本發(fā)明屬于生物技術(shù)與飼料行業(yè)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：脂肪酶(lipase)是一類典型的羧酸水解酶，因能催化水解、酯化、轉(zhuǎn)酯化等多種反應(yīng)類型而廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、能源、環(huán)境等領(lǐng)域，但脂肪酶在飼料方面的應(yīng)用開發(fā)相對其它飼用酶仍處于起步階段。絕大多數(shù)微生物脂肪酶為堿性脂肪酶，對動物腸胃的酸性pH與消化酶環(huán)境的耐受性低，在動物腸胃環(huán)境下難以發(fā)揮催化活力。以解脂耶氏酵母脂肪酶為代表的飼用脂肪酶具有耐受腸胃環(huán)境、生物安全性好、pH及溫度性能優(yōu)越等諸多飼用酶所需特點，具有很高的開發(fā)應(yīng)用潛力?，F(xiàn)有技術(shù)可利用生物載體等進行脂肪酶的單產(chǎn)，如閻金勇等利用畢赤酵母表達生產(chǎn)脂肪酶，如吳蘭等利用解脂耶氏酵母生產(chǎn)胞外脂肪酶；然而其產(chǎn)量不高，脂肪酶產(chǎn)量低于1000U/ml，菌體的干重通常低于20g/L，蛋白質(zhì)含量低于50％。現(xiàn)有技術(shù)通常采取物理化學(xué)工藝、或者發(fā)酵工藝的優(yōu)化實現(xiàn)目標產(chǎn)物的產(chǎn)量的提高，然而僅能實現(xiàn)單目標產(chǎn)物的提高，且提高輻度有限。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)的以上缺陷或改進需求，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母，其目的在于實現(xiàn)飼料用脂肪酶與單細胞蛋白的聯(lián)產(chǎn)，以同時提高兩種目標產(chǎn)物的含量。為實現(xiàn)上述目的，按照本發(fā)明的一個方面，提供了一種轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母，包括如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，用于實現(xiàn)飼料用脂肪酶與單細胞蛋白的聯(lián)產(chǎn)。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母的蛋白質(zhì)含量為60％～70％。優(yōu)選地，在5％碳源的YPD液體培養(yǎng)基、裝液量10％、轉(zhuǎn)速250rpm、培養(yǎng)溫度28℃、以及培養(yǎng)時間84h的培養(yǎng)條件下，所述轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母的干重為32g/L～39g/L，飼料用脂肪酶的產(chǎn)量為3200U/ml～5900U/ml。按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種上述轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母的構(gòu)建方法，包括以下步驟：(1)將飼料用脂肪酶基因連接至表達載體上，獲得重組質(zhì)粒；所述飼料用脂肪酶基因具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；(2)將重組質(zhì)粒線性化，并轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母的營養(yǎng)缺陷型感受態(tài)細胞；(3)篩選轉(zhuǎn)化后的營養(yǎng)缺陷型感受態(tài)細胞，獲得所述轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母。優(yōu)選地，所述表達載體為pINA1317載體或pINA1297載體。優(yōu)選地，所述營養(yǎng)缺陷型為尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型。作為進一步優(yōu)選地，所述步驟(3)中的篩選方法為：利用無氨基酸培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的營養(yǎng)缺陷型感受態(tài)細胞。作為更進一步優(yōu)選地，所述無氨基酸培養(yǎng)基為YNBD(Yeastnitrogenbase-glucose)無氨基酸固體培養(yǎng)基，其包括6g/L～8g/L酵母氮堿，10g/L～15g/L葡萄糖以及15g/L～20g/L瓊脂，而不包括氨基酸。按照本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母在飼料用脂肪酶與單細胞蛋白的聯(lián)產(chǎn)中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述應(yīng)用的方法為：將所述轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母在YPD液體培養(yǎng)基中20℃～30℃發(fā)酵12h～240h。優(yōu)選地，所述YPD液體培養(yǎng)基包括2％～5％的碳源。作為進一步優(yōu)選地，所述碳源為葡萄糖、蔗糖、油酸、橄欖油、甘油或糖蜜。作為進一步優(yōu)選地，所述發(fā)酵的條件為：將轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母置于裝液量10％～30％的培養(yǎng)瓶中，在200rpm～300rpm的轉(zhuǎn)速下以搖床培養(yǎng)。