下公式計(jì)算：幼蟲生長抑制(％)＝100×(用空白對(duì)照飼喂的幼蟲體重-用混合飼料飼喂的幼蟲體重)/(用空白對(duì)照飼喂的幼蟲體重)。如果沒有體重顯著增加(<0.1mg/幼蟲)的幼蟲，則指定該重復(fù)為100％的幼蟲生長抑制。生長抑制數(shù)據(jù)用雙向ANOVA進(jìn)行分析，以昆蟲株系和Bt蛋白溶液濃度作為兩個(gè)主要因子。使用LSMEANS檢驗(yàn)確定α＝0.05水平的處理差異。

3、飼喂混合飼料的昆蟲株系的幼蟲死亡率及生長抑制率測定結(jié)果

飼喂Cry1Ac蛋白處理的混合飼料的ACB-BtS和ACB-AcR的幼蟲死亡率均隨著Cry1Ac蛋白濃度的增加而提高，且在同一濃度下ACB-BtS的幼蟲死亡率顯著高于ACB-AcR。如表1和圖2所示，基于ACB-BtS的幼蟲死亡率計(jì)算的LC50值為0.21μg/g；基于ACB-AcR的幼蟲死亡率計(jì)算的LC50值大于1000μg/g，因此ACB-BtS和ACB-AcR的LC50值的差異是極顯著的，兩者對(duì)于Cry1Ac蛋白的抗性差異也是極顯著的，即Cry1Ac蛋白對(duì)于ACB-AcR具有極弱的殺蟲活性。

飼喂Cry2Ab蛋白處理的混合飼料的ACB-BtS和ACB-AcR的幼蟲死亡率均隨著Cry2Ab蛋白濃度的增加而提高，且在同一濃度下ACB-BtS的幼蟲死亡率高于ACB-AcR。如表1和圖3所示，基于ACB-BtS的幼蟲死亡率計(jì)算的LC50值為1.23μg/g；基于ACB-AcR的幼蟲死亡率計(jì)算的LC50值6.71μg/g，因此ACB-BtS和ACB-AcR的LC50值的差異是顯著的，但Cry2Ab蛋白對(duì)于ACB-BtS和ACB-AcR均具有殺蟲活性。

如圖4所示，橫坐標(biāo)為所用Bt蛋白濃度(μg/g)的對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)為對(duì)應(yīng)亞洲玉米螟的生長抑制率，飼喂Cry1Ac蛋白處理的混合飼料的ACB-BtS和ACB-AcR的幼蟲生長抑制率均隨著Cry1Ac蛋白濃度的增加而提高，且在同一濃度下ACB-BtS的幼蟲生長抑制率顯著高于ACB-AcR；達(dá)到70％生長抑制率時(shí)，ACB-BtS所需Cry1Ac蛋白的濃度為約0.1μg/g，ACB-AcR所需Cry1Ac蛋白的濃度為約500μg/g，表明Cry1Ac蛋白對(duì)于ACB-AcR具有較弱的抑制活性。

如圖5所示，飼喂Cry2Ab蛋白處理的混合飼料的ACB-BtS和ACB-AcR的幼蟲生長抑制率均隨著Cry2Ab蛋白濃度的增加而提高，且在同一濃度下ACB-BtS的幼蟲生長抑制率高于ACB-AcR；達(dá)到100％生長抑制率時(shí)，ACB-BtS所需Cry2Ab蛋白的濃度為約1μg/g，ACB-AcR所需Cry2Ab蛋白的濃度為約5μg/g，表明Cry2Ab蛋白對(duì)于ACB-BtS和ACB-AcR具有相當(dāng)?shù)囊种苹钚浴?/p>

表1：Bt蛋白對(duì)ACB-BtS和ACB-AcR新生幼蟲的毒性結(jié)果

上述結(jié)果表明，ACB-AcR對(duì)Cry1Ac蛋白具有大于5000倍抗性(即抗性比例大于5000)，且Cry2Ab蛋白對(duì)于ACB-BtS和ACB-AcR均具有殺蟲活性，故ACB-AcR顯示出對(duì)Cry2Ab蛋白較低的交互抗性，抗性比例顯著降低為5.4。由此可見，Cry2Ab蛋白與Cry1Ac蛋白的交互抗性較低，Cry2Ab蛋白與Cry1Ac蛋白組合應(yīng)用可以延緩或推遲亞洲玉米螟對(duì)Cry1Ac蛋白產(chǎn)生抗性，同時(shí)Cry2Ab蛋白可以有效管理亞洲玉米螟物種對(duì)Cry1Ac蛋白產(chǎn)生的抗性。