總體而言，通過本發(fā)明所構(gòu)思的以上技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，能夠取得下列有益效果：1、通過基因工程的方法，建立了飼料用脂肪酶的表達與單細胞蛋白的生產(chǎn)之間的協(xié)同促進關(guān)系，以大量表達的飼料用脂肪酶促進了轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母對油脂碳源的利用，從而促進單細胞蛋白的生物合成，從而突破了兩種目標產(chǎn)物之間的相互制約，最終實現(xiàn)兩種目標產(chǎn)物(飼料用脂肪酶與單細胞蛋白)的高產(chǎn)；經(jīng)驗證，轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母的蛋白質(zhì)含量為60％～70％，轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母菌體的干重為32g/L～39g/L，飼料用脂肪酶的產(chǎn)量可達3200U/ml～5900U/ml；2、本發(fā)明的轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母能在一次發(fā)酵過程中獲得兩種目標產(chǎn)物，且該兩種目標產(chǎn)物飼料用脂肪酶與單細胞蛋白可以同時作為飼料添加劑應(yīng)用于飼料生產(chǎn)，減小了飼料生產(chǎn)的生產(chǎn)程序，降低了生產(chǎn)成本；本發(fā)明的生物安全性好，生產(chǎn)成本低，能耗低，條件溫和等明顯優(yōu)勢，極具農(nóng)業(yè)應(yīng)用前景；3、解脂耶氏酵母具備飼料用生物安全性，可以利用YPD液體培養(yǎng)基中的多種碳源進行發(fā)酵，節(jié)約了生產(chǎn)成本。具體實施方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。此外，下面所描述的本發(fā)明各個實施方式中所涉及到的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母，包括如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，用于實現(xiàn)飼料用脂肪酶與單細胞蛋白的聯(lián)產(chǎn)。上述轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母的構(gòu)建方法包括以下步驟：(1)將飼料用脂肪酶基因連接至pINA1317載體或pINA1297載體等表達載體上，獲得重組質(zhì)粒；所述飼料用脂肪酶基因具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；所述表達載體的基因序列包括啟動子hp4d，信號肽XPR2pre，終止子XPR2t，以及篩選標記Ura3d1或Ura3d4；(2)將重組質(zhì)粒線性化，生成由啟動子、信號肽、SEQIDNO:1以及終止子終成的表達框，并轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母Y.lipolytica的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型感受態(tài)細胞；(3)利用無氨基酸培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的營養(yǎng)缺陷型感受態(tài)細胞，篩選出轉(zhuǎn)化成功的營養(yǎng)缺陷型感受態(tài)細胞，即獲得所述轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母；所述無氨基酸培養(yǎng)基可以采用YNBD(Yeastnitrogenbase-glucose)固體培養(yǎng)基，其包括6～8g/L酵母氮堿，10g/L～15g/L葡萄糖以及15g/L～20g/L瓊脂，而不含氨基酸。上述轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母直接在YPD液體培養(yǎng)基中20℃～30℃發(fā)酵12h～240h，即可實現(xiàn)飼料用脂肪酶與單細胞蛋白的聯(lián)產(chǎn)；YPD液體培養(yǎng)基包括2％～5％的碳源；解脂耶氏酵母的生長條件非常廣泛，碳源可利用葡萄糖、蔗糖、油酸、橄欖油、甘油或糖蜜等，甚至粗甘油等廉價碳源也可實現(xiàn)較好的發(fā)酵效果；發(fā)酵的條件優(yōu)選為：培養(yǎng)瓶裝液量10％～30％，搖床轉(zhuǎn)速200rpm～300rpm。例如，在5％碳源的YPD液體培養(yǎng)基、裝液量10％、轉(zhuǎn)速250rpm、培養(yǎng)溫度28℃、以及時間84h的培養(yǎng)條件下，所述轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母的干重為32g/L～39g/L，飼料用脂肪酶的產(chǎn)量為3200U/ml～5900U/ml，蛋白質(zhì)含量為60％～70％。實施例1(1)以來源于解脂耶氏酵母脂肪酶家族中的脂肪酶lip(具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列)為目標脂肪酶基因，以pINA1317為載體，通過酶切酶連構(gòu)建重組質(zhì)粒pINA1317-lip；(2)線性化所述得到重組質(zhì)粒，由hp4d啟動子，XPR2pre信號肽，lip基因與XPR2t終止子組成的表達框(hp4d-XPR2pre-lip-XPR2t)；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化ura缺陷型Y.lipolytica感受態(tài)細胞；(3)以Ura3d1為篩選標記，通過YNBD選擇性培養(yǎng)基(6.7g/L不含氨基酸的酵母氮堿，10g/L葡萄糖，20g/L瓊脂)篩選獲得實施例1解脂耶氏酵母重組工程菌株。實施例2將實施例1獲得的解脂耶氏酵母重組工程菌株在以5％糖蜜為碳源的培養(yǎng)基中發(fā)酵，搖瓶裝液量10％，搖床轉(zhuǎn)速250rpm，培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)時間為84h，脂肪酶產(chǎn)量達到3200U/ml，菌體干重達到33g/L，菌體蛋白質(zhì)含量達到61％。實施例3(1)以來源于解脂耶氏酵母脂肪酶家族中的脂肪酶lip(具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列)為目標脂肪酶基因，以pINA1297為載體，通過酶切酶連構(gòu)建重組質(zhì)粒pINA1297-lip；(2)線性化所述重組質(zhì)粒得到由hp4d啟動子，XPR2pre信號肽，lip基因與XPR2t終止子組成的表達框(hp4d-XPR2pre-lip-XPR2t)；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化ura缺陷型Y.lipolytica感受態(tài)細胞；(3)以Ura3d4為篩選標記，通過YNBD選擇性培養(yǎng)基(6.7g/L不含氨基酸的酵母氮堿，10g/L葡萄糖，20g/L瓊脂)篩選獲得實施例3解脂耶氏酵母重組工程菌株。實施例4將實施例3獲得的解脂耶氏酵母重組工程菌株在以5％糖蜜為碳源的培養(yǎng)基中發(fā)酵，搖瓶裝液量10％，搖床轉(zhuǎn)速250rpm，培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)時間為84h，脂肪酶產(chǎn)量達到5900U/ml，菌體干重達到39g/L，菌體蛋白質(zhì)含量達到60.6％。實施例5將實施例3獲得的解脂耶氏酵母重組工程菌株在以5％粗甘油為碳源的培養(yǎng)基中發(fā)酵，搖瓶裝液量10％，搖床轉(zhuǎn)速250rpm，培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)時間為84h，脂肪酶產(chǎn)量達到4500U/ml，菌體干重達到32g/L，菌體蛋白質(zhì)含量達到62.6％。為對說明書內(nèi)容進行簡化，故將實施例6-實施例8的培養(yǎng)條件列至表1中，最后獲得的脂肪酶產(chǎn)量和菌體干重與碳源比例、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)時間正相關(guān)，與裝液量負相關(guān)；而菌體蛋白質(zhì)含量則與實施例2、實施例4與實施例5類似。表1實施例6-實施例8的培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件實施例6實施例7實施例8碳源2％的蔗糖3％的蔗糖4％的粗甘油裝液量10％20％30％搖床轉(zhuǎn)速200rpm230rpm300rpm培養(yǎng)溫度20℃28℃30℃培養(yǎng)時間12h24h240h本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>華中科技大學(xué)<120>一種轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母及其構(gòu)建方法與應(yīng)用<130>無<160>10<170>PatentInversion3.3<210>1<211>993<212>DNA<213>人工序列<400>1atgaagaacctaaacatcctcctcacagcttcggctactctggcagcagctgtacccact60gccatctctccttctgaggctgcagtcctccagaagagagtcttcacttctaccgtgacc120actcccattgaccaggacgattacaacttctttcaaaagtatgcccgtcttgcaaacatt180ggatactgtgtcggtcctctgaccctgatcttcccgcccttcacctgtggtctgcagtgt240gcctacttccccaatgttgagctgatccaggagttcgacgatccacttctcctgtctgat300gtctccggatacctggctgtggaccacaactcgcagcaaatctacctggtgatccgagga360acccactctctggaggacgtcatcacagacctccgagtcacccaggctcctctcactaac420gttgatctcgctgctaacatctctgccactgccacttgcgaagactgccttgttcacagc480ggtttcatgcagtcctacaacgacaccttcaacctgattggcccgaagcttgactctgtc540attgctcagtaccccaactacgagattgccgtcacccgccactctctgggtggagctgcc600gccgtgctgttcggaatcaacctcaaggtcaacggtcacgatcccctcgttgtcactctc660ggacagcctattgctggaaacgctggcgttgccaactcggttgacacactcttctttggc720caggagaaccccgatgtctctaaggtgacccgtgaccgaaagctctaccgaatcacccac780cagggagatatcgtgcctcagattcccttctgggccggctaccagcactgctctggagaa840gtcttcatcgactggcctctgatcctccctcctctctccaccgtgctcatgtgtgaaggc900cagagcaactcccagtgttctgcaggcaacactctgctacagcaagccaacgtgcttgga960aaccatctccagtacgtcaccggttgtatctaa993當(dāng)前第1頁1 2 3