第三實(shí)施例、Cry2Ab蛋白與Cry1Ac蛋白在生產(chǎn)抗蟲轉(zhuǎn)基因植物中的用途

通過第二實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，Cry2Ab蛋白與Cry1Ac蛋白預(yù)期可以用于在轉(zhuǎn)基因植物例如玉米植物中組合表達(dá)以延緩或防止亞洲玉米螟對(duì)該植物產(chǎn)生抗性。

第一種方法為相繼轉(zhuǎn)化：其中對(duì)已轉(zhuǎn)化了第一基因(例如Cry1Ac基因)的植物進(jìn)行再轉(zhuǎn)化，以引入第二基因(例如Cry2Ab基因)。該相繼轉(zhuǎn)化優(yōu)選地使用兩個(gè)不同的選擇標(biāo)記基因，例如卡那霉素抗性基因和賦予對(duì)草銨膦除草劑的抗性的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(例如pat或bar基因)。

第二種方法為共轉(zhuǎn)化方法：編碼Cry1Ac蛋白的核苷酸序列在植物中與編碼Cry2Ab蛋白的核苷酸序列一起表達(dá)，可以通過利用與各自基因連接的選擇標(biāo)記，整體篩選包含兩個(gè)選擇基因的植物。

第三種方法為獨(dú)立的轉(zhuǎn)化事件，將兩個(gè)殺蟲蛋白基因各自單獨(dú)地轉(zhuǎn)移至不同植物的基因組中，隨后可以通過雜交將其組合在單獨(dú)的植物中，并且可以使用DNA標(biāo)記技術(shù)來選擇包含這些不同基因的植物。

綜上所述，本發(fā)明通過利用兩種殺蟲蛋白Cry1Ac蛋白和Cry2Ab蛋白有效延緩或防止亞洲玉米螟產(chǎn)生抗性，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)亞洲玉米螟的控制或防治，使植物更大限度的獲得保護(hù)并穩(wěn)定產(chǎn)量；同時(shí)本發(fā)明使Cry1Ac蛋白和Cry2Ab蛋白在植物體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，且只需種植能夠該轉(zhuǎn)基因植物即可，而不需要采用其它措施，從而節(jié)省了大量人力、物力和財(cái)力，同時(shí)效果穩(wěn)定、徹底。

最后所應(yīng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司

北京大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司

<120> 殺蟲蛋白組合及其管理昆蟲抗性的方法

<130> DBNBC116

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 634

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cry2Ab氨基酸序列

<400> 1

Met Asp Asn Ser Val Leu Asn Ser Gly Arg Thr Thr Ile Cys Asp Ala

1 5 10 15

Tyr Asn Val Ala Ala His Asp Pro Phe Ser Phe Gln His Lys Ser Leu

20 25 30

Asp Thr Val Gln Lys Glu Trp Thr Glu Trp Lys Lys Asn Asn His Ser

35 40 45

Leu Tyr Leu Asp Pro Ile Val Gly Thr Val Ala Ser Phe Leu Leu Lys

50 55 60

Lys Val Gly Ser Leu Val Gly Lys Arg Ile Leu Ser Glu Leu Arg Asn

65 70 75 80

Leu Ile Phe Pro Ser Gly Ser Thr Asn Leu Met Gln Asp Ile Leu Arg

85 90 95

Glu Thr Glu Lys Phe Leu Asn Gln Arg Leu Asn Thr Asp Thr Leu Ala

100 105 110

Arg Val Asn Ala Glu Leu Thr Gly Leu Gln Ala Asn Val Glu Glu Phe

115 120 125

Asn Arg Gln Val Asp Asn Phe Leu Asn Pro Asn Arg Asn Ala Val Pro

130 135 140

Leu Ser Ile Thr Ser Ser Val Asn Thr Met Gln Gln Leu Phe Leu Asn

145 150 155 160

Arg Leu Pro Gln Phe Gln Met Gln Gly Tyr Gln Leu Leu Leu Leu Pro

165 170 175

Leu Phe Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Phe Ile Arg Asp Val

180 185 190

Ile Leu Asn Ala Asp Glu Trp Gly Ile Ser Ala Ala Thr Leu Arg Thr

195 200 205

Tyr Arg Asp Tyr Leu Lys Asn Tyr Thr Arg Asp Tyr Ser Asn Tyr Cys

210 215 220

Ile Asn Thr Tyr Gln Ser Ala Phe Lys Gly Leu Asn Thr Arg Leu His

225 230 235 240

Asp Met Leu Glu Phe Arg Thr Tyr Met Phe Leu Asn Val Phe Glu Tyr

245 250 255

Val Ser Ile Trp Ser Leu Phe Lys Tyr Gln Ser Leu Leu Val Ser Ser

260 265 270

Gly Ala Asn Leu Tyr Ala Ser Gly Ser Gly Pro Gln Gln Thr Gln Ser

275 280 285

Phe Thr Ser Gln Asp Trp Pro Phe Leu Tyr Ser Leu Phe Gln Val Asn

290 295 300

Ser Asn Tyr Val Leu Asn Gly Phe Ser Gly Ala Arg Leu Ser Asn Thr

305 310 315 320

Phe Pro Asn Ile Val Gly Leu Pro Gly Ser Thr Thr Thr His Ala Leu

325 330 335

Leu Ala Ala Arg Val Asn Tyr Ser Gly Gly Ile Ser Ser Gly Asp Ile

340 345 350

Gly Ala Ser Pro Phe Asn Gln Asn Phe Asn Cys Ser Thr Phe Leu Pro

355 360 365

Pro Leu Leu Thr Pro Phe Val Arg Ser Trp Leu Asp Ser Gly Ser Asp

370 375 380

Arg Glu Gly Val Ala Thr Val Thr Asn Trp Gln Thr Glu Ser Phe Glu

385 390 395 400

Thr Thr Leu Gly Leu Arg Ser Gly Ala Phe Thr Ala Arg Gly Asn Ser

405 410 415

Asn Tyr Phe Pro Asp Tyr Phe Ile Arg Asn Ile Ser Gly Val Pro Leu

420 425 430

Val Val Arg Asn Glu Asp Leu Arg Arg Pro Leu His Tyr Asn Glu Ile

435 440 445

Arg Asn Ile Ala Ser Pro Ser Gly Thr Pro Gly Gly Ala Arg Ala Tyr

450 455 460

Met Val Ser Val His Asn Arg Lys Asn Asn Ile His Ala Val His Glu

465 470 475 480

Asn Gly Ser Met Ile His Leu Ala Pro Asn Asp Tyr Thr Gly Phe Thr

485 490 495

Ile Ser Pro Ile His Ala Thr Gln Val Asn Asn Gln Thr Arg Thr Phe

500 505 510

Ile Ser Glu Lys Phe Gly Asn Gln Gly Asp Ser Leu Arg Phe Glu Gln

515 520 525

Asn Asn Thr Thr Ala Arg Tyr Thr Leu Arg Gly Asn Gly Asn Ser Tyr

530 535 540

Asn Leu Tyr Leu Arg Val Ser Ser Ile Gly Asn Ser Thr Ile Arg Val

545 550 555 560

Thr Ile Asn Gly Arg Val Tyr Thr Ala Thr Asn Val Asn Thr Thr Thr

565 570 575

Asn Asn Asp Gly Val Asn Asp Asn Gly Ala Arg Phe Ser Asp Ile Asn

580 585 590

Ile Gly Asn Val Val Ala Ser Ser Asn Ser Asp Val Pro Leu Asp Ile

595 600 605

Asn Val Thr Leu Asn Ser Gly Thr Gln Phe Asp Leu Met Asn Ile Met

610 615 620

Leu Val Pro Thr Asn Ile Ser Pro Leu Tyr

625 630

<210> 2

<211> 1178

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cry1Ac氨基酸序列

<400> 2

Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu

1 5 10 15

Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly

20 25 30

Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu Ser

35 40 45

Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile Ile

50 55 60

Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile

65 70 75 80

Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala

85 90 95

Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu

100 105 110

Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu

115 120 125

Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala

130 135 140

Ile Pro Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val

145 150 155 160

Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser

165 170 175

Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg

180 185 190

Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp His Ala Val

195 200 205

Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg

210 215 220

Asp Trp Ile Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val

225 230 235 240

Leu Asp Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr Pro

245 250 255

Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val

260 265 270

Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu

275 280 285

Gly Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr

290 295 300

Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Glu Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln

305 310 315 320

Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe Pro

325 330 335

Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala

340 345 350

Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg

355 360 365

Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp

370 375 380

Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val

385 390 395 400

Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln

405 410 415

Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His

420 425 430

Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile

435 440 445

Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn

450 455 460

Ile Ile Ala Ser Asp Ser Ile Thr Gln Ile Pro Ala Val Lys Gly Asn

465 470 475 480

Phe Leu Phe Asn Gly Ser Val Ile Ser Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly

485 490 495

Asp Leu Val Arg Leu Asn Ser Ser Gly Asn Asn Ile Gln Asn Arg Gly

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Tyr Ile Glu Val Pro Ile His Phe Pro Ser Thr Ser Thr Arg Tyr Arg

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Val Arg Val Arg Tyr Ala Ser Val Thr Pro Ile His Leu Asn Val Asn

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Trp Gly Asn Ser Ser Ile Phe Ser Asn Thr Val Pro Ala Thr Ala Thr

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Ser Leu Asp Asn Leu Gln Ser Ser Asp Phe Gly Tyr Phe Glu Ser Ala

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Asn Ala Phe Thr Ser Ser Leu Gly Asn Ile Val Gly Val Arg Asn Phe

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Ser Gly Thr Ala Gly Val Ile Ile Asp Arg Phe Glu Phe Ile Pro Val

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Thr Ala Thr Leu Glu Ala Glu Tyr Asn Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala

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Val Asn Ala Leu Phe Thr Ser Thr Asn Gln Leu Gly Leu Lys Thr Asn

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Val Thr Asp Tyr His Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val Thr Tyr Leu

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Asn Phe Lys Asp Ile Asn Arg Gln Pro Glu Arg Gly Trp Gly Gly Ser

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Val Thr Leu Ser Gly Thr Phe Asp Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr

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820 825 830

Ile Asp Val Gly Cys Thr Asp Leu Asn Glu Asp Leu Gly Val Trp Val

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Glu Phe Leu Glu Glu Lys Pro Leu Val Gly Glu Ala Leu Ala Arg Val

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Lys Arg Ala Glu Lys Lys Trp Arg Asp Lys Arg Glu Lys Leu Glu Trp

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Asn Val Ile Lys Asn Gly Asp Phe Asn Asn Gly Leu Ser Cys Trp Asn

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Val Lys Gly His Val Asp Val Glu Glu Gln Asn Asn Gln Arg Ser Val

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Leu Val Val Pro Glu Trp Glu Ala Glu Val Ser Gln Glu Val Arg

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Val Cys Pro Gly Arg Gly Tyr Ile Leu Arg Val Thr Ala Tyr Lys

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Glu Gly Tyr Gly Glu Gly Cys Val Thr Ile His Glu Ile Glu Asn

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Asn Thr Asp Glu Leu Lys Phe Ser Asn Cys Val Glu Glu Glu Ile

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Tyr Pro Asn Asn Thr Val Thr Cys Asn Asp Tyr Thr Val Asn Gln

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Glu Glu Tyr Gly Gly Ala Tyr Thr Ser Arg Asn Arg Gly Tyr Asn

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Arg Gly Tyr Arg Asp Tyr Thr Pro Leu Pro Val Gly Tyr Val Thr

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Leu Leu Met Glu Glu

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

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<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cry1Ac核苷酸序列

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aacggtgact tcaacaatgg cctcagctgc tggaatgtga aaggtcatgt ggacgtggag 3000

